CN104428675A - 用于即时检测性免疫层析分析的冻干缀合物结构体、使用其进行免疫检测的试剂盒,以及使用该试剂盒进行分析的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于免疫层析分析的冻干缀合物构建体、提供了所述冻干缀合物构建体和用于免疫层析分析的试纸条的免疫检测试剂盒，以及通过使用所述免疫检测试剂盒对样品中的分析物进行定性或定量分析的方法。本发明使用了单独制备的冻干缀合物构建体，其在外部并一致地与样品反应并接受免疫层析分析，从而相比使用包含通过吸附缀合物制备的缀合物垫的免疫层析试纸条的常规方法，允许以更高的再现性和浓度线性度来进行定量分析。可将本发明的冻干缀合物构建体容纳于包含额外的用于递送的盖子的室中，使得所述冻干缀合物构建体可被储存而不发生污染且容易携带，并且适于通过使用所述免疫检测试剂盒进行即时检测分析，因为其可被快速且一致地溶解，以便与液体缓冲剂和分析样品直接混合并立即反应。

Description

用于即时检测性免疫层析分析的冻干缀合物结构体、使用其进行免疫检测的试剂盒,以及使用该试剂盒进行分析的方法
技术领域
本发明涉及用于免疫层析分析的冻干缀合物结构体、包含所述冻干缀合物结构体以及免疫层析试纸条(immunochromatographic strip)的免疫检测试剂盒，以及使用所述免疫检测试剂盒定性或定量分析样品中的分析物的方法。
发明背景
免疫层析测定(也称为快速测试方法)，是一种能够使用抗原-抗体反应在短时间内定性和定量分析痕量分析物的方法，并且已被用于诊断或检测多种疾病以及多个领域，包括医药、农业、畜牧业、食品、军工和环境领域。通常使用包含反应物质的测定试纸条来进行该免疫层析测定，所述反应物质可响应待检测的分析物而发生变化，或者使用包含安装于塑料箱体中的测定试纸条的测定装置来进行测定。图1是用于免疫层析测定的常规测定试纸条的截面图。如图1所示，该常规测定试纸条包括：用于接收液体样品的样品垫；包含缀合物的缀合物垫，所述缀合物通过将能够产生可视觉感知或通过传感器感知的信号的标记物与诸如抗原或抗体的配体缀合而得到；其上固定有能够与样品中的分析物特异性结合的结合性物质(抗体或抗原)和/或所述缀合物的多孔膜垫；以及用于最终接收液体样品的吸收垫。这些功能垫以上述顺序彼此连接，同时彼此部分重叠并与固体载体结合，从而使它们连续布置。在以安装于塑料箱体中的形式使用测定试纸条的情况下，在该箱体上形成用于将样品滴落于样品垫对应位置的样品导入口，并且在固定于多孔膜垫上的结合剂对应位置形成用于观察测定结果的观察窗。在使用该测定试纸条进行的免疫层析测定中，当液体样品滴落于样品垫上时，其通过毛细管现象移动通过缀合物垫和多孔膜垫，并最终被接收于吸收垫中。在本文中，缀合物垫中的缀合物还与液体样品一起移动，并且如果在样品中存在待检测的分析物，则缀合物将通过分析物与多孔膜垫上的结合剂结合(一般称为“三明治反应”)，或者缀合物和分析物竞争结合结合剂(一般称为“竞争反应”)，并因此，可视觉感知或通过传感器感知样品中分析物的存在。
然而，该常规测定试纸条具有的问题在于，通过毛细管现象移动的液体样品并不一致地与固定于缀合物垫上的干燥缀合物结合，并因此，测定试纸条之间可存在变化，这提示，对样品的定量分析的精确性和再现性可能被降低。
此外，在经常用于生化测定的、采用液体试剂的方法中，可通过在孔板中以特定的比率混合液体试剂来改进样品分析的精确性和再现性。然而，当包含抗体和抗原的液体试剂被储存了长时间时，抗原-抗体反应的亲和力将降低，或者抗原和抗体将变性，这提示，这些液体试剂存在稳定性方面的问题。因此，可冷藏或冻藏液体试剂，以改进其长期稳定性，但是冷藏或冻藏的液体试剂难以用于诸如快速测试的即时测试的各个测量位点。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于免疫层析分析的冻干缀合物结构体，其包含第一缀合物，所述第一缀合物包含用于信号检测的第一标记物和与分析物反应的第一配体，其中所述第一标记物和所述第一配体在物理上或化学上彼此连接，并且所述缀合物结构体通过如下方式形成：快速冷冻这样的分散液，在所述分散液中预定浓度的所述第一缀合物以具有一致体积的小滴形式分散于溶剂中，然后冻干，从而去除所述溶剂，其中通过去除所述溶剂，所述冻干小滴中由所述溶剂占据的空间形成多孔空间。
本发明的另一个目的是提供包含上述冻干缀合物结构体和免疫层析试纸条的免疫检测试剂盒。
本发明的又一个目的是提供使用上述免疫检测试剂盒来定性或定量分析样品中的分析物的方法，所述方法包括：同时或顺序添加缓冲剂和样品至缀合物结构体，并同时或顺序进行所述缀合物结构体的溶解和所述缀合物与所述样品间的反应；将产生自前述步骤的物质加载于免疫层析试纸条上，并允许所加载的物质沿着所述试纸条迁移；以及确定从测试线上的第一标记物生成的信号的存在与否及其强度。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了用于免疫层析分析的冻干缀合物结构体，其包含第一缀合物，所述第一缀合物包含用于信号检测的第一标记物和与分析物反应的第一配体，其中所述第一标记物和所述第一配体在物理上或化学上彼此连接，并且所述缀合物结构体通过如下方式形成：快速冷冻这样的分散液，在所述分散液中预定浓度的所述第一缀合物以具有一致体积的小滴形式分散于溶剂中，然后冻干，从而去除所述溶剂，其中通过去除所述溶剂，所述冻干小滴中由所述溶剂占据的空间形成多孔空间。
