CN113195519A

CN113195519A - 亲和膜及其制备方法

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Publication number: CN113195519A
Application number: CN201980081937.7A
Authority: CN
Inventors: 周金祥; 格雷厄姆·坦普尔; 丹尼尔·海恩
Original assignee: Pure Logic Co ltd
Current assignee: Donaldson Co Inc
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2021-07-30
Also published as: CA3118156A1; US20200188859A1; JP2022512344A; EP3894428A4; EP3894428A1; US11918957B2; WO2020123714A1

Abstract

一种制备用于结合生物分子的吸附介质的方法，该方法包括将大孔载体浸入偶联试剂在溶剂溶液中的第一溶液中，用以附着偶联试剂而形成偶联基团；以及，将大孔载体浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成群组的孵育溶液中，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到大孔载体的偶联基团的至少一部分上，用以在生物靶分子暴露于大孔载体时与该生物靶分子结合。

Description

亲和膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种使用亲和分离方法纯化生物制品如蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、核苷酸、病毒载体和疫苗的膜，更具体而言，涉及一种在短停留时间内为生物制品提供高结合能力的膜以及一种制备在短停留时间内为生物制品提供高结合能力的膜的方法。

背景技术

包括单克隆抗体(monoclonal antibodies；mAbs)在内的生物制剂是许多例如癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病等慢性疾病和许多罕见疾病的治疗方案的主要组成部分。然而，生物制剂是最昂贵的药物之一。例如，最近的报告表明，单克隆抗体的研究、开发和生产成本约占药品价格的35％。随着时间的推移，药物研究变得越来越昂贵，开发一种美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物的研发成本每9年翻一番。此外，行业正朝着小批量生产的方向发展，以此作为减少由于竞争加剧而导致的市场不确定性的策略。特别是，由于竞争和新兴市场(如个性化药物和罕见病药物)，对小批量生产的需求正在增长。然而，生物制品小批量生产的单位剂量成本可能是大规模生产的10倍。能够快速有效净化生物制品的技术将有助于生产能够负担得起的药物，从而改善人类健康。

树脂基柱的一个主要缺点是结合能力随着流速的增加(停留时间缩短)而降低。由于蛋白质通过树脂小孔结构的缓慢传质，必须使用长停留时间来获得高结合能力。典型的树脂色谱产品需要6分钟或更长的停留时间来达到最佳的结合能力。如此长的停留时间导致生产率非常低，有时会导致产品降解。

例如，蛋白A配体由于其对抗体Fc区的高亲和力，在工业上被常规用作mAb捕获的平台技术。尽管强烈倾向于使用基于蛋白A的产品进行mAb纯化，但主要的蛋白A树脂色谱产品在6分钟停留时间内的结合能力为60-80mg mAb/mL。在1至2分钟的停留时间内，它们的结合能力将降至18-30mg/mL。因此，目前市场上没有(或已知正在开发中的)蛋白A色谱产品在6秒或更短的停留时间下具有>40mg/mL的结合能力。同样，对于其他生物制品，如质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质和内毒素，也无可用的高产亲和色谱产品。

膜色谱解决了这个问题，并提供了一种替代树脂基色谱的方法。具有大的通流孔的吸附膜的停留时间短，但是结合能力低。由于表面积高，现有的多孔水凝胶膜的静态结合能改善。然而，它们的小筛孔尺寸导致大分子可及性较差，这导致在短停留时间(<60秒)时结合能力降低。由与短停留时间相关的流速增加所导致的高背压(>3巴)是与多孔水凝胶膜相关的另一个问题。因此，对于在短停留时间内具有高结合能力的亲和柱，仍然存在技术差距。这样的发明将使得下游生物制品纯化生产率的经济增长。

除了需要使用较长的停留时间外，传统树脂基柱的小孔结构进一步限制了其在大型生物制品纯化中的应用。特别是，随着基因和细胞治疗业的发展，对大型生物制品的高效纯化的需求迅速增长。这类生物制品的实例包括质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒以及一些天然和重组蛋白质。这些生物制品接近或大于树脂珠的孔隙。对于这些较大的生物制品，树脂基柱的结合能力通常即使在长停留时间下也较低。树脂基色谱柱也很容易堵塞或结垢。大孔结构的膜色谱产品可解决这个问题。然而，目前没有亲和膜色谱产品可用于这类应用。

因此，本发明的目的是提供一种膜和制备亲和膜的方法，以快速有效地纯化生物制品，例如抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品，特别是单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供用于预填充色谱柱的膜，所述膜具有短停留时间和高结合能力，用于在低背压下的抗体捕获步骤纯化。

本发明的又一目的是提供一种在短停留时间和低背压下具有高结合能力的蛋白A膜。

发明内容

根据本发明，上述目的是通过提供一种制备用于结合生物分子的膜的方法来实现的，所述方法包括以下步骤：将膜浸入偶联试剂在第一溶胀溶剂溶液中的第一溶液中，以溶胀所述膜并增加所述膜上的反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团；将所述膜浸入在第二溶胀溶剂溶液中的包括吸附基团的第二溶液中，以使所述偶联基团中的至少一部分与所述吸附基团反应，提供用以将选自由配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶所组成的群组中的至少一种偶联至所述偶联基团的浓度效应；以及，将所述膜浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成群组的孵育溶液中，以将配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述膜的所述偶联基团中的至少一部分上，以用于在所述生物靶分子暴露于所述膜时与所述生物靶分子结合。

在另一有利的实施例中，所述膜为比表面积约为0.1-20m^2/mL的再生纤维素膜；其中配体为蛋白A；其中所述膜在小于3巴的背压下停留时间为约6秒时，具有在约20-90mg之间的人免疫球蛋白G/mL膜的动态蛋白质结合能力；以及，其中所述膜具有大于60mg人免疫球蛋白G/mL膜的静态蛋白质结合能力。

在另一有利的实施例中，所述第一溶胀溶剂溶液和第二溶胀溶剂溶液包括选自由二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)、其中DMSO含量大于70体积％的DMSO与其他溶剂的混合物、有机溶剂、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜、以及它们的组合所组成的群组的至少一种溶胀溶剂。

在另一有利的实施例中，所述偶联试剂选自由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(N,N’-disuccinimidyl carbonate；DSC)、1,1’-羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiimidazole；CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide；DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride；EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐以及它们的组合所组成的群组。

在另一有利的实施例中，所述第二溶液的所述吸附基团选自由含叔胺的基团、包括带负电荷部分、带正电荷部分、促进疏水、亲水和π-π堆叠相互作用的部分的官能基团、以及它们的组合所组成的群组。。

在另一有利的实施例中，所述第一溶胀溶剂溶液和第二溶胀溶剂溶液由二甲基亚砜(DMSO)组成，所述偶联试剂由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)组成，所述吸附基团由N,N’-二甲基乙二胺(N,N’-dimethylethylenediamine；DMEDA)组成，所述孵育溶液包括蛋白A溶液，并且所述蛋白A溶液的蛋白A浓度为10mg/mL或更低。

根据本发明，上述目的进一步通过提供一种制备用于结合生物分子的吸附介质的方法来实现，所述方法包括以下步骤：提供大孔载体；将所述大孔载体浸入偶联试剂在溶剂溶液中的第一溶液，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团；将所述大孔载体浸入包括有机溶剂和靶结合溶液的孵育溶液中，所述孵育溶液对生物靶分子具有亲和力且选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成的群组，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述大孔载体的所述偶联基团中的至少一部分上，用以在所述生物靶分子暴露于所述大孔载体时与其结合。

在另一有利的实施例中，所述大孔载体选自由聚烯烃膜、聚醚砜膜、聚四氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维膜、水凝胶膜、水凝胶整料、聚乙烯醇膜、天然聚合物膜、纤维素酯膜、醋酸纤维素膜、再生纤维素膜、纤维素纳米纤维膜、纤维素整料、滤纸膜以及含有大量纤维素或其衍生物的大孔支承膜、以及它们的组合所组成的群组。

