CN114846331A

CN114846331A - 用于免疫分析系统的选择性白细胞裂解

Info

Publication number: CN114846331A
Application number: CN202080088890.XA
Authority: CN
Inventors: R·P·桑伯斯基
Original assignee: Rapid Pathogen Screening Inc
Current assignee: Rapid Pathogen Screening Inc
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-08-02
Also published as: EP4077657A4; US12078636B2; CA3165294A1; WO2021127374A1; AU2020407110A1; EP4077657A1; US20230026491A1

Abstract

一种具有选择性白细胞(WBC)裂解的试纸条，用于WBC内容物的释放和红细胞(RBC)的捕获与保留，允许用于快速清除和结果判读，并在早期时间点获得更准确的结果，因为缺乏由RBC裂解的的背景红色血红素颜色引起的红色干扰。去除红色干扰提高试纸条的目视和数字判读，例如免疫分析测试的试纸条。该试纸条同时改善了WBC胞内蛋白和RBC胞外蛋白的检测，如MxA和CRP、MxA和PCT、MxA和HNL、以及MxA和IL‑6、MxA和髓样细胞(sTREM‑1)、MxA和血管生成素2、MxA和血管内皮生长因子(VEGF)或其可溶性血管内皮生长因子受体‑1(sVEGFR1)，MxA和肝素结合蛋白(HBP)或其他组合。

Description

用于免疫分析系统的选择性白细胞裂解

背景技术

技术领域

本发明属于免疫分析系统领域。更具体地说，本发明涉及具有选择性或优先的白细胞裂解的免疫分析系统。

相关技术

大多数全血免疫分析系统使用各种过滤器阻止所有血细胞(包括红细胞和白细胞)，仅允许血清或血浆通过进行检测。虽然这一方法是有效的，但它不适用于同时检测细胞内白细胞蛋白质和细胞外血清或血浆成分的系统。在传统的分析中，全血样本中的所有血细胞都会被裂解，释放出细胞内白细胞蛋白质和红细胞血红素(heme)，血红素加深了试纸条红色的红色背景，这会减慢测试结果的速度并使结果模糊，该结果利用目视判读或使用电子读取仪读取。传统的读取仪已经采用了各种技术来克服红色背景，主要是通过物理上保留所有血细胞，而只允许血清或血浆通过进行蛋白质检测。

发明内容

一种同时进行细胞内白细胞(WBC)蛋白质和血清蛋白质检测的免疫分析方法。

一种具有选择性白细胞(WBC)裂解的试纸条，用于WBC内容物的释放和红细胞(RBC)的同时捕获和保留，因为缺乏由RBC裂解的背景红色血红素颜色引起的红色干扰，所以可以降低背景影响，更快地进行清除和结果判读，并在早期时间点获得更准确的结果。去除红色干扰提高试纸条(如免疫分析试纸条)的目视判读和数字判读。该试纸条同时提高WBC胞内蛋白和RBC胞外蛋白的检测，如MxA和CRP、MxA和PCT、MxA和HNL、MxA和IL-6、MxA和髓样细胞(sTREM-1)、MxA和肝素结合蛋白(HBP)或其他胞内蛋白和胞外蛋白的组合。

在本发明的一个实施例中，免疫分析测试的试纸条具有吸收垫、血液分离垫、结合垫和膜垫，所有这些垫都粘附至背衬卡(backing card)。吸收垫与血液分离垫重叠。血液分离垫与结合垫重叠，且结合垫与膜垫重叠。试纸条的相邻垫之间不存在间隙。白细胞的选择性裂解发生在吸收垫上，并且红细胞的任何裂解和相关血红素的吸收都发生在血液分离垫上，从而减少试纸条上存在的红色干扰，减少目视和数字读取试纸条所需的时间。免疫分析试纸条可以是侧向流动层析试纸条或其他免疫分析试纸条。