有益效果
因为样品是在外部在一致地与根据本发明从外部单独制备的冻干缀合物结构体反应后接受免疫层析分析，所以与使用包含通过吸附缀合物制备的缀合物垫的免疫层析试纸条进行的常规测定方法相比，可以较高的重复性和取决于浓度的线性度来进行定量分析。
此外，可以这样的状态来提供本发明的冻干缀合物结构体，其中所述冻干缀合物结构体被接纳于还另外包含盖子的腔室中。因此，其可被储存而不发生污染，并且容易携带。此外，所述冻干缀合物结构体可快速并一致地溶解，以使其能够立即与缓冲剂和样品的混合物反应，并且可通过免疫检测试剂盒来分析反应产物。因此，其适用于即时测试。
附图说明
图1是用于常规免疫层析测定的测定试纸条的截面图。
图2是常规免疫检测装置的分解透视图。
图3是根据本发明的实施方案的免疫检测装置的分解透视图。
图4示出了根据本发明的实施方案的冻干缀合物珠的形状。
图5示出了根据本发明的实施方案的样品预处理装置的透视图和免疫检测方法。具体地，图5(A)示出了样品预处理装置，其为配备了盖子并且包含冻干缀合物珠的腔室。图5(B)示出了采用所述样品预处理装置的免疫检测方法。
图6示出了使用根据本发明的实施例和比较实施例的免疫检测装置进行的糖基化血红蛋白定量分析的结果的比较。菱形表示由根据本发明的实施例的免疫检测装置得到的测量值，并且方块表示由根据比较例的常规免疫检测装置得到的测量值。
图7示出了糖基化血红蛋白的测量值随根据本发明的实施方案的冻干缀合物珠的体积的变化。
优选实施方式
作为实现上述目的的一个方面，本发明提供了冻干缀合物结构体，其特征在于，其作为用于免疫层析分析的冻干缀合物结构体，包含第一缀合物，所述第一缀合物包含用于信号检测的第一标记物和与分析物反应的第一配体，所述第一标记物与所述第一配体在物理上或化学上彼此连接，所述缀合物结构体通过如下方式形成：快速冷冻这样的分散液，在所述分散液中预定浓度的所述第一缀合物以具有一致体积的小滴形式分散于溶剂中，然后冻干，从而去除所述溶剂，其中通过去除所述溶剂，所述冻干小滴中由所述溶剂占据的空间形成多孔空间。
本文所用术语“免疫层析”是指这样的测定方法，其利用基于抗原-抗体反应的免疫反应原理与其中样品和试剂通过流动相沿着介质移动的免疫层析原理的组合。简单地说，预先将待分析的抗体或抗体分散并固定于多孔膜上，并且当血液样品从所述膜的一端迁移至固定的抗体或抗原时，观察与样品中的抗原或抗体的反应。在一般含义中，术语“免疫反应”是指抗原-抗体反应，但是在本发明的广义含义中，其意为不仅包括抗原-抗体反应，还包括受体和与其特异性结合的配体之间的反应。此外，不限于此，其还包括特异性识别彼此的物质之间的反应，例如酶-底物反应。
可使用标记物以能够容易地视觉检测或使用传感器检测抗原-抗体反应。此外，可以与标记物连接的状态使用能够特异性结合分析物的配体，以使所述标记物可与待检测的分析物结合。本文所用术语“缀合物”是指标记物与配体的缀合物。标记物和配体可在物理上或化学上彼此连接。具体地，标记物和配体可通过被动吸附彼此连接，或者标记物可被修饰为具有反应性基团并可与配体共价连接，但不限于此。此外，可使用本领域技术人员已知的任何方法来进行标记和配体之间的连接。
本文所用术语“标记物”是指能产生可视觉感知或使用传感器感知的信号的物质。本发明中所用的标记物的实例包括但不限于胶乳颗粒、金颗粒、有色聚苯乙烯微粒、酶、荧光染料、导电聚合物或磁颗粒。此外，可通过标记物的固有特性(例如冷光)，或通过外部刺激(例如荧光)来产生信号。
本文所用术语“配体”是指与特定物质特异性结合的物质。例如，特异性结合抗原的抗体，或特异性结合特定受体的配体在广义上充当彼此的配体。此外，在本发明中可使用任何物质作为配体，只要其显示上述特性即可。在本发明上下文中，除非具体规定为特异性结合特定受体的配体，否则术语“配体”是指如上文所描述的与特定物质特异性结合的物质。
可通过以下方法来制备所述缀合物：制备包含预定浓度的标记物的溶液和包含预定浓度的配体的溶液，将这些溶液混合到一起，并使所述混合溶液反应预定的时间。在本文中，可根据标记物与配体之间的结合比率来确定溶液的浓度以及溶液之间的混合比率。配体与标记物结合可为一种配体与一种标记物的结合、多种配体与一种标记物的结合，或多种标记物与一种配体的结合。具体的结合比率对本发明并非为至关重要的，但是优选维持于恒定比率。结合比率可根据标记物和配体的种类而变化，并且可根据它们的相对尺寸和结合位点数来估计。例如，当使用具有数微米的尺寸的胶乳珠作为标记物且使用抗体作为配体时，可将多种抗体与一个胶乳珠结合。优选地，为了使一致数目的抗体结合至每个胶乳珠的表面，可控制抗体和胶乳溶液的浓度和混合比率，以使抗体结合胶乳的表面至饱和，但是本发明的范围不限于此。
如上文所述，可通过以下方法来获得包含预定浓度的缀合物的溶液：混合分别包含预定浓度的标记物和配体的溶液，并使混合溶液反应。缀合物溶液为分散液形式，其中缀合物分子以预定浓度均匀地分散于溶液中。