在另一有利的实施例中，在亲和吸附介质制备过程中的任何步骤之前或之后，将所述大孔载体浸入溶胀溶剂溶液中以溶胀所述大孔载体并增加反应位点、偶联基团和配体位点中的至少一种的暴露。

在另一有利的实施例中，所述溶胀溶剂溶液包括选自由二甲基亚砜(DMSO)、其中DMSO含量大于70体积％的DMSO与其他溶剂的混合物、有机溶剂、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜、以及它们的组合所组成的群组的至少一种溶胀溶剂。

在另一有利的实施例中，所述大孔载体为比表面积约为0.1-20m^2/mL的再生纤维素膜；其中所述配体为蛋白A；其中所述大孔载体在小于3巴的背压下停留时间为约6秒时，具有在约20-90mg之间的人免疫球蛋白G/mL膜的动态蛋白质结合能力；并且，其中所述大孔载体具有大于60mg人免疫球蛋白G/mL膜的静态蛋白质结合能力。

在另一有利的实施例中，所述偶联试剂选由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐、以及它们的组合所组成的群组。

在另一有利的实施例中，所述有机溶剂选自由水混溶性醇、酮、醚、酰胺、以及它们的组合所组成的群组，以促进所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种与所述大孔载体的偶联。

在另一有利的实施例中，所述有机溶剂选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(tetrahydrofuran；THF)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide；DMF)和二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组。

在另一有利的实施例中，所述第一溶液由二甲基亚砜(DMSO)组成；所述偶联试剂由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)组成；所述孵育溶液包括至少一种选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组的有机溶剂，所述孵育溶液包括蛋白A溶液；并且，所述蛋白A溶液的蛋白A浓度为10mg/mL或更低。

在另一有利的实施例中，所述孵育溶液中所述有机溶剂的量实质上接近但不显著大于所述配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液的浊点。

根据本发明，上述目的进一步通过提供一种制备用于结合生物分子的吸附介质的方法来实现，所述方法包括以下步骤：将膜浸入偶联试剂在溶胀溶剂溶液中的第一溶液中，以溶胀所述膜并增加所述膜上反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团，所述偶联试剂选自由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐、以及它们的组合所组成的群组；将所述膜浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成群组的孵育溶液中，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述膜的所述偶联基团中的至少一部分上，以用于在所述生物靶分子暴露于所述膜时与所述生物靶分子结合。

在另一有利的实施例中，所述孵育溶液包括选自由磷酸钠、硫酸钠或硫酸铵以及它们的组合所组成的群组的亲液盐，以促进所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一者与所述膜的偶联。

在另一有利的实施例中，所述孵育溶液包括选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组的有机溶剂。

附图说明

下文将描述设计用以实现本发明的系统以及本发明的其他特征。通过阅读以下说明书并参考构成说明书一部分的附图，将更容易理解本发明，其中示出了本发明的实例，且其中：

图1显示了根据本发明通过与DSC反应、用DMEDA部分取代以及蛋白A的固定化来合成蛋白A膜；

图2显示了根据本发明在膜表面的蛋白A的局部浓度以及在膜上的固定；

图3显示了根据本发明用DSC直接修饰纤维素膜，随后在高浓度溶液中固定蛋白A；

图4显示了根据本发明用DSC直接修饰纤维素膜，随后在含有有机溶剂的低浓度溶液中固定蛋白A；

图5显示了根据本发明用DSC直接修饰纤维素膜，随后在含有亲液盐的低浓度溶液中固定蛋白A；

图6显示了根据本发明使用方法1制备的蛋白A膜的静态结合能力；

图7显示了根据本发明使用方法1至方法4制备的蛋白A膜的静态结合能力比较；

图8显示了根据本发明在表面活化步骤中使用不同有机溶剂制备的蛋白A膜的静态结合能力；

图9显示了根据本发明使用方法2在表面活化步骤期间用DMSO/乙腈混合溶剂制备的蛋白A膜的静态结合能力；

图10显示了根据本发明使用方法3在表面活化步骤期间用DMSO/乙腈混合溶剂制备的蛋白A膜的静态结合能力；

图11显示了根据本发明使用方法3在表面活化步骤期间用DMSO/乙腈混合溶剂制备的伴刀豆球蛋白A膜的静态结合能力；

图12显示了根据本发明使用方法2时，静态结合能力随蛋白A浓度的增加的变化；

图13显示了根据本发明使用方法4时，静态结合能力随1-16.6mg/mL蛋白A浓度的变化；

图14显示了根据本发明使用方法3使用不同的偶联试剂和有机溶剂制备的蛋白A膜的静态结合能力；

图15显示了根据本发明使用环氧氯丙烷制备并使用方法3和方法4进一步修饰的蛋白A膜的静态结合能力；

图16显示了根据本发明方法5中描述的用额外DMSO浸泡的蛋白A膜的静态结合能力；

图17显示了根据本发明方法3中使用不同量的乙醇的伴刀豆球蛋白A膜的静态结合能力；

图18显示了根据本发明使用方法1的蛋白A膜的动态结合能力；

图19显示了根据本发明使用方法2的蛋白A膜的动态结合能力；

图20显示了根据本发明使用方法3的蛋白A膜的动态结合能力；

图21显示了根据本发明使用方法3的蛋白A膜的动态结合能力；

图22显示了根据本发明的膜与其他商业膜产品的比较；以及，

图23显示了根据本发明的膜与商业树脂产品的比较。

本领域技术人员将理解，本发明的一个或多个方面可满足某些目标，而一个或多个其他方面可满足某些其他目标。每个目标可能不会在其所有方面均等地适用于本发明的每个方面。因此，前述目的可从相对于本发明的任何一个方面的替代方面来看。当结合附图和实例阅读以下详细说明时，本发明的这些和其他目的和特征将变得更加明显。然而，应当理解，本发明的前述发明内容和以下具体实施方式均是优选实施例性质，而不是对本发明或本发明的其他替代实施例实施限制。具体而言，尽管本发明在此参照多个具体实施例进行了描述，但是应当理解，所述描述是对本发明的举例说明，而不是对本发明的限制。在不脱离权利要求书所述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可想到各种修改和应用。同样，本发明的其他目的、特征、益处和优点将从本述和下面描述的某些实施例中变得显而易见，并且对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些目的、特征、益处和优点将从上文结合所附的实例、数据、图和从中得出的所有合理的推论，单独地或结合本文引用的参考文献而变得显而易见。

具体实施方式

参考附图，现在将更详细地描述本发明。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前公开的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的方法、装置和材料相似或等同的任何方法、装置和材料可用于当前公开的主题的实践或测试，但本文描述了代表性的方法、装置和材料。

除非特别说明，否则本文件中使用的术语和短语及其变体，除非另有明确说明，应被解释为开放式而非限制性的。同样，用连词“和(and)”连接的一组项目不应理解为要求这些项目中的每一个都存在于所述分组中，而是应理解为“和/或”，除非另有明确说明。类似地，用连词“或(or)”连接的一组项目不应被理解为要求在所述组中的相互排他性，而是也应被理解为“和/或”，除非另有明确说明。

此外，尽管本公开的项目、元件或组件可以单数形式描述或要求保护，但是除非明确说明限制为单数形式，否则复数形式也在本公开的范围内。在某些情况下，例如“一个或多个(one or more)”、“至少(at least)”、“但不限于(but not limited to)”或其他类似短语的扩大单词和短语的存在不应被理解为意味着在这些扩大短语可能不存在的情况下，意欲表示或需要更为缩小的情况。

本发明包括亲和膜，其能够实现快速捕获步骤纯化蛋白质，例如单克隆抗体(mAbs)、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质和内毒素或其他靶生物制品。它提供了比现有树脂产品，如蛋白A色谱柱更高的生产率。在制备蛋白A亲和膜的一个实施例中，根据本文所述方法制备的膜在停留时间为6秒或更短、背压<3巴时能够提供60-100mg的人免疫球蛋白G/mL的静态蛋白质结合能力以及20-90mg的人免疫球蛋白G/mL的动态蛋白质结合能力。

