CN113668069A

CN113668069A - 一种蛋白质芯片板的制备方法

Info

Publication number: CN113668069A
Application number: CN202010403050.XA
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 张继颖; 彭伍平; 张许科
Original assignee: Luoyang Zhongke Biochip Technology Co ltd
Current assignee: Luoyang Zhongke Biochip Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2040-05-13
Also published as: NL2026488A; NL2026488B1; CN113668069B

Abstract

本发明涉及一种蛋白质芯片板的制备方法，所述制备方法包括：步骤1)配制膜处理液，将纳米膜浸泡在所述膜处理液中，然后用纯化水冲洗、吹干；步骤2)配制点样液，将蛋白质用点样液稀释后于纳米膜上进行点样，获得蛋白质芯片；步骤3)将蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥；步骤4)配制膜封闭液，用膜封闭液对蛋白质芯片进行封闭，获得蛋白质芯片板。该方法涉及将膜处理液、干燥条件、膜封闭液组合使用，使得样品点无溢出无拖尾无晕圈现象、边缘清晰，样品点规则且直径变异系数较小，矩阵规整，反应后不同蛋白的颜色适中、灰度值适中且变异系数较小，重复性较好，保存期较长，可满足生产的需求。

Description

一种蛋白质芯片板的制备方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质芯片板的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达分析，研究蛋白质之间的相互作用，在疾病筛查，早期诊断以及筛选药物作用的蛋白靶点方面有突出的优势。蛋白质芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，使其表面具有一定的功能性，再将一种蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列、体内表达水平、生物学功能、与其他分子(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等) 的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。

蛋白质微阵列是蛋白质芯片的其中一类，其原理是通过点样机械装置在基底上面进行设计点样，将点样针吸取纯化后的蛋白质溶液，然后移至基材上方，通过接触或非接触式的喷射，将蛋白质溶液固定在基材表面，后续处理后形成蛋白质芯片。

但是，在试剂盒制备过程中，蛋白质芯片板是造成批内批间差异化的主要原因，蛋白质芯片板的制备所涉及到的处理液影响样品点的形态及溢出状态，矩阵也极易不规整，封闭液影响蛋白质后续反应结果，但本领域对于点样仪及点样针或蛋白质芯片的基材研究成果比较多，鲜有对基材处理液、封闭液进行深入研究的。因此，亟需建立一种能减小蛋白质芯片差异化的制备方法，以满足大批量转产的需求。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于优化一种蛋白质芯片板制备的方法，通过优化使得蛋白质样品点无溢出无拖尾无晕圈现象、边缘清晰，矩阵规整，样品点直径变异系数较小，反应后不同蛋白的颜色适中、灰度值适中且变异系数较小，重复性较好，保存期较长。

为此，本发明提供了一种蛋白质芯片板的制备方法，所述制备方法包括：

步骤1)配制膜处理液，将纳米膜浸泡在所述膜处理液中，然后用纯化水冲洗、吹干；

步骤2)配制点样液，将蛋白质用点样液稀释后于纳米膜上进行点样，获得蛋白质芯片；

步骤3)将蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥；

步骤4)配制膜封闭液，用膜封闭液对蛋白质芯片进行封闭，获得蛋白质芯片板。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述膜处理液为含4％w/v(g/ml)EDC、2％w/v(g/ml)NHS、0.25％v/v～1％v/v DMSO 的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀，所述PBS溶液为pH值 5.5的PBS溶液。

DMSO含量可以选自0.25％v/v、0.30％v/v、0.35％v/v、 0.40％v/v、0.45％v/v、0.50％v/v、0.55％v/v、0.60％v/v、0.65％v/v、0.70％v/v、 0.75％v/v、0.80％v/v、0.85％v/v、0.90％v/v、0.95％v/v、1％v/v。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述膜处理液为4％w/v EDC、2％w/vNHS、0.5％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入 0.1％v/v DCC混匀。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中，将所述纳米膜浸泡在所述膜处理液中30-60分钟，优选50分钟。