缀合物溶液还可包含另一种缀合物分子，其包含用于信号检测的标记和与固定于对照线上的报告子分子反应的配体，从而使该缀合物分子可用作内部对照。所述另外的缀合物可以与用于制备上文描述的缀合物的方法相同的方法制备为均匀的分散液，并可与上文描述的缀合物溶液混合。用于所述另外的缀合物分子的标记物可与上述缀合物中的标记物相同或不同。以上术语以及用于内部对照的术语将在下文中详细论述。
在本发明中，为了便于储存和与样品一致地反应，可通过快速冷冻具有一致体积的小滴形式的缀合物分散液并冻干已冻结的小滴来制备所述“冻干缀合物结构体”。具体地，可通过喷射具有一致体积的分散液的小滴以使其与极低温度的液体制冷剂接触，从而冷冻以预定浓度均匀分散于溶剂中的缀合物分子的分散液。在本文中，快速冷冻分散液的小滴以提供具有一致尺寸的固体小球。用于本发明的极低温度的液体制冷剂可为具有-270℃至-180℃的蒸发点的液体。例如，其可为液氮、液氦、液氧、液氢等，并可根据成本和安全性进行选择。优选地，其可为液氮或液氦，但不限于此。
本发明中的免疫层析可用于定性分析或定量分析。为了在定量分析中使用所述冻干缀合物结构体，可将每个缀合物结构体制备为包含特定数目的缀合物分子。如上文所述，可通过制备包含预定浓度的缀合物的均匀分散液并将具有一致体积的分散液小滴喷射入极低温度的液体制冷剂中以将其快速冷冻，来进行该制备。为了喷射具有一致体积的小滴形式的均匀缀合物分散液，可使用分散器。当使用分散器时，可以具有一致体积的小滴形式来喷射所述分散液，并且可使所述小滴的体积变化最小化。在本文中，可通过控制喷嘴孔径以及分配分散器的压力来控制喷射的分散液小滴的体积。此外，可根据缀合物溶液的组成和粘度、所述溶液的滴落速率和量以及所述小滴的表面张力来控制缀合物小滴的大小。溶液小滴可为具有5μl至30μl体积以及0.5mm至5mm直径的小球，但不限于此。
可进一步冻干所述快速冷冻的缀合物结构体以提供冻干的缀合物结构体。在该冷冻干燥方法中，从冷冻的缀合物结构体中去除了溶剂，并因此使所述结构体成为多孔的。按上文描述制备的多孔冻干缀合物结构体可快速溶解于缓冲剂中，使得其可一致地与样品反应。可使用冻干机来进行所述冷冻干燥方法，并且冻干机中的冷却温度可为-20℃或更低。优选地，所述冷却温度可为-40℃或更低，但不限于此。可根据待干燥样品的特征来改变冷冻干燥时间和温度。所制备的冻干缀合物结构体具有70％至90％的孔隙率，并且可立即或在开始溶解程序后5秒内完全溶解于缓冲剂中。
在另一个方面，本发明提供了包含上文描述的冻干缀合物结构体以及免疫层析试纸条的免疫检测试剂盒。
本文所用术语“免疫检测”是指使用诸如抗原-抗体反应的特定免疫反应来检测分析物的方法。在本文中，可使用层析原理进行免疫层析分析。免疫层析分析在包含分析物的样品通过毛细管现象与流动相一起移动通过介质的同时进行。因此，作为用于免疫层析分析的介质，可制备和使用试纸条。该免疫层析试纸条的详细要素和功能将在下文中描述。
如上文所述，免疫层析基于其中含有分析物的流动相沿着介质移动的色谱原理。因此，为了使用免疫层析试纸条进行免疫检测，需要用于使包含分析物的样品沿着试纸条移动的流动相。因此，本发明的免疫检测试剂盒还可包含缓冲剂。所述缓冲剂不仅充当用于使样品沿着免疫层析试纸条移动的流动相，其还充当用于溶解缀合物的溶剂。如果需要，其还可充当用于稀释样品的稀释剂。此外，所述免疫检测试剂盒还可包含用于裂解诸如红细胞的血细胞的组分，以分析全血。作为缓冲剂，可不受限制使用常规缓冲剂，例如，10mM至1M的磷酸盐缓冲液(PBS)、非离子表面活性剂或两性表面活性剂或其混合物。可根据诸如抗原-抗体反应的期望反应类型来适当地选择缓冲剂。
优选地，当使用本发明的免疫检测试剂盒时，在将样品注入免疫层析柱之前，使样品与冻干缀合物结构体的均匀溶液在缓冲剂中反应，以确保缀合物与样品之间的一致性反应，然后可使用测定试纸条分析样品。
为了储存所述冻干缀合物结构体，可将其与包含盖子的腔室一起提供，其被提供以便其溶解于缓冲剂中以及其与样品反应。可直接将缓冲剂和样品添加至保存于所述包含盖子的腔室中的冻干缀合物结构体，使得所述缀合物结构体可被溶解并可与样品一致地反应。当使用所述腔室时，可在用盖子盖住所述腔室的状态下储存冻干缀合物结构体，所述冻干缀合物结构体本身和/或其与缓冲剂及样品的混合物可被储存而不受污染。优选地，所述腔室可为圆锥形，以便能够通过使用诸如移液器的装置将反应混合物溶液容易地加载于试纸条上而不出现损失，但是不限于此。
因为所述冻干缀合物结构体是通过这样的方法得到的结构体，即冷冻作为具有一致体积的小滴的预定浓度的缀合物分散液，然后冻干该冷冻的小滴，所以所述结构具有恒定的缀合物分子含量，并因此适用于对分析物进行定量分析。
此外，所述免疫检测试剂盒还可包含第二冻干缀合物结构体作为内部对照，所述第二冻干缀合物结构体包含第二缀合物，其包含用于信号检测的第二标记物和与报告子分子反应的第二配体，其中所述第二冻干缀合物结构体根据与上文描述的冻干缀合物结构体相同的原理和制备方法提供。如上文所述，可通过在制备冻干缀合物结构体期间将第二缀合物结构体添加至缀合物分散液中来产生单个的结构体，从而提供所述内部对照。可选地，可使用与上文描述相同的方法单独制备所述第二冻干缀合物结构体，并且可将其添加至样品与缀合物的混合物中。所述内部对照和所述报告子分子将在下文中进行描述。