蛋白A柱以结合-洗脱模式运行。过程生产率可用下面的等式来定义。在分母中，Vtot是包括装载、冲洗、洗脱和再生步骤的整个过程中通过柱的溶液总体积。BV是蛋白A介质床体积，τ是停留时间。装载体积与蛋白A介质的动态结合能力成正比。因此，过程生产率随着结合能力的增加和停留时间的减少而增加。

市场领先的树脂柱产品在360秒的停留时间下运行，其动态结合能力为80mg/mL。对于达到相同产品产率的具有相同动态结合能力的两种介质，负荷生产率的比率可通过停留时间的反比来估计。因此，与停留时间≤6秒下具有60mg/mL动态结合能力的本发明膜相比，本文所述膜的负载生产率可为用于捕获和纯化单克隆抗体的领先树脂柱产品的45倍(＝60/80×360s/6s)。目前没有树脂或膜产品接近本发明所达到的生产率水平。

根据本发明，制备用于亲和分离程序的膜涉及不同的生产方法。在一个实施例中，使用这些方法制备的亲和膜基于其在短停留时间内对蛋白质如抗体(包括单克隆抗体(mAbs))的优异结合能力而与竞争技术区分开来。在本文所述的示例性实施例中，本发明涉及使用配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或酶，例如寡脱氧胸苷、蛋白A、伴刀豆球蛋白A、胰蛋白酶、蛋白酶或核酸内切酶，它们与膜化学偶联；并且，在蛋白A的情况下，在停留时间为6秒或更短以及背压<3巴下，提供60-100mg的人免疫球蛋白G/mL的静态蛋白质结合能力以及20-90mg的人免疫球蛋白G/mL的动态蛋白质结合能力。在一个应用中，所述膜通过结合和洗脱操作用于蛋白质的捕获步骤纯化。

膜制备方法1：此方法涉及制备用于结合生物制品的膜，包括以下步骤：1)将膜浸入由溶胀溶剂中的偶联试剂组成的第一溶液中，以溶胀所述膜并增加所述膜上反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂；2)将所述膜浸入在第二溶胀溶剂溶液中的含有吸附基团的第二溶液中，以使所述偶联基团中的至少一部分与吸附基团反应，为将配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的至少一种偶联至所述偶联基团提供浓缩效果；以及，3)将所述膜浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成的孵育溶液中，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽和酶中的一种偶联到所述膜的所述偶联基团中的至少一部分上，以用于在所述生物靶分子暴露于所述膜时与所述生物靶分子结合。制备蛋白A亲和膜的此实施例能够提供一种膜，所述膜能够具有大于60mg的人免疫球蛋白G/mL的高静态蛋白质结合能力。

参考图1和图2，在一个实施例中，本发明包括通过协同使用溶胀膜的溶剂、预固定偶联及吸附基团来制备掺入配体的膜。在一些实施例中，膜选自包括但不限于下列的群组：诸如聚烯烃膜、聚醚砜膜、聚(四氟乙烯)膜、尼龙膜、玻璃纤维膜、水凝胶膜、水凝胶整料、聚乙烯醇膜等材料；天然聚合物，例如纤维素或其衍生物，包括但不限于纤维素酯膜、醋酸纤维素膜、再生纤维素膜、纤维素纳米纤维膜、纤维素整料、或滤纸；或含有大量纤维素或其衍生物的大孔载体。在一些实施例中，溶胀溶剂选自包括但不限于下列化学物质的群组：例如有机溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜或其混合物。在下面的详细实施例中，膜包括再生纤维素(regenerated cellulose；RC)，且溶胀溶剂是DMSO。然而，所述膜可由稳定再生纤维素或其他纤维素基膜组成，这些膜结合有本文详述的蛋白A配体，但所述方法不限于这种膜化学，如本领域技术人员所理解的。

在一个实施例中，使用的膜具有以下孔径：约0.1μm至10.0μm、0.1μm至0.2μm、0.1μm至0.45μm、0.1μm至1μm、0.1μm至2μm、0.2至0.45、0.2至1μm、0.2至2μm、0.2至10μm、0.45μm至1μm、0.45μm至2μm、0.45μm至10μm、1μm至2μm、或1μm至5μm，具有以下厚度：>500μm、>250μm、>100μm、>80μm、>50μm、>30μm、30μm至500μm、50μm至500μm、80μm至500μm、100μm至500μm、250μm至500μm、30μm至250μm、50μm至250μm、80μm至250μm、100μm至2500μm、30μm至100μm、50μm至100μm、80μm至100μm。根据本发明，测试孔径为1μm、0.45μm和0.2μm的膜，并在<3的巴背压下达成<6秒的停留时间。膜可为大孔的或基于纤维的。膜可堆叠成多层排列，以增加给定应用的结合能力。在一个实施例中，膜的堆叠排列约为以下厚度：70μm至10,000μm、>10,000μm、>7,500μm、>5,000μm、>2,500μm、>1,000μm、>900μm、>800μm、>700μm、>600μm、>500μm、>400μm、>300μm、>200μm、>100μm、>70μm、70μm至100μm、70μm至200μm、70μm至300μm、70μm至400μm、70μm至500μm、70μm至750μm、70μm至1,000μm、70μm至2,000μm、70μm至3,000μm、70μm至4,000μm、70μm至5,000μm、250μm至300μm、250μm至400μm、250μm至500μm、250μm至750μm、250μm至1,000μm、250至2,000μm、250至3,000μm、250至4,000μm、250至5,000μm、500μm至1,000μm、500至2,000μm、500至3,000μm、500至4,000μm、500至5,000μm。优选地，膜是再生纤维素膜，其孔径在0.2μm与5.0μm之间，厚度在70μm与2,000μm之间，呈约为70至10,000μm高的堆叠排列。

步骤1：在高度溶胀的溶剂中活化膜表面：

在示例性实施例的第一步骤中，将再生纤维素膜浸泡在N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、三乙胺(TEA)和二甲基亚砜(DMSO)的混合物中。DMSO是优选的溶胀溶剂，也可使用其他溶胀溶剂，如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)。如图1所示，再生纤维素支撑膜上的羟基与DSC反应生成氨基反应性碳酸酯中间体(-NHS)。在表面活化阶段使用DMSO作为优选溶剂制备的膜比使用其他有机溶剂制备的膜具有明显更高的结合能力。溶胀溶剂增加了可用于DSC反应的羟基，从而增加了后续蛋白质配体偶联的位点。在纤维素的其他溶剂的情况下，发生较少的溶胀，并且表面积和蛋白质配体偶联位点较低。

在此示例性实施例中，第一步骤的过程可通过使用在DMSO、乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、环丁砜或任何其他溶胀膜的溶剂/溶液中的0.1-120mg/mL的DSC和5-100μL/mL的三乙胺(TEA)，在约10-60℃的温度下进行约1-1,800分钟。例如，将一个直径为47mm、厚度为70μm的膜在40℃下在溶于10mL DMSO中的300mg DSC、139μL TEA中浸泡16小时。

根据膜材料的不同，溶剂会产生不同程度的溶胀。因此，应该选择产生高度溶胀的溶剂。对于纤维素基膜，DMSO是优选的溶剂，无论是单独使用还是与包括水在内的其他溶剂结合使用。然而，用于纤维素基膜的其他溶剂包括但不限于其他有机溶剂，例如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜或其混合物。

除了DSC之外，可使用的合适的偶联试剂包括但不限于1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐或其混合物。

