CN116133739A - 表面官能化亲和膜 - Google Patents

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S·施耐德曼
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Abstract

本公开提供表面官能化亲和膜。所述表面官能化亲和膜能够通过改进的偶联化学物质、配体密度、间隔臂类型和间隔臂长度提供增加的结合能力。还提供制备所述表面官能化亲和膜的方法和使用所述表面官能化亲和膜从样品中分离包含核酸分子和蛋白质的感兴趣目标的方法。

Description

表面官能化亲和膜
授权参考
本发明是根据美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的授权号IIP-1329377在政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月1日提交的美国临时申请第63/003,629号的优先权，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开大体上涉及色谱领域。更具体来说，本公开涉及对膜表面的修饰以用于亲和配体的定制布置和固定。
背景技术
单克隆抗体作为治疗剂和诊断工具的巨大潜力已导致生物技术行业为生产高纯度抗体进行了大量研究工作。免疫球蛋白G(IgG)的大规模生产需要能够处理高体积的上游处理单元和高效下游处理单元两者来生产极纯产物。在过去十年中，在抗体生产的上游细胞培养滴度方面实现的最近改进对下游处理施加了巨大的压力，所述下游处理可占IgG的实际生产成本的高达80％。蛋白质A亲和色谱通常用作纯化免疫球蛋白的第一步骤。IgG的Fc区与蛋白质A之间的高亲和相互作用形成IgG的许多亚类的亲和纯化的基础。由于此可逆相互作用，细胞培养液(CCF)通过蛋白质A柱导致IgG的结合和不需要的杂质(例如病毒、宿主细胞蛋白质、DNA等)通过色谱介质的流动。然而，传统的基于树脂的蛋白质A色谱受到例如高压降、较高缓冲液消耗、低容量、低生产率(尤其在高流动速率下)、高成本等的限制。因此，大量研究工作已集中于开发基于蛋白质A的膜吸附器作为在IgG生产中基于树脂的纯化步骤的替代方案。已报道了几种大孔膜。尽管与填充床树脂相比，这些膜具有更快的吸附动力学和高渗透性，但由于可用于吸附的表面积有限，其具有低结合能力。
因此，需要用于纯化免疫球蛋白和其它生物分子的替代组合物和方法，其提供有利的吸附动力学、高表面积、高孔隙率、高结合能力和易于官能化。
发明内容
在优选实施例中，表面官能化亲和膜包括：膜支撑体；多个间隔臂，其固定于所述膜支撑体上，每一间隔臂包括末端；以及配体，其偶联到所述末端。所述膜支撑体可包括浇铸膜、电纺膜或其组合。在优选实施例中，所述膜支撑体进一步包括固定于所述膜支撑体的表面上的一或多个惰性官能团。
在优选实施例中，制备表面官能化亲和膜的方法包括：提供纳米纤维膜支撑体；将间隔臂固定于膜支撑体上，其中每一间隔臂包括末端；以及经由反应性官能团将配体偶联到所述间隔臂的所述末端。所述膜支撑体可包括浇铸膜、电纺膜或其组合。在优选实施例中，所述膜支撑体进一步包括固定于所述膜支撑体的表面上的一或多个惰性官能团。
在优选实施例中，从样品中分离感兴趣目标的方法包括：使包括所述感兴趣目标的所述样品与所述表面官能化亲和膜接触以吸附所述感兴趣目标。所述膜支撑体可包括浇铸膜、电纺膜或其组合。在优选实施例中，所述膜支撑体进一步包括固定于所述膜支撑体的表面上的一或多个惰性官能团。
虽然公开了多个实施例，但根据示出且描述本发明的说明性实施例的以下详细描述，本发明的另外其它实施例对本领域技术人员而言将变得显而易见。因此，附图和详细描述应被视为本质上是说明性而非限制性的。
附图说明
以下图式形成本说明书的部分且为了进一步展现本发明的某些实施例或各种方面而包含在内。在一些情况下，可通过参考附图与本文中所呈现的详细描述的组合而最好地理解本发明的实施例。所述描述和附图可突出显示本发明的某一具体实例或某一方面。然而，本领域技术人员将理解，实例或方面的部分可与本发明的其它实例或方面组合使用。
图1展示能够偶联含胺分子的各种官能团。此包含环氧化物或环氧乙烷、NHS酯、醛和磺酰氯(从左到右)。
图2A展示用于将蛋白质A固定到环氧化物活化表面上的活化密度与配体密度之间的区别。
图2B展示由于空间相互作用和大小限制而超出最小配体密度从而阻止IgG结合能力增加的表面。
图2C展示通过改变活化密度和定制表面官能化以包含惰性官能团和示例性亲和配体(蛋白质A)以最大化配体效率而优化的表面。
图2D展示具有多个不同间隔分子长度以最大化IgG的结合的表面。
图3展示用于用羧酸基进行后续活化的烃间隔分子的引入。其中X＝F、Cl、Br或I。n＝0到无穷大。
图4展示固定到纤维素基质上的各种双环氧化物间隔/连接分子。此包含丁二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚(平均Mn＝500)和聚(乙二醇)二缩水甘油醚(平均Mn＝2000)(从左到右)。
图5展现可能的优化表面，其具有不同的环氧化物，且因此具有不同的配体、密度以及不同的间隔分子长度，以最大化潜在IgG结合。
图6展示不同间隔分子长度对环氧化物表面蛋白质A与IgG结合有用性的影响。
图7展示不同间隔分子长度对每ml膜的IgG结合能力的影响。
图8展示不同间隔分子长度对从1ml中50mg蛋白质A中摄取的蛋白质的影响。
图9展示不同间隔分子长度对NHS表面蛋白质A与IgG结合有用性的影响。
图10展示不同间隔分子长度对每ml膜的IgG结合能力的影响。
具体实施方式
本公开涉及表面官能化亲和膜，其具有经由间隔臂附接到膜表面的多个配体。与现有分离技术(包含填充床树脂、大孔膜和表面官能化膜)相比，亲和膜具有许多优点。举例来说，亲和膜可归因于高比表面积、增加的配体密度和增加的配体效率而具有更高的结合能力。根据本公开，这些优点可通过定制偶联化学物质、配体密度、间隔臂类型和间隔臂长度来实现。本文中所描述的实施例可应用于可变化且为本领域技术人员所理解的任何亲和膜。
为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明的实施例所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本文中所描述的那些方法和材料类似的、修改的或等效的许多方法和材料可用于实践本发明的实施例而无需过多的实验，本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求本发明的实施例时，将根据下文所陈述的定义使用以下术语。
本说明书内所列举的数值范围包含定义所述范围的数字，且包含所定义范围内的每一整数。贯穿本公开，本发明的各个方面均以范围格式呈现。应理解，采用范围格式的描述仅为了方便和简洁起见，且不应解释为对本发明范围的硬性限制。因此，对范围的描述应当被认为已经明确地公开了所述范围内所有可能的子范围、分数和个别数值。举例而言，对例如从1到6的范围的描述应当被认为具有明确地公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的个别数字，例如，1、2、3、4、5和6，以及小数和分数，例如，1.2、3.8、11/2和43/4。无论范围的广度如何，这都适用。
应理解，本文中所使用的所有术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在以任何方式或范围进行限制。举例来说，除非内容另外明确指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”可包含多个指示物。此外，所有单位、前缀和符号可以其SI公认形式表示。