附图说明

图1示出了本发明实施例的具有白细胞选择性裂解的试纸条的示意图。

图2示出了施加于两张试纸条的tris缓冲液、施加于两张试纸条的未诱导的血样和施加于两张试纸条的经诱导的血样的测试线颜色强度图。

图3示出了未诱导和经诱导的血液样本相对于tris缓冲液样本的测试线颜色强度的变化图。

图4示出了六张试纸条，其中tris缓冲液施加于两张试纸条，未诱导的血样施加于两张试纸条，经诱导的血样施加于两张试纸条。

具体实施方式

图1示出了免疫分析试纸条的示例，例如用于侧向流动免疫分析测试的试纸条，该试纸条可进行目视判读和由读取仪进行数字读取。免疫分析试纸条也可以是与以下相关的试纸条：放射免疫分析(RIA)、计数免疫分析(CIA)、酶免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)和化学发光免疫分析(CLIA)。

该测试可以表示单独使用的一次性形式和/或与便携式或台式分析仪一起使用。试纸条100优选包括一定长度的吸收垫104、一定长度的血液分离垫106、一定长度的结合垫108和一定长度的膜垫110，所有这些垫都粘附至疏水的背衬卡102。这些垫中的每一个都具有自发输送流体的能力。吸收垫104与血液分离垫106重叠。血液分离垫106与结合垫108重叠，结合垫108与膜垫110重叠。此外，试纸条可包含与膜垫110相邻的废物垫，以吸取多余试剂并防止任何液体回流。试纸条100的相邻垫之间不存在间隙。样本提供在吸收垫104上，并通过毛细管作用沿箭头112所示的方向流向膜垫110。

吸收垫104、结合垫108和膜垫110由玻璃、天然纤维、聚酯或其组合制成。血液分离垫106优选为玻璃纤维或聚酯纤维。血液分离垫106可以是奥斯龙明士克(Ahlstrom

)美国股份有限公司的6614垫。

在一个实施例中，试纸条100至少长43mm，其具有长15mm的吸收垫104，长8mm的血液分离垫106，长8mm的结合垫108，长12mm的膜垫110。每个垫之间至少有2mm的重叠。在一个实施例中，缓冲液的输送116、全血样本的输送114和选择性白细胞的裂解发生在吸收垫104上。红细胞的分离和捕获发生在血液分离垫106上。样本与生物标志物的结合发生在结合垫108上。膜垫110上至少有一条测试线和控制线。

在一个实施例中，缓冲液在距离吸收垫104的端部120约7mm处输送至吸收垫。全血样本114在吸收垫104的端部120约11mm处输送至吸收垫104。裂解剂存在于吸收垫104上、缓冲液中或既存在于缓冲液中和又存在于吸收垫104上，并且位于距离吸收垫104的端部120约11mm处。

试纸条100优选具有样本施加区130、裂解区132、血液分离区134、试剂区136和检测区138。样本施加区130接收待测试的全血样本114以及运行缓冲液116，该运行缓冲液使全血样本沿图1箭头所示的流动方向112流过试纸条100。

裂解区132优选存在于吸收垫104上。裂解剂可以是试纸条100的一部分，或者也可以添加到运行缓冲液中，或者将具有裂解剂的试纸条100和包含裂解剂的运行缓冲液结合使用。

在一个实施例中，裂解剂位于样本施加区130和血液分离区134之间的裂解区132中。裂解剂优选可溶于或可混溶于样本输送液中，并且裂解剂在与样本输送液接触时裂解并活化。然后，样本输送液中既含有溶液或悬浮液中的裂解剂，也含有悬浮液中的样本成分。接着，样本中的任何易裂解成分在悬浮液中暴露于裂解剂中，其本身在原位裂解。接着，运行缓冲液将样本(包括任何未裂解的成分)输送至血液分离区134。