步骤2：用吸附基团修饰活化表面的一部分：

在一个示例性实施例中，如图1所示的第二步骤，将步骤1的DSC活化膜浸入在二甲基亚砜(DMSO)溶剂中的N,N-二甲基乙二胺(DMEDA)溶液中，以用含有叔胺基团的配体取代一部分偶联基团。DMEDA吸附蛋白A配体(见图2)，这有助于在较低浓度的溶液中蛋白A配体与膜的偶联。在此示例性实施例中，第二步骤的过程可通过使用约1-100μL/mL、<100μL/mL、<75μL/mL、<50μL/mL、<20μL/mL、<10μL/mL、1至10μL/mL、1至20μL/mL、1至50μL/mL、1至75μL/mL、1至100μL/mL、10至20μL/mL、10至50μL/mL、10至75μL/mL、10至100μL/mL、20至50μL/mL、20至75μL/mL、20至100μL/mL、50至75μL/mL、50至100μL/mL的在DMSO、其他有机溶剂如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、环丁砜或任何其他使膜溶胀的溶剂/溶液中的DMEDA，在约10-60℃下进行约1分钟至24小时。例如，将膜室温下置于在DMSO中的15μL/mL DMEDA的溶液中30分钟。

除了含叔胺的基团之外，合适的吸附基团包括官能基团，所述官能基团可包括但不限于负电荷部分、正电荷部分、促进疏水、亲水或π-π堆叠相互作用的部分或其混合体，这取决于待偶联的配体。

步骤3：配体偶联，在一个实施例中，配体是蛋白A：

在一个示例性实施例中，如图1所示的第三步骤，将DMEDA/DSC修饰的膜在蛋白A溶液中孵育。在此步骤中，DMEDA基团能够通过蛋白质物理吸附来提高蛋白质偶联效率。由于浓缩效应，在此步骤中，掺入DMEDA基团使得能够使用低蛋白A浓度(约0.5-5mg/mL)，如图2所示。虽然图示的实施例是针对蛋白A溶液描述的，但是对于给定的靶，包括但不限于抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品，可使用其他配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液。例如，蛋白A溶液可用于靶向免疫球蛋白G，寡核苷酸溶液可用于靶向质粒DNA或信使RNA，伴刀豆球蛋白A溶液可用于靶向糖蛋白。

在此示例性实施例中，第三步骤的过程可通过使用0.1至20mg/mL、<0.1mg/mL、<0.5mg/mL、<0.75mg/mL、<1mg/mL、<2.5mg/mL、<5mg/mL、<10mg/mL、<20mg/mL、<45mg/mL、0.1至0.5mg/mL、0.1至0.75mg/mL、0.1至1mg/mL、0.1至2.5mg/mL、0.1至5mg/mL、0.1至10mg/mL、0.1至20mg/mL、0.1至45mg/mL、0.5至0.75mg/mL、0.5至1mg/mL、0.5至2.5mg/mL、0.5至5mg/mL、0.5至10mg/mL、0.5至20mg/mL、0.5至45mg/mL、0.75至1mg/mL、0.75至2.5mg/mL、0.75至5mg/mL、0.75至10mg/mL、0.75至20mg/mL、0.75至45mg/mL、1至2.5mg/mL、1至5mg/mL、1至10mg/mL、1至20mg/mL、1至45mg/mL、2.5至5mg/mL、2.5至10mg/mL、2.5至20mg/mL、2.5至45mg/mL、5至10mg/mL、5至20mg/mL、5至45mg/mL、10至20mg/mL、10至45mg/mL、20至45mg/mL的蛋白A浓度，使用pH值为7的约0.01-1M三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)、磷酸盐或碳酸盐缓冲液构成的缓冲液，在0-45℃的温度下进行约1分钟至24小时的任何时间。例如，将膜在室温下置于蛋白A浓度为5mg/mL、含pH值为7.0的20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液的蛋白A溶液中16小时。

在示例性实施例的第三步骤中与膜偶联的蛋白A配体包括可结合抗体(包括mAbs)的位点。在一个实施例中，使用方法1制备的四层70μm厚的膜堆叠在注射器式滤器样柱中。这种排列在停留时间≤6秒且背压<3巴下，产生在约20-90mg之间的人免疫球蛋白G/mL的目标生物结合能力。膜色谱的一个广为人知的优点是它不像树脂或凝胶色谱那样受到扩散传质的限制。因此，大孔吸附膜的动态结合能力在很宽的停留时间范围内对流速的依赖性较小。在蛋白质吸附的特征时间大于流过色谱柱的停留时间的足够短的停留时间方面是有限度的。然而，只要目标生物反应速率与传质的对流速率相比足够快，那么动态结合能力将不太受停留时间的影响。

膜制备方法2：此方法涉及制备用于结合生物制品的膜，包括以下步骤：1)将膜浸入由在溶胀溶剂中的偶联试剂组成的溶液中，以溶胀所述膜，并增加所述膜上反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂；以及，2)在选自由配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶组成的群组的溶液中孵育所述膜，其中所述溶液具有高浓度的配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶，用于与膜偶联。在制备蛋白A亲和膜的一个实施例中，蛋白A配体溶液的浓度至少为30mg/mL。

方法1能够在与膜偶联期间使用低配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液浓度实现高结合能力，而方法2聚焦于高配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液浓度。参考图3，通过例如用DSC对膜进行直接修饰，然后进行配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶偶联，而没有DMEDA吸附基团步骤(步骤2，上述方法1)，也可在短停留时间和低背压下实现相同的高结合能力。然而，需要使用高配体、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或酶的溶液浓度(例如，对于蛋白A，约>30mg/mL、>45mg/mL、>75mg/mL、>100mg/mL、125mg/mL、>150mg/mL、>175mg/mL、30至45mg/mL、30至100mg/mL、30至125mg/mL、30至150mg/mL、30至200mg/mL、45至100mg/mL、45至125mg/mL、45至150mg/mL、45至200mg/mL、75至100mg/mL、75至125mg/mL、75至150mg/mL、75至200mg/mL、100至125mg/mL、100至150mg/mL、100至200mg/mL、125至150mg/mL、125至200mg/mL、150至200mg/mL)。在一个实施例中，选择蛋白A浓度>80mg/mL。

步骤1：在高度溶胀的溶剂中活化膜表面：

在一个示例性实施例中，在第一步骤中，将再生纤维素膜浸泡在N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、三乙胺(TEA)与二甲基亚砜(DMSO)的混合物中。DMSO是优选的溶胀溶剂，也可使用其他溶胀溶剂，如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)。如图8所示，当使用方法2制备时，用DMSO、乙腈、DMF、THF作为溶胀溶剂制备的膜具有90、50、51、50mg的人免疫球蛋白G/mL的静态结合能力。再生纤维素支撑膜上的羟基与DSC反应，形成氨基反应性碳酸酯中间体(-NHS)。在表面活化阶段使用DMSO作为优选溶剂制备的膜比使用其他有机溶剂制备的膜具有显著更高的结合能力。溶胀溶剂增加了可用于DSC反应的羟基，从而增加了后续蛋白质配体偶联的位点。在纤维素的其他溶剂的情况下，发生较少的溶胀，并且表面积和蛋白质配体偶联位点较低。

在一个示例性实施例中，第一步骤的过程可通过使用在DMSO、其他有机溶剂如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、环丁砜或任何其他溶胀膜的溶剂/溶液中的0.1-120mg/mL DSC和5-100μL/mL三乙胺(TEA)，在约10-60℃的温度下进行约1-1,800分钟。例如，将一个直径为47mm、厚度为70μm的膜在40℃下在溶于10mL DMSO中的300mg DSC、139μL TEA中浸泡16小时。

根据膜材料的不同，溶剂会产生不同程度的溶胀。因此，应该选择产生高度溶胀的溶剂。关于纤维素基膜，DMSO是优选的溶剂，无论是单独使用还是与包括水在内的其他溶剂结合使用。然而，用于纤维素基膜的其他溶剂包括但不限于有机溶剂，例如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜或其混合物。

步骤2：使用高亲和配体浓度进行配体偶联，在一个实施例中，配体为蛋白A：

在一个示例性实施例中，在此第二步骤中，直接在蛋白A溶液中孵育DSC修饰的膜，跳过上述方法1中的步骤2。然而，这需要高的配体浓度，例如，蛋白A溶液浓度>45mg/mL，如此处所详述。