本发明所提供的膜处理液，用于蛋白质芯片板制备，可使样品点无溢出、边缘清晰，明显改善纳米膜表面静电的干扰，使得矩阵规整，样品点直径变异系数小，样品点灰度值变异系数小，表明处理液处理后的纳米膜均一性良好。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中蛋白质包括猪伪狂犬病病毒gDgE蛋白、霉菌毒素抗原、禽用抗生素抗原、轮状病毒抗体。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中将所述蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥6-8小时，优选6 小时。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤4)中膜封闭液为含 BSA、甘油、Tween-20的PBS溶液，所述PBS溶液为pH值7.4的PBS 溶液；优选地，所述膜封闭液为含1％w/v BSA、0.1％～0.5％v/v甘油、 0.1％v/v Tween-20的PBS溶液。

甘油含量可以选自0.10％v/v、0.11％v/v、0.12％v/v、0.13％v/v、 0.14％v/v、0.15％v/v、0.16％v/v、0.17％v/v、0.18％v/v、0.19％v/v、0.20％v/v、 0.21％v/v、0.22％v/v、0.23％v/v、0.24％v/v、0.25％v/v、0.26％v/v、0.27％v/v、 0.28％v/v、0.29％v/v、0.30％v/v、0.31％v/v、0.32％v/v、0.33％v/v、0.34％v/v、 0.35％v/v、0.36％v/v、0.37％v/v、0.38％v/v、0.39％v/v、0.40％v/v、0.41％v/v、 0.42％v/v、0.43％v/v、0.44％v/v、0.45％v/v、0.46％v/v、0.47％v/v、0.48％v/v、 0.49％v/v、0.50％v/v。

本发明所提供的膜封闭液，用于蛋白质芯片板制备，可使样品点规则、无拖尾无晕圈现象，反应后颜色适中且变异系数较小，较易判定样品的阴阳性，加速稳定性可保存6天，实时稳定性可保存15个月。

本发明还提供了一种膜处理液，所述膜处理液为含4％w/v EDC、2％w/v NHS、0.25％v/v～1％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入 0.1％v/v DCC混匀，所述PBS溶液为pH值5.5的PBS溶液；优选地，所述膜处理液为4％w/v EDC、2％w/v NHS、0.5％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀。

本发明还提供了一种膜封闭液，所述膜封闭液为含BSA、甘油、Tween-20的PBS溶液，所述PBS溶液为pH值7.4的PBS溶液；优选地，所述膜封闭液为含1％W/V BSA、0.1％～0.5％V/V甘油、0.1％ V/V Tween-20的PBS溶液。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想 pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约 4-10的范围，优选约5-9的范围。

本发明制备的蛋白质芯片板使得样品点无溢出无拖尾无晕圈现象、边缘清晰，样品点规则且直径变异系数较小，矩阵规整，反应后不同蛋白的颜色适中、灰度值适中且变异系数较小，重复性较好，保存期较长，可满足生产的需求。

附图说明

图1自上而下分别为采用处理液1、处理液2、处理液3、处理液4将纳米膜进行前处理之后的点样图；

图2自上而下分别为采用条件1、条件2、条件3将纳米膜进行处理后的反应结果；

图3自上而下分别为采用封闭液1、封闭液2、封闭液3、封闭液4、封闭液5、封闭液6将纳米膜进行处理后的反应结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1改性硅胶膜的制备

按照US2006/0057180A1小批量制备纳米膜(又称改性硅胶膜)，并在该膜上直接点样作为蛋白质芯片，制备试剂盒后可用于检测抗原或抗体，但检测同一份样品时批间批内重复性差(CV＞20％)、热稳定性差(仅可保存2天)。试剂盒检测效果存在严重缺陷，无法实现试剂盒的顺利转产，也无法满足试剂盒的临床使用。基于此进行了大量的工艺优化，挑取较优的结果进行阐述。

