CN101365948B - 亲和层析基质及其制备和使用方法 - Google Patents

亲和层析基质及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了将蛋白质配体偶联到固体支持物上的方法。本发明还提供了亲和层析基质，和用亲和层析基质纯化靶分子的方法。

Description

亲和层析基质及其制备和使用方法
本申请要求以2006年1月6日递交的美国临时申请60/756,873号作为优先权，通过引用的方式将其全部内容并入本文。
发明领域
本发明主要涉及层析领域。在一些特定实施方式中本发明提供了涉及亲和层析的基质及方法。
发明背景
层析方法一般用于从混合物中分离和/或纯化目标分子如蛋白质、核酸和多糖。亲和层析具体包括使混合物通过连有特异性配体(即特异性结合配偶体)的基质，以使目标分子结合于其上。通过接触配体，目标分子结合到基质上并因此从混合物中保留下来。相比于其他类型的层析，亲和层析提供了一些优点。它提供了一种高特异性、快速、经济和高产率的纯化方法。
在一个应用中亲和层析可被用于纯化如单克隆抗体的蛋白质。比如IgG亚型抗体可通过结合有A蛋白或G蛋白的基质而得到亲和纯化(Boyle andReis，1987，Biotechnology 5：697；Hermanson et al.，1992，Immobilized AffinityLigand Techniques，Academic Press；美国专利公开2006/0134805号)。
连接蛋白质配体的方法过去已被描述，如将A蛋白和G蛋白连接到固体支持物例如层析介质上，参见，例如Hermanson et al.1992，ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，Academic Press；美国专利5,874,165号；3,932,557号；4,772,635号；4,210,723号；5,250,6123号；欧洲专利申请EP 1 352 957 A1，WO 2004/074471。典型地，这种介质是用反应官能团(“活化基团”)如环氧化物(表氯醇)、氰(溴化氰CNBr)，N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、醛或活化的羧酸(如N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯、羰基二咪唑(CDI)活化酯)来活化的。这些活化基团能直接连接到基础基质，如CNBr，或者它们也可以是“接头”或间隔分子的一部分，典型地是碳、氧和氮原子的直链，如在接头丁二醇二缩水甘油醚(一种常用的环氧化物偶联剂)中发现的碳和氧的十元链。在偶联条件下再将活化介质与蛋白质配体相平衡。一旦偶联反应完成，彻底洗涤介质。对于A蛋白，通常每毫升介质可负载4-6毫克蛋白质(配体密度)，形成IgG的最大静态容量(Qs)为40g/L。蛋白质配体密度决定了静态容量。静态容量给出了能在层析分离中应用的蛋白质容量的上限。一般动态容量或者说负载容量(Qd)在一定的介质中与静态容量相关。
一种适合于连接到琼脂糖支持物上的重组形式的A蛋白也已被描述。重组形式的蛋白质被工程化以具有半胱氨酸末端，参见，例如美国专利6,399,750号；GE Healthcare Product Literature for r-Protein A Sepharose FastFlow，
Figure S200780001886XD00021
and Mabselect
Figure S200780001886XD00022
运用该种重组A蛋白，IgG的静态容量已能达到55-70g/L。然而，应用该种重组A蛋白的一个局限是其必须经基因工程化以包含选择性偶联官能团，由此导致的耗时和昂贵。
另一种将蛋白质配体偶联到固体支持物上的策略是“接头辅助偶联”。接头辅助偶联与以下要详述的配体辅助偶联相反，它的特点是依赖于一个包含了配体(即待纯化靶分子的特异结合配偶体)和有助于将配体偶联到固体支持物上的适当连接官能团的单分子。这种技术包括将官能团(如带电的胺)工程化设计为能偶联目标蛋白质配体的接头或间隔区。这些体系中的接头也含有将蛋白质偶联到接头上的活化基团。接头首先连接到固体支持物，再与蛋白质接触。因此单分子接头同时起着将蛋白质共价连接到基质和非共价地与蛋白质相互作用的功能。这提供了在偶联反应前/中实体的预先连接。这一技术已用于将聚糖偶联到膜表面以进行膜印迹凝胶电泳(美国专利5,543,054号；Charkoudian et al.，1995，Analytical Letters，28：1055)。
另一个接头辅助偶联的实例是市售产品Affi-Gel
Figure S200780001886XD00023
(BioRad，Hercules，CA)。Affi-Gel
Figure S200780001886XD00024
是一种琼脂糖支持物，经NHS活化的羧酸作为其接头臂的一部分含有带正电的官能团。此带正电的官能团是一个仲胺。该胺在pH7.4时被质子化并允许偶联等电点(pI)小于6的蛋白质。Affigel基质和其他由接头辅助偶联产生的此类配体有局限性，由于连接基团(带正电)是蛋白质偶联接头的一部分，使得两种官能团的比率固定在1∶1。另一个在美国专利5,260,373号中描述的带电接头臂是将A蛋白偶联到琼脂糖上：包含了精氨酸的短接头臂用于辅助蛋白质偶联到琼脂糖支持物上。精氨酸接头用NHS活化并携带有正电荷。然而结果显示，相比于无接头辅助的偶联，IgG结合容量仅有少量改进。另外上面所述的1∶1比率问题仍然存在。最近的美国专利申请10/928,731号描述了A蛋白通过接头结合到固体支持物上。
在发酵和组织培养上，应用同比放大的方法已能同时提高体积和靶分子浓度，如单克隆抗体的生产。产品浓度超过1g/L也不足为奇。这些产品在投入市场前需要经过纯化。因此，需要一种具有提高的结合容量以提供良好的产品产率，并且经济而易于制造的层析基质。本发明以下描述的多种实施方式满足了这些以及其他需求。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供了一种制造亲和层析基质的方法，其中所述基质包含固体支持物和至少一种蛋白质配体，并且其中所述方法包括：a)使缔合基团接触所述固体支持物以使缔合基团与固体支持物反应；b)活化所述固体支持物(如添加活化基团)；c)使所述蛋白质配体接触所述固体支持物以使该蛋白质配体结合到固体支持物上并与a)中的缔合基团相互作用。
在一些其他实施方式中，本发明提供了一种亲和层析基质，其包含：a)固体支持物；b)结合到所述固体支持物上的蛋白质配体；和c)单独地结合到固体支持物上的缔合基团，在固体支持物上所述缔合基团与所述蛋白质配体相互作用。
