CN105675884A - 一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，采用以下步骤：a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：采用EDC介导法偶联铕标记聚苯乙烯纳米球和牛毛检测抗体，制得荧光标记牛毛检测抗体；b.试纸的组装：将荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，进行干燥；将牛毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，进行干燥；分别将样品垫、荧光标记结合垫、硝酸纤维素膜垫和吸水垫组装在PVC底板上，将组装好的板条切成条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。利用本发明方法制备的检测试纸对古代牛毛微痕迹进行检测时，具有快速、准确、高灵敏性的特点。

Description

一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法。
背景技术
牛毛及牛毛制品的主要成分是蛋白质，长期埋藏在地下环境中，受到湿、热和微生物等因素的影响，纤维会发生不同程度的降解；出土后因环境条件的剧烈变化，进一步加速了纤维的老化。因此，在漫长的历史进程中，当年埋入墓葬或遗址中的一些牛毛及其制品早已失去了实体面貌，降解成肽段和氨基酸，或者成为痕迹，或者化入泥土，在肉眼下已经无法辨识，且年代越早的证据越难寻觅，给牛毛类文物的鉴定和保护研究带来了很大的困难。因此如何利用现代先进的自然科学手段，从牛毛微痕迹中提取古代牛毛的信息，具有重要的科学和文化价值。
对于出土时严重糟朽的牛毛类文物，普通的分析检测技术，如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，X-衍射分析、质谱等，在遇到这种微痕迹类残留物分析时，往往束手无策。国内外对于牛毛微痕迹的鉴定，大多数还停留在对纤维形态的分析上，所得出的鉴定结果也没有十足的准确性。因此，寻找一种更为科学的手段来鉴定牛毛微痕迹是非常必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法。利用本发明方法制备的检测试纸对古代牛毛微痕迹进行检测时，具有快速、准确、高灵敏性的特点。
本发明的具体技术方案为：一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，采用以下步骤：
a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺介导法偶联铕标记聚苯乙烯纳米球和牛毛检测抗体，制得荧光标记牛毛检测抗体。
b.试纸的组装：将上述制备的荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，然后置于36-38℃下干燥；将牛毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，并置于36-38℃下干燥；在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1cm处粘贴荧光标记结合垫，所述荧光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合1mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合1mm；将组装好的板条切成条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。
作为优选，所述荧光标记牛毛检测抗体的制备方法具体为：分别将铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和牛毛检测抗体加入到20mmol/L的PBS缓冲液中；在室温条件下搅拌反应1.5-2.5h后，将得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，然后重新分散于含有0.05%（w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl溶液中封闭未反应的羧酸盐；最后采用离心法收集得到荧光标记牛毛检测抗体，将抗体于4℃下保存备用。
作为优选，所述铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和牛毛检测抗体的质量比为1:90:30。
作为优选，在步骤b中荧光标记牛毛检测抗体的喷涂量为1μL/cm。
作为优选，在步骤b中牛毛角蛋白抗原的浓度为4.8mg/mL；山羊抗兔抗体的浓度为1.5mg/mL；牛毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体的用量为1μL/cm。
作为优选，步骤b中切成条状后的检测试纸的宽度为4mm。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）免疫检测技术是以特定抗体作为分析试剂，然后对待测物进行定量或者定性分析的一种方法。它是将免疫反应与现代的测试技术相结合而建立的一种超微量测定技术，具有灵敏度高、特异性强、快速和高效的特点。
（2）在检测过程中，可以通过延长检测时间，来消除背景荧光造成的干扰。因此，该试纸能够保持较高的灵敏度。另外，将荧光技术和免疫层析技术相结合，除去了繁琐的洗涤步骤，具备操作简单的优点。相对于胶体金免疫层析技术，检测灵敏度比较高，并且可以进行相对准确的定量分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，采用以下步骤：
a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：分别加入1μg铕标记聚苯乙烯纳米球、30uL3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和30uL1mg/mL牛毛检测抗体到10mL的20mmol/L的PBS（pH7.4）缓冲液中；在室温条件下搅拌反应2小时后，得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，重新分散于含有0.05%（w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl中封闭60min。制备得到的荧光标记牛毛检测抗体采用离心法收集，离心速度为15000r/min，4℃冰箱中保存备用。
b.试纸的组装：将上述制备的荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上（喷涂量为1μL/cm），然后置于37℃下干燥；将浓度为4.8mg/mL的牛毛角蛋白抗原和浓度为1.5mg/mL的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上（喷涂量为1μL/cm），并置于37℃下干燥；在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1cm处粘贴荧光标记结合垫，所述荧光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合1mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合1mm；将组装好的板条切成宽度为4mm的条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。
c.试纸的特异性检测：取2mg古代牛毛微痕迹样品，研磨均匀，溶解于2mLPBS(pH7.4)缓冲液中，搅拌均匀，1h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上；25min后，将试纸置于波长为365nm的紫外荧光激发器下检测，如果只有质控线显出荧光条带，说明样品中含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品为牛毛微痕迹；如果质控线和检测线均显出荧光条带，说明样品中不含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品不是牛毛微痕迹。
实施例2
一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，采用以下步骤：