免疫层析试纸条可包含多孔膜垫和吸收垫，在所述多孔膜垫上形成用于捕获样品中的分析物的测试线，所述吸收垫提供于所述多孔膜垫的一端，其作用是为转移分析物提供驱动力。
为了检测样品中的分析物，将能够特异性结合分析物以选择性捕获所述分析物的配体，或与所述分析物相同的物质，或其通过诱导与分析物的竞争反应来检测所述分析物的类似物，作为配体固定于多孔膜垫上，以形成“测试线”。在本发明的免疫层析试纸条的测试线上，可将能够结合样品中的分析物的物质，或与分析物相同的物质，或其可诱导与分析物的竞争反应的类似物，作为第三配体固定。可根据所使用的免疫检测的类型来选择第三配体的种类。免疫检测的类型将在下文中描述。如同所述缀合物中包含的配体，与报告子分子反应的第二配体，以及结合样品中的分析物的第三配体，可为例如，抗原、抗体、受体或特异性结合受体的配体。
作为流动相和样品沿着其迁移的介质，可使用多孔膜垫以使流动相和样品可通过毛细管现象而移动。在多孔膜垫的一端，布置为转移样品提供驱动力的吸收垫。将所述吸收垫布置为使其与所述多孔膜垫部分重叠。用于本发明的膜可为硝化纤维素膜、玻璃纤维膜、聚醚砜(PES)膜、纤维素膜、尼龙膜或其两种或更多种的组合。优选地，本发明可使用孔径为5μm至15μm的硝酸纤维素膜，但不限于此。
免疫层析试纸条还可包含固体垫板。固体垫板可由塑料材料制成。当将所述试纸条结合于所述固体垫板时，其可具有增加的耐久性，并且可容易地进行处理和储存。此外，所述固体垫板使其易于将所述试纸条安装于外部箱体中。可用于固体垫板的塑料材料的实例包括但不限于，聚丙烯膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、丙烯酸膜等。
可将所述免疫层析试纸条安装于箱体单元中。下部箱体可包含多个导引部和/或试纸条支承部，其功能是在合适的位置布置并固定或按压所述免疫层析试纸条。上部箱体可具有处于下部箱体的导引部或试纸条支承部对应位置的导引部和试纸条支承部。换言之，所述导引部和/或所述试纸条支承部可仅在下部箱体中形成，或在上部箱体与下部箱体中都形成。上部箱体可具有处于所述测试线对应位置的样品导入口和用于检测来自标记物的信号的观察窗。样品导入口可在多孔膜的一端以小孔或狭缝的形式形成，其相对于测试线位于所述吸收垫的对面，并与所述吸收垫分开足够远，以使样品可沿着所述膜迁移。可在所述多孔膜的所述测试线对应位置处和/或在包含测试线和对照线(如果形成的话)的位置处形成观察窗，以使得具有足够的大小来视觉观察或使用传感器观察所述测试线和/或所述控制线。所述观察窗的大小和形状没有限制，只要能够通过所述观察窗观察所述测试线和/或所述控制线即可。
所述上部箱体和所述下部箱体可由常规塑料材料制成，例如聚碳酸酯或丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)，但不限于此。可单独制备所述上部箱体和所述下部箱体，并通过诸如耦接凹槽和耦接凸起的常规方法彼此耦接。在一些情况下，所述上部箱体和所述下部箱体可以整体形式制备。
当使用本发明的免疫检测试剂盒时，结合至所述第一缀合物的分析物，即通过所述第一配体结合至所述第一标记物的分析物，通过与之特异性结合的所述第三配体而被捕获于所述测试线上，并且可通过测量从所述测试线上的所述第一标记物产生的信号来确定所述样品中的所述分析物的存在与否、量或二者。换言之，可基于是否存在从所述测试线上的所述第一标记物产生的信号来定性分析所述分析物，并且还可通过测量从所述测试线上的所述第一标记物产生的信号的强度来定量分析所述分析物。
因此，所述免疫层析试纸条还可在测试线之前或之后包含用于确定所述样品是否迁移的对照线。可通过在所述多孔膜上的测试线之前或之后，于距所述测试线合适距离处固定报告子分子来形成所述对照线。
本文所用术语“对照线”是指无论样品类型或样品中分析物的浓度都产生恒定信号的部分。可通过与用于形成所述测试线的方法相似的方法来形成所述对照线。例如，可通过固定配体物质形成对照线，所述配体物质不结合待分析的物质，并且同时能够特异性结合并捕获第二缀合物的配体，其被包含于样品和所述缀合物的混合物中作为内部对照，并通过流动相与样品一起沿着所述多孔膜移动，从而不管所述样品中分析物的浓度以及是否存在都发射恒定的信号。可用于所述对照线的配体在本文中被称为“报告子分子”。用于本发明的报告子分子的实例包括抗兔IgG、抗鸡IgY、链霉亲和素等。可根据所使用的抗原-抗体反应等适当地选择所述测试线和所述对照线的尺寸和位置。可基于从对照线发射的信号的存在与否来确定所述样品是否迁移，并且可通过比较所述测试线的信号强度与所述对照线的信号强度来进行所述分析物的定量分析。