在另一些实施方式中，本发明给出了一种从混合物中纯化靶分子的方法，其包括：1)在第一组条件下使所述混合物与亲和层析基质接触，以使靶分子结合到基质的蛋白质配体上，其中亲和层析基质包含a)固体支持物；b)结合到固体支持物上的蛋白质配体；和c)单独地结合到固体支持物上的缔合基团，在固体支持物上所述缔合基团与所述蛋白质配体相互作用；2)改变1)所述的条件以使靶分子不再结合在基质的蛋白质配体上，以纯化目标物质。任选地，可在步骤1和2之间使用诸如磷酸盐缓冲液、水、以及下文提及的补充缓冲液等恰当的洗涤试剂进行一个或数个洗涤步骤。在步骤1之前基质也可先用合适的缓冲液进行平衡。
其他实施方式中，本发明给出了一种将蛋白质配体偶联到固体支持物上的方法，其包括：a)使缔合基团接触固体支持物以使缔合基团与固体支持物进行反应；b)活化固体支持物；c)使蛋白质配体接触固体支持物，以使蛋白质配体结合到固体支持物上并与a)中的缔合基团相作用。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种将A蛋白偶联到琼脂糖支持物上的方法，其包括：a)使带电物质接触琼脂糖支持物以使带电物质与琼脂糖支持物共价反应；b)用活化基团活化琼脂糖支持物；c)使A蛋白接触琼脂糖支持物，以使A蛋白共价结合到固体支持物上，并非共价地与a)中的带电物质相互作用。
在其他实施方式中，本发明提供了一种亲和层析基质，其包含：a)琼脂糖支持物；b)共价结合到琼脂糖支持物上的A蛋白；c)共价地结合到固体支持物上并非共价地与A蛋白相互作用的带电物质。
在另一些实施方式中，本发明提供了一种琼脂糖珠，其包含至少10g/L蛋白质配体，这些配体结合在琼脂糖珠表面上。蛋白质配体可作为亲和配体如A蛋白、G蛋白，也可作为靶分子如目标蛋白质的特异性结合配偶体。
在一些实施方式中，蛋白质配体可不通过任何居于其间的接头分子，而是通过活化的官能团以如共价结合的方式结合到固体支持物上。蛋白质配体也可非共价地同一个或数个缔合基团相互作用，这些缔合基团通过不同的共价键共价结合到固体支持物上，其间或有或无接头分子的作用。因此在一些实施方式中，本发明提供了非接头辅助的偶联到固体支持物上的缔合基团。在一些实施方式中，本发明提供了一种非接头辅助的，能偶联到固体支持物上的蛋白质配体。在一些实施方式中，缔合基团和蛋白质配体单独地通过共价键偶联到固体支持物上。
在其它实施方式中蛋白质配体通过被活化的官能团，在居于其间的接头分子作用下，以如共价结合的方式结合到固体支持物上。蛋白质配体也可非共价地与一个或数个缔合基团相互作用，所述缔合基团不通过接头分子便共价结合到固体支持物上。因此在一些实施方式中，本发明提供了非接头辅助的偶联到固体支持物上的缔合基团，以及有接头辅助的偶联到固体支持物上的蛋白质配体。
在其它实施方式中，本发明提供了偶联到固体支持物上的缔合基团，以及偶联到固体支持物上的蛋白质配体，其中缔合基团和蛋白质配体的某部分群体是通过接头偶联到固体支持物上的。蛋白质配体的某群体可通过接头偶联到固体支持物上，或者缔合基团的某群体可通过接头偶联到固体支持物上。在一些实施方式中，缔合基团和蛋白质配体均具有通过不同的接头偶联到固体支持物上的群体。
在其他一些实施方式中，本发明提供了一种接头辅助的缔合基团，通过例如共价键的方式偶联到固体支持物上。这种缔合基团也可在无接头分子的情况下，与共价偶联到固体支持物上的蛋白质配体以例如非共价的形式相互作用。
本发明的其余目的和优点一部分将通过之后的描述阐明，有些通过描述就能明确地获知，或者可通过实践本发明而认识到。本发明的目的和优点尤其将通过之后的权利要求书所指出的要素和结合而被认识和达到。
应当理解，之前的一般性介绍和接下来详细的描述仅是示例性的和解释性的，并不是对请求保护的发明的限制。
附图说明
图1示出含A蛋白的不同亲和层析介质的动态及静态容量。
图2比较了使用本发明的方法，当用和不用缔合基团和配体辅助A蛋白进行偶联时，不同亲和层析介质的结合容量。
图3示出使用和未使用中间盐缓冲液洗涤时，测定的洗脱池中CHO细胞蛋白(CHOP)的水平，以及结合到介质上的宿主细胞蛋白的水平，所述介质上含有不同量的缔合基团。IgG的回收率都类似，～90％-95％。
图4a示出通过进行中间盐洗涤以配体辅助偶联化学方法偶联了A蛋白的介质时，洗脱池中宿主细胞蛋白水平的降低。
图4b示出通过进行中间盐洗涤以配体辅助偶联化学方法偶联了A蛋白的介质时，洗脱池中DNA的水平的降低。
图5示出用不同pH和盐浓度的缓冲液进行中间洗涤以配体辅助偶联化学方法偶联了A蛋白的介质时，洗脱池中宿主细胞蛋白水平的降低。
图6a示出用含有丙氨酸或甜菜碱的缓冲液进行中间洗涤以配体辅助偶联化学方法偶联了A蛋白的介质时，洗脱池中宿主细胞蛋白水平的降低。
图6b示出用含有不同氨基酸的缓冲液进行中间洗涤以配体辅助偶联化学方法偶联了A蛋白的介质时，洗脱池中宿主细胞蛋白水平的降低。
具体实施方式
将配体偶联到固体支持物上的方法
在一些实施方式中，本发明提供了一种将蛋白质配体偶联(如配体辅助偶联)到诸如层析介质的预成型的固体支持物上的方法，其中所述活化剂和缔合基团通过单独的和不同的反应连接到固体支持物上，并且其中所述活化剂和缔合基团在共价连接到固体支持物上的反应之前并未连接，所述活化剂共价结合蛋白质配体，而所述缔合基团非共价地与蛋白质配体的作用加速了蛋白质配体和活化剂间共价键的形成。所述的方法可包括：a)使缔合基团与固体支持物反应；b)活化固体支持物；c)将蛋白质配体偶联到固体支持物上。一些实施方式中缔合基团与蛋白质配体均可共价连接到固体支持物上，但不能互相共价结合，除非通过固体支持物。缔合基团和活化剂都可共价结合到固体支持物的外表面。蛋白质配体可共价连接到已结合在固体支持物上的活化剂。缔合基团可通过与蛋白质配体间比如非共价作用来促进蛋白质配体与活化剂之间共价键的形成，活化剂是共价结合在固体支持物的外表面的。也考虑蛋白质配体和缔合基团都可结合到固体支持物上可及的内表面和孔。
应当理解步骤a)和b)可按任何顺序进行。因此在一些实施方式中本发明提供了可用于将缔合基团和蛋白质配体偶联到固体支持物上的两步反应。独立进行步骤a)-c)有一些优点，包括选择缔合基团、蛋白质配体和固体支持物的灵活性，并可通过控制缔合基团相对于蛋白质配体的比例来优化所需亲和层析反应的条件。这不同于前面所述将蛋白质配体偶联到固体支持物上的方法，例如接头辅助偶联，后者必将导致蛋白质配体和缔合基团的比例达到1∶1。
在过去描述的方法中，活化剂与缔合基团在被结合到固体支持物前会互相共价连接，或者直接掺入固体支持物中作为形成所述固体支持物的聚合反应的一部分。这些方法缺乏灵活性，也不能对配体密度进行优化。其他一些方法如随机偶联或多点连接取决于蛋白质配体中的任何胺基。多点连接缺乏灵活性，不能控制蛋白质配体偶联到固体支持物上。
本发明的其他优点包括应用两种或多种不同的缔合基团和/或两种或多种不同的蛋白质配体。而另一些优点包括严密控制配体密度以优化动态容量、静态容量或其二者。其它优点还在于限制了基质上非特异性结合的不需要的杂质的量。非特异性结合是过去已有的方法的特殊问题，它依赖于用结合目标蛋白质配体的物质如包含胺基的物质涂敷固体支持物。本发明提供的配体浓度控制避免了这些以前描述的方法中所发现的高非特异性结合水平。
