CN108646031A - 一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头及其制备方法 - Google Patents

一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头，在所述枪头内壁中段附着有荧光微球抗体复合物，所述荧光微球抗体复合物含有与抗体偶联的荧光微球,所述检测试剂盒在2℃～30℃的环境下保质期一年。本发明将原本喷涂在标记垫上或液态单独密封的包含抗体的标记物喷涂在塑料材质的枪头上，冷冻过夜、经真空冷冻干燥后用于组装检测试剂盒，这种结构的检测试剂盒在2℃～30℃的环境下保质期为一年，大幅降低了检测试剂盒的保存条件，降低了运输及存储成本，避免因保存条件不足导致检测结果不准确的缺陷，克服了现有技术中的不足。

Description

一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头及其制备方法。
背景技术
荧光层析法可用于定量检测样本中的N-端脑利钠肽前体(NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)或肌红蛋白(Myo)等生化标志物，其原理如下：将待测样本加入检测卡的加样孔，如果样本中存在待测生化标志物，则包被有相应抗体的荧光微球与生化标志物结合形成复合物。该复合物再沿着检测卡的试纸条侧向移动，结合了荧光微球的复合物就会在检测区被捕捉到，而多余的荧光微球则在质控区被捕捉。当检测卡插入荧光免疫分析仪后，分析仪自动扫描、检测检测区和质控区上的荧光强度，用两个荧光强度的比值即可计算出所测生化标志物的含量。
公告号为CN102520193B的中国专利公开了一种定量检测人心肌肌钙蛋白I的荧光免疫层析方法及其试剂盒，该试剂盒包含缓冲液和试纸条，包含抗体的标记物被喷涂在试纸条的标记垫上，该试剂盒需要在4℃环境下保存。
公告号为CN102680703B的中国专利一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法，该检测卡组件包含检测卡和独立包装的铂卟琳标记特异抗体，包含抗体的标记物是密封在塑料瓶中的，该检测卡组件需要在2℃～8℃环境下保存。
从上述记载可以看出，包含抗体的标记物要么喷涂在标记垫上、要么液态密封在塑料瓶中，试剂盒均需要在冷藏的环境下保存，这一要求极大地提高了试剂盒的运输和保存成本，也容易因保存条件不足导致检测结果不准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头，可以降低检测试剂盒的保存条件，以克服现有技术中的不足。
本发明的技术方案：
一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头，在所述枪头内壁中段附着有荧光微球抗体复合物，所述荧光微球抗体复合物含有与抗体偶联的荧光微球,所述检测试剂盒在2℃～30℃的环境下保质期一年。
优选地，所述荧光微球抗体复合物中的荧光微球和抗体的重量比为10～100:1。
进一步优选地，所述抗体为NT-proBNP抗体、CK-MB抗体、cTnI抗体或Myo抗体。
一种制备上述枪头的方法，包含如下步骤：
①取荧光微球，离心取沉淀，用MES缓冲液洗涤；
②活化：在洗涤后的荧光微球中加入EDC溶液和Sulfo-NHS溶液，室温震荡；
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤后加入用于检测的抗体，室温震荡，使羧基与-NH2共价结合；
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液，室温震荡；
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入储存液保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物；
⑥将荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，-80℃冷冻过夜后,经真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
优选地，步骤②中加入等体积等摩尔浓度的EDC溶液和Sulfo-NHS溶液。
优选地，步骤④所述封闭液为10mM PB，其中含5wt％BSA或0.5wt％酪蛋白。
进一步优选地，步骤④所述封闭液还含有0.5wt％Tween-20或2wt％蔗糖。
优选地，步骤⑤所述储存液为pH＝7.4的10mM PB溶液，其中含2～15wt％海藻糖、0.5～4wt％BSA、0.05～0.5wt％Tween-20、0.1wt％Proclin300、0.1～5wt％甘油、0.1～5wt％乙二醇和0.01～2wt％PVP 10。
与现有技术相比，本发明将原本喷涂在标记垫上或液态单独密封的包含抗体的标记物喷涂在塑料材质的枪头上，冷冻过夜、经真空冷冻干燥后用于组装检测试剂盒，这种结构的检测试剂盒在2℃～30℃的环境下保质期为一年，大幅降低了检测试剂盒的保存条件，降低了运输及存储成本，避免因保存条件不足导致检测结果不准确的缺陷。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：制备肌酸激酶同工酶(CK-MB)检测试剂盒的枪头
①取0.1ml荧光微球(浓度10mg/ml，购自上海辉质生物)，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。
②活化：在洗涤后的荧光微球中分别加入200μl的20mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC)和200μl的20mM的羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(Sulfo-NHS)，室温震荡1h。
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤两次。加入10μg的CK-MB单抗，室温震荡5h，使羧基与-NH2共价结合。
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液(5wt％BSA，10mM PB)，室温震荡1h。
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入125μl储存液(pH＝7.4的10mM PB，含2wt％海藻糖+0.5wt％BSA+0.05wt％Tween-20+0.1wt％Proclin300+0.1wt％甘油+0.1wt％乙二醇+0.01wt％PVP 10)，保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物。
⑥将制备好的标记有CK-MB单抗的荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，每个枪头1μL，-80℃冰箱冷冻过夜后，真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