在一个示例性实施例中，第二步骤的过程可通过使用约>30mg/mL、>45mg/mL、>75mg/mL、>100mg/mL、125mg/mL、>150mg/mL、>175mg/mL、30至45mg/mL、30至100mg/mL、30至125mg/mL、30至150mg/mL、30至200mg/mL、45至100mg/mL、45至125mg/mL、45至150mg/mL、45至200mg/mL、75至100mg/mL、75至125mg/mL、75至150mg/mL、75至200mg/mL、100至125mg/mL、100至150mg/mL、100至200mg/mL、125至150mg/mL、125至200mg/mL、150至200mg/mL的浓度，pH值为约6.0至10的0.01-1M三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐或碳酸盐缓冲液的缓冲液浓度，在约0-45℃的温度下进行约1分钟至48小时。例如，将膜在室温下置于蛋白A浓度为约45-160mg/mL、含pH值为8.0的约20-200mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液的蛋白A溶液中16小时。虽然图示的实施例是针对蛋白A溶液描述的，但是配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液可用于给定的靶，包括但不限于抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品。例如，蛋白A溶液可用于靶向免疫球蛋白G，寡核苷酸溶液可用于靶向质粒DNA或信使RNA，伴刀豆球蛋白A溶液可用于靶向糖蛋白。

膜制备方法3：此方法涉及制备用于结合生物制品的膜，包括以下步骤：1)将膜浸入由在溶胀溶剂中的偶联试剂组成的溶液中，以溶胀所述膜，并增加所述膜上反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂；以及，2)在含有有机溶剂和选自由配体、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶组成的群组的靶结合溶液的溶液中孵育所述膜，以将所述配体、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到膜上。在制备蛋白A亲和膜的一个实施例中，蛋白A溶液的浓度不大于10mg/mL。

方法1能够在配体偶联过程中使用低配体溶液浓度(<5mg/mL)实现高结合能力。方法2能够实现高结合能力，但在配体偶联过程中需要高配体浓度(步骤2)。参考图4，方法3利用水混溶性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)和任何其他水混溶性有机溶剂如其他醇、酮、醚、酰胺以及它们的组合作为固定化溶液的组分，以提高亲和配体偶联效率，这使得能够在偶联溶液中使用低配体浓度。方法3利用增加比例的有机溶剂(20-80体积％，取决于所用的有机溶剂)使溶液接近浊点，浊点是蛋白质溶液在增加有机溶剂浓度时开始出现混浊的点。在方法3中，有机溶液代替蛋白质溶剂化外壳中的水分子，这可促进配体与膜之间更大的相互作用。超出浊点添加的额外的有机溶液会加剧配体的聚集和絮凝动力学，这会相对降低偶联反应的效率。

步骤1：在高度溶胀的溶剂中活化膜表面：

在一个示例性实施例中，在第一步骤中，将再生纤维素膜浸泡在N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、三乙胺(TEA)和二甲基亚砜(DMSO)的混合物中。DMSO是优选的溶胀溶剂，也可使用其他溶胀溶剂，如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)。再生纤维素支撑膜上的羟基与DSC反应，形成氨基反应性碳酸酯中间体(-NHS)。在表面活化阶段使用DMSO作为优选溶剂制备的膜比使用其他有机溶剂制备的膜具有明显更高的结合能力。溶胀溶剂增加了可用于DSC反应的羟基，从而增加了后续蛋白质配体偶联的位点。在纤维素的其他溶剂的情况下，发生较少的溶胀，并且表面积和蛋白质配体偶联位点较低。

在此示例性实施例中，第一步骤的过程可通过使用在DMSO、其他有机溶剂如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、环丁砜或任何其他溶胀膜的溶剂/溶液中的0.1-120mg/mL DSC和5-100μL/mL三乙胺(TEA)，在约10-60℃的温度下进行约1-1,800分钟。例如，将一个直径为47mm、厚度为70μm的膜在40℃下在溶于10mL DMSO中的300mgDSC、139μL TEA中浸泡16小时。

根据膜材料的不同，溶剂会产生不同程度的溶胀。因此，应该选择产生高度溶胀的溶剂。关于纤维素基膜，DMSO是优选的溶剂，无论是单独使用还是与包括水在内的其他溶剂结合使用。然而，用于纤维素基膜的其他溶剂包括但不限于其他有机溶剂，例如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜或其混合物。

除了DSC之外，可使用的合适的偶联试剂包括但不限于1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐或其混合物。

步骤2：使用低配体浓度进行配体偶联，在一个实施例中，配体是蛋白A：

在一个示例性实施例中，在此第二步骤中，将经DSC、甲苯磺酰氯或环氧氯丙烷修饰的膜直接在含有有机溶剂的低浓度蛋白A溶液中孵育，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮。

在一个示例性实施例中，第二步骤的过程可通过使用约0.1至20mg/mL、<0.1mg/mL、<0.5mg/mL、<0.75mg/mL、<1mg/mL、<2.5mg/mL、<5mg/mL、<10mg/mL、<20mg/mL、<45mg/mL、0.1至0.5mg/mL、0.1至0.75mg/mL、0.1至1mg/mL、0.1至2.5mg/mL、0.1至5mg/mL、0.1至10mg/mL、0.1至20mg/mL、0.1至45mg/mL、0.5至0.75mg/mL、0.5至1mg/mL、0.5至2.5mg/mL、0.5至5mg/mL、0.5至10mg/mL、0.5至20mg/mL、0.5至45mg/mL、0.75至1mg/mL、0.75至2.5mg/mL、0.75至5mg/mL、0.75至10mg/mL、0.75至20mg/mL、0.75至45mg/mL、1至2.5mg/mL、1至5mg/mL、1至10mg/mL、1至20mg/mL、1至45mg/mL、2.5至5mg/mL、2.5至10mg/mL、2.5至20mg/mL、2.5至45mg/mL、5至10mg/mL、5至20mg/mL、5至45mg/mL、10至20mg/mL、10至45mg/mL、20至45mg/mL的亲和抗体浓度，pH值在约6.0-10.0之间的与大量有机溶剂混合的0.01-1M三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐或碳酸盐缓冲液的缓冲液浓度，在0-45℃的温度下进行约1分钟至48小时。例如，将膜在室温下置于蛋白A浓度为约0.1-20mg/mL、含pH值为8.0的约20-200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的蛋白A溶液中16小时。然而，可使用更高浓度的蛋白A(20至175mg/mL)。有机溶剂的体积分数为1％-99％，具体数值根据使溶液接近浊点的需要来确定，浊点是蛋白质溶液在增加有机溶剂浓度时开始出现混浊的点。适用于本发明的有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)。

本领域技术人员可理解，最佳比例取决于配体和有机溶剂。此外，当使用遇水不稳定的连接体时，这种方法还有额外的优点，因为有机溶剂的加入相对于胺偶联反应速率降低了水解速率，提高了偶联效率。虽然图示的实施例是针对蛋白A溶液进行描述的，但是其他配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液可用于给定的靶，包括但不限于抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品。例如，蛋白A溶液可用于靶向免疫球蛋白G，寡核苷酸溶液可用于靶向质粒DNA或信使RNA，伴刀豆球蛋白A溶液可用于靶向糖蛋白。