因此通过不联合缔合基团和活化剂结合到固体支持物上的反应，本发明能更好地控制活化剂和缔合基团的浓度比例，进而更好地控制和修正用于分离靶蛋白质的层析条件，如pH、缓冲液盐浓度。因此本发明的一些实施方式预期了各种蛋白质配体和缔合基团的比例，包括蛋白质配体浓度超过缔合基团时的比例，以及缔合基团浓度超过蛋白质配体浓度时的比例。本发明的不同实施方式还预期使用了多种不同的缔合基团。本发明的不同实施方式预期了多种不同的能用于活化固体支持物的活化剂。同样，预期多种不同的蛋白质配体也可用于本发明的各种实施方式中。
在本文中，蛋白质配体是指结合到固体支持物上的蛋白质，它适合于特异性地结合目标靶分子。蛋白质可以包括全长蛋白质、全长蛋白质的片断或亚基、多肽、或蛋白质的肽段。
在一些实施方式中本发明提供了将高浓度蛋白质配体偶联到固体支持物上的方法。相比于以前描述的一些方法，这转而可提高靶分子的结合容量，如静态容量(Qs)和动态容量(Qd)。例如使用以前的方法，典型地每ml固体支持物仅能负载4-6mg的n-A蛋白(即来源于葡萄球菌A的A蛋白)。而采用本发明的方法，每ml固体支持物能负载7-100mg的A蛋白。在一些实施方式中固体支持物上能负载超过10mg/ml的A蛋白。在其它实施方式中固体支持物上至少能装载8mg/ml。本发明的一些实施方式虽未重组改变A蛋白，如添加一半胱氨酸残基，也未依赖于接头辅助偶联，但也都提高了静态和动态容量。
在一些实施方式中，本发明的方法包括使至少一种能与固体支持物反应的缔合基团与固体支持物接触。固体支持物可以是已经形成的，如聚合支持物，它可与至少一种缔合基团发生反应。另一些实施方式中，固体支持物没有预形成，如非聚合的，从而将缔合基团添加到化学组分中，所述化学组分随后与掺入的缔合基团反应形成固体支持物。固体支持物和缔合基团间的反应可导致其间共价键的形成。于是缔合基团可共价结合到固体支持物的外表面，也可结合到可及的内表面，如孔。
也考虑了涉及缔合基团的非共价相互作用，如离子相互作用、疏水相互作用、范德华力和氢键。例如缔合基团可非共价地与带电分子(如共价连接于固体支持物的聚合物)相互作用。缔合基团也可与蛋白质配体相作用。因此固体支持物被活化后，蛋白质配体能共价地结合到固体支持物上，并且非共价地与缔合基团相互作用。这样非共价相互作用促进蛋白质配体共价结合到固体支持物上。
在一些实施方式中缔合基团可直接与固体支持物反应而不需要任何居间的或连接的分子。另一些实施方式中缔合基团可作为一种混合物提供，第一群缔合基团与固体支持物直接反应，第二群缔合基团通过一个或多个接头分子间接地与固体支持物反应。另外接头分子的活化作用可引起缔合基团的改变，至少将一些缔合基团掺入接头分子中，也允许一些缔合基团直接与固体支持物反应，比如通过共价结合。由于某些化学反应的本质，设计与蛋白质配体非共价相互作用的缔合基团可能会与活化基团反应，因此最终是通过包含缔合基团和活化基团的接头臂，而将蛋白质配体偶联到固体支持物上。然而这些活化反应改变了固体支持物和缔合基团，造成蛋白质偶联位点的分散。这些位点中的一群包含了通过缔合基团而连接到固体支持物上的活化基团(比如经CNBr活化的肿胺)。第二群缔合基团可能存在于包含了直接连接到底部基质的活化基团和未改性的缔合基团的偶联位点上(比如具有未改性的仲胺的经CNBr活化的底部基质)。这是“接头辅助偶联”(仅可能存在一群偶联位点)和“配体辅助偶联”(存在至少两个可变的群的偶联位点)差异的一个例子。由于缔合基团与活化基团在类型、量和反应性上可独立地变化，可应用更宽范围的偶联条件和结构。
考虑了所有缔合基团和蛋白质配体间的非共价相互作用。与蛋白质配体的非共价相互作用可包括例如离子相互作用、疏水相互作用、范德华力或氢键介导的相互作用。
在一个实施方式中，缔合基团和蛋白质配体之间的相互作用是离子相互作用。比如带正电的缔合基团可结合到固体支持物上。然后，固体支持物即以化学官能性活化，这将促进蛋白质配体化学结合到固体支持物上，如通过共价结合。包含蛋白质配体溶液的pH值可被调节，以使蛋白质携带同固体支持物相连接的缔合基团的电荷所互补的电荷，比如至少一个负电荷或一个净负电荷。与固体支持物结合的带正电缔合基团与带负电的蛋白质之间的相互作用将促进蛋白质配体键合到已被活化的固体支持物上，同以前的方法相比还将提高结合容量。这些带电物质可以是离子，或带净电荷的分子。
选择合适的缓冲条件以将蛋白质配体偶联到固体支持物上对于本领域技术人员来说是完全在能力范围内的。适合的缓冲液包括任何不含胺的缓冲液，如碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和醋酸盐缓冲液。缓冲液的盐浓度取决于所用的缔合基团。例如盐浓度可在5nM-100mM之间。当利用带电物质时，盐浓度至少为5nM但低于0.1M，至少为5nM但低于0.01M，至少为5nM但低于0.001M。在一些实施方式中盐浓度可为0.01M。当利用疏水性种类时需要较高的盐浓度。此时盐浓度可大于0.001M，大于0.01M，大于0.1M。
实施本发明方法的温度为0℃到99℃的范围。在一些实施方式中实施本方法的温度低于60℃，低于40℃，低于20℃，低于10℃。在一些实施方式中实施本发明方法的温度为4℃。在其他一些实施方式中实施本发明方法的温度为20℃。
缔合基团
本发明中所用适合的缔合基团包括如离子性物质的带电物质，以及如疏水性物质的不带电物质。所述缔合基团可改性固体支持物，如直接共价结合固体支持物。离子性物质的恰当实例可包括季胺、叔胺、仲胺、伯胺、磺酸、碳酸、或其任意组合。疏水性物质的恰当实例可包括苯基、丁基、丙基、或其任意组合。同样考虑可使用混合模式的物质，如带电物质和疏水性物质的混合物。缔合基团也可与蛋白质配体相互作用。因此缔合基团与蛋白质配体的相互作用可以包括混合物的相互作用，例如离子性物质和疏水性物质。
缔合基团可通过使固体支持物上的官能团和缔合基团上的官能团的反应而被共价偶联到固体支持物。合适的官能团包括，但不仅限于胺、羟基、巯基、羧基、亚胺、醛、酮、烯、炔、偶氮、腈、环氧化物、氰和被活化的羧酸基团。例如琼脂糖珠包含的羟基可与如缩水甘油三甲基氯化铵这样的带正电缔合基团的环氧化物官能团反应。本领域技术人员将意识到只要使用至少一种双功能缔合基团，多种缔合基团就可偶联到固体支持物。因此缔合基团可先后被偶联到固体支持物上，或者可单独地直接偶联到固体支持物上。
蛋白质配体和靶分子
任何蛋白质配体可应用在本发明的实践中，只要它是目标靶分子特异性结合的配偶体。蛋白质配体的实例可包括A蛋白、G蛋白、抗体的Fc受体、激素或生长因子的受体。蛋白质配体可以是免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或它们的片段。片段可包括保留了结合靶抗原表位、和/或结合Fc受体、和/或A蛋白和/或G蛋白的能力的免疫球蛋白片段。蛋白质配体可以是Fc分子或其片段，Fab或其类似物，一种酶如谷胱甘肽转移酶，酪氨酸激酶如MAP、Src、Lck，一种底物如谷胱甘肽。蛋白质配体可以是一个蛋白质标签，如带有一个或多个组氨酸的多肽。蛋白质配体可以是融合蛋白如
