CN113358867A - 新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试剂、检测试剂盒 - Google Patents
新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试剂、检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学检测领域,特别涉及新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试剂、检测试剂盒。本发明涉及一种操作方便的新型冠状病毒中和抗体的检测试剂盒。15μL待测血清或血浆加入到试剂管中,与预先装入的荧光微球试剂进行混合,室温反应15分钟后,将混合物滴加到层析试纸卡上,10分钟后读取荧光值,通过读取检测线和质控线的荧光值,并与仪器内置的阈值进行比较,即可得出中和抗体阳性或者阴性的结果。该检测试剂盒操作简便,不使用活病毒,不用进行细胞培养,检测耗时短,可以在30分钟内完成全部检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域,特别涉及新型冠状病毒中和抗体的检测组合 物、检测试剂、检测试剂盒。
背景技术
人体感染新冠病毒或者免疫预防性疫苗后,会产生特异性抗体。其中中 和抗体是能够与病毒结合,阻止其进入宿主细胞的功能性抗体。人体内只有 产生足够高浓度的中和抗体,才能阻断病毒感染。由于个体差异,无论是自 然感染者还是接种过疫苗的群体,不同人血液中中和抗体浓度存在较大差异。 因此,中和抗体浓度测定对应疫苗免疫效果评价以及自然感染康复者是否有 再次感染的风险评估具有重要意义。
病毒膜蛋白与敏感细胞的受体结合是病毒完成感染的第一步。新型冠状 病毒膜表面的S蛋白的RBD(Receptor-binding domain,受体结合结构域), 会与人细胞表面的ACE2发生结合,从而开启感染的过程。中和抗体会与病 毒膜表面的SRBD发生有效结合,并阻止SRBD与ACE2的结合,从而达到 阻断病毒感染进程的作用。
中和抗体测定的经典方法是微量中和法。使用一定量的活病毒与被检测 的抗体相混合,然后把混合物加入到对病毒敏感的细胞上,如果病毒没有被 抗体所阻断,即可以感染细胞,通过观察细胞病变或者通过检测病毒复制, 判断检测标本是否可以阻断病毒感染。
也可以使用假病毒系统进行中和抗体检测。原理是制备包含有新冠病毒 膜蛋白的假病毒。假病毒一般还含有荧光素酶或者荧光蛋白等报告基因。把 待测标本与假病毒混合后,把混合物加入到敏感细胞上,通过检测报告基因 判断是否有病毒感染。
微量中和实验是中和抗体检测方法的金标准,其结果最具有权威性。但 是该方法使用具有感染性的活病毒、生物安全等级高;使用细胞作为感染靶 标,试验周期长,不具备大规模使用的条件。假病毒中和试验由于使用的病 毒为改造过的病毒,不具有感染性,其安全要求比微量中和实验低,但是仍 需使用活细胞,同时仍需使用活细胞,试验周期长,不具备大规模使用的条 件,读取细胞荧光值需要大型仪器,也不可能进行大规模推广。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试 剂、检测试剂盒。本专利所述方法仅有孵育,层析,读值3个步骤,使用简 便,用时短,可在30min之内完成检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了新型冠状病毒中和抗体的检测组合物,包括:鸡IgY荧光 微球标记物和SRBD抗原荧光微球标记物;
所述鸡IgY荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与 鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY- 羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记 物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微 球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球; 活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球 免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物。
本发明提供了所述的检测组合物的制备方法,所述鸡IgY荧光微球标记 物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳 胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合 物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微 球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球; 活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球 免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物。
基于上述研究,本发明还提供了所述检测组合物在制备检测新型冠状病 毒中和抗体的检测试剂、检测装置或检测试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中,所述检测装置包括检测芯片、检测试 纸卡或检测中通用的装置。
本发明还提供了检测新型冠状病毒中和抗体的检测试剂,包括如权利要 求1所述的检测组合物以及检测中可接受的助剂或辅料。
本发明还提供了检测新型冠状病毒中和抗体的检测装置,包括如权利要 求1所述的检测组合物以及检测中可接受的载体。
在本发明的一些具体实施方案中,所述检测装置为检测试纸卡,其制备 方法包括:
步骤1:制备所述鸡IgY荧光微球标记物:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY 偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基 乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
步骤2:将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得 包被膜;其中,
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,并在包被缓冲液中加入 海藻糖做为保护剂;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,并在包被缓冲液中加入海藻糖 做为保护剂;
65℃2h烘干;
步骤3:取步骤1制得的所述鸡IgY荧光微球标记物与步骤2制得的所述 包被膜组成所述检测试纸卡。
更重要的是,本发明还提供了检测新型冠状病毒中和抗体的检测试剂盒, 包括所述的检测组合物以及检测中可接受的助剂、辅料或载体。
在本发明的一些具体实施方案中,包括所述的检测装置和冻干反应装置; 所述冻干反应装置包括所述的SRBD抗原荧光微球标记物和冻干液。