根据原理可将免疫检测大致分为两类：三明治测定和竞争性或抑制性测定。在三明治测定的情况下，所述缀合物的第一配体首先与样品中的分析物发生免疫反应从而形成免疫复合物。所述免疫复合物通过流动相沿着免疫层析试纸条移动，并且被其上具有固定的特异性结合所述分析物的第三配体的测试线免疫特异性结合和捕获。另一方面，在竞争性或抑制性测定的情况下，将特异性结合所述缀合物的第一配体的第三配体固定于所述多孔膜的测试线上。所述第三配体可为与样品中的分析物相同的物质，或其类似物，但是任何物质都可用作第三配体而无限制，只要其可与所述分析物竞争结合所述第一配体。因为由所述测试线通过免疫反应所捕获的缀合物的标记物产生的信号强度与样品中的分析物浓度成正比或成反比，所以可基于所述信号是阳性或阴性来定性分析所述分析物的存在与否，并且可通过将所述信号的强度与标准比色系统或内部对照进行比较来定量分析所述分析物。
在另一方面，本发明提供了用于使用上述免疫检测试剂盒来定性或定量分析样品中的分析物的方法，所述方法包括：同时或顺序添加缓冲剂和样品至缀合物结构体，并同时或顺序进行所述缀合物结构体的溶解和所述缀合物与所述样品间的反应；将产生自前述步骤的物质加载于免疫层析试纸条上，并使所加载的物质沿着所述试纸条迁移；以及确定从测试线上的第一标记物产生的信号的存在与否及其强度。
使用本发明的免疫检测试剂盒定性和/或定量分析样品中的分析物的原理如上文所描述。
可根据以下方法来进行本发明的免疫检测方法。首先，将所述缀合物结构体溶解于缓冲剂中，然后向溶液中添加样品并与之均匀混合，并使所述混合物反应预定时间。可选地，可同时将缓冲剂和样品添加至所述缀合物结构体，以使所述缀合物结构体溶解，并且同时可使其与所述样品中的分析物反应。优选地，使所述缀合物完全溶解于缓冲剂中，以形成所述缀合物分子的均匀分散液，并将样品添加至所述分散液，以与所述样品中的分析物发生免疫反应。然而，缀合物结构体、缓冲剂以及样品混合或彼此反应的顺序没有限制，只要所述缀合物结构体可完全溶解以使所述缀合物分子可一致地溶解于溶液中并充分地与所述样品反应而形成免疫复合物即可。然后，将从所述溶解和免疫反应步骤产生的包含免疫复合物的溶液加载至所述免疫层析试纸条上，并使其沿着所述试纸条迁移，然后可通过确定产生自所述测试线上的所述第一标记物的信号的存在与否和强度来进行所述样品中分析物的定性分析或定量分析。
因为包含沿着所述试纸条的所述多孔膜迁移的分析物的溶液变得更均匀，所以流动相的迁移速度和抗原-抗体反应时间变得更加恒定，并且因此，提高了样品分析的精确性。因此，本发明的测试方法适于提高分析的精确性，所述方法包括，将样品与缀合物的均匀溶液在缓冲剂中混合，使所述混合物充分反应，将所述反应混合物加载至免疫层析试纸条上，并使所加载的混合物沿着所述试纸条迁移。
在本发明的实施例中，进行了本发明的测定方法和采用还包含其上吸附有缀合物的缀合物垫的免疫检测试纸条的常规测定方法，并且将这些测定方法的结果彼此进行比较。结果，表明使用本发明的方法可在糖基化的血红蛋白分析中得到更高再现性的结果(表1)。此外，其还表明，糖基化的血红蛋白浓度与定量分析中测得的信号强度彼此高度线性相关(图6)。
用于本发明的免疫检测的样品的实例包括分离自哺乳动物优选人的所有生物学样品，包括全血、血细胞、血清、血浆、骨髓、汗、尿、泪、唾液、皮肤、黏膜和毛发。例如，所述样品可为血液。所述血液样品可为不含血细胞的血清或血浆。当使用全血时，可使用包含能够裂解血细胞的组分的缓冲剂。
本发明的免疫检测方法可用于使用全血作为样品来分析血糖水平和诊断疾病。所述疾病的实例包括疟疾抗原(Ag)、AIDS、丙肝、乙肝、梅毒、引起胃溃疡的微生物、癌症标记物(AFP、PSA、CEA)、结核病、SAS、登革热和麻风。优选地，所述分析物可为糖基化的血红蛋白，但不限于此。
根据本发明的具体实施方案，可通过如下方法测量血液中的糖基化血红蛋白的浓度：使用血液作为样品，固定抗糖基化的血红蛋白的抗体作为测试线上的第二配体，以及测量由测试线捕获的缀合物的标记物产生的信号强度。例如，可使用分光光度计作为传感器来进行所述测量，但所述检测方法不限于此。糖基化的血红蛋白的浓度一般表示为糖基化的血红蛋白浓度相对于总血红蛋白浓度的百分比。糖基化的血红蛋白浓度(HbA1c)相对于总血红蛋白浓度(总Hb)的百分比可使用以下方程式进行计算。当糖基化的血红蛋白浓度的百分比为3％至6.5％时，所述样品被判定为正常，并且当所述百分比为6.5％至20％时，所述样品被诊断为糖尿病。
为了测量人红细胞中血红蛋白和糖基化的血红蛋白的浓度，需要裂解红细胞的步骤。如同常规的糖基化的血红蛋白分析，本发明的测定方法可包括裂解红细胞的预处理步骤。可通过将血细胞裂解缓冲剂添加至用于样品预处理步骤的液体缓冲剂中来同时进行红细胞的裂解和缀合物-样品反应。因此，本发明的试剂盒非常适合用作即时测试试剂盒。
在下文中，将参照附图来详细描述本发明。
图3是根据本发明的实施方案的免疫检测装置的分解透视图；图4是根据本发明的冻干缀合物的图像；并且图5按顺序示出根据本发明的免疫检测方法的步骤。如图3和图5中所示，根据本发明的免疫检测装置包括：包含在其上形成了测试线的多孔膜的至少一个膜试纸条，所述测试线上固定有通过免疫特异性反应(即，抗原抗体反应)结合样品中的可检测分析物和/或缀合物的结合剂(抗原、抗体或配体)，以通过免疫层析测定来定性或定量分析所述分析物；覆盖所述膜试纸条的上部并且具有样品导入口和观察窗的上部箱体；覆盖所述膜试纸条的下部并且具有样品储库的下部箱体；以及样品预处理装置(图5)，其包含含有所述缀合物的冻干缀合物，并且其用于将所述样品、液体缓冲剂和所述缀合物彼此混合，并将混合物导入样品储库中。可选地，所述免疫检测装置可仅由所述膜试纸条和所述样品预处理装置组成。