Figure S200780001886XD00101
蛋白质配体可以是结合蛋白质的核酸，如转录因子、逆转录酶、拓扑异构酶、螺旋酶。在本发明的方法中假如靶分子是一个受体，其配体如生长因子可作为蛋白质配体。当靶分子为一免疫球蛋白如IgG或包含至少一个Fc区段部分的IgG片段，蛋白质配体就可为A蛋白、G蛋白或其功能性片段。其功能性片段包括保留了结合Fc区域、或IgG的Fc片段的能力的A蛋白片段或G蛋白片段。
蛋白质配体可以是一个天然存在的分子或工程化的分子。在一些实施方式中需要基因改造天然存在的蛋白质配体以促进其结合到固体支持物上或将其定向到固体支持物上或兼具这二者功能。因此，依赖所用的缔合基团，本领域技术人员可将带电基团、或疏水性基团、或此二者工程化到蛋白质配体中。这些改变可在蛋白质配体的任何位置进行。
当蛋白质配体是A蛋白时，如果使用n-A蛋白(天然存在)，本发明提供了大于50mg/ml的静态结合容量Qs，如果使用r-A蛋白(重组A蛋白)则提供了大于65mg/ml的静态结合容量Qs。重组A蛋白可包括除末端半胱氨酸外的修饰。
当固体支持物在溶液中提供时，如珠，合适的蛋白质配体浓度是0.05-700μmol/ml固体支持物、0.1-100μmol/ml固体支持物。
靶分子可包括特异地结合到所选蛋白质配体上的任何分子。当蛋白质配体是A蛋白或G蛋白时，靶分子可包括IgG亚类的免疫球蛋白。靶分子的具体实例包括单克隆抗体。同样考虑保留了结合所选蛋白质配体的能力的免疫球蛋白片段。靶分子也可以是融合蛋白，包括Fc融合蛋白，如
Figure S200780001886XD00111
固体支持物和活化剂
任何多孔材料均可用作固体支持物。作为实例而非限制，多孔材料可采用膜、珠、凝胶、盒、柱、芯片、滑片板或单块。
多孔材料可包括有机或无机分子或其组合，也可包括一种或数种适合于反应(如与缔合基团、活化剂或两者形成共价键)进行的官能团(如羟基)。多孔材料可包括亲水性化合物、疏水性化合物、疏油性化合物、亲油性化合物或其任意组合。多孔材料可包括聚合物或共聚物。
合适的多孔材料的实例包括但不仅限于聚醚砜、聚酰胺如琼脂糖、纤维素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚)、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(噁唑酮)、聚苯乙烯、陶瓷、尼龙和金属。
固体支持物可用恰当的化学官能团来活化。合适的化学官能团包括氰如溴化氰，醛，环氧化物，经活化的羧酸如N-羟基琥珀酰亚胺酯，或其任意组合物。或者，当缔合基团是伯胺、仲胺或叔胺时，缔合基团能被表氯醇或双功能环氧化物活化。
接头
在一些实施方式中本发明提供了可通过居间接头偶联到固体支持物上的缔合基团和/或蛋白质配体。此接头包含至少一个偶联到连接部分的官能团。连接部分可包括任何能被偶联到官能团的分子。因此连接部分可以包括任何烷基、链烯基或炔基。连接部分可包含有1-30个碳原子的碳链。在一些实施方式中接头可包含超过30个碳原子。连接部分可包含至少一个杂原子如氮、氧和硫。连接部分可包含支链、直链或环状链。连接部分可被两个或多个官能团所取代。一个特定实施方式中接头可包含下列通过羟基连接到琼脂糖的基团：
CH2CH2N(CH2CH3)2CH2CH(OH)CH2O(CH2)4OCH2CH(O)CH2。
纯化靶分子的方法
在一些实施方式中本发明提供了从混合物中纯化靶分子的方法。靶分子可以是任何分子，其带有特异性结合配偶体，该特异性结合配偶体可偶联到固体支持物上。靶分子的实例包括蛋白质(如免疫球蛋白)。免疫球蛋白可以是多克隆抗体或单克隆抗体或其功能片段。功能片段可包括任何包含可变区的免疫球蛋白的片段，其仍然特异性结合其抗原，同时保持了特异性结合偶联于固体支持物的蛋白质配体的能力。
在一些实施方式中，所述方法包括：a)在第一组条件下使包含靶分子的混合物接触本发明(本文所描述)的固体支持物，以使靶分子特异性结合蛋白质配体，偶联于固体支持物；b)改变条件以使靶分子不再结合在亲和配体上。在一些实施方式中，所述方法包括改变步骤a)和b)之间的pH值。在一些实施方式中进行步骤b)的pH比步骤a)的pH更呈酸性。因此步骤a)可在中性pH(例如pH6-8)进行，而步骤b)可在酸性pH(如pH1-6)进行。另一些实施方式中本方法包括改变缓冲液的盐浓度。因此在一个实施方式中步骤a)可使用高盐浓度，如大于0.1M，和/或步骤b)可使用低盐浓度，如小于0.1M。另一些实施方式中步骤a)可使用低盐浓度，如小于0.1M，和/或步骤b)可使用高盐浓度。在其它实施方式中步骤a)和步骤b)之间的缓冲液pH值和/或盐浓度均可改变。
1.层析基质的中间洗涤
在一些实施方式中本发明也提供了洗涤层析基质以除去非特异结合的杂质，由此得到更纯净的终产物的方法。基质可包括本领域任何公知的层析基质。例如层析基质可以是一种亲和基质。亲和基质可以是本文所描述的任何亲和基质，包括通过配体辅助偶联制作的亲和基质。该方法可包括在靶分子结合到层析基质上以后进行一次中间洗涤。一般地，非特异性吸附的杂质可包括除靶分子或产物之外的任何组分。非特异性结合的杂质的例子可包括蛋白质、DNA、脂类、内毒素、病毒颗粒，及其他小分子包括酚红、蛋白胨、泊洛沙姆、氨基酸。
中间洗涤试剂可包括平衡缓冲液，或与进料液(即含有未纯化样品的溶液)有相似pH和盐浓度的缓冲液，进一步包含a)提高浓度的盐(如氯化钠、氯化铵、硫酸钠、氯化钾、硫酸铵等)，或b)不同的pH值(更低或更高)，或c)a)和b)的组合，或d)添加剂，如表面活性剂(如吐温)、氨基酸及其衍生物、或有机溶质(如乙二醇)。与PBS这样的洗涤溶液相比，该中间洗涤可降低某些种类的非特异性结合2-5倍。在一些实施方式中，与众所周知的PBS之类的洗涤溶液相比，可降低某些种类的非特异性结合超过5倍。
在一些实施方式中本发明提供了洗涤亲和基质以除去非特异性结合种类的方法，包括使具有弱碱性pH(如7.3-7.5)以及添加盐浓度为0-1M的缓冲液接触亲和基质。因此，缓冲液可以是PBS或任何其他合适的缓冲液，并进一步添加额外的盐。在一些实施方式中盐浓度的范围是0.15M到1M。在其它实施方式中盐浓度的范围是0.25M到1M。在另一些实施方式中盐浓度的范围是0.25M到0.5M。在一些实施方式中盐浓度大于0.0001M但低于0.8M。
其他实施方式中的缓冲液，如PBS或任何其他合适的缓冲液，具有酸性pH(如6.5)且添加盐浓度小于1M、大于0.0001M(如0.4M)。在其它实施方式的缓冲液具有弱碱性pH值(如7.3-7.5)。一些实施方式中洗涤缓冲液可包含一种或多种带电氨基酸。洗涤缓冲液可包含氨基酸或烷基化氨基酸，包括甜菜碱、L-丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、和赖氨酸。氨基酸或烷基化氨基酸的浓度可为0.25M到0.5M。一些实施方式中氨基酸或烷基化氨基酸浓度小于0.5M但大于0.0001M。其它实施方式中氨基酸或烷基化氨基酸浓度的范围是从0.0001M到1M。中间洗涤缓冲液所用的合适的氨基酸包括但不仅限于甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及氨基酸衍生物如n-甲基甘氨酸和三甲基β-丙氨酸。在一些实施方式中，中间冲涤缓冲液包括添加氨基酸或氨基酸衍生物的缓冲液，所述缓冲液具有弱酸性pH值，如pH范围在6.0-6.99。