如本文中所使用，术语“约”是指例如通过典型测量技术和设备相对于任何可定量变量(包含但不限于质量、体积、时间、温度、长度、分子量、密度、吸收和结合能力)可能发生的数值数量的变化。此外，在现实世界中使用的固体和液体处理程序的情况下，存在某些无意的误差和变化，这可能是由于用于制造组合物或实行方法等的成分的制造、来源或纯度的差异而引起的。术语“约”也涵盖这些变化。无论是否由术语“约”修饰，权利要求书均包含此数量的等效值。
如本文中所使用的术语“膜”、“毡”和“垫”是可互换的，并且是指非编织或随机覆叠的纤维集合，任选地通过应用额外步骤以形成最终组合物而形成，所述额外步骤包含但不限于退火、熔合、加热、压制、涂布和交联。形成膜的纤维可具有任何适合的直径。在优选实施例中，所述膜包括纳米纤维、微纤维或纳米纤维与微纤维的组合。膜可为圆柱形或基本上平面的。
术语“膜支撑体”是指膜，包含浇铸膜、电纺膜或浇铸膜与电纺膜的组合。膜支撑体可包括可层叠在一起的多个膜。
如本文中所使用的术语“纳米纤维膜”是指纳米纤维的集合，其还可包含为了强度、增强通量和其它特性而添加的微纤维。
如本文中所使用的术语“微纤维”是指直径大于1.0微米且通常在1.0微米与1.0毫米之间的纤维。
如本文中所使用的术语“纳米纤维”是指直径小于1.0微米，且通常在10纳米与1.0微米之间，例如在200nm与600nm之间的纤维。
如本文中所使用的术语“杂化纳米纤维膜”是指由至少两种类型的聚合物组成的非编织或随机覆叠的纤维集合，所述聚合物呈单一组分纤维或复合纤维与至少一种其它单一组分纤维或至少一种其它复合纤维的组合。
如本文中所使用的术语“复合纳米纤维”为由至少两种不同聚合物生产的纳米纤维。
如本文中所使用的术语“电纺”是指将电力施加到纺丝原液以形成纳米纤维。
如本文中所使用的术语“纺丝原液”是指用于电纺工艺中的聚合物溶液。
如本文中所使用，术语“容量”是指每单位吸附剂结合的产物的量。
术语“亲和色谱”在本文中用于特定的色谱模式，其中配体以锁键方式经由生物亲和与目标相互作用。亲和色谱中有用的相互作用的实例为例如酶-底物相互作用、生物素-抗生物素蛋白相互作用、抗体-抗原相互作用等。
术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”可互换使用，并且是指包括通过相邻氨基酸残基之间的肽键接合在一起的氨基酸的任何天然或重组分子。“肽键(peptide bond)”、“肽键(peptide link)”或“酰胺键”是当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时在两个氨基酸之间形成的共价键。术语“氨基酸”、“氨基酸残基”和“残基”在本文中可互换使用。
如本文中所使用，术语“核酸”是指单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物或衍生物。术语“核酸”中还包含核酸的类似物，例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA和其它此类类似物和衍生物或其组合。
“载体”为包括经分离核酸且可用于将经分离核酸递送至细胞内部的物质组合物。载体的实例包含但不限于直链多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包含自主复制质粒或病毒。所述术语还解释为包含促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包含但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
如本文中所使用的“病毒样粒子”或“VLP”是指至少一种不含任何核酸的病毒粒子。因此，VLP可用于疫苗接种或用于在个体中诱发免疫原性反应。然而，由于不存在核酸，VLP将不能够在宿主细胞中复制且因此是非复制性的。
如本文中所使用的术语“脂质纳米粒子”或“LNP”是描述亚微米范围内的基于脂质的粒子的通用术语。LNP可具有脂质体的结构特征和/或具有替代的非双层类型的结构。LNP构成用于递送活性成分(例如寡核苷酸和小分子药物)的其它微粒系统(例如乳液、脂质体、胶束、微粒和/或聚合纳米粒子)的替代物。
如本文中所使用的术语“胞外体”是指小的分泌囊泡(通常约30到150nm)，其可含有或已存在于其膜、核酸、蛋白质或其它生物分子中，且可在身体或生物系统中的不同位置之间用作此货物的载体。
如本文中可互换使用的术语“纯化”、“分离(separating)”或“分离(isolating)”是指从包括分子和一或多种杂质的组合物或样品中增加感兴趣分子或目标分子的纯度。
如本文中可互换使用的术语“间隔分子”、“间隔臂”或“连接子”是指使配体远离膜支撑体的元件。
如本文中所使用的术语”配体”是指能够与目标化合物(例如抗体)相互作用的分子或化合物。
如本文中所使用，术语“样品”是指待用于本文中所描述的方法中的任何液体或固体材料。举例来说，样品可为含有真核或原核细胞或细胞材料、或病毒或病毒材料、或细菌或细菌材料、或微生物或病原体的溶液。样品可基本上为水或缓冲溶液或由任何人工引入的化学品构成，且可或可不含有核酸或蛋白质。
如本文中所使用，“生物样品”是指从活体或病毒来源或其它大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包含可从其中获得核酸或蛋白质或其它大分子的个体的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或处理过的样品。举例来说，扩增的经分离核酸构成生物样品。生物样品可包含生物固体材料或生物流体或生物组织。生物固体材料的实例包含肿瘤、细胞球粒或活检体。生物流体的实例包含细胞培养物、细胞匀浆、细胞于培养基中的悬浮液、尿液、血液、血浆、血清、汗液、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊髓液、漱口水、泪液、粘液、精子、羊水等。生物组织通常为特定种类的细胞以及其细胞间物质的聚集体，其形成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料中的一种，包含结缔组织、上皮组织、肌肉和神经组织。生物组织的实例还包含器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个别细胞。生物样品的定义还包含土壤、水和其它环境样品，包含工业废料和可能含有病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物和其组分的天然水体(湖泊、溪流、河流、海洋)。
膜支撑体
本公开的亲和膜组合物包含膜支撑体。膜支撑体可为浇铸膜、电纺膜或其组合。膜支撑体包括纤维。形成膜支撑体的纤维可具有任何所要直径。在优选实施例中，膜支撑体包括纳米纤维、微纤维或其混合物。膜支撑体可由各种类型的聚合材料制成。在优选实施例中，膜支撑体包括纤维素、纤维素衍生物、非纤维素聚合物、复合纳米纤维或其混合物。
在优选实施例中，所述膜包括纤维素。纤维素为用于亲和膜组合物的优选基底材料，因为其极低非特异性结合特征允许能够通过预期的固定配体与目标生物分子特异性地相互作用，而不直接与基底材料相互作用。纤维素中的羟基(-OH)可容易地转化成其它所要官能度，以用于使用各种表面接枝方法进行偶联反应。
膜支撑体可制备或以制备形式获得。膜支撑体可为含有纤维素和非纤维素基聚合物的杂化膜。适合的杂化膜和其制备方法描述于以全文引用的方式并入本文中的美国专利公开案第2015/0360158号中。如果膜支撑体为杂化膜，那么杂化膜优选地包括至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％或至少70wt.％的基于纤维素的纤维。在另一实施例中，膜支撑体可由基于纤维素的纤维组成或基本上由基于纤维素的纤维组成。膜支撑体可包括表面官能化且可根据本文中所描述的方法进一步表面官能化。