实施例
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。但是应理解，这些实施例仅用于举例说明的目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：使用冻干缀合物珠分析糖基化的血红蛋白
A.抗体固定的硝酸纤维素垫的制备
以1mg/ml的浓度将糖基化的血红蛋白的单克隆抗体稀释于0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后使用分散器将其喷射于硝酸纤维素垫(宽度：25mm；孔径：10μm至12μm)的测试线位置上。同时，将通过将兔免疫球蛋白G接种于小鼠中而得到的抗兔免疫球蛋白G抗体以1mg/ml的浓度稀释于0.1M PBS中，喷射于硝化纤维素垫的对照线位置上，并在孵育器中于37℃下干燥以使其固定。在硝化纤维素垫的除固定了抗体部分以外的部分上，喷射包含0.05wt％牛血清白蛋白、4wt％蔗糖和0.0625wt％离子型表面活性剂的PBS，以进行封闭，并使其在孵育器中于30℃下干燥60分钟至120分钟。将所得到的硝化纤维素垫与其上涂有黏合剂的聚丙烯垫板结合，然后将吸收垫(Millipore，美国)与所述消化纤维素垫结合以使其重叠1mm。
B.包含抗体-胶乳缀合物的冻干缀合物珠的制备
以如下方法来制备缀合物溶液。首先，以多种浓度将每种抗糖基化的血红蛋白单克隆抗体和兔免疫球蛋白G添加至1ml于0.1M MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲剂(pH 6.0)中的胶乳水溶液中，然后于37℃使其在孵育器中反应1小时。将每种得到的缀合物溶液在12,000rpm下离心一次，并去除上清液，然后去除未反应的抗体。向剩余的物质中添加包含1wt％牛血清白蛋白的缓冲液，并使其反应24小时，以使未反应的胶乳表面被牛血清白蛋白封闭。所用的缓冲液为0.1M PBS，其除1wt％牛血清白蛋白之外，还包含0.5wt％蔗糖、1wt％PEG(聚乙二醇)、1wt％PVA(聚乙烯醇)等。
使用分散器将所得到的包含缀合物的溶液以具有20μl体积的小滴形式逐滴添加至液氮中，以使其快速冷冻。重复该快速冷冻处理以得到缀合物珠，然后在冻干机中将其冻干20小时。
C.免疫检测装置的制备
将步骤A中制备的试纸条安装于下部箱体中，然后用上部封盖覆盖，从而制备根据本发明的实施方案的免疫检测试纸条装置(图3)。将步骤B中制备的每种冻干缀合物珠(图4)放置于预处理装置(图5)中，然后用盖子覆盖。将制备的免疫检测试纸条装置和预处理装置除湿、密封、包装于单个小袋(pouch)中并储存。
比较例1：包含缀合物垫的常规测定试纸条的制备
A.抗体固定的硝酸纤维素垫的制备
以和实施例1的步骤A中所描述的方法相同的方法制备抗体固定的硝化纤维素垫。
B.抗体-胶乳缀合物垫的制备
以和实施例1的步骤B中所描述的方法相同的方法制备抗体-胶乳缀合物溶液。使用分散器以10μl/25mm2的密度将所制备的缀合物溶液施用至图1所示的玻璃纤维垫。用液氮快速冷冻具有对其施用的所述抗体-胶乳缀合物的垫，然后在冻干机中干燥20小时，并将干燥的垫切成7mm×30mm的大小。
将得到的缀合物与其上涂有黏合剂的聚丙烯垫板结合，以使1mm的缀合物垫与结合于垫板的硝化纤维素垫的下侧重叠。
C.免疫检测装置的制备
将包括在比较例1的步骤A和B中制备的硝化纤维素垫和缀合物垫在内的垫按图1所示布置，使它们彼此重叠。将该装置安装于下部箱体中，并用上部箱体覆盖，从而制备根据比较例的免疫检测试纸条装置(图2)。将制备的免疫检测试纸条装置除湿、密封、包装于单个小袋中并储存。
测试例1：分别采用缀合物垫和冻干缀合物珠的测定试纸条之间的针对糖 基化的血红蛋白的测量性能的比较
为了比较实施例1和比较例1中制备的测定试纸条之间的性能，使用每种测定试纸条测量10个血液样品中的糖基化的血红蛋白水平，每个样品测量10次。此外，使用自动测试系统(Variant II Turbo；Bio-RadLaboratories,Hervules，美国加利福利亚)测量在上述测量中所用的10个血液样品中的每一个中的糖基化的血红蛋白水平，并与使用实施例1和比较例1中制备的测定试纸条得到的测量结果进行比较。用能够测量膜的包括测试线和对照线在内的特定区域的光强度的分光光度计，将使用所制备的测定试纸条得到的测量结果表示为数值。从通过分光光度计测得的测试线和对照线中的数值计算糖基化的血红蛋白水平(HbA1c％)。计算结果在下表1中示出。
表1：糖基化的血红蛋白测量的性能比较
如在上表1中可见到的，与使用比较例1中制备的测定试纸条得到的测量值相比，使用实施例1中制备的测定试纸条得到的测量值具有高再现性(低变异系数；CV％)。此外，当将测量值与通过自动测试系统得到的测量值相比时，可见到，与使用比较例1的测定试纸条得到的测量值相比，使用实施例1的测定试纸条得到的测量值具有低变异性。换言之，其表明，与使用常规方法相比，使用本发明的测定试纸条测量糖基化的血红蛋白的方法的使用显示高的精确性和再现性。