实施例
实施例1：使用季铵类配体、溴化氰和n-A蛋白(14/mg/ml)进行配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。根据下述方法使琼脂糖珠与带正电的缔合基团如阳离子反应：在100mL的75％重量的缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)和3.3g的50％重量的氢氧化钠中加入100mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。再将这些珠过滤并用三个200mL体积的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。
珠(10mL)经过滤后置于20mL 1M的Na2CO3中平衡。再将样品与第二个每毫升乙腈含0.5g CNBr的罐一起在冰上进行冷却。一旦溶液冷却，将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振荡仪上(＞100rpm)。2分钟后再将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振荡仪上(＞100rpm)。允许珠反应4分钟，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3进行洗涤并过滤。再将过滤的珠饼(10mL)加入到含有140mg n-A蛋白(14mg/mL)的10mL的0.012MNaHCO3。珠在室温振荡过夜。接着用0.2M NaHCO3洗涤并过滤。将珠饼加入20mL 0.2M NaHCO3中的0.5M氨基乙醇中。30分钟后用0.2MNaHCO3，含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠(pH4.5)，最后是磷酸盐缓冲液洗涤珠。静态和动态容量的测定依实施例12的描述进行。
实施例2：使用季铵类配体、溴化氰和n-A蛋白(17.8mg/ml)进行配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。依下述方法使琼脂糖颗粒与带正电的缔合基团如阳离子反应：在100mL的75％重量缩水甘油基三甲基氯化铵)(GTMAC)和3.3g的50％重量氢氧化钠中加入100mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。然后过滤珠，并用三个200mL体积的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。
珠(10mL)经过滤后置于20mL 1M的Na2CO3中平衡。再将样品与每毫升乙腈含0.5g CNBr的第二个罐一起在冰上进行冷却。溶液冷却后，将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。2分钟后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。允许珠反应4分钟，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3进行洗涤并过滤。再将过滤的珠饼(10mL)加入到含有285mg n-A蛋白(17.8mg/mL)的16mL 0.012M NaHCO3中。珠在室温振荡过夜。接着用0.2M NaHCO3洗涤并过滤。将珠饼加入20mL 0.2MNaHCO3中的0.5M氨基乙醇中。30分钟后用0.2M NaHCO3、含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠(pH4.5)、最后是磷酸盐缓冲液洗涤珠。其静态和动态容量的测定依实施例12的描述进行。
实施例3：使用季铵类配体、溴化氰和r-A蛋白进行配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。依下述方法使琼脂糖珠与带正电的缔合基团如阳离子反应：在100mL的75％重量缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)和3.3g的50％重量氢氧化钠中加入100mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。然后过滤珠并用三个200mL体积的Milli-Q水进行洗涤。
珠(10mL)经过滤后置于20mL 1M的Na2CO3中平衡。再将样品与每毫升乙腈含0.5g CNBr的第二个罐一起在冰上进行冷却。一旦溶液冷却，立即将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。2分钟后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。允许珠反应4分钟，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3洗涤并过滤。再将过滤的珠饼(10mL)加入到含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的10mL 0.012MNaHCO3溶液中。珠在室温振荡过夜。接着用0.2M NaHCO3洗涤珠并过滤。将珠饼加入20mL 0.2M NaHCO3中的0.5M氨基乙醇中。30分钟后用0.2MNaHCO3、含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠溶液(pH4.5)、最后是磷酸盐缓冲液洗涤珠。其静态和动态容量的测定依实施例12的描述进行。
实施例4：不使用季胺类配体，用溴化氰和n-A蛋白(17.8mg/ml)进行无配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。然后过滤珠并用三个200mL体积的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。