在优选实施例中，杂化膜中按质量计的大部分可来自基于纤维素的聚合物，在膜内并入额外类型的纤维可提供膜应用所需的官能度。因此，希望在膜内具有额外纤维，因为其可为膜提供增加的机械强度，允许将多个官能度并入到膜中，且为制造过程提供稳定性。
许多非纤维素聚合物已经成功地用于通过浇铸或电纺形成膜支撑体。适合于形成膜支撑体的非纤维素聚合物包含但不限于(1)热塑性均聚物，例如乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酯、聚醚和聚碳酸酯，(2)热塑性共聚物，例如乙烯基-共-乙烯基聚合物、丙烯酸-共-丙烯酸共聚物和乙烯基-共-丙烯酸聚合物，(3)弹性体聚合物，例如三嵌段共聚物弹性体、聚氨酯弹性体和乙烯-丙烯-二烯-弹性体，(4)高性能聚合物，例如聚酰亚胺和芳香族聚酰胺，(5)液晶聚合物，例如聚(对苯二甲酰对苯二胺)和聚芳酰胺，(6)纺织聚合物，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯腈，(7)导电聚合物，例如聚苯胺，以及(8)生物相容性聚合物(即“生物聚合物”)，如聚己内酯、聚丙交酯、壳聚糖和聚乙交酯。如所描述，形成膜支撑体的纤维可包括这些聚合物中的一或多种，也可为上文所提到的聚合物种类中的两种或更多种的共聚物，且可为包括纤维素和/或纤维素衍生物以及前述聚合物中的一种的复合纤维。
示例性电纺工艺通常可描述如下：
步骤1：将纺丝原液(例如，聚合物溶液)放置在具有喷丝头(1)的容器中，且将通常在5到40千伏特的范围内的DC高压(2)经由电极(例如，铜线)(3)施加到溶液。电接地集电器(4)放置在距喷丝头一定距离(称为间隙距离)(5)处。间隙距离可在几厘米到一米的范围内。当静电场达到临界值且电力克服表面张力和粘弹性力时，射流/细丝被喷出且直线行进一定距离(称为射流长度)。
步骤2：接着射流开始弯曲，形成螺旋环圈。此现象被称为“弯曲(或搅打)不稳定性”。通常，弯曲不稳定性导致射流的长度在极短时间周期(50ms或更短)内伸长超过10,000倍。因此，弯曲不稳定性期间的伸长速率极高(高达1,000,000s-1)。此极快伸长速率可有效地拉伸大分子链且使其沿纳米纤维轴紧密排列。
步骤3：射流通过蒸发溶剂或在熔融物冷却到低于固-液转变温度时固化。固化时间越长，射流可伸长得越多。固化时间与许多因素有关，例如溶剂蒸气压、溶剂扩散率、射流所承载的体积电荷密度和所施加静电场的强度。
任选的电纺后处理
在所收集的纳米纤维的固化之后，存在可执行的某些额外步骤，以便针对特定用途“定制”纳米纤维。下文论述示例性额外步骤：
a.加热和压制
在优选实施例中，可将由电纺纤维制备的膜加热且压制在一起以将纤维退火和/或熔合在一起。
b.去除聚合物
在一些情况下，聚合物中的一或多种，且特别是包括可区别地去除的聚合物的复合纳米纤维，可使用较高热和/或溶剂去除可区别地去除的聚合物中的一种。可区别地去除的聚合物的去除提供剩余聚合纤维的额外表面积和改进的孔隙度。这是因为在去除可区别地去除的聚合物之后，剩余聚合物具有在所去除的聚合物用于占据空间的位置处留下的受控大小的“孔”。此额外“空隙空间”在所得膜支撑体上提供更大表面积，其可例如增加分离的吸附结合能力，改进基于大小的分离的选择性，且改进来自额外孔隙度的通量。
c.纤维素再生
在采用衍生纤维素的实施例中，在制备“作为电纺”纳米纤维之后，衍生纤维素可通过再生过程转化成纤维素。再生纤维素将具有与先前所描述的纯天然纤维素相同的特性。通过使含有衍生纤维素的纳米纤维与例如强碱(例如，氢氧化钠)或其它溶剂接触来完成再生过程。在转化成纤维素的再生反应之后，可洗涤纳米纤维以去除在过程期间使用的任何过量溶剂。
更详细电纺技术进一步公开于美国专利第9,604,168号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
表面官能化
在制备或获得膜支撑体之后，将膜支撑体的表面官能化。更具体来说，纤维表面经官能化。无论其直径如何，纤维表面都可被官能化。在优选实施例中，官能化的纤维表面包括纳米纤维、微纤维或其混合物。
优选地，官能化包含添加亲和配体，所述亲和配体包含但不限于病毒缀合物、抗体、酶底物和小分子仿生物质。所添加的亲和配体还可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、核酸、寡核苷酸、蛋白质、寡肽、多糖、寡糖、糖、肽、抗原、适体、亲和体、小有机化合物、药物和其它配体。适合的亲和配体的实例可在已发表的文献中获得且为众所周知的。优选地，配体可结合免疫球蛋白。此类配体的非限制性实例包含蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。
为了用于生物分离，表面官能化膜理想地为生物惰性的，这意味其应抵抗例如细胞和细胞碎片的不溶性固体的非特异性结合，以及与蛋白质、糖、核酸、病毒和存在于许多生物生产系统中的其它可溶性组分的非所需相互作用。
在优选实施例中，用于生物分离的表面官能化膜展现以下技术特征中的一或多个：(1)允许最大量的比面积的小直径纤维；(2)允许在吸附应用期间均匀流动分布的纤维之间的良好控制和窄孔径分布；(3)具有优异的机械和化学稳定性以承受潜在的高操作压力和苛刻的清洁条件的纤维；以及(4)具有定义明确的且空间一致的大小和化学组成的纤维。在更优选实施例中，膜支撑体包括交联的纤维。在最优选实施例中，膜支撑体包括交联的纤维素纳米纤维；例如美国专利第10,919,986号中所描述的交联的纳米纤维，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
对于其中大分子产物(例如蛋白质、核酸和病毒)为主要目标的吸附过程，与本文中所描述的表面官能化膜相关联的大比表面积为吸附生物分离提供多个潜在结合位点。膜支撑体可通过添加表面官能化以含有多个结合位点来改性，且吸附可在纤维的表面上发生，这使得结合位点在不需要目标分子在内部扩散的情况下立即可用。结合位点中的每一个包括经由表面官能化附接的亲和配体。就此而言，亲和配体固定于膜支撑体上。当使用传统多孔树脂珠粒时，由于目标分子的大小相对较大，所以内部扩散常常可能限制生物产品的许多吸附过程的能力。此外，因为膜支撑体可由许多不同的基于聚合物和纤维素的纤维制成，所以可定制吸附配体以满足特定分离的需要。
本文中所描述的表面官能化亲和膜提供优于传统树脂珠粒分离技术的改进。那些改进中的两个为(1)流动通过膜支撑体的微孔和大孔(与紧密填充树脂珠粒相反)，和(2)在纤维的表面上发生吸附，其中不需要内部扩散。这些因素减少了具有较高流动速率的高压降的问题，且消除了在树脂珠粒内吸附所需的缓慢粒子内扩散。我们已发现，生物分子与表面官能化亲和膜的结合能力在量值上类似于树脂珠粒，但可在比填充床快超过10倍的处理流动速率下操作。这些因素允许快得多的处理时间和潜在的更高的结合水平，以纯化有价值的生物产物。这是非常期望的，尤其是对于大的生物分子(大于100kDa的分子量，和/或20到300nm的流体力学直径)，这是因为由于树脂珠粒的小孔内的质量转移限制，难以使用填充床纯化所述大的生物分子。
偶联化学物质
可利用各种类型的化学物质将所要配体永久地结合到膜支撑体的表面。必须选择反应化学物质的选择，使得在色谱过程条件下无干扰副反应。举例来说，如果所纯化的分子在盐浓度的高变化下洗脱，那么应选择耐盐的配体和偶联化学物质以便维持培养基的可重用性。由于几乎所有蛋白质或肽分子都能够经由胺偶联过程固定的事实，可偶联到含胺分子的反应性官能团是优选的。在胺偶联过程中使用的常见官能团的实例展示于图1中。
胺反应性官能团包含但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺基-NHS酯、酰氯(例如磺酰氯)、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、氨基甲酸酯、芳基卤化物、烷基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、三嗪和其组合。这些官能团可通过附接到构成膜的纤维的表面而直接附接到膜支撑体的表面，或其可以是间隔分子的部分。