实施例2膜处理液的制备及评价

2.1试剂

DCC：二环己基碳二亚胺；

EDC：(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)；

NHS：N-羟基丁二酰亚胺；

DMSO：二甲基亚砜。

2.2配制方法

4％EDC溶液配制：称取4g EDC至纯水中，搅拌溶解，并定容至100ml，摇匀。

2％NHS溶液配制：称取2g NHS至纯水中，搅拌溶解，并定容至100ml，摇匀。

1％DMSO溶液配制：按照1％(V/V)比例用纯水稀释，成浓度为1％的DMSO溶液。

PBS(pH5.5)溶液配制：先配制0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49:51的体积比进行混合，调pH值得到pH值为5.5的磷酸盐缓冲液。

2.3纳米膜处理液的配制

膜处理液1：将4％EDC溶液和2％NHS溶液按照1:1(V/V) 比例混合均匀，摇匀。

膜处理液2：称取2gEDC和1gNHS至PBS溶液中，搅拌溶解，并用PBS溶液定容至100ml，摇匀。

膜处理液3：称取2gEDC和1gNHS至1％v/v DMSO溶液中，搅拌溶解，并用1％DMSO溶液定容至100ml，摇匀。

膜处理液4：称取4gEDC和2gNHS至1％v/v DMSO溶液中，搅拌溶解，并定容至50ml，再与50ml PBS溶液进行同体积混合摇匀备用。临用前加入100μL DCC，摇匀即可。

2.4对比试验

EDC常作为酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取。而NHS常作为搭配EDC使用，提高偶联几率。但是当EDC和NHS作为纳米膜的处理液，目的是将纳米膜表面羧基最大程度的进行活化，在点样时与蛋白质表面的氨基进行快速偶联。所以EDC经常和NHS搭配作为羧基的活化液。但是偶联效率低下，仅能做到20％～50％。

为了提高蛋白质和纳米膜的偶联效率，让蛋白质更稳固的固着在纳米膜表面，使芯片稳定性更佳。所以我们开发了几种纳米膜处理液，通过多种蛋白质芯片筛选出最优配方，为便于阐述，本发明仅以霉菌毒素抗原制备的蛋白芯片为例进行阐述。

将纳米膜放置在大小合适的玻璃容器中，平整摆放。将膜处理液加入盛有纳米膜的容器中，将纳米膜表面完全覆盖。静置50分钟，将纳米膜从处理液中取出，用纯化水反复冲洗10次并吹干即可用于点样。

通过试验对纳米膜活化后均匀性进行验证：点样样品：1ng 霉菌毒素抗原溶液(浓度为0.05ng/nl)，点样矩阵：4×4阵列(见表1)，点样体积：20nl，经与酶标霉菌毒素抗体、底物发生显色反应后进行测定。测定方法：点样完毕后采用工业相机对芯片逐孔进行拍照，通过软件对样品点直径进行测定和分析；将芯片进行反应后，读取灰度值，计算反应后的灰度值变异范围和变异系数，结果见表2、图1，综合判断纳米膜活化后的均匀性。

表1点样矩阵中所对应的抗原

羊抗鼠二抗	点样液(空白对照)	点样液(空白对照)	点样液(空白对照)
				霉菌毒素抗原	霉菌毒素抗原	霉菌毒素抗原	霉菌毒素抗原
霉菌毒素抗原	霉菌毒素抗原	点样液(空白对照)	点样液(空白对照)
				羊抗鼠二抗	点样液(空白对照)	点样液(空白对照)	羊抗鼠二抗

表2不同处理液处理膜均匀性的评价结果汇总

图1第1排是采用处理液1将纳米膜进行前处理之后的点样图，重复4次。因此得到四个照片，其中每一个照片拍摄的是4×4阵列的显色现象。肉眼观察图1第1排照片可以看到样品点溢出严重、拖尾严重且有样品点存在聚集现象，而且矩阵不规整；用工业相机测定，以第1个照片中霉菌毒素样品点为例阐述，点样直径为480.2μm、 666.4μm、571.2μm、708.6μm、414.8μm、552.0μm，变异系数为19.51％；点样点的灰度值为7688、15006、13651、12253、12049、12198，变异系数为20.29％，变异系数均较大，均匀性较差，远不能满足生产需求。