在其他实施例中，裂解区132与样本施加区130重叠。在其他实施例中，裂解区132与血液分离区134重叠。

对于特定的裂解剂，可根据其性质对其进行分组和选择：盐、两性和阳离子剂、离子和非离子洗涤剂。氯化铵(NH₄Cl)盐裂解红细胞。其他盐，包括但不限于高浓度的氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)，能够破坏某些细胞壁和细胞膜。其他裂解剂为两性剂，包括但不限于Lyso PC、CHAPS和两性洗涤剂(Zwittergent)。或者，可使用阳离子剂(包括但不限于C16TAB和苯扎氯铵)作为裂解剂。离子和非离子洗涤剂通常用于破坏或裂解细胞壁或细胞膜成分，如脂蛋白和糖蛋白。常见的离子洗涤剂包括但不限于SDS、胆酸盐(Cholate)、月桂酰肌氨酸钠(也称为sarkosyl)和脱氧胆酸盐。离子洗涤剂是很好的增溶剂。抗体在0.1％或更低浓度的SDS下保持其活性。常见的非离子洗涤剂包括但不限于：辛基葡萄糖苷、洋地黄皂苷、皂苷、C12E8、Lubrol、Triton X-100、Noniodet P-40、NP-40(例如

NP-40)、吐温20和吐温80。非离子和温和的离子洗涤剂是较弱的变性剂，并且通常用于裂解膜蛋白，如病毒表面蛋白。其他裂解剂包括但不限于尿素和酶。不同裂解剂的组合可用于优化裂解环境。

在一些优选实施例中，Brij 35或另一种聚氧乙烯可用作侧向流动层析试纸条上的裂解剂。在其他优选实施例中，裂解剂在含有Tris的运行缓冲液中，并且包含Brij 35或另一种聚氧乙烯。在其他优选实施方案中，条带上的裂解剂(包括Brij 35或另一种聚氧乙烯)和在含有Tris的运行缓冲液中的裂解剂(包括Brij 35或另一种聚氧乙烯)组合使用。在其他实施例中，可向样本施加电磁场以帮助白细胞的选择性裂解。电磁场的施加可与试纸条上的裂解剂和/或运行缓冲液中的裂解剂共同使用。

运行缓冲液还包括表面活性剂。表面活性剂通常是润湿剂，并且降低液体的表面张力。这样就可以通过降低液体之间的界面张力来更容易地扩散。表面活性剂可以干扰抗原和抗体或配体和受体的自然结合。因此，每种裂解剂的浓度都是通过实验选择。一旦发生裂解，不阻碍所需的结合反应是重要的。通常，0.001％的裂解剂浓度被视为下限，上限约为1％。当使用裂解剂的组合时，会产生累加或协同效应。这将扩大浓度的工作范围从约0.001％到1％。在所有情况下，预加载到单张试纸条的所有位置的裂解剂总量必须足以裂解白细胞对免疫检测的屏障，从而允许试纸条的实际操作。

裂解剂本身不应干扰任何其他分析检测器或指示剂，因此不会干扰任何其他分析相互作用和反应到妨碍分析的实际操作的程度。裂解剂应具有足够长的有效期，以便在即时检测中使用试纸条之前能够制造、销售和储存。在本发明的实施例中，裂解是特异性靶向白细胞的。

表面活性剂溶液优选在运行缓冲液的0.1％-1.0％范围内，并且可以包括以下一种或多种：叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(Triton X-100)、正-壬基苯氧基聚甘油(Olin10G)、仲醇的聚乙二醇酯(Tergitol 15-D-12)、聚氧乙烯十二烷基醚(Brij 35)、聚氧乙烯硬脂酸酯、皂苷和洋地黄皂苷。向缓冲液中添加表面活性剂溶液，额外地提高血红素从试纸条100上任何裂解红细胞的血液清除速度。在优选实施例中，所使用的缓冲液是含有Brij-35或另一种聚氧乙烯的Tris。

由于全血样本的RBC能够发生一些裂解，因此红细胞膜稳定剂可添加到运行缓冲液中和/或存在于裂解区132处。红细胞膜稳定剂可包括但不限于：甘露醇、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)或辣根过氧化物酶(HRP)偶联物稳定剂