孵育溶液中有机溶剂的量应该基本上接近但不明显大于浊点。可定义孵育溶液中有机溶剂的适当量的范围，其中上限用“V％_cp+a(100％-V％_cp)”表示，下限用“V％_cp–bV％_cp”表示，其中“V％_cp”是浊点处配体溶液中有机溶剂的体积百分比，“a”是偏离浊点的上偏差，“b”是偏离浊点的下偏差。举例来说，如果浊点处配体溶液中有机溶剂的体积百分比(V％_cp)为60％，并且上下限由a＝0.3和b＝0.5限定，那么孵育溶液中有机溶剂的相应合适量将在30-72体积％有机溶剂的范围内。在一个示例性实施例中，第二步骤的过程可通过在孵育溶液中使用一定量的有机溶剂来进行，其中“a”为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.99，且“b”为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.99。对于100mM Tris中的5mg/mL蛋白A，发现甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮使溶液刚好低于浊点的体积百分比分别约为74％、62％、50％、57％、20％、20％、43％、50％。虽然图示的实施例是针对蛋白A溶液进行描述的，但是其他配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液可用于给定的靶，包括但不限于抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品。例如，蛋白A溶液可用于靶向免疫球蛋白G，寡核苷酸溶液可用于靶向质粒DNA或信使RNA，伴刀豆球蛋白A溶液可用于靶向糖蛋白。

膜制备方法4：此方法类似于方法3，但是涉及使用亲液盐代替有机溶剂。方法1能够在配体偶联过程中使用低配体溶液浓度实现高结合能力。方法2能够实现高结合能力，但在配体偶联过程中需要高配体浓度(步骤2)。方法3利用可与水混溶的有机溶剂作为固定溶液的成分来提高配体偶联效率，这使得能够在偶联溶液中使用低浓度的配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶。参考图5，在方法4下，这种高结合能力也可通过用DSC直接修饰膜，然后用亲液盐(包括但不限于磷酸钠、硫酸钠或硫酸铵)偶联蛋白A配体来实现。

方法4利用增加亲液盐的比例来使配体溶液实质上接近但不显著大于浊点，浊点是蛋白质溶液在增加亲液盐浓度时开始出现混浊的点，超过此点添加的额外盐会加剧配体的聚集和絮凝动力学，这会相对降低偶联反应的效率。在方法4中，亲液盐破坏了蛋白质的溶剂化外壳，这可促进蛋白A与膜之间更大的相互作用。在浊点附近，配体分子之间的排斥静电相互作用通过溶剂化层的压缩和蛋白质中带电基团之间的相互作用以及蛋白质现在更加暴露的疏水部分与膜之间的盐增强相互作用来减轻，增加了配体沿着膜/溶液界面的定位，这可提高偶联反应的效率。

步骤1：在高度溶胀的溶剂中活化膜表面：

在一个示例性实施例中，在第一步骤中，将再生纤维素膜浸泡在N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、三乙胺(TEA)和二甲基亚砜(DMSO)中。DMSO比许多其他有机溶剂，如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)更显著地溶胀纤维素。再生纤维素支撑膜上的羟基与DSC反应，形成氨基反应性碳酸酯中间体(-NHS)。在表面活化阶段使用DMSO作为优选溶剂制备的膜比使用其他有机溶剂制备的膜具有显著更高的结合能力。溶胀溶剂增加了可用于DSC反应的羟基，从而增加了后续蛋白质配体偶联的位点。在纤维素的其他溶剂的情况下，发生较少的溶胀，并且表面积和蛋白质配体偶联位点较低。

在此示例性实施例中，第一步骤的过程可通过使用在DMSO、其他有机溶剂如乙腈、四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、环丁砜或任何其他溶胀膜的溶剂/溶液中的0.1-120mg/mL DSC和5-10μL/mL三乙胺(TEA)，在约10-60℃的温度下进行约1-1,800分钟。例如，将一个直径为47mm、厚度为70μm的膜在40℃下在溶于10mL DMSO中的300mgDSC、139μL TEA中浸泡16小时。

步骤2：使用低亲和配体浓度进行配体偶联，在一个实施例中，配体是蛋白A：

在一个示例性实施例中，在该第二步骤中，将DSC修饰的膜在浓缩的亲液盐溶液中的低浓度蛋白A溶液中直接孵育。

在一个示例性实施例中，第二步骤的方法可通过使用约1至20mg/mL、<1mg/mL、<2.5mg/mL、<5mg/mL、<10mg/mL、<20mg/mL、<45mg/mL、1至2.5mg/mL、1至5mg/mL、1至10mg/mL、1至20mg/mL、1至45mg/mL、2.5至5mg/mL、2.5至10mg/mL、2.5至20mg/mL、2.5至45mg/mL、5至10mg/mL、5至20mg/mL、5至45mg/mL、10至20mg/mL、10至45mg/mL、20至45mg/mL的配体浓度，0.5-3M、0.5至1M、0.5至2M、0.5至2.5M、0.5至3M、1至2M、1至2.5M、1至3M、1.5至2M、1.5至2.5M、1.5至3M、2至2.5M、2至3M、2.5至3M的盐浓度，约6.0至10.0的pH水平以及在约0至45℃的温度下进行约1分钟至48小时。例如，将膜在室温下置于蛋白A浓度为约5mg/mL、含pH值为6.5的约2M Na₂SO₄的蛋白A溶液中16小时。然而，可使用更高浓度的蛋白A(20至175mg/mL)。亲液盐浓度可在0.5与3M之间，以使溶液接近但优选低于浊点(如上文方法3中所述)，浊点是蛋白质溶液在增加亲液盐浓度时开始出现混浊的点。本领域技术人员可理解，最佳比例取决于配体和亲液盐。虽然图示的实施例是针对蛋白A溶液描述的，但是其他配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或酶溶液可用于给定的靶，包括但不限于抗体、质粒DNA、信使RNA、病毒载体、病毒颗粒、病毒样颗粒、天然蛋白质、重组蛋白质、内毒素和其他生物制品。例如，蛋白A溶液可用于靶向免疫球蛋白G，寡核苷酸溶液可用于靶向质粒DNA或信使RNA，伴刀豆球蛋白A溶液可用于靶向糖蛋白。

膜制备方法5：此方法涉及通过在方法1-4所述的亲和膜制备过程中的任何步骤之前或之后使用溶胀溶剂来制备用于结合生物制品的膜。在一个实施例中，溶胀溶剂是DMSO，配体是蛋白A，且将再生纤维素膜在活化步骤之前预浸在DMSO中，随后固定蛋白A配体。在另一实施例中，在活化步骤之后，将再生纤维素膜浸泡在DMSO中，然后固定蛋白A配体。在另一实施例中，将蛋白A官能化的再生纤维素膜浸泡在DMSO中。结果表明，在这些不同的安排方式下，相比非溶胀膜，溶胀可使结合能力提高45％。

在一个实施例中，再生纤维素膜在活化步骤之前预浸在二甲基亚砜中，随后进行蛋白A配体固定。例如，将直径为47mm、厚度为70μm的膜在40℃下浸泡在10mL DMSO中16小时。

在另一实施例中，将再生纤维素膜在活化步骤之后浸泡在DMSO中，然后固定蛋白A配体。例如，将直径为47mm、厚度为70μm的NHS活化的膜在40℃下浸泡在10mL的DMSO中16小时。

在另一实施例中，将蛋白A官能化的再生纤维素膜浸泡在DMSO中。例如，将直径为47mm、厚度为70μm的蛋白A官能化膜在40℃下浸泡在10mL DMSO中16小时。

在方法5中，不需要在溶胀溶剂中完成活化步骤，因为在任何步骤之前或之后的溶胀步骤可足以产生具有高结合能力的膜的方式增加反应位点、偶联位点或配体位点的暴露。

薄膜性能：

具有根据上述方法制备的膜的柱的关键性能测量指标包括静态结合能力(SBC)和10％穿通时的动态结合能力(DBC_10％)。在一个实施例中，在测试过程中研究的主要生物学物质是纯化的多克隆人免疫球蛋白G(human Immunoglobulin G；hIgG)，因为它在行业中经常被用作蛋白A基产品的标准化性能测试的模型抗体。这些蛋白质是分子量约为150,000Da的抗体。这些分子的等电点在测试过程中没有特别确定，但它们的范围是从6.1到9.4。