作为实例，环氧化物或环氧乙烷基团将在开环过程中与伯胺亲核试剂反应，且将产生在环氧化合物上含有β-羟基的仲胺，从而将其锚定到膜上。此过程易于在通常在8到10的范围内的中等碱性pH值下进行。在所固定的蛋白质或配体在这些条件下稳定的假设下，可使用更高的pH值以便加速偶联过程以及提高偶联效率。与环氧化物基团一起发生的主要副反应为环氧化物环的水解，这在低pH值下更容易发生，从而产生相邻的羟基。就例如琼脂糖和纤维素的培养基来说，膜表面上的羟基可在稍高温度和强碱性条件下用表氯醇活化以便产生官能环氧化物基团。
在另一实例中，羧酸可转变成活化的酯以用于与亲核伯胺偶联，从而产生仲酰胺。最常见的是，此活化用于通过碳二亚胺和NHS或二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)产生N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。接着，此酯用于通过将活化的羧酸-NHS酯的NHS与任何游离亲核胺交换以形成酰胺键而将生物分子(例如酶)固定在支撑体上以进行纯化和反应。此方法是有用的，因为其容易在8.6或更低的生理pH下发生，这归因于NHS水解慢得多，且因此在低于此pH值时偶联产率高。NHS偶联也是缓冲液依赖性的。在偶联之前产生的活化酯可立即使用或在凉爽无水条件下储存，因此对于活化是非常有用的。用于活化官能团的额外化学物质描述于美国专利第8,114,611号中，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
膜支撑体表面可用反应性官能团官能化以固定亲和配体，且用惰性官能团官能化以改进配体固定的效率且降低结合位点处的空间位阻的可能性。出于演示目的，图2C展示此情况的非限制性实例。就此而言，膜支撑体的表面用惰性官能团和结合位点双官能化，所述结合位点为反应以附接示例性亲和配体蛋白质A的反应性官能团。惰性官能团可基于针对特定应用选择的亲和配体而选择；具体来说，惰性基团可基于其不与附接特定亲和配体所需的官能度反应而选择。举例来说，环氧化物环与胺官能团反应，且因此在某些实施例中可为反应性基团；然而，在反应性基团不与环氧化物反应的实施例中，则环氧化物可用作惰性基团。
如本文中所描述，胺官能团的组合可用于将生物分子配体永久地固定到膜组合物的纳米纤维的表面。另外，这些胺官能团可与离子交换官能团组合。在一个实例中，膜表面上的羟基中的一些可用3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CHPTAC)活化，导致引入季铵阳离子以进行阴离子交换分离。使用CHPTAC是特别有利的，因为其导致关于表面上的羟基的净改变为零。接着可用双-环氧乙烷(例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚)活化任何残余羟基，导致引入用于共价配体固定的环氧化物基团。最终结果为具有活性偶联官能度(亲和配体)和惰性偶联官能度两者的双官能化膜支撑体，所述活性偶联官能团和惰性偶联官能团防止结合位点处的空间位阻且减少或消除固定配体的低效使用。此双官能化膜支撑体可包括季铵离子，所述季铵离子用作强吸引中心以使生物分子配体极为接近环氧化物基团，因此其可共价固定。
在另一实例中，膜表面上的羟基中的一些可用3-氯-2-羟基丙磺酸钠盐(CHPSAS)活化，导致引入用于阳离子交换分离的磺酸基团。类似地，如前所述，结果是关于表面上的羟基的净改变为零。接着可用双-环氧乙烷(例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚)活化任何残余羟基，导致引入用于共价配体固定的环氧化物基团。最终结果为具有磺酸基团的双官能化材料，所述磺酸基团使用强吸引中心以使生物分子配体极为接近所述环氧化物基团，因此其可共价固定。因此，可受阴离子或阳离子吸引中心影响的任何配体可能潜在地得益于用双官能化表面固定。此双官能化可扩展到任何胺官能团、阳离子或阴离子基团和其组合。对此的优点在于配体密度和配体之间的间距可更具体地控制和定制。
活化剂密度
取决于应用于纳米纤维膜的化学物质的类型，可确定活化密度。活化密度是指每量的膜材料共价键合的活化剂的量。举例来说，在用环氧化物基团活化膜的情况下，活化密度可表示为每克膜材料的环氧化物基团的摩尔数。确定活化密度是重要参数，因为其给出对材料的最大可实现结合能力的指示。在施加化学物质且因此活化材料之后，理论结合能力可从不超过活化密度。归因于空间位阻和分子相互作用，效率损失总是发生在活化与偶联之间，以及偶联与静态/动态结合之间。如图2A中所展示，简化实例展现配体偶联步骤期间位点密度的此损失。由于这些复杂分子相互作用，可能需要降低或升高活化密度以便实现纳米纤维膜的总体较高结合能力。
偶联配体密度
要考虑的另一参数为固定于培养基表面上的配体的量，或更确切地说是密度。如图2B中所展示，在假设每一个蛋白质A(ProtA)分子仅有一个IgG分子结合的情况下，展示了展现配体浓度对IgG结合的影响的简化实例。应了解，与此实例相反，理论上每分子固定蛋白质A存在四个潜在IgG结合位点。然而，结合位点的有效数目可小于四个，这归因于空间和排斥相互作用可防止由于具有过度拥挤的表面而导致的IgG的接近和因此的亲和结合。尽管如此，图2B展示尽管在本实例中存在五个蛋白质A分子，且因此存在五个潜在结合位点，但仅三个IgG分子能够结合到表面。这导致培养基表面上蛋白质A利用的损失，且因此归因于蛋白质A的相对昂贵的价格，成本更高。因此，可通过改变培养基表面上的配体密度同时还维持IgG结合能力来优化蛋白质A利用的效率。
本公开的益处为其提供通过定制表面官能化以避免空间位阻和排斥相互作用来改进效率的机制。存在用于实现此的两种机制。第一，膜支撑体可用如先前所描述的双官能度表面官能化，即通过附接活性结合官能化(其结合和固定亲和配体)和惰性官能度以避免空间位阻和不必要的配体结合。第二，可定制表面官能化以包含确定长度的间隔臂以避免空间位阻。这两种机制可在同一膜支撑体上一起使用。有利的是，这些机制中的任一个或两个可用于通过定制表面官能化以减少空间位阻的几率且避免由于空间位阻而未被使用的配体的结合来增加配体结合的效率。
配体可以约10mg/g到约1000mg/g的密度存在。实施例提供可以约10mg/g到约100mg/g、约10mg/g到约200mg/g、约10mg/g到约250mg/g、约10mg/g到约300mg/g、约10mg/g到约400mg/g、约10mg/g到约500mg/g、约10mg/g到约600mg/g、约10mg/g到约700mg/g、约10mg/g到约750mg/g、约10mg/g到约800mg/g、约10mg/g到约900mg/g、约50mg/g到约100mg/g、约50mg/g到约200mg/g、约50mg/g到约250mg/g、约50mg/g到约300mg/g、约50mg/g到约400mg/g、约50mg/g到约500mg/g、约50mg/g到约600mg/g、约50mg/g到约700mg/g、约50mg/g到约750mg/g、约50mg/g到约800mg/g、约50mg/g到约900mg/g、约50mg/g到约1000mg/g、约100mg/g到约200mg/g、约100mg/g到约250mg/g、约100mg/g到约300mg/g、约100mg/g到约400mg/g、约100mg/g到约500mg/g、约100mg/g到约600mg/g、约100mg/g到约700mg/g、约100mg/g到约750mg/g、约100mg/g到约800mg/g、约100mg/g到约900mg/g、约100mg/g到约1000mg/g、约200mg/g到约250mg/g、约200mg/g到约300mg/g、约200mg/g到约400mg/g、约200mg/g到约500mg/g、约200mg/g到约600mg/g、约200mg/g到约700mg/g、约200mg/g到约750mg/g、约200mg/g到约800mg/g、约200mg/g到约900mg/g、约200mg/g到约1000mg/g、约250mg/g到约300mg/g、约250mg/g到约400mg/g、约250mg/g到约500mg/g、约250mg/g到约600mg/g、约250mg/g到约700mg/g、约250mg/g到约750mg/g、约250mg/g到约800mg/g、约250mg/g到约900mg/g、约250mg/g到约1000mg/g、约300mg/g到约400mg/g、约300mg/g到约500mg/g、约300mg/g到约600mg/g、约300mg/g到约700mg/g、约300mg/g到约750mg/g、约300mg/g到约800mg/g、约300mg/g到约900mg/g、约300mg/g到约1000mg/g、约400mg/g到约500mg/g、约400mg/g到约600mg/g、约400mg/g到约700mg/g、约400mg/g到约750mg/g、约400mg/g到约800mg/g、约400mg/g到约900mg/g、约400mg/g到约1000mg/g、约500mg/g到约600mg/g、约500mg/g到约700mg/g、约500mg/g到约750mg/g、约500mg/g到约800mg/g、约500mg/g到约900mg/g、约500mg/g到约1000mg/g、约600mg/g到约700mg/g、约600mg/g到约750mg/g、约600mg/g到约800mg/g、约600mg/g到约900mg/g、约600mg/g到约1000mg/g、约700mg/g到约750mg/g、约700mg/g到约800mg/g、约700mg/g到约900mg/g、约700mg/g到约1000mg/g、约750mg/g到约800mg/g、约750mg/g到约900mg/g、约750mg/g到约1000mg/g、约800mg/g到约900mg/g、约800mg/g到约1000mg/g或约900mg/g到约1000mg/g的密度存在的配体。实施例提供可以约10mg/g、约50mg/g、约100mg/g、约200mg/g、约250mg/g、约300mg/g、约400mg/g、约500mg/g、约600mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约900mg/g或约1000mg/g的密度存在的配体。
间隔分子(间隔臂)
增加配体固定的一个选择为通过在纳米纤维膜与亲和配体之间引入间隔分子。通过将多个间隔分子引入到膜支撑体的表面上，可减少或甚至消除基质与固定配体以及吸附物质之间的空间位阻。举例来说，蛋白质A和IgG两者都是非常大的生物分子，且因此可具有显著量的空间位阻，从而限制其在蛋白质A固定和IgG动态结合两者期间接近基质的能力。另外，高配体密度可限制吸附密度，这归因于空间位阻阻断了彼此极为接近的配体分子上的潜在活性位点。引入长间隔分子还可以间接地降低配体密度。降低来自配体和基质的空间位阻可允许在动态结合期间更容易接近IgG分子，从而导致吸附能力增加。
间隔臂的化学物质可对亲和色谱具有较大影响，这取决于支撑体、固定配体和结合目标。此影响可以是多方面的，这不仅归因于疏水性和亲水性相互作用，而且归因于来自其它侧链的特定缔合键合。图3展示引入烃间隔分子以用于用羧酸进行后续活化的实例。并入亲水性性质的间隔分子可防止支撑体、间隔、配体和目标之间的非特异性疏水性侧链键合，这促进对膜的正或负键合影响。亲水性效应可通过将电负性原子并入到间隔分子中而并入到间隔臂中，如PEG实例中所见(图4)。为了最大化亲和相对于疏水性或亲水性结合效应，应评估缓冲液离子浓度以最大化蛋白质A与IgG之间的亲和结合。
每一间隔臂具有反应性官能团或惰性官能团所在的末端。反应性官能团可反应以结合亲和配体。就此而言，亲和配体可位于末端处。间隔臂通常为碳、氧和氮原子的直链。间隔臂可包括分支链、不分支链或环状链。组合物可包括亲水性间隔臂、疏水性间隔臂或亲水性间隔臂与疏水性间隔臂的组合。优选地，间隔臂具有在1与100个原子之间、在1与90之间、在1与80之间、在1与70之间、在1与60之间、在1与50之间的长度。实施例提供具有在1与5个原子之间、在1与10个原子之间、在1与15个原子之间、在1与20个原子之间、在1与25个原子之间、在5与10个原子之间、在5与15个原子之间、在5与20个原子之间、在5与25个原子之间、在5与30个原子之间、在10与15个原子之间、在10与20个原子之间、在10与25个原子之间、在10与30个原子之间、在15与20个原子之间、在15与25个原子之间、在15与30个原子之间、在20与25个原子之间、在20与30个原子之间或在25与30个原子之间的长度的间隔臂。实施例提供具有1个原子、2个原子、3个原子、4个原子、5个原子、6个原子、7个原子、8个原子、9个原子、10个原子、11个原子、12个原子、13个原子、14个原子、15个原子、16个原子、17个原子、18个原子、19个原子、20个原子、21个原子、22个原子、23个原子、24个原子、25个原子、26个原子、27个原子、28个原子、29个原子或30个原子的长度的间隔臂。
针对特定配体应用定制所有参数
偶联化学物质、配体密度、间隔分子类型和间隔分子长度都可同时组合和优化以最大化配体利用效率以及在亲和色谱期间感兴趣目标的动态结合能力。这些参数中的每一个独立地对工艺性能具有影响，且当组合时导致吸附培养基的总体更大利用率和性能。
具有多个不同间隔分子长度的表面可具有比仅具有一种类型的间隔长度的表面更大的对感兴趣目标的动态结合能力，因为间隔开配体可能导致用于结合配体的活性位点的更大可用性。此概念的实例在图5中利用蛋白质A作为示例性配体示出。
图5展现一种可能的表面组合，其具有不同的配体密度和多个不同间隔分子长度以及具有在无间隔分子的情况下活化的一些羟基。应注意，此仅仅是在试图最大化IgG和蛋白质A的动态结合效率时可产生的许多可能的组合中的一个。举例来说，当活化膜时，可平行使用多种不同化学物质，例如NHS酯和环氧化物基团。替代地，可仅存在一种类型的活化化学物质，但具有多个不同连接子长度和类型。此的实例将用疏水性和亲水性双环氧化物间隔分子两者(以及各自具有不同间隔臂长度)活化纤维素基质上的羟基。对于这些情形中的每一个，还存在可确定以便进一步优化性能的最优配体密度。
使用膜的方法
表面官能化亲和膜可用于通过使包括感兴趣目标的样品与组合物接触以吸附感兴趣目标来从样品中分离感兴趣目标。所述方法可以进一步包括使组合物与洗脱剂接触以释放感兴趣目标且回收感兴趣目标。感兴趣目标可包含与选择的配体特异性结合的任何分子。目标分子可为蛋白质或核酸分子，包含载体、病毒载体或病毒。在一些实施例中，目标分子为免疫球蛋白，例如免疫球蛋白G(IgG)。感兴趣目标还可包含与选择的配体特异性结合的任何纳米粒子。目标纳米粒子可包含囊封纳米粒子、脂质纳米粒子、病毒样粒子和/或胞外体。
核酸可呈脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)以及类似物、衍生物或其任何组合的形式。此类衍生物可含有例如核苷酸类似物或除磷酸二酯键以外的“主链”键，例如磷酸三酯键，氨基磷酸酯键，硫代磷酸酯键或硫酯键。天然存在的RNA分子包含但不限于转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)或基因组RNA，例如来自流感或C型肝炎病毒的RNA。RNA的其它形式包含但不限于小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。核酸分子可为单链(ss；且其可为有义的或反义的)、双链(ds)或两种的组合，且可为直链或圆形的，其中后者可以是开放圆形或封闭圆形。