珠(10mL)经过滤后置于20mL 1M的Na2CO3中平衡。将样品与每毫升乙腈含0.5g CNBr的第二个罐一起在冰上进行冷却。溶液冷却后，将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。2分钟后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。允许珠反应4分钟，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3洗涤并过滤。将过滤的珠饼(10mL)加入到含有285mg n-A蛋白(17.8mg/mL)的16mL 0.012M NaHCO3溶液中。珠在室温振荡过夜。接着用0.2M NaHCO3洗涤并过滤。将珠饼加入20mL 0.2MNaHCO3中的0.5M氨基乙醇。30分钟后用0.2M NaHCO3、含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠溶液(pH4.5)、最后是磷酸盐缓冲液洗涤珠。其动态和静态容量的测定依实施例12的描述进行。
实施例5：不使用季胺类配体，用溴化氰和r-A蛋白进行无配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。然后过滤珠并用三个200mL体积的
Figure S200780001886XD00171
水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。珠(10mL)经过滤后置于20mL 1M的Na2CO3中平衡。再将样品与每毫升乙腈含0.5g CNBr的第二个罐一起置于冰上进行冷却。溶液冷却后，将1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。2分钟后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并将珠放置在置于冰上的振荡仪(＞100rpm)上。允许珠反应4分钟，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3进行洗涤并过滤。再将过滤的珠饼(10mL)加入到10mL含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的0.012M NaHCO3。珠在室温振荡过夜。接着用0.2M NaHCO3洗涤珠并过滤。将珠饼加入20mL 0.2M NaHCO3中的0.5M氨基乙醇。30分钟后用0.2M NaHCO3、含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠溶液(pH4.5)、最后是磷酸盐缓冲液洗涤珠。其动态和静态容量的测定依实施例12的描述进行。
实施例6：使用季铵类配体、丁二醇二缩水甘油醚和n-A蛋白进行配体辅助偶联
按过去已被描述的方法(Porath and Fornstedt，1970，J.Chromatography，51：479)将琼脂糖珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare，Piscataway NJ)用表氯醇进行交联。按照下述方法使琼脂糖珠与带正电的缔合基团(如阳离子)反应：在40g的75％重量缩水甘油基三甲基氯化铵)(GTMAC)、10mLMilli-Q水和1.67g的50％重量氢氧化钠中加入50mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。然后过滤珠并用三个100mL体积的水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。珠样品用下述方法进行滴定以测定季铵配体密度。
将珠(50mL，滤饼)添加到含有15mL 4.6M NaOH的罐中。浆化混合物，然后加入19.5mL的丁二醇二缩水甘油醚(BUDGE)。该混合物在35℃振荡2小时。再将颗粒用750mL
Figure S200780001886XD00181
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤，用250mL的10mM NaHCO3平衡。
BUDGE活化步骤后立即将10mL珠滤饼加入10mL含30g/L浓度n-A蛋白的10mM NaHCO3的溶液中。使珠在杂交仪中37℃旋转2小时。2小时后用30mL
Figure S200780001886XD00182
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤珠。再将珠滤饼(10mL)加入一盛有由1mL巯基乙醇、9mL具有0.2M NaHCO3和0.5MNaCl的缓冲液组成的10mL溶液的罐中。浆化混合物并在室温旋转过夜。再将珠用30mL的下列缓冲液洗涤：0.1M Tris缓冲液(pH8)，添加了0.15MNaCl的0.1M Tris缓冲液(pH8)，50mM醋酸(pH4.5)，含0.002％叠氮化钠的PBS(pH7.4)。用前述方法表征珠的静态容量，并用标准BCA测定(Pierce，Rockford，IL)以n-A蛋白作标准曲线测定的A蛋白配体密度见下表1。
实施例7：使用季铵类配体、丁二醇二缩水甘油醚和n-A蛋白进行配体辅助偶联
实施例7中的珠与实施例6中的一样，差别在于加入缔合基团。根据下述方法使琼脂糖珠与带正电的缔合基团(如阳离子)反应：在25g的75％重量GTMAC，25mL
Figure S200780001886XD00183
水，和1.67g的50％重量氢氧化钠中加入50mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。然后过滤珠并用三个100mL体积的
Figure S200780001886XD00184
水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。之后所有的步骤(BUDGE活化和A蛋白偶联)都与实施例6一样。然后，用前述方法表征珠的静态容量，并用标准BCA测定(Pierce，Rockford，IL)以n-A蛋白作标准曲线测定的A蛋白配体密度见下表1。
实施例8：使用季铵类配体、丁二醇二缩水甘油醚和n-A蛋白进行配体辅助偶联
实施例8中的珠与实施例6中的一样，差别在于加入缔合基团。按照下述方法使琼脂糖珠与带正电的缔合基团(如阳离子)反应：在10g的75％重量GTMAC，40mL
Figure S200780001886XD00185
水(Millipore公司，Billerica，MA)，和1.67g的50％重量氢氧化钠中加入50mL珠。在室温，反应在旋转振荡仪上剧烈振荡(＞100rpm)进行过夜。然后过滤珠并用三个100mL体积的
Figure S200780001886XD00191
水(Millipore公司，Billerica，MA)进行洗涤。之后所有的步骤(BUDGE活化和A蛋白偶联)都与实施例6一样。用前述方法表征珠的静态容量，并用标准BCA测定(Pierce，Rockford，IL)以n-A蛋白作标准曲线测定的A蛋白配体密度见下表1。
表1.实施例6-8中的介质特性总结
  缔合配体密度(μmol/mL)   静态容量(g/L)   A蛋白配体密度(g/L)