在另一实施例中，伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A；Con A)用作亲和配体。Con A已被用于纯化糖基化蛋白。为了评估Con A亲和膜的性能，使用了hIgG或猪甲状腺球蛋白，它们为行业标准品。

i：SBC测量：静态结合能力(SBC)测试为初始筛选研究提供了良好的基准。使用Nanodrop分光光度计测量的初始和平衡hIgG浓度通过质量平衡来测量SBC。图6显示由方法1制备的蛋白A膜的SBC随步骤2(方法1)中DMEDA的浓度而变化。本研究中使用的蛋白A浓度为在pH 7.0的20mM Tris中5mg/mL。将hIgG用作模型抗体。在所有提到的实例中，均使用DMSO作为溶剂。使用方法1得到的最高SBC浓度大于100mg/mL。

图7比较了使用方法1、2、3和4制备的孔径为1、0.45和0.2μm的蛋白A膜的SBC。在此实例中，在方法1、2和3的配体偶联过程中使用了5mg/mL的蛋白A溶液。方法4使用16.6mg/mL蛋白A溶液。总的来说，方法1、3和4比方法2使用更低浓度的蛋白A溶液产生更高的SBC。对于较小孔径的支撑膜，SBC的性能差异更为显著。因此，方法2需要大于45mg/mL的蛋白A浓度才能获得与方法1、3和4相似的结果。没有收集使用方法4的1μm孔径膜的数据。

图8表明，使用方法2，在表面活化过程中使用DMSO作为溶胀溶剂制备的膜比使用乙腈、DMF或THF制备的膜具有显著更高的hIgG结合能力。这是使用在pH 8.0-9.0的100mM的三羟甲基氨基甲烷中的90mg/mL蛋白A制备的。图9中显示，使用方法2，使用在pH 8.0-9.0的100mM三羟甲基氨基甲烷中的90mg/mL蛋白A，用不同体积比例的DMSO-乙腈混合溶剂(0、30％、50％、70％、100％DMSO)活化的膜的IgG结合能力。膜结合能力随着DMSO含量的增加而增加，因为溶胀溶剂增加了可用于DSC反应的羟基，从而增加了后续蛋白质配体偶联的位点。使用方法3制备蛋白A亲和膜吸附剂也观察到相同的趋势，如图10所示，制备时，在步骤1(方法3)中使用DMSO-乙腈混合溶剂，在配体偶联步骤中，使用在pH 8.0-9.0的100mM三羟甲基氨基甲烷中的5mg/mL蛋白A以及约60体积％的乙醇。

在图11中，通过方法3制备Con A膜，在膜活化步骤中使用不同体积比例的DMSO-乙腈(0、25％、50％、75％、100％DMSO)。在配体偶联步骤中使用乙醇(19.6体积％)作为有机溶剂，并且Con A配体的浓度为5mg/mL。以猪甲状腺球蛋白为探针蛋白质，在20mM Tris pH7.4、0.5M NaCl、1mM MnCl₂、1mM CaCl₂中测定SBC。结合能力通常也随着所用DMSO体积比例的增加而增加。

表1显示了用DMSO/乙腈混合溶剂活化的蛋白A膜且然后在不同的缓冲条件下固定蛋白A的蛋白A膜的SBC。总的来说，当活化步骤中使用的溶剂从DMSO转变为乙腈时，SBC会降低，因为溶胀溶剂会增加可用于DSC反应的羟基，从而增加后续蛋白质配体偶联的位点。

表1：如下所述制备的膜的SBC：使用方法3，在步骤1中用二甲基亚砜-乙腈混合溶剂，在配体偶联步骤中，用约60％体积的乙醇，使用具有给定pH值的100mM缓冲液和5mg/mL蛋白A。

图12显示了在方法2的配体偶联步骤中需要使用浓度>100mg/mL的蛋白A，以达到SBC>80mg hIgG/mL。相比之下，在方法1、3和4中，可使用浓度<20mg/mL的蛋白A溶液来制备SBC>80mg/mL的膜。结果，方法1、3和4可显著降低膜生产成本，因为降低的蛋白质浓度足以生产具有同等结合能力的膜。

在图13中，通过方法4制备膜。所述图显示，对于在含有2M硫酸钠的偶联溶液中的蛋白A的一系列浓度，SBC保持相似。在活化步骤中，将0.2μm孔径的支撑膜浸泡在5mg DSC/mL DMSO中。

图14表明，使用方法3，可用各种偶联试剂获得高结合能力的蛋白A膜。在此实例中，使用DSC、甲苯磺酰氯和环氧氯丙烷来活化孔径为0.2μm的再生纤维素膜。将这些膜分别浸泡在下列溶液中：含有5mg DSC/mL DMSO的溶液；含0.12mL 1M NaOH、0.13mL环氧氯丙烷/mL DMSO的溶液；以及含有22.5mg甲苯磺酰氯/mL DMSO的溶液。

在图15中，在两种不同的环氧氯丙烷溶液中活化孔径为0.2μm的膜，每种溶液使用不同的碱催化剂。溶液A为1.45mg酰胺钠、0.132mL环氧氯丙烷/mL DMSO，溶液B为0.067mLTEA、0.132mL环氧氯丙烷/mL DMSO。随后，将活化的膜浸入使用方法3和4中描述的配方的蛋白A溶液中。

前面的实例表明，在表面活化过程中，用溶胀溶剂如DMSO浸泡膜会增加结合能力。图16显示，也可通过在根据方法1至4制备亲和膜过程中的任何步骤之前或之后(包括表面活化之前或之后以及配体固定之后)溶胀膜来增加结合能力。在本实例中，再生纤维素膜在DSC/DMSO或DSC/乙腈中活化。蛋白A偶联溶液在pH值为8.0-9.0的100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液中含有约60％的乙醇和5mg/mL的蛋白A。在进行表面活化前、表面活化后或配体偶联后，将制备的膜在40℃下在DMSO中浸泡15小时。结果表明，与非溶胀膜相比，溶胀可使结合能力提高45％。经过溶胀处理的膜通过增加反应位点、偶联位点或配体位点的暴露来增加结合能力。

图17显示了在配体浓度为5mg/mL的方法3的配体偶联步骤中，使用不同量的乙醇(体积百分比为0％、24.5％、29.4％和40％的乙醇)制备的Con A膜的SBC。hIgG被用作测试糖蛋白，以测量在20mM Tris pH 7.4，0.5M NaCl、1mM MnCl₂、1mM CaCl₂中的SBC。SBC随着乙醇添加量的增加而增加。本实例中的最大SBC是在40体积％乙醇下在浊点附近获得的。

ii：DBC_10％测量：DBC_10％表示当膜床流出物中的蛋白质浓度度达到进料浓度的10％时，每单位体积膜床结合的蛋白质的质量。将膜装入塑料原型微型柱(膜体积＝0.08-0.1mL)中，测量DBC_10％值。测试使用AKTA纯色谱系统进行。使用对应于6-0.6秒停留时间的10-100柱体积/分钟(CVs/min)的流速来测量DBC_10％。测试溶液是在pH 7.3的1XPBS缓冲液中的不同浓度的人IgG。

图18显示了装在注射器式滤器样的膜架中的蛋白A膜的DBC_10％。使用不同浓度的hIgG溶液收集DBC_10％。显示的数据是三次运行的平均值，误差条表示标准误差。这些膜通过方法1制备。将孔径为0.45μm的膜在50mg DSC/mL DMSO溶液中活化，然后在50μL DMEDA/mLDMSO溶液中进一步修饰，随后使用在20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝7.0)中的5mg/mL蛋白A进行配体偶联。

图19显示了装在注射器式滤器样膜架中的蛋白A膜的DBC_10％。使用不同浓度的hIgG溶液收集DBC_10％。这些膜通过方法2制备。将孔径为0.45μm的膜在30mg DSC/mL DMSO溶液中活化，随后使用在100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0-9.0)中的120mg/mL蛋白A进行配体偶联。