a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：分别加入1μg铕标记聚苯乙烯纳米球、30uL3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和30uL1mg/mL牛毛检测抗体到10mL的20mmol/L的PBS（pH7.4）缓冲液中；在室温条件下搅拌反应1.5小时后，得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，重新分散于含有0.05%（w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl中封闭60min。制备得到的荧光标记牛毛检测抗体采用离心法收集，离心速度为15000r/min，4℃冰箱中保存备用。
b.试纸的组装：将上述制备的荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上（喷涂量为1μL/cm），然后置于36℃下干燥；将浓度为4.8mg/mL的牛毛角蛋白抗原和浓度为1.5mg/mL的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上（喷涂量为1μL/cm），并置于36℃下干燥；在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1cm处粘贴荧光标记结合垫，所述荧光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合1mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合1mm；将组装好的板条切成宽度为4mm的条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。
c.试纸的特异性检测：取2mg古代牛毛微痕迹样品，研磨均匀，溶解于2mLPBS(pH7.4)缓冲液中，搅拌均匀，1h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上；25min后，将试纸置于波长为365nm的紫外荧光激发器下检测，如果只有质控线显出荧光条带，说明样品中含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品为牛毛微痕迹；如果质控线和检测线均显出荧光条带，说明样品中不含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品不是牛毛微痕迹。
实施例3
一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，采用以下步骤：
a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：分别加入1μg铕标记聚苯乙烯纳米球、30uL3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和30uL1mg/mL牛毛检测抗体到10mL的20mmol/L的PBS（pH7.4）缓冲液中；在室温条件下搅拌反应2.5小时后，得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，重新分散于含有0.05%（w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl中封闭60min。制备得到的荧光标记牛毛检测抗体采用离心法收集，离心速度为15000r/min，4℃冰箱中保存备用。
b.试纸的组装：将上述制备的荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上（喷涂量为1μL/cm），然后置于38℃下干燥；将浓度为4.8mg/mL的牛毛角蛋白抗原和浓度为1.5mg/mL的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上（喷涂量为1μL/cm），并置于38℃下干燥；在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1cm处粘贴荧光标记结合垫，所述荧光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合1mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合1mm；将组装好的板条切成宽度为4mm的条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。
c.试纸的特异性检测：取2mg古代牛毛微痕迹样品，研磨均匀，溶解于2mLPBS(pH7.4)缓冲液中，搅拌均匀，1h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上；25min后，将试纸置于波长为365nm的紫外荧光激发器下检测，如果只有质控线显出荧光条带，说明样品中含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品为牛毛微痕迹；如果质控线和检测线均显出荧光条带，说明样品中不含有牛毛角蛋白，该微痕迹样品不是牛毛微痕迹。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
a.荧光标记牛毛检测抗体的制备：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺介导法偶联铕标记聚苯乙烯纳米球和牛毛检测抗体，制得荧光标记牛毛检测抗体；
b.试纸的组装：将上述制备的荧光标记牛毛检测抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，然后置于36-38℃下干燥；将牛毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，并置于36-38℃下干燥；在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1cm处粘贴荧光标记结合垫，所述荧光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合1mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合1mm；将组装好的板条切成条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。
2.如权利要求1所述的一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述荧光标记牛毛检测抗体的制备方法具体为：分别将铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和牛毛检测抗体加入到20mmol/L的PBS缓冲液中；在室温条件下搅拌反应1.5-2.5h后，将得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，然后重新分散于含有0.05%（w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl溶液中封闭未反应的羧酸盐；最后采用离心法收集得到荧光标记牛毛检测抗体，将抗体于4℃下保存备用。
3.如权利要求2所述的一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和牛毛检测抗体的质量比为1:90:30。
4.如权利要求1所述的一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤b中荧光标记牛毛检测抗体的喷涂量为1μL/cm。
5.如权利要求4所述的一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤b中牛毛角蛋白抗原的浓度为4.8mg/mL；山羊抗兔抗体的浓度为1.5mg/mL；牛毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体的用量为1μL/cm。
6.如权利要求1所述的一种古代牛毛微痕迹荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤b中切成条状后的检测试纸的宽度为4mm。
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