实施例2：制备肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒的枪头
①取0.1ml荧光微球(浓度10mg/ml，购自上海辉质生物)，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。
②活化：在洗涤后的荧光微球中分别加入100μl的20mM的EDC溶液和100μl的20mM的Sulfo-NHS溶液，室温震荡1h。
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤两次。加入40μg的cTnI单抗，室温震荡5h，使羧基与-NH2共价结合。
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液(5wt％BSA+0.5wt％Tween-20，10mM PB)，室温震荡2h。
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入220μl储存液(pH＝7.4的10mM PB，含6wt％海藻糖+1.5wt％BSA+0.2wt％Tween-20+0.1wt％Proclin300+2wt％甘油+2.5wt％乙二醇+0.8wt％PVP 10)，保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物。
⑥将制备好的标记有cTnI单抗的荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，每个枪头1μL，-80℃冰箱冷冻过夜后，真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
实施例3：制备N-端脑利钠肽前体(NT-proBNP)检测试剂盒的枪头
①取0.1ml荧光微球(浓度10mg/ml，购自上海辉质生物)，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。
②活化：在洗涤后的荧光微球中分别加入120μl的20mM的EDC溶液和120μl的20mM的Sulfo-NHS溶液，室温震荡1h。
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤两次。加入70μg的NT-proBNP单抗，室温震荡5h，使羧基与-NH2共价结合。
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液(5wt％BSA+2wt％蔗糖，10mM PB)，室温震荡2h。
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入250μl储存液(pH＝7.4的10mM PB，含10wt％海藻糖+3wt％BSA+0.4wt％Tween-20+0.1wt％Proclin300+4wt％甘油+4wt％乙二醇+1.5wt％PVP 10)，保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物。
⑥将制备好的标记有NT-proBNP单抗的荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，每个枪头1μL，-80℃冰箱冷冻过夜后，真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
实施例4：制备肌红蛋白(Myo)检测试剂盒的枪头
①取0.1ml荧光微球(浓度10mg/ml，购自上海辉质生物)，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。
②活化：在洗涤后的荧光微球中分别加入100μl的20mM的EDC溶液和100μl的20mM的Sulfo-NHS溶液，室温震荡1h。
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤两次。加入100μg的MYO单抗，室温震荡5h，使羧基与-NH2共价结合。
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液(0.5wt％酪蛋白，10mMPB)，室温震荡2h。
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入100μl储存液(pH＝7.4的10mM PB，含15wt％海藻糖+4wt％BSA+0.5wt％Tween-20+0.1wt％Proclin300+5wt％甘油+5wt％乙二醇+2wt％PVP 10)，保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物。
⑥将制备好的标记有MYO单抗的荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，每个枪头1μL，-80℃冰箱冷冻过夜后，真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
实施例5：测试用实施例1制备的肌酸激酶同工酶(CK-MB)枪头组装成的检测试剂盒在30℃的环境下保存一年后的准确性，实施方法如下：
枪头采用实施例1制备的肌酸激酶同工酶(CK-MB)枪头，检测试剂盒除枪头外的其他组件均为常规方法制造，区别仅在于不在检测卡的标记垫上喷涂包含检测抗体的标记物、也不将包含检测抗体的标记物液态单独密封。将检测试剂盒的所有组件放入铝箔袋、加干燥剂封口。
将上述检测试剂盒在30℃的环境下保存一年，然后加入浓度为50ng/mL、10ng/mL和3ng/mL的CK-MB抗原检测，检测结果如下：
测试浓度 50ng/ml 10ng/ml 3ng/ml
测试1 49.32 11.24 3.14
测试2 48.62 10.15 3.16
测试3 46.39 9.63 2.87
测试4 47.35 9.52 2.94
测试5 53.58 9.87 2.97
测试6 53.69 11.27 3.26
测试7 54.51 10.89 2.83
测试8 46.95 10.56 2.76
测试9 47.36 9.84 2.91
测试10 54.67 10.46 3.27
测试11 46.62 10.58 2.84
测试12 47.82 9.41 2.87
测试13 47.20 9.35 2.71
测试14 46.83 11.16 3.20
测试15 52.19 9.26 3.19
测试16 51.74 9.19 2.99
测试17 52.51 10.68 2.89
测试18 48.28 10.53 2.73
测试19 47.37 9.34 2.84
测试20 52.43 9.45 2.81
AVE 49.7715 10.119 2.959
SD 2.9929782 0.7165186 0.18028924
CV 6.01％ 7.08％ 6.09％
从上表可知，实施例1制备的肌酸激酶同工酶(CK-MB)枪头组装成的检测试剂盒在30℃的环境下保存一年后的CV<10％，满足了检测试剂盒的准确性要求。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的记载为准。