图1第2排是采用处理液2将纳米膜进行前处理之后的点样图，重复4次，肉眼观察图1第2排照片可以看到样品点溢出有所改善但还是有轻微溢出现象，矩阵略有改善但仍不规整，仍有样品点拖尾现象且反应显色较为严重；用工业相机测定，以第1个中霉菌毒素样品点为例阐述，点样直径为630.9μm、532.4μm、585.7μm、727.6μm、809.3μm、 594.3μm，变异系数为15.88％；点样点的灰度值为13171、19261、17869、 15871、16486、16370，变异系数为12.41％，虽略优于处理液1的制备结果但均匀性仍然较差，仍不能满足生产需求。

图1第3排是采用处理液3将纳米膜进行前处理后的点样图，重复4次，肉眼观察图1第3排照片可以看到样品点溢出完全消失，样品点边缘清晰但有个别样品点拖尾现象，但矩阵仍受到静电的轻微影响，有不规整的情况存在；用工业相机测定，以第1个中霉菌毒素样品点为例阐述，点样直径为567.7μm、545.9μm、568.3μm、592.1μm、489.1μm、 558.6μm，变异系数为6.33％；样品点的灰度值为11002、13041、13860、 13023、13188、11217，变异系数为9.26％，虽略优于处理液1、处理液 2的制备结果但仍不能满足生产需求。

图1第4排是采用处理液4将纳米膜进行前处理后的点样图，重复4次，肉眼观察图1第4排照片可以看到样品点溢出完全消失，样品点边缘清晰，矩阵规整；用工业相机测定，以第1个中霉菌毒素样品点为例阐述，点样直径为498.9μm、521.9μm、526.8μm、528.8μm、527.3μm、 548.5μm，变异系数为3.03％；样品点的灰度值为10490、11845、11151、 11053、11393、11322，变异系数为3.98％，优于处理液1、处理液2、处理液3的制备结果，可满足生产需求。

为进一步摸索处理液中所含DMSO的终体积比，其它成分不变，特将DMSO含量设为0.05％V/V、0.25％V/V、1％V/V、1.5％V/V依次制备成处理液5、6、7、8进行试验，结果：DMSO含量为0.05％V/V 时样品点直径变异系数为10.1％、灰度值变异系数为9.8％，为1.5％V/V时样品点直径变异系数为9.7％、灰度值变异系数为9.5％，而DMSO含量为0.25％V/V、1％V/V时样品点直径变异系数、灰度值变异系数均≤ 3.90，故考虑膜处理液中DMSO的含量为0.25％V/V～1％V/V。

以上结果表明，含0.25％V/V～1％V/V DMSO的膜处理液，可将纳米膜处理液完全浸润纳米膜表面，减小水的表面张力，提高纳米膜表面羧基与EDC的偶联效率；在研究过程中还发现，DMSO还能明显改善纳米膜表面静电的干扰，使点样矩阵避免因静电而出现不规整的现象；DCC能明显改善样品点拖尾现象。

为便于后续研究，将处理液4作为纳米膜的前处理液，处理后再进行点样。

2.5猪伪狂犬病病毒gDgE蛋白质芯片

用处理液4处理纳米膜后将猪伪狂犬病病毒gD蛋白点样，肉眼观察样品点均无溢出且边缘清晰，矩阵规整；测定PRVgD样品点的点样直径为536.5μm、522.8μm、549.4μm、568.6μm、549.0μm、576.4μm，变异系数为3.60％；反应后测定灰度值为23096、21608、22481、23059、 23469、23292，变异系数为3.01％；肉眼观察样品点无溢出、边缘清晰，矩阵规整。