单独或与糖或蛋白质附着物或抗体组合使用。使用稳定剂对红细胞膜的进一步稳定，可以通过减少RBC裂解引起的背景来增强信号。在一些实施例中，RBC稳定剂还可以存在于血液分离垫中。

血液分离区134优选存在于血液分离垫106上。血液分离垫106从任何裂解的RBC中吸收血红素，并且在一些实施例中，由于完整RBC的尺寸，从而捕获RBC。血液分离区134中RBC的物理捕获可通过降低膜孔隙率和/或将玻璃珠并入血液分离垫106中来完成。在其他实施例中，血液分离区中RBC的物理捕获可通过配体的特异性结合来完成，配体包括但不限于抗体或凝集素。血红素的吸收和完整红细胞的捕获去除了试纸条上可能存在的任何红色背景色，以便于测试结果的目视读取和通过读取仪读取结果。此外，通过减少与来自血红素的试纸条背景色相关的红色，试纸条的结果可以在少于10分钟的时间内进行目视和数字读取。在一些实施例中，试纸的结果可在少于8分钟或更短的时间内进行目视和数字读取。血液分离垫106优选将存在的任何裂解红细胞中的血红素减少至少10-20％。

试剂区136与结合垫108对齐，并包含至少一个标记的结合配偶体(bindingpartner)，该结合配偶体结合到细胞内和细胞外生物标志物或蛋白质的组合，使得结合蛋白标志在穿过结合垫108时标记目标颗粒，并继续穿过检测区138中包含测试线和控制线的膜垫110。同时检测到的细胞内和细胞外的蛋白质可包括但不限于：粘病毒抗性蛋白A(MxA)和C反应蛋白(CRP)、MxA和降钙素原(PCT)、MxA和人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)、MxA和白细胞介素-6(IL-6)、MxA和髓样细胞(sTREM-1)、MxA和血管生成素2，MxA和血管内皮生长因子(VEGF)或其可溶性血管内皮生长因子受体-1(sVEGFR1)，以及MxA和肝素结合蛋白(HBP)或其他细胞内和细胞外蛋白的组合。细胞内和细胞外生物标志物可指示病毒标志物和至少一个标记的结合配偶体，结合配偶体结合并指示细菌标志物，细菌标志物通过样本输送液(例如缓冲液)洗脱并且然后能够随其迁移。标记的结合配偶体能够特异性结合到感兴趣的病毒或细菌标志物以形成复合物，该复合物又能够特异性结合到检测区138中的另一特定试剂或结合配偶体。

在一个实施例中，包含0.01％至1.0％的表面活性剂溶液的运行缓冲液与全血样本一起添加到样本施加区130的吸收垫中，表面活性剂溶液选自叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(Triton X-100)、正-壬基苯氧基聚甘油(Olin 10G)、仲醇的聚乙二醇酯(Tergitol15-D-12)、聚氧乙烯十二烷基醚(Brij 35)和聚氧乙烯硬脂酸酯，将皂苷和洋地黄皂苷。运行缓冲液优选为含有Brij-35或另一种聚氧乙烯的Tris。全血样本的WBC在吸收垫104上的裂解区132中裂解。全血样本中的WBC和RBC裂解而来的蛋白质流向血液分离区134的血液分离垫106。与裂解的RBC相关的血红素优选从样本中分离并被血液分离垫106吸收。可在血液分离区134内物理捕获整个RBC。裂解WBC的胞内蛋白和与RBC相关的胞外蛋白从血液分离垫106流向试剂区136的结合垫108，其中WBC的胞内蛋白和RBC的胞外蛋白可以结合到生物标志物。与生物标志物结合的蛋白质和未结合的蛋白质通过结合垫流向膜垫，并通过至少一条测试线和控制线。