Claims (8)

1.一种作为荧光免疫层析检测试剂盒组件的枪头，其特征在于：在所述枪头内壁中段附着有荧光微球抗体复合物，所述荧光微球抗体复合物含有与抗体偶联的荧光微球,所述检测试剂盒在2℃～30℃的环境下保质期一年。
2.根据权利要求1所述的枪头，其特征在于：所述荧光微球抗体复合物中的荧光微球和抗体的重量比为10～100:1。
3.根据权利要求2所述的枪头，其特征在于：所述抗体为NT-proBNP抗体、CK-MB抗体、cTnI抗体或Myo抗体。
4.制备权利要求1至3中任一权利要求所述枪头的方法，其特征在于，包含如下步骤：
①取荧光微球，离心取沉淀，用MES缓冲液洗涤；
②活化：在洗涤后的荧光微球中加入EDC溶液和Sulfo-NHS溶液，室温震荡；
③偶联反应：将活化后的荧光微球离心取沉淀，用PB缓冲液洗涤后加入用于检测的抗体，室温震荡，使羧基与-NH2共价结合；
④将经过偶联反应的荧光微球离心取沉淀，加入封闭液，室温震荡；
⑤将封闭后的荧光微球离心取沉淀，加入储存液保存于4℃，即为荧光微球抗体复合物；
⑥将荧光微球抗体复合物喷点于枪头中，-80℃冷冻过夜后,经真空冷冻干燥后即可用于组装检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤②中加入等体积等摩尔浓度的EDC溶液和Sulfo-NHS溶液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤④所述封闭液为10mM PB，其中含5wt％BSA或0.5wt％酪蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤④所述封闭液还含有0.5wt％Tween-20或2wt％蔗糖。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤⑤所述储存液为pH＝7.4的10mMPB溶液，其中含2～15wt％海藻糖、0.5～4wt％BSA、0.05～0.5wt％Tween-20、0.1wt％Proclin300、0.1～5wt％甘油、0.1～5wt％乙二醇和0.01～2wt％PVP 10。
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