  实施例6   20-40   71   15
  实施例7   10-20   68   14
  实施例8   5-10   64   12
  Q-Sepharose FF   170-180
  Mabselect   55   9
实施例9：使用季铵类配体、表氯醇和n-A蛋白在CPG上进行配体辅助偶联
可控孔度玻璃(CPG)(Millipore公司，Billerica，MA)LCA-CPG 1000A用于使用缔合基团辅助将A蛋白偶联到CPG上。将LCA-CPG(10mL)加入到10mL含50％重量的缩水甘油基三甲基氯化铵。反应在30℃轻微振荡(＜100rpm)进行过夜。然后用50mL
Figure S200780001886XD00192
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤CPG并过滤形成一干饼。再将CPG加入到35mL含表氯醇(6％重量)的水溶液中，在30℃轻微振荡2分钟。然后用100mL
Figure S200780001886XD00193
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤珠，然后过滤形成一干饼。将珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL浓度的n-A蛋白的0.01M NaHCO3中。偶联反应在35℃轻微振荡进行过夜。再用100mL
Figure S200780001886XD00194
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤珠并过滤形成一干饼。然后将珠加入到10mL 0.1M Tris缓冲液中的1M氨基乙醇，pH8。反应1小时后用各50mL的0.2M NaHCO3，添加了0.5M NaCl的0.1M醋酸钠(pH4.5)洗涤珠，最后用磷酸盐缓冲液洗涤珠。按前述方法测定静态容量，结果示于表2。缔合基团浓度用元素分析法测定。
实施例10：不使用季铵类配体和表氯醇，在CPG上进行n-A蛋白的配体偶联
可控孔度玻璃(CPG)(Millipore公司，Billerica，MA)ProSep 5-CHO1000A用于不使用缔合基团辅助将A蛋白偶联到CPG上。将5-CHO珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL浓度n-A蛋白的0.01M NaHCO3中。偶联反应在35℃轻微振荡进行过夜。然后用100mL
Figure S200780001886XD00201
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤珠并过滤形成一干饼。然后将珠加入到10mL 0.1MTris缓冲液中的1M氨基乙醇，pH8。反应1小时后用各50mL的0.2MNaHCO3，添加了0.5M NaCl的0.1M醋酸钠(pH4.5)洗涤珠，最后用磷酸盐缓冲液洗涤珠。按前述方法测定静态容量，结果示于表2。缔合基团浓度用元素分析法测定。
表2.实施例9和10的介质特性的总结
  缔合配体浓度(μmol/mL)     静态容量(g/L)   A蛋白配体密度(g/L)
    实施例9     61     65     ＞10
    实施例10     0     40     6
实施例11：缔合基团浓度的测定：季铵类配体的滴定
季铵类配体密度用酸碱滴定法测定。将1mL珠的样品置于一次性塑料柱中，然后用
Figure S200780001886XD00202
水(10mL)(Millipore公司，Billerica，MA)和1M NaOH(10mL)平衡。再用4mL
Figure S200780001886XD00203
水(Millipore公司，Billerica，MA)洗涤珠并过滤形成一湿珠饼。将珠加入到盛有80mL的1M NaCl溶液的带有搅拌棒的小玻璃烧杯中。将pH计放在烧杯中。样品用0.01M HCl滴定。用强阴离子交换树脂珠(Q-Sepharose FF)作为对照。实施例6-8的数值示于下表1。结果惊人地显示相比于市售产品和各种试验条件，较低密度的缔合基团和相应较低密度的配体提供了更优的静态容量。
实施例12：IgG静态和动态容量的测定
前述实施例和市售基准的静态和动态容量依据下述方法测定：
1.在PBS缓冲液中制取每个样品的珠悬浮液(20％珠)。
2.搅拌珠悬浮液，将500μL样品移入3支15mL塑料锥形管中。
3.向每支管加入PBS中的蛋白质溶液(IgG)(1mg/ml)(14mL)。
4.盖上管并置于定轨振荡仪中缓慢振荡(＜100rpm)。
5.24小时后使珠沉淀，结合后从溶液中读出UV值。
6.将UV吸光度转换成IgG浓度(ε～1.38)，而质量衡算用于测定饱和容量。
将A蛋白介质填充入Omnifit柱(直径0.66cm，床高7cm)，测定多克隆人免疫球蛋白(IgG)的动态结合容量。柱用PBS缓冲液(pH7.4)平衡，使用同样的缓冲液将蛋白质(1g/L)上柱。以10％穿透时的容量来比较不同介质。图1示出两个市售基准
Figure S200780001886XD00211
和Mabselect
Figure S200780001886XD00212
(GEHealthcare，Piscataway，NJ)及实施例1-3的产品中IgG的静态和动态容量的比较。实施例2-5的结果示于图2。表示出实施例6-8的静态容量。表2示出实施例9-10的静态含量。
实施例13：经过或未经中间洗涤时，不同缔合配体密度下宿主细胞蛋白(HCP)在IgG洗脱池中的水平
澄清单克隆抗体(mAb)、无血清CHO培养基(Angel Biotechnology，Northumberland，UK)用作模式HCP原料。经过10个柱体积(CV)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4-7.5，电导率15-17mS/cm)平衡后，将20CV的原料负载于填充了实施例6-8所述A蛋白介质的柱(内径0.66cm，x长7cm)上。然后用10CV的PBS洗涤珠，或者用8CV的添加了1M NaCl的PBS(pH7.4-7.5)、再用2CV未添加的PBS(pH7.4-7.5)洗涤。接着用10CV的0.1M柠檬酸钠(pH3)缓冲液洗脱。从0.5至5.5CV收集峰部分。再将柱用5CV的6M盐酸胍清洗，用PBS缓冲液平衡。这个结合-洗脱试验是在
Figure S200780001886XD00213
预备液相色谱系统(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上进行的。洗脱池在280nm紫外吸收处测定IgG浓度及产率。CHOP浓度用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Cygnus Technologies Inc.，Southport，NC)分析。图3示出的结果显示用合适的中间洗涤缓冲液易于将伴有较高蛋白质配体浓度的非特异性结合进行抵消。与表1示出的结果相结合，数据显示出本方法的灵活性以及本文所描述的基质能使本领域技术人员在减小不良副效应(例如非特异性结合)的同时最大化所需容量，这就提供了一种适合于特定性应用的亲和基质。