示例

三个样本分别在试纸条上运行，该试纸条包含吸收垫、6614吸收垫的血液分离垫、结合垫和膜。

第一个样本仅为缓冲液，第二个样本为未诱导的人干扰素-α(-I)或阴性样本，第三个样本为经诱导的(+I)人干扰素-α，阳性的MxA血样。

每95μL的样本1-3接收5μL 30％的Brij L23储备(1.5％浓度)。将样本1-3的10μL样本分别输送至三张试纸条的吸收垫。然后将85μL pH值为9.0的Tris缓冲液添加到三张试纸条的吸收垫中。然后在10分钟内读取每张试纸条。

在图2和图3中总结了结果。图2示出了每个样本的MxA信号，该信号由基于照相机的试纸条读取仪测量，其中tris缓冲液施加于两张试纸条，未诱导的血样施加于两张试纸条，经诱导的血样施加于两张试纸条。图3示出了未诱导和经诱导的血液样本相对于tris缓冲液样本的测试线颜色强度的变化图。六张试纸条如图4所示，每个样本有两张试纸条。

因此，应当理解，本文所描述的本发明的实施例仅是对本发明原理的应用的说明。本文对所示实施例的细节的引用并不旨在限制权利要求的范围，权利要求本身列举了那些被视为对本发明必要的特征。

Claims

1.一种免疫分析试纸条，其包括：

吸收垫，所述吸收垫用于接收用于测试的血液样本，并选择性地裂解至少血液样本的白细胞；

血液分离垫，所述血液分离垫与所述吸收垫相邻并重叠，用于保留完整的红细胞或从血样的任何裂解红细胞中去除血红素；

结合垫，所述结合垫与所述血液分离垫相邻并重叠，包含用于结合血液样本中白细胞的胞内蛋白和红细胞的胞外蛋白的生物标志物；以及

膜垫，所述膜垫与所述结合垫相邻并重叠，用于指示血液样本中白细胞的胞内蛋白和红细胞的胞外蛋白的存在的结果；

其中，所述样本从所述吸收垫流向所述血液分离垫、所述结合垫和所述膜垫；

其中，所述结果能够在十分钟或更短时间内识别出来。

2.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述血液分离垫捕获整个未裂解的红细胞。

3.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述分离垫将血红素减少至少20％。

4.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述样本的结果是目视读取的。

5.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述样本的结果是数字读取的。

6.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述吸收垫还包括裂解剂。

7.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述运行缓冲液含有红细胞膜稳定剂。

8.根据权利要求7所述的免疫分析试纸条，其中所述红细胞膜稳定剂选自由以下组成的组：甘露醇、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸和辣根过氧化物酶结合物稳定剂，单独或与糖或蛋白质附着物或抗体组合使用。

9.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述运行缓冲液含有0.1％-1.0％的表面活性剂，所述表面活性剂选自由以下组成的组：叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(TritonX-100)、正-壬基苯氧基聚甘油(Olin 10G)、仲醇的聚乙二醇酯(Tergitol 15-D-12)、聚氧乙烯十二烷基醚(Brij 35)、聚氧乙烯硬脂酸酯、皂苷和洋地黄皂苷。

10.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述白细胞的胞内蛋白和所述红细胞的胞外蛋白的存在表明存在一对选自由以下组成的组的蛋白质：粘病毒抗性蛋白A(MxA)和C反应蛋白(CRP)、MxA和降钙素原(PCT)、MxA和人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)、MxA和白细胞介素-6(IL-6)，MxA和髓样细胞(sTREM-1)、MxA和血管生成素2、MxA和血管内皮生长因子(VEGF)或其可溶性血管内皮生长因子受体-1(sVEGFR1)以及MxA和肝素结合蛋白(HBP)。

11.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其选自由以下组成的组：放射免疫分析(RIA)、计数免疫分析(CIA)、酶免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)和化学发光免疫分析(CLIA)。

12.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述试纸条是侧向流动层析试纸条。

13.根据权利要求1所述的免疫分析试纸条，其中所述血液分离垫包括玻璃珠、纤维或过滤器，具有减小的硝酸纤维素浇注尺寸，与所述吸收垫相邻或重叠，用于保留完整的红细胞或从所述血样的任何裂解红细胞中去除血红素。