用处理液4处理纳米膜后将猪伪狂犬病病毒gE蛋白点样，肉眼观察样品点均无溢出且边缘清晰，矩阵规整；测定PRVgE样品点的点样直径为526.4μm、538.5m、555.5μm、537.7μm、576.5μm、554.5μm，变异系数为3.24％；反应后测定灰度值为24593、22664、22155、23541、 23957、23272，变异系数为3.76％；肉眼观察样品点无溢出、边缘清晰，矩阵规整。

2.6禽用抗生素抗原

用处理液4处理纳米膜后将禽用抗生素抗原点样，肉眼观察样品点均无溢出且边缘清晰，矩阵规整；测定禽用抗生素抗原样品点的点样直径为563.3μm、529.3μm、568.6μm、559.5μm、576.4μm、528.5μm，变异系数为3.69％；反应后测定灰度值为16096、14608、15481、16059、 16466、15856，变异系数为4.12％；肉眼观察样品点无溢出、边缘清晰，矩阵规整。

2.7轮状病毒抗体

用处理液4处理纳米膜后将轮状病毒抗体点样，肉眼观察样品点均无溢出且边缘清晰，矩阵规整；测定轮状病毒抗体样品点的点样直径为542.1μm、537.3μm、534.7μm、553.5μm、563.9μm、585.7μm，变异系数为3.52％；反应后测定灰度值为24152、22664、23537、24115、24525、25346，变异系数为3.77％；肉眼观察样品点无溢出、边缘清晰，矩阵规整。

对霉菌毒素抗原蛋白质芯片、猪伪狂病病毒gDgE蛋白蛋白质芯片、禽用抗生素抗原蛋白质芯片、轮状病毒抗体蛋白质芯片不同批之间的样品点点样直径、反应后的灰度值变异系数＜5％，表明处理液4 处理后的蛋白质芯片均匀性较好，可批量生产。

实施例3蛋白质芯片板的制备及检验

3.1点样液的配制

5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油置100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇置250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

0.05％曲拉通溶液的配制：用移液枪量取50μl曲拉通置100ml 容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

DMSO溶液：直接采用DMSO试剂即可；

PBS(pH6.8)溶液配制：先配置0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49:51的体积比进行混合，得到pH值为6.8的磷酸盐缓冲液；

将上述溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀，作为点样液。

3.2蛋白质芯片板的制备

蛋白质芯片板的制备方法包括：

步骤1)配制膜处理液，将纳米膜浸泡50分钟后用纯化水冲洗、吹干；

步骤3)将蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥不同的时间；

步骤4)配制封闭液，用封闭液对蛋白质芯片进行封闭，获得蛋白质芯片板。

实施例4蛋白质芯片干燥条件

设定蛋白质芯片干燥条件1～3，

条件1：在温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥4小时；

条件2：在温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥6小时；

条件3：在温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥16小时。

本发明对多个产品用条件1～3进行制备，结果相同，为便于阐述以猪伪狂犬病病毒gDgE蛋白二联检芯片(点样矩阵见表3，2×3 矩阵)为例，用以下样品进行评价、分析。

表3猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白点样矩阵中所对应的抗原

羊抗鼠二抗	点样液(空白对照)
		猪伪狂犬病病毒gD蛋白	猪伪狂犬病病毒gE蛋白
羊抗鼠二抗	羊抗鼠二抗

PRVgD阳性且PRVgE阴性的猪血清(简称P1)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价为1∶51.3；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阳性，S/P值2.393；经IDEXX PRVgE试剂盒测定结果为阴性， S/N值0.989。

PRVgE阳性且PRVgD阳性的猪血清(简称P2)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价为1∶11.2；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阳性，S/P值1.152；经IDEXX PRVgE试剂盒测定结果为阳性， S/N值0.454。

PRVgD阴性且PRVgE阴性的猪血清(简称N)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价＜1∶2；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阴性，S/P值0.191；经IDEXX PRVgE试剂盒测定结果为阴性，S/N 值0.958。