测试例2：分别采用缀合物垫和冻干缀合物珠的免疫检测装置之间的定量 分析糖基化的血红蛋白的能力的比较
为了比较实施例1中和比较例1中制备的免疫检测装置之间的定量分析能力，分析了12个包含多种浓度的糖基化的血红蛋白的血液样品。此外，使用如测试例1中描述的自动测试系统(Variant II；Bio-RadLaboratories,Inc)测量在上述分析中所用的12个样品中的每一个中的糖基化的血红蛋白水平，并分析其与糖基化的血红蛋白浓度的关系。分析结果在图6中示出。在图6中，菱形表示通过本发明的实施例1中制备的免疫检测装置测量的信号值(强度)，并且方块表示通过比较例1中制备的免疫检测装置测量的信号值(强度)。如在图6中可见到的，通过本发明的免疫检测装置得到的测量值与糖基化的血红蛋白的浓度成比例，并且在包括可诊断糖尿病的范围在内的较宽浓度范围内具有高线性度(R2＝0.996)。另一方面，类似于常规免疫检测装置，通过比较例1的免疫检测装置得到的测量值显示整体与糖基化的血红蛋白浓度成比例的趋势，但是具有较低的线性度(R2＝0.919)，并且特别地，显示包含浓度为5％至8％(包括用于诊断糖尿病的标准6.5％)的糖基化的血红蛋白的样品的不可靠的低线性度(R2＝0.747；数据未示出)。在依赖于浓度的测试中使用的样品的糖基化的血红蛋白浓度和测量值概括于下表2中。
表2：定量分析糖基化的血红蛋白能力的比较
样品号 HbA1c A(◆) B(■)
样品1 5.1％ 0.85709 0.74213
样品2 5.4％ 0.87160 0.77635
样品3 6.6％ 0.93709 0.78221
样品4 6.7％ 0.93586 0.79454
样品5 7.1％ 0.96748 0.80414
样品6 8.0％ 1.01602 0.93555
样品7 9.5％ 1.09534 0.99538
样品8 11.1％ 1.18901 1.02154
样品9 11.0％ 1.18645 1.00212
样品10 5.6％ 0.89845 0.75455
样品11 6.1％ 0.91795 0.80114
样品12 6.8％ 0.96111 0.85412
A：本发明的免疫检测装置(实施例1)；
B：常规免疫检测装置(比较例1)。
测试例3：糖基化的血红蛋白测量值随冻干缀合物的小滴体积的变化
为了证明制备的冻干缀合物结构体在小滴体积中的一致性与定量分析能力紧密相关，制备了六种不同的冻干缀合物结构体，每种由具有5μl、10μl、15μl、20μl、25μl或30μl的一致体积的小滴制得，并对糖基化的血红蛋白进行定量分析。继而将5个具有不同的糖基化的血红蛋白浓度的样品施用至所述六种不同的冻干缀合物结构体，然后测量糖基化的血红蛋白水平。下表3示出了样品的糖基化的血红蛋白值，以及来自施用至其中的各冻干缀合物结构体的测量值。此外，图7中示出了生成的图。
表3：根据冻干缀合物的小滴体积的糖基化的血红蛋白测量值
HbA1c％ 5μl 10μl 15μl 20μl 25μl 30μl
5.4％ 0.7245 0.7845 0.8241 0.8716 0.8944 0.9123
7.2％ 0.8124 0.8874 0.9214 0.96748 0.9541 1.001
9.5％ 0.9841 1.015 1.0135 1.09534 1.1121 1.1231
11.4％ 1.0245 1.1112 1.1231 1.18901 1.2234 1.2234
13.8％ 1.0844 1.1945 1.2121 1.2752 1.2955 1.3454
如在表3和图7中可见到的，在由具有一致体积的小滴制成的冻干缀合物结构体中，糖基化的血红蛋白浓度与糖基化的血红蛋白值之间具有高度的线性相关性。通过测试还证实，在浓度水平相同的的样品中，糖基化的血红蛋白值随着冻干缀合物的小滴体积增加而轻微增加。该结果表明，使用以具有5μl至30μl的一致体积的小滴制成的冻干缀合物结构体，有助于提高免疫检测试剂盒定量分析的精确性和再现性，从而允许更精确的定性测定和定量测定。
同时，还发现，在以具有不同体积的小滴制成的冻干缀合物结构体中，信号的强度不仅受到样品中糖基化血红蛋白浓度的影响，而且甚至还受到冻干缀合物小滴体积的影响。例如，当采用具有15μl体积的冻干缀合物结构体时，具有的糖基化的血红蛋白浓度为11.4％的样品显示1.1231的糖基化的血红蛋白值，并且采用具有30μl体积的冻干缀合物结构体在具有的糖基化的血红蛋白浓度为9.5％的样品中获得了同样的糖基化的血红蛋白值(1.1231)。这提示，如果冻干缀合物结构体由不同体积的小滴制成，则样品分析的精确性得不到保证，因为不清楚得到了什么样的样品测量值。这还提示，如果采用以不同体积的小滴制成的冻干缀合物结构体，则可能降低定量分析的精确性和再现性。

Claims (24)