核酸分子可为载体。载体可为病毒载体，优选地慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、水泡性口炎病毒(VSV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、呼吸道合胞病毒载体、副流感病毒载体、泡沫病毒载体或逆转录病毒载体。
在本发明的方面中，与先前所描述的方法相比，组合物可提供目标分子的增强的结合能力，例如静态能力和动态能力。组合物可具有按质量计在约10mg/g与约200mg/g之间，优选地在约60mg/g与约100mg/g之间的静态结合能力。
实例
在以下非限制性实例中进一步例示本公开的优选实施例。应理解，这些实例虽然指示某些优选实施例，但仅借助于说明给出。根据以上论述和这些实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明的实施例做出各种改变和修改以使本发明适于不同用途和条件。因此，除了本文中所展示和描述的那些以外，根据前面的描述，本发明实施例的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
根据本文中所描述的方法生产配体官能化膜且评估各种因素。这些因素包含蛋白质A偶联、动态结合和静态结合。通过BCA或Bradford测定来评估偶联，其中将原始浓度与剩余浓度相比较以确定所结合的配体的量。
为了评估性能，使用GE Akta Pure 150。所使用的平衡缓冲液为0.1M磷酸钠pH7.0、0.1M磷酸钠pH 7.0中用于结合的1mg/ml人类IgG和用于洗脱的0.1M甘氨酸pH 2.5。为了计算IgG结合量，取洗脱峰积分且计算结合的总量。通过将样品在1mg/ml人类IgG于0.1M磷酸钠pH 7.0中的已知溶液中振荡24小时来测量静态能力，用Bradford IgG剩余对照已知标准进行。
实例1：环氧化物官能度
不具有间隔分子、表氯醇和蛋白质A的环氧化物偶联
根据以下方法使用表氯醇对杂化纤维素纳米纤维膜进行环氧化物活化：在热水浴中将15mL 1M NaOH预加热到60℃。将杂化纤维素纳米纤维膜材料(0.0255g)浸泡在先前溶液中，且将其放置在温度为60℃的空气加热的旋转振荡器上。在浸泡15分钟之后，添加1.5mL表氯醇(Epi.)，且在60℃的温度下剧烈振荡(>100rpm)反应4小时。接着用反渗透(RO)H2O洗涤膜材料足够量的时间(>30min)。基于所使用的活化剂的量来估计最大潜在环氧化物基团。
根据以下方法将环氧化物活化的纤维素纳米纤维膜材料与蛋白质A偶联：制备偶联缓冲液，且包括1M磺酸铵和0.1M碳酸钠，pH为8.75，使用HCl调节。将膜材料添加到900μL偶联缓冲液和100μL 50mg/mL蛋白质A(Repligen)中。将膜在室温下振荡(>100rpm)24小时。在偶联之后，使用使用HCl将pH调节到9的1M乙醇胺溶液阻断未反应的环氧化物基团。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific)以蛋白质A作为标准曲线测定溶液中蛋白质A的最终量。与膜材料偶联的蛋白质A的最大量被视为所添加的初始蛋白质浓度与最终蛋白质浓度之间的差。
具有间隔分子、聚(乙二醇)二缩水甘油醚(平均Mn＝500)和蛋白质A的环氧化物偶联
根据以下方法使用表氯醇对杂化纤维素纳米纤维膜进行环氧化物活化：制备15mL1M NaOH。将杂化纤维素纳米纤维膜材料(0.0264g)浸泡在先前溶液中，且将其在室温下放置于旋转振荡器上。在浸泡15分钟之后，添加187.5μL平均分子量为500的聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEG-500)，且在室温下剧烈振荡(>100rpm)反应4小时。接着用RO H2O洗涤膜材料足够量的时间(>30min)。基于所使用的活化剂的量来估计最大潜在环氧化物基团。
根据以下方法将环氧化物活化的纤维素纳米纤维膜材料与蛋白质A偶联：制备偶联缓冲液，且包括1M磺酸铵和0.1M碳酸钠，pH为8.75，使用HCl调节。将膜材料添加到900μL偶联缓冲液和100μL 50mg/mL蛋白质A(Repligen)中。将膜在室温下振荡(>100rpm)24小时。在偶联之后，使用使用HCl将pH调节到9的1M乙醇胺溶液阻断未反应的环氧化物基团。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific)以蛋白质A作为标准曲线测定溶液中蛋白质A的最终量。与膜材料偶联的蛋白质A的最大量被视为所添加的初始蛋白质浓度与最终蛋白质浓度之间的差。表1展示环氧化物-蛋白质A偶联结果的汇总。
具有间隔分子、聚(乙二醇)二缩水甘油醚(平均Mn＝2000)和蛋白质A的环氧化物偶联
根据以下方法使用表氯醇对杂化纤维素纳米纤维膜进行环氧化物活化：将0.1681g平均分子量为2000的聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEG－2000)完全溶解于15mL 1MNaOH中。将杂化纤维素纳米纤维膜材料(0.0268g)浸泡在先前溶液中，且将其放置在旋转振荡器上，且在室温下剧烈振荡(>100rpm)反应4小时。接着用RO H2O洗涤膜材料足够量的时间(>30min)。基于所使用的活化剂的量来估计最大潜在环氧化物基团。
根据以下方法将环氧化物活化的纤维素纳米纤维膜材料与蛋白质A偶联：制备偶联缓冲液，且包括1M磺酸铵和0.1M碳酸钠，pH为8.75，使用HCl调节。将膜材料添加到900μL偶联缓冲液和100μL 50mg/mL蛋白质A(Repligen)中。将膜在室温下振荡(>100rpm)24小时。在偶联之后，使用使用HCl将pH调节到9的1M乙醇胺溶液阻断未反应的环氧化物基团。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific)以蛋白质A作为标准曲线测定溶液中蛋白质A的最终量。与膜材料偶联的蛋白质A的最大量被视为所添加的初始蛋白质浓度与最终蛋白质浓度之间的差。表1展示环氧化物-蛋白质A偶联结果的汇总。
表1
Figure BDA0003873482200000171
Figure BDA0003873482200000181
根据以下方法测定蛋白质A偶联的纤维素纳米纤维膜材料的IgG静态结合能力：在pH 7下制备1mg/mL IgG于0.1M NaHPO4中的溶液。将蛋白质A偶联的纤维素纳米纤维放置于2mL先前所提及的溶液中且在旋转振荡器(>100rpm)上结合过夜。使用IgG作为标准曲线，使用Bradford蛋白质测定(SigmaAldrich)测定溶液中的IgG。结合到膜材料的IgG的最大量被视为所添加的初始IgG浓度与最终IgG浓度之间的差。根据上文先前所提及的方法测定动态结合性能。IgG与环氧化物活化的蛋白质A偶联的纤维素纳米纤维膜的静态和动态结合的结果汇总展示于下表2中。
表2
Figure BDA0003873482200000182
表1中所展示的结果展现官能团密度和间隔臂长度对可固定到基质上的蛋白质A的量具有的影响。第一行指示不具有活性结合位点的环氧化物基团，所述行采用PEG-500作为间隔臂，且第三采用PEG-2000作为较长间隔臂。实验上，添加到表面的环氧化物基团的最大潜在摩尔数随着间隔长度增加而减少，从而同时改变两个参数。尽管蛋白质A偶联的环氧化物的潜在摩尔数较少，但偶联到膜的蛋白质A的量随着间隔臂长度的增加而增加。
图6展现不同间隔分子长度对固定蛋白质A的效率具有的影响。对于静态和动态结合两者，结果展示间隔分子的长度的增加导致蛋白质A的更大利用。
表2和图7展现增加间隔分子长度对IgG的静态和动态结合能力具有的影响。结果展示，引入间隔分子将动态结合从2.60mg/mL增加到3.74mg/mL，且增加间隔分子的长度将动态结合从3.74mg/mL增加到4.29mg/mL。这些结果由以下事实支持：洗脱峰高度和积分面积随着间隔分子长度增加而相应地增加。类似地，对于静态结合，引入间隔分子将结合从6.46mg/mL增加到14.43mg/mL，且增加间隔分子的长度将结合从14.43mg/mL增加到15.81mg/mL。