实施例14：使用盐缓冲液中间洗涤降低了IgG洗脱池中宿主细胞蛋白(HCP)和DNA水平
澄清非IgG表达、无血清CHO培养基(Lampire Biological Laboratories，Piperville，PA)用作模式HCP原料，其掺入(spike)1mg/ml多克隆人丙种球蛋白(hlgG)(SeraCare Life Sciences，Inc.，Oceanside，CA)。经过10个柱体积(CV)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4-7.5，电导率15-17mS/cm)平衡后，将20CV原料负载于填充了实施例2所述A蛋白介质的柱(内径0.66cm，x长7cm)上。然后用8CV的添加了0-1M NaCl的PBS(pH7.4-7.5)洗涤，再用2CV的未添加的PBS(pH7.4-7.5)洗涤。接着用10CV的0.1M柠檬酸钠(pH3)缓冲液洗脱。从0.5至5.5CV收集峰部分。再将柱用5CV的6M盐酸胍清洗，用PBS缓冲液再平衡。结合-洗脱试验是在
Figure S200780001886XD00221
预备液相色谱系统(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上进行的。洗脱池在280nm紫外吸收处测定IgG浓度及产率。CHOP浓度用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Cygnus Technologies Inc.，Southport，NC)分析。
图4a示出用不同的盐洗涤缓冲液测定的洗脱池中CHOP的水平。自0-1M逐渐增加的NaCl浓度使CHOP浓度从450ng/ml到80ng/ml下降超过5倍。IgG的回收率全部类似，～90-95％。
图4b示出使用添加了1M NaCl的PBS缓冲液测定的洗脱池中DNA的水平。相比于用普通PBS洗涤溶液配体辅助偶联的A蛋白样品，盐洗降低了非特异性吸附的DNA水平达20-60％。
实施例15：使用较低pH和较高盐浓度的中间洗涤降低了IgG洗脱池中HCP水平
试验在与实施例14所述相似条件下进行，不同之处在于使用了包含8CV的PBS(pH 6.5，添加了0.4M NaCl)的中间洗涤缓冲液。
图5示出用不同pH和盐浓度的中间洗涤缓冲液测定的洗脱池中CHOP的水平。相比于用未添加的PBS(pH 7.4-7.5)缓冲液洗涤步骤所得到的结果，含0.4M NaCl的pH 6.5PBS缓冲液将CHOP水平降低到约1/8。
实施例16：使用含氨基酸或烷基化氨基酸的缓冲液的中间洗涤降低了IgG洗脱池中HCP水平
试验在与实施例14所述相似条件下进行，不同之处在于使用了中间洗涤缓冲液，其包含8CV的PBS(pH 7.4-7.5，电导率15-17mS/cm)和0.25-0.5M甜菜碱，L-丙氨酸，甘氨酸，或赖氨酸，或0.125-0.25M缬氨酸，或0.15M谷氨酸。
图6a示出用含甜菜碱和L-丙氨酸的中间洗涤缓冲液测定的洗脱池中CHOP的水平。0.25M甜菜碱降低了CHOP的浓度。比较而言，丙氨酸比甜菜碱更有效。两个浓度的丙氨酸都使结合的CHOP减少了超过2倍。
图6b示出用含不同浓度缬氨酸、甘氨酸、谷氨酸或赖氨酸的中间洗涤测定的洗脱池中CHOP的水平。相比于PBS洗涤，使用氨基酸洗涤使得洗脱池内CHOP的水平减少了约3-10倍，其中赖氨酸和谷氨酸看起来是最有效的。
本说明书和权利要求书中使用的表示组分数量、反应条件等的所有数字在所有情况下应当理解为由术语“大约”所修饰。因此，除非作了相反的表示，说明书和权利要求书中的数值参数是近似值，可依据本发明希望得到的目的性质进行变化。至少为了不将与本发明教导等价的应用限定在权利要求书的范围内，每个数值参数应依据有效数字的数值和普通四舍五入法进行解释。
对于本领域技术人员来说明显的，任何不违背本发明精神和范围的修改和改变都可以被做出。本文中所述的具体实施方式仅通过举例的方式而提供，并不意味做出了任何限制。说明书和实施例仅被作为示例，本发明的真正范围和精神实质体现在以下权利要求书中。

Claims (13)

1.一种将蛋白质配体偶联到固体支持物上的方法，该方法包括a)使缔合基团接触所述固体支持物，以使所述缔合基团与所述固体支持物相互作用；b)用活化基团活化所述固体支持物；c)使所述蛋白质配体接触固体支持物，以使所述蛋白质配体结合到活化的固体支持物上，并与a)所述的缔合基团非共价地相互作用，其中所述缔合基团和活化基团均单独地连接到所述固体支持物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的固体支持物是珠。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的珠是琼脂糖珠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的缔合基团是带电物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的带电物质带有正电荷。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述的带电物质带有负电荷。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的缔合基团是疏水性的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的固体支持物通过接触至少一种下列物质而被活化：a)溴化氰；b)醛；c)环氧化物；d)被活化的羧酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白质配体也能够结合免疫球蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的蛋白质配体选自A蛋白和G蛋白。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白质配体共价地结合到所述的固体支持物上。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的缔合基团与固体支持物间的相互作用是共价键。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述缔合基团和活化基团单独地连接到所述固体支持物包括单独地进行所述缔合基团和活化基团与所述固体支持物的结合反应。
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