1.用于免疫层析分析的冻干缀合物结构体，其包含第一缀合物，所述第一缀合物包含用于信号检测的第一标记物和与分析物反应的第一配体，其中所述第一标记物和所述第一配体在物理上或化学上彼此连接，并且所述缀合物结构体通过以下方式形成：快速冷冻这样的分散液，在所述分散液中预定浓度的所述第一缀合物以具有一致体积的小滴形式分散于溶剂中，然后冻干，从而去除所述溶剂，其中通过去除所述溶剂，所述冻干小滴中由所述溶剂占据的空间形成多孔空间。
2.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述第一标记物选自胶乳颗粒、金颗粒、有色聚苯乙烯微粒、酶、荧光染料、导电聚合物和磁颗粒。
3.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其还包含第二缀合物，所述第二缀合物包含用于信号检测的第二标记物和与受体分子反应的第二配体，其中所述第二标记物和所述第二配体在物理上或化学上彼此连接，并且所述第二标记物与所述第一标记物相同或不同。
4.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述配体为抗原、抗体、受体或受体的配体。
5.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中通过将所述分散液逐滴添加至具有-270℃至-180℃的蒸发点的液体中来进行所述快速冷冻。
6.如权利要求5所述的冻干缀合物结构体，其中所述液体是液氮或液氦。
7.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中通过使用分散器添加具有一致体积的所述小滴来进行所述快速冷冻。
8.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述免疫层析分析用于定性分析或定量分析。
9.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述小滴具有5μl至30μl的体积。
10.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述缀合物结构体具有70％至90％的孔隙率。
11.如权利要求1所述的冻干缀合物结构体，其中所述缀合物结构体立即或在5秒内完全溶解于缓冲剂中。
12.免疫检测试剂盒，其包含权利要求1至11中任一项所述的冻干缀合物结构体，以及免疫层析试纸条。
13.如权利要求12所述的免疫检测试剂盒，其还包含用于溶解所述冻干缀合物结构体的缓冲剂。
14.如权利要求13所述的免疫检测试剂盒，其中所述缓冲剂充当用于溶解所述缀合物的溶剂，或用于层析分析的流动相。
15.如权利要求13所述的免疫检测试剂盒，其中所述缓冲剂起稀释样品或裂解血细胞的作用。
16.如权利要求12所述的免疫检测试剂盒，其还包含含有第二缀合物的冻干缀合物结构体，所述第二缀合物包含用于信号检测的第二标记物和与受体分子反应的第二配体，其中所述第二标记物与所述第二配体在物理上或化学上彼此连接，并且所述缀合物结构体通过以下方式形成：快速冷冻这样的分散液，在所述分散液中所述第二缀合物以具有一致体积的小滴形式分散于溶剂中，然后冻干，从而去除所述溶剂，其中通过去除所述溶剂，所述冻干小滴中由所述溶剂占据的空间形成多孔空间。
17.如权利要求12所述的免疫检测试剂盒，其中所述免疫层析试纸条包含多孔膜垫和吸收垫，在所述多孔膜垫上形成用于捕获样品中的分析物的测试线，所述吸收垫提供于所述多孔膜垫的一端，并用于为转移所述分析物提供驱动力。
18.如权利要求17所述的免疫检测试剂盒，其中所述免疫层析试纸条还包含处于下面的固体垫板。
19.如权利要求17所述的免疫检测试剂盒，其中所述所述免疫层析试纸条被安装于包含上部箱体和下部箱体的箱式单元中，其中所述下部箱体包含导引部或试纸条支承部，并且所述上部箱体包含样品导入口和处于测试线对应位置的观察窗。
20.如权利要求17所述的免疫检测试剂盒，其中所述测试线具有固定于其上的第三配体，所述第三配体特异性结合所述样品中的所述分析物。
21.如权利要求20所述的免疫检测试剂盒，其中通过所述第一配体与所述第一标记物结合的所述分析物被所述测试线上的所述第三配体捕获，并且通过测量由所述测试线上的所述第一标记物产生的信号来确定所述样品中的所述分析物的存在、量或二者。
22.如权利要求17所述的免疫检测试剂盒，其中所述免疫层析试纸条在所述测试线之前或之后还包含用于确定所述样品是否发生迁移的对照线，其中所述对照线具有固定于其上的报告子分子。
23.使用权利要求12所述的免疫检测试剂盒定性或定量分析样品中的分析物的方法，所述方法包括：
同时或顺序添加缓冲剂和样品至缀合物结构体，并同时或顺序进行所述缀合物结构体的溶解和所述缀合物与所述样品间的反应；
将产生自前述步骤的物质加载于免疫层析试纸条上，并允许所述加载的物质沿着所述试纸条迁移；以及
确定从测试线上的第一标记物生成的信号的存在与否及其强度。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述样品是全血、血清或血浆，并且所述分析物是糖基化血红蛋白。
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