实例2：NHS官能度
为了探究与纳米纤维膜的共轭，使纤维素纳米纤维与各种长度的卤代链烷酸在苛性碱溶液中反应。在此情况下，卤代链烷酸包含一氯醋酸(MCA)，溴己酸(BrHex)，溴十一烷酸(uBr)，和反应到纳米纤维表面上的那些中的每一种的三分之一的组合。将膜在0.4L/g膜的60℃1.2M NaOH中预浸泡15分钟，随后添加0.7mol/L链烷酸溶液并剧烈振荡以溶解。将反应在60℃下在振荡下再加热4小时，洗涤反应物且将其储存于RO水中。这导致通过醚键将各种链烷酸接枝到不同长度的纤维素纳米纤维上。基于20mM磷酸钠中在pH 7下的溶菌酶阳离子交换(CEX)能力表征所得膜的能力和流动条件。此外，这些与蛋白质A偶联以确定不同间隔臂长度将对IgG保持能力具有的影响。
接着使用二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、三乙胺(TEA)和乙腈活化CEX膜。首先将膜用0.3M HCl洗涤，用RO水重复冲洗，且随后使用25:75、50:50、75:25丙酮/水混合物脱水，随后用纯水洗涤两次15分钟以确保完全脱水。此后，将膜添加到每克膜(干基)167ml无水乙腈与83.5ml TEA的混合物中，且在振荡下用54g DSC/L乙腈活化。此活化进行12小时。接着将膜洗涤干净且在冰箱中在4℃下储存于异丙醇(IPA)上。为了检查活化，从IPA去除一枚硬币大小，用冰冷1mM HCl冲洗且在20mM tris缓冲液pH 9中振荡。UV 280nm用于估计每克膜材料结合的NHS的量。
为了偶联，将0.1M碳酸氢钠0.5M NaCl缓冲液盐混合到Repligen rSPA蛋白质A中以产生50mg/ml蛋白质A的pH 7.8溶液。将小试验硬币的活化膜用冰冷1mM HCl水洗涤除去IPA，然后放置于33.3ml蛋白质A溶液/克膜中，每个样品使用约0.01克膜，每个类型的膜使用3个样品。将膜在4℃下振荡12小时。之后，从溶液中去除膜，用水洗涤。这之后用20mMTris 1.0M NaCl pH 9振荡4小时以检查吸附的蛋白质A。
表3展示NHS-蛋白质A偶联结果的汇总。结果指示，对于增加的连接子长度，通过NHS化学物质附接的蛋白质A的量减少，尽管膜的活化增加(MCA为最短间隔臂长度且Ubr为最长间隔臂长度)。应注意，由于具有一定比例的短增量剂，组合样品中蛋白质A的附接量略有增加。图8中进一步例示此效应。将预期此对最终IgG结合性能具有不利影响。
表3
Figure BDA0003873482200000191
疏水性间隔臂中较长连接子长度还可以展示为影响蛋白质A与IgG结合的有效程度。图9展示较长连接子长度如何增加蛋白质A对IgG的结合效率。在连接子长度从2个碳原子变化到11个碳原子时，蛋白质A结合IgG的效率(mg/mg)对于动态结合从3.4％增加到8.3％，对于静态结合从6.3％增加到16.4％。这可归因于任何数目的因素，包含间隔臂的疏水性化学物质、结合位点的密度降低或由于连接子长度增加使结合远离支撑体基质而导致的蛋白质A-IgG结合位阻降低。
表4展示在NHS-蛋白质A偶联膜上的静态和动态IgG结合的汇总。表4和图10展现增加长度可对结合能力具有的影响。应注意，具有最长连接子的最低蛋白质A负载具有最高能力，具有78mg/g静态和40mg/g动态能力。此可能归因于配体密度效应和间隔长度两者。
表4
Figure BDA0003873482200000201
前述实例展现亲和配体可通过表面官能化而固定于膜支撑体的表面上。此外，已证实可定制间隔臂长度以避免空间位阻，且可在膜支撑体的表面上利用双官能化以改进结合效率。通过定制表面官能化，可针对特定亲和配体和其感兴趣目标达到最优条件以最大化有效配体密度、配体结合效率和避免空间位阻。虽然在前述实例中通常利用蛋白质A作为亲和配体，但本发明绝不限于蛋白质A的使用；实际上，蛋白质A的使用仅出于实例之间的一致性和演示目的。本公开中提供的教示可应用于各种亲和配体以分离各种感兴趣目标。
已如此描述了本发明，将显而易见的是，本发明可以多种方式变化。此类变化将不被视为脱离本发明的精神和范围，并且所有此类修改旨在包含在以下权利要求书的范围内。以上说明书提供了所公开的组合物和方法的制造和使用的描述。由于许多实施例可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行，因此本发明归属于权利要求书。

Claims (44)

1.一种亲和膜，其包括：
膜支撑体；其中所述膜支撑体为浇铸膜支撑体、电纺膜支撑体或其组合；
多个间隔臂，其固定于所述膜支撑体上；其中所述间隔臂各自包括末端；以及
配体，其偶联到所述末端，其中所述配体经由所述间隔臂结合到所述膜支撑体。
2.根据权利要求1所述的膜，其中所述膜支撑体包括纳米纤维、微纤维或其组合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的膜，其中所述膜支撑体为电纺膜支撑体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的膜，其中所述膜支撑体进一步包括固定于所述膜支撑体的表面上的一或多个惰性官能团。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的膜，其中所述多个间隔臂包括不同长度的间隔臂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的膜，其中所述配体经由反应的胺官能团偶联到所述间隔臂的所述末端。
7.根据权利要求1至6所述的膜，其中所述纳米纤维膜包括纤维素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的膜，其中所述纳米纤维膜包括非纤维素聚合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的膜，其中所述间隔臂为亲水性的。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的膜，其中所述间隔臂为疏水性的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述间隔臂具有1与100个原子之间的长度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的膜，其中所述间隔臂具有1与30个原子之间的长度。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述组合物进一步包括阳离子交换基团或阴离子交换基团。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的膜，其中所述配体以约10mg/g到约1000mg/g的密度存在于所述纳米纤维膜支撑体上。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的膜，其中所述配体为肽。
16.根据权利要求13所述的膜，其中所述肽为蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的膜，其中所述配体能够结合蛋白质或核酸分子。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的膜，其中所述配体能够结合DNA分子、RNA分子、载体、病毒载体、病毒或免疫球蛋白。
19.一种制备表面官能化亲和膜的方法，所述方法包括：
提供膜支撑体；其中所述膜支撑体为浇铸膜支撑体、电纺膜支撑体或其组合；
将多个间隔臂固定于所述膜支撑体上，其中所述间隔臂各自包括末端；以及