用上述血清选择猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体评价不同干燥条件，因本方法原理为酶联免疫阻断法，因而通过计算N/P 值，并选择N/P值最大时对应的干燥条件为最佳条件，反应结果见表4 和图2，结果分析：条件1干燥后的反应结果重复性较差(10％＜CV值＜15％)，肉眼观察有拖尾现象、点不规则且阳性样品点颜色较深，加速稳定性试验仅可于37℃条件下保存2天；条件3干燥后的反应结果肉眼观察有拖尾现象，重复性虽好(CV值＜5％)但阳性样品颜色深，P1、 P2灰度值较高导致同样条件下N/P1、N/P2偏低，不利于准确判断阴阳性，加速稳定性试验较条件1略有改善；相比而言，条件2干燥后的反应结果重复性好(CV值＜4％)，肉眼观察反应适中且N/P1、N/P2值均为最高更易于判定阴阳性，稳定性试验较佳。

表4不同干燥条件反应结果汇总

实施例5膜封闭液的制备及评价

5.1配制膜封闭液

在原有优化的基础上，为进一步研究稳定性，按下表配制封闭液1～封闭液6。

表5不同膜封闭液配方

编号	封闭液组分
		封闭液1	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA
封闭液2	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA、0.1％V/V Tween-20
		封闭液3	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V胎牛血清、0.1％V/V Tween-20
封闭液4	pH7.4的0.1M PBS、0.2％V/V甘油
		封闭液5	pH7.4的0.1M PBS、0.2％V/V甘油、0.1％V/V Tween-20
封闭液6	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA、0.2％V/V甘油、0.1％V/V Tween-20
		封闭液7	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA、0.1％V/V甘油、0.1％V/V Tween-20
封闭液8	pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA、0.5％V/V甘油、0.1％V/V Tween-20

5.2封闭效果评价

本发明对多个产品用膜封闭液1～6进行制备，结果相同，为便于阐述以猪伪狂犬病病毒gDgE蛋白二联检芯片(2×3矩阵)为例，对实施例4中的样品N、P1、P2进行评价、分析。

膜封闭液1～6处理后反应结果见表6及图3，结果分析：封闭液1反应后肉眼观察样品点不规则、有拖尾现象，变异系数均较大，加速稳定性试验仅可保存2天；封闭液2反应后肉眼观察样品点不规则、有拖尾现象，变异系数均较大，加速稳定性试验稍佳(可保存4天)；封闭液3反应后肉眼观察样品点不规则、有拖尾现象，变异系数均稍大，加速稳定性试验稍佳(可保存4天)；封闭液4反应后肉眼观察样品点有晕圈现象，阳性样品的样品点反应后颜色较深、灰度值高导致假阴性，变异系数均稍大，加速稳定性试验欠佳(仅可保存2天)；封闭液5反应后肉眼观察阳性样品的样品点颜色较深、灰度值高导致假阴性，变异系数均稍大，加速稳定性试验欠佳(可保存4天)；相比而言，封闭液6 反应后肉眼观察样品点颜色适中，无拖尾、无晕圈现象，加速稳定性试验可保存6天。

表6不同膜封闭液处理后的反应结果汇总

为进一步研究甘油在膜封闭液中的含量，其它成分不变，特设定甘油含量为0.05％V/V、0.1％V/V(封闭液7)、0.5％V/V(封闭液8)、 1％V/V依次制备成封闭液9、封闭液7、封闭液8、封闭液10进行试验，结果：甘油含量为0.05％V/V、1％V/V时变异系数均≥15％，反应后样品点不规则、有拖尾现象，加速稳定性试验仅可保存4天；仅当封闭液为0.1％V/V、0.5％V/V时样品点均一、无拖尾无晕圈现象，变异系数均 ≤5％，加速稳定性试验可保存6天。故考虑膜封闭液中甘油的含量为 0.1％V/V～0.5％V/V。