图20显示了装在注射器式滤器样膜架中的蛋白A膜的DBC_10％。使用不同浓度的hIgG溶液收集DBC_10％。显示的数据是三次运行的平均值，误差条表示标准误差。这些膜通过方法3制备。将孔径为0.2μm和0.45μm的膜分别在5mg DSC/mL DMSO溶液中活化，然后使用在约60％乙醇、100mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝8.0-9.0)中的5mg/mL蛋白A进行配体偶联。

图21显示了使用方法3制备的蛋白A膜的DBC_10％。在2.32秒的停留时间下使用了两种不同的IgG浓度。显示的数据是三次运行的平均值，误差条表示标准误差。将孔径为0.2μm的再生纤维素膜在0.0665mL TEA、0.131mL环氧氯丙烷/mL DMSO的溶液中活化。随后的偶联溶液含有在约60％乙醇、100mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝8.0-9.0)中的5mg/mL蛋白A。

图22和图23比较了蛋白A膜柱与标识为Comp 1、Comp 2和Comp 3的商业产品的性能。根据本发明制备的膜在0.6-6秒的停留时间下产生40、54和66mg hIgG/mL的出色的DBC_10％，并显著优于商业蛋白A膜产品Comp 1和Comp 2(图22)以及另一种蛋白A树脂产品Comp 3(图23)。图23与顶级工业树脂柱的性能进行了比较，后者在60秒的停留时间下仅达到25mg hIgG/mL。

表2说明了不同处理对再生纤维素膜的比表面积(specific surface area；SSA)(平方米/mL膜体积)的影响。数据来源于BET分析。

表2：用DSC、DMSO和乙腈的各种组合处理的膜的单位体积膜比表面积(m^2/mL)。

虽然已经参照具体的示例性实施例及其方法详细描述了本发明的主题，但是应当理解，本领域技术人员在理解了前述内容之后，可容易地得出这些实施例的变更、变化和等同项。因此，本公开的范围是示例性的，而不是限制性的，并且本主题公开不排除包括对于使用本文公开的教导的本领域普通技术人员来说是显而易见的对本发明主题的这种修改、变化和/或添加。

Claims

1.一种制备用于结合生物分子的膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将膜浸入偶联试剂在第一溶胀溶剂溶液中的第一溶液中，以溶胀所述膜并增加所述膜上的反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团；

将所述膜浸入在第二溶胀溶剂溶液中的包括吸附基团的第二溶液中，以使所述偶联基团中的至少一部分与所述吸附基团反应，提供用以将选自由配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶所组成的群组中的至少一种偶联至所述偶联基团的浓度效应；以及，

将所述膜浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成的群组的孵育溶液中，以将配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述膜的所述偶联基团的至少一部分上，以用于在所述生物靶分子暴露于所述膜时与所述生物靶分子结合。

2.一种根据权利要求1所述的方法制备的膜，其特征在于，所述膜为比表面积约为0.1-20m^2/mL的再生纤维素膜；

其中所述配体为蛋白A；

其中所述膜在小于3巴的背压下停留时间为约6秒时，具有在约20-90mg之间的人免疫球蛋白G/mL膜的动态蛋白质结合能力；并且，

其中所述膜具有大于60mg人免疫球蛋白G/mL膜的静态蛋白质结合能力。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶胀溶剂溶液和第二溶胀溶剂溶液包括选自由二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)、其中DMSO含量大于70体积％的DMSO与其他溶剂的混合物、有机溶剂、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜、以及它们的组合所组成的群组的至少一种溶胀溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联试剂选自由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(N,N’-disuccinimidyl carbonate；DSC)、1,1’-羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiimidazole；CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide；DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride；EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、表氯醇、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐以及它们的组合所组成的群组。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溶液的所述吸附基团选自由含叔胺的基团、包括带负电荷部分、带正电荷部分、促进疏水、亲水和π-π堆叠相互作用的部分的官能基团、以及它们的组合所组成的群组。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶胀溶剂溶液和第二溶胀溶剂溶液由二甲基亚砜(DMSO)组成，所述偶联试剂由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)组成，所述吸附基团由N,N’-二甲基乙二胺(N,N’-dimethylethylenediamine；DMEDA)组成，所述孵育溶液包括蛋白A溶液，并且所述蛋白A溶液的蛋白A浓度为10mg/mL或更低。

7.一种制备用于结合生物分子的吸附介质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供大孔载体；

将所述大孔载体浸入偶联试剂在溶剂溶液中的第一溶液，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团；

将所述大孔载体浸入包括有机溶剂和靶结合溶液的孵育溶液中，所述孵育溶液对生物靶分子具有亲和力且选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成的群组，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述大孔载体的所述偶联基团的至少一部分上，用以在所述生物靶分子暴露于所述大孔载体时与所述生物靶分子结合。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大孔载体选自由聚烯烃膜、聚醚砜膜、聚四氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维膜、水凝胶膜、水凝胶整料、聚乙烯醇膜、天然聚合物膜、纤维素酯膜、醋酸纤维素膜、再生纤维素膜、纤维素纳米纤维膜、纤维素整料、滤纸膜以及含有大量纤维素或其衍生物的大孔支承膜、以及它们的组合所组成的群组。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在亲和吸附介质制备过程中的任何步骤之前或之后，将所述大孔载体浸入溶胀溶剂溶液中以溶胀所述大孔载体并增加反应位点、偶联基团和配体位点中的至少一种的暴露。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述溶胀溶剂溶液包括至少一种选自由二甲基亚砜(DMSO)、其中DMSO含量大于70体积％的DMSO与其他溶剂的混合物、有机溶剂、六甲基磷酰胺、离子液体、环丁砜、以及它们的组合所组成的群组的溶胀溶剂。

11.一种根据权利要求7所述的方法制备的大孔载体，其特征在于，所述大孔载体为比表面积约为0.1-20m^2/mL的再生纤维素膜；

其中所述配体为蛋白A；

其中所述大孔载体在小于3巴的背压下停留时间为约6秒时，具有在约20-90mg之间的人免疫球蛋白G/mL膜的动态蛋白质结合能力；并且，

其中所述大孔载体具有大于60mg人免疫球蛋白G/mL膜的静态蛋白质结合能力。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述偶联试剂选自由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、表氯醇、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐、以及它们的组合所组成的群组。

13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自由水混溶性醇、酮、醚、酰胺、以及它们的组合所组成的群组，以促进所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种与所述大孔载体的偶联。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(tetrahydrofuran；THF)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide；DMF)和二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组。

15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一溶液由二甲基亚砜(DMSO)组成；

所述偶联试剂由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)组成；

所述孵育溶液包括至少一种选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组的有机溶剂，

所述孵育溶液包括蛋白A溶液；并且，

所述蛋白A溶液的蛋白A浓度为10mg/mL或更低。

16.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述孵育溶液中所述有机溶剂的量实质上接近但不显著大于所述配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液的浊点。

17.一种制备用于结合生物分子的吸附介质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将膜浸入偶联试剂在溶胀溶剂溶液中的第一溶液中，以溶胀所述膜并增加所述膜上反应位点的暴露，用以附着所述偶联试剂而形成偶联基团，所述偶联试剂选自由N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、卤化氰、二异氰酸酯、二缩水甘油醚、表氯醇、甲苯磺酰氯、戊二醛、二乙烯基砜、酰卤、三嗪、酸酐、以及它们的组合所组成的群组；

将所述膜浸入对生物靶分子具有亲和力的选自由配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液所组成群组的孵育溶液中，以将所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种偶联到所述膜的所述偶联基团的至少一部分上，以用于在所述生物靶分子暴露于所述膜时与所述生物靶分子结合。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述孵育溶液包括选自由磷酸钠、硫酸钠或硫酸铵以及它们的组合所组成的群组的亲液盐，以促进所述配体、核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质和酶中的一种与所述膜的偶联。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述孵育溶液包括选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)所组成的群组的有机溶剂。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述孵育溶液中所述有机溶剂的量实质上接近但不显著大于所述配体溶液、核苷酸溶液、寡核苷酸溶液、肽溶液、多肽溶液、蛋白质溶液和酶溶液的浊点。