经由反应性官能团将配体偶联到所述间隔臂的所述末端。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述膜支撑体包括纳米纤维、微纤维或其组合。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述膜支撑体为电纺膜支撑体。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述膜支撑体进一步包括固定于所述膜支撑体的表面上的一或多个惰性官能团。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述多个间隔臂包括不同长度的间隔臂。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述配体经由胺反应性官能团偶联到所述间隔臂的所述末端。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述胺反应性官能团为环氧化物或环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或其组合。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述纳米纤维膜包括纤维素。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述纳米纤维膜包括非纤维素聚合物。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述间隔臂为疏水性的。
29.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述间隔臂为亲水性的。
30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中所述间隔臂具有1与100个原子之间的长度。
31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述间隔臂具有1与30个原子之间的长度。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中所述配体以约10mg/g到约1000mg/g的密度存在于纳米纤维膜上。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中所述配体为肽。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述肽为蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L。
35.根据权利要求19至34中任一项所述的方法，其中所述配体能够结合蛋白质或核酸分子。
36.根据权利要求19至35中任一项所述的方法，其中所述配体能够结合免疫球蛋白。
37.一种从样品中分离感兴趣目标的方法，其包括：
使包括所述感兴趣目标的所述样品与根据权利要求1至18中任一项所述的亲和膜接触以吸附所述感兴趣目标。
38.根据权利要求37所述的方法，其进一步包括：
使所述亲和膜与洗脱剂接触以释放所述感兴趣目标；且回收所述感兴趣目标。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述感兴趣目标为蛋白质或核酸分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述感兴趣目标为DNA分子、RNA分子、载体、病毒载体、病毒或免疫球蛋白。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述免疫球蛋白为免疫球蛋白G(IgG)。
42.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述感兴趣目标为纳米粒子、囊封纳米粒子、脂质纳米粒子、病毒样粒子或胞外体。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述样品为生物样品。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述样品为细胞培养液。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202202713D0 (en) * 2022-02-28 2022-04-13 Cytiva Bioprocess R & D Ab Method of preparing a functionalised chromatography medium
WO2023239374A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic dies with hydrophilic epichlorohydrin-amine surfaces
CN115069099B (zh) * 2022-07-04 2023-09-26 东华大学 具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用
WO2024091527A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Donaldson Company, Inc. Separation media and purification methods for carbohydrate containing molecules using the same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003290858A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 The Regents Of The University Of California Nano-porous fibers and protein membranes
JP5530633B2 (ja) 2006-01-06 2014-06-25 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよびその作成および使用法。
HUE039313T2 (hu) 2013-02-14 2018-12-28 Nanopareil Llc Elektrosztatikus szálképzéssel nyert hibrid nanoszálas nemez, eljárás annak készítésére, valamint eljárás biomolekulák tisztítására
US20170276671A1 (en) * 2015-11-18 2017-09-28 Nb Postech, Inc. Receptor linked regenerated cellulose membrane and methods for producing and using the same
ES2945064T3 (es) 2016-04-29 2023-06-28 Nanopareil Llc Membrana híbrida que comprende celulosa entrecruzada
GB201800448D0 (en) * 2018-01-11 2018-02-28 Puridify Ltd Chromatography media and methods for producing them
CN113195519A (zh) * 2018-12-12 2021-07-30 纯净逻辑有限责任公司 亲和膜及其制备方法

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