并将封闭液6、封闭液7、封闭液8制备的抗原板于2～8℃ 进行实时保存期试验，结果：保存15个月检测时均无明显变化，可满足生产需求。

综上所述，本发明的蛋白质芯片板制备过程中所用到膜处理液、干燥条件、膜封闭液经组合使用，使得样品点无溢出无拖尾无晕圈现象、边缘清晰，样品点规则且直径变异系数较小，矩阵规整，反应后不同蛋白的颜色适中、灰度值适中且变异系数较小，重复性较好，保存期较长，可满足生产的需求。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种蛋白质芯片板的制备方法，其中，所述制备方法包括：

步骤2)配制点样液，将蛋白质用所述点样液稀释后于所述纳米膜上进行点样，获得蛋白质芯片；

步骤3)将所述蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥；

步骤4)配制膜封闭液，用膜封闭液对所述蛋白质芯片进行封闭，获得蛋白质芯片板。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤1)中所述膜处理液为含4％w/vEDC、2％w/v NHS、0.25％v/v～1％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀，所述PBS溶液为pH值5.5的PBS溶液；优选地，所述步骤1)中所述膜处理液为4％w/v EDC、2％w/v NHS、0.5％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀；优选地DMSO含量选自0.25％v/v、0.30％v/v、0.35％v/v、0.40％v/v、0.45％v/v、0.50％v/v、0.55％v/v、0.60％v/v、0.65％v/v、0.70％v/v、0.75％v/v、0.80％v/v、0.85％v/v、0.90％v/v、0.95％v/v、1％v/v。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤1)中，将所述纳米膜浸泡在所述膜处理液中30-60分钟，优选50分钟。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤2)中，所述蛋白质包括猪伪狂犬病病毒gDgE蛋白、霉菌毒素抗原、禽用抗生素抗原、轮状病毒抗体。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤3)中将所述蛋白质芯片于温度23℃±2℃、湿度25％以下的条件下干燥6-8小时，优选6小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤4)中所述膜封闭液为含BSA、甘油、Tween-20的PBS溶液，所述PBS溶液为pH值7.4的PBS溶液；优选地，所述膜封闭液为含1％w/vBSA、0.1％～0.5％v/v甘油、0.1％v/v Tween-20的PBS溶液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述甘油含量选自0.10％v/v、0.11％v/v、0.12％v/v、0.13％v/v、0.14％v/v、0.15％v/v、0.16％v/v、0.17％v/v、0.18％v/v、0.19％v/v、0.20％v/v、0.21％v/v、0.22％v/v、0.23％v/v、0.24％v/v、0.25％v/v、0.26％v/v、0.27％v/v、0.28％v/v、0.29％v/v、0.30％v/v、0.31％v/v、0.32％v/v、0.33％v/v、0.34％v/v、0.35％v/v、0.36％v/v、0.37％v/v、0.38％v/v、0.39％v/v、0.40％v/v、0.41％v/v、0.42％v/v、0.43％v/v、0.44％v/v、0.45％v/v、0.46％v/v、0.47％v/v、0.48％v/v、0.49％v/v、0.50％v/v。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备的蛋白质芯片板。

9.一种用于蛋白质芯片板的膜处理液，其中，所述膜处理液为含4％w/v EDC、2％w/vNHS、0.25％v/v～1％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀，所述PBS溶液为pH值5.5的PBS溶液；优选地，所述膜处理液为4％w/v EDC、2％w/v NHS、0.5％v/v DMSO的PBS溶液，临用前加入0.1％v/v DCC混匀。

10.一种用于蛋白质芯片板的膜封闭液，其中，所述膜封闭液为含BSA、甘油、Tween-20的PBS溶液，所述PBS溶液为pH值7.4的PBS溶液；优选地，所述膜封闭液为含1％W/V BSA、0.1％～0.5％V/V甘油、0.1％V/V Tween-20的PBS溶液。