此外,本发明还提供了所述的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:制备鸡IgY荧光微球标记物和SRBD抗原荧光微球标记物;
所述鸡IgY荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与 鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY- 羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记 物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括::取活化的羧基乳胶 微球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球; 活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球 免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物;
步骤2:将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得 包被膜;其中,
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,并在包被缓冲液中加入 海藻糖做为保护剂;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,并在包被缓冲液中加入海藻糖 做为保护剂;
65℃2h烘干;
步骤3:取步骤1制得的所述鸡IgY荧光微球标记物与步骤2制得的所述 包被膜组成所述检测试纸卡;
步骤4:取如权利要求1所述的SRBD抗原荧光微球标记物和冻干液制得 所述冻干反应装置;
步骤5:取步骤3制得的所述检测试纸卡和步骤4制得的所述冻干反应装 置,制得所述检测试剂盒。
本发明还提供了所述的检测试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
1.冻干管复溶:1人份的冻干管中,加入100ul冻干复溶液。
2.样本处理:15ul待测血清或者血浆加入到复溶冻干管中,涡旋混匀,室 温(10℃~30℃)静置15分钟。
3.加样:取80ul步骤3冻干管内溶液加入试纸条样品孔中,水平放置, 层析10分钟。
4.检测:将试纸条插入荧光检测仪中,点击“即时检测”,检测器对试纸卡 进行检测,检测结果显示在屏幕上。
5.结果解释:”阳性“表示该份样本中含有新冠中和抗体;”阴性“表示该份 样本中不含新冠中和抗体或中和抗体水平低于检测限。
荧光检测器通过扫描试纸卡质控线(C线)处的荧光强度,并经过信号 转化,峰面积积分,获得C面积;
荧光检测器通过扫描试纸卡检测线(T线)处的荧光强度,并经过信号转 化,峰面积积分,获得T面积;
通过计算T面积与C面积的比值,获得T/C;
通过检测大量未免疫疫苗临床血清的T/C值,并求取他们T/C值的平均 值,获得阴性T/C平均值;求取他们T/C值的SD,获得阴性T/C SD;
通过公式阴性T/C平均值-2*阴性T/C SD,获得本检测试剂的cut off值;
通过比较待测样本T/C值与cut off值的高低来判定待测样本的阴阳性;
若待测样本T/C值小于cut off值则判定为阳性;
若待测样本T/C值大于cut off值则判定为阴性。
此外,本发明还提供了新型冠状病毒中和抗体的检测方法,包括如下步 骤:
1.冻干管复溶:1人份的冻干管中,加入100ul冻干复溶液。
2.样本处理:15ul待测血清或者血浆加入到复溶冻干管中,涡旋混匀,室 温(10℃~30℃)静置15分钟。
3.加样:取80ul步骤3冻干管内溶液加入试纸条样品孔中,水平放置, 层析10分钟。
4.检测:将试纸条插入荧光检测仪中,点击“即时检测”,检测器对试纸卡 进行检测,检测结果显示在屏幕上。
5.结果解释:”阳性“表示该份样本中含有新冠中和抗体;”阴性“表示该份 样本中不含新冠中和抗体或中和抗体水平低于检测限。
荧光检测器通过扫描试纸卡质控线(C线)处的荧光强度,并经过信号 转化,峰面积积分,获得C面积;
荧光检测器通过扫描试纸卡检测线(T线)处的荧光强度,并经过信号转 化,峰面积积分,获得T面积;
通过计算T面积与C面积的比值,获得T/C;
通过检测大量未免疫疫苗临床血清的T/C值,并求取他们T/C值的平均 值,获得阴性T/C平均值;求取他们T/C值的SD,获得阴性T/C SD;
通过公式阴性T/C平均值-2*阴性T/C SD,获得抑制率的cut off值;
通过比较待测样本T/C值与cut off值的高低来判定待测样本的阴阳性;
若待测样本T/C值小于cut off值则判定为阳性;
若待测样本T/C值大于cut off值则判定为阴性。
本发明提供了一种简单易行,可以在普通实验室中进行操作的新冠病毒 中和抗体检测方法。这种方法不使用活病毒,不用进行细胞培养,检测耗时 短,可以在30分钟内完成全部检测。操作者只需把待测标本加入到预先装有 检测试剂的试剂管中,混合后静置15分钟,然后滴加到试纸卡上,反应10 分钟后进行荧光值读取。由检测仪直接给出阴阳性结果,结果判读客观。
具体实施方式
本发明公开了新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试剂、检测试 剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的, 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行 了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的 方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
术语:
病原体:指能引起疾病的微生物和寄生虫的统称。其中微生物包括病毒、 衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌等。本专利主要指引起人 类疾病的病原体。
中和抗体:中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病 原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结 合,才能感染细胞,并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体, 能够与病原微生物表面的抗原结合,从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体, 防止侵入细胞。
受体:受体(receptor,又称受器、接收器)是一个生物化学上的概念, 指一类能传导细胞外信号,并在细胞内产生特定效应的分子。受体存在于细 胞膜、胞浆或细胞核内,其产生的效应可能仅在短时间内持续,比如改变细 胞的代谢或者细胞的运动,也可能是长效的效应,比如上调或下调某个或某 些基因的表达。
滴度/效价:滴度,是一种表述浓度的用词,通常在化学,病理学和免疫 学中使用。滴度是稀释度的倒数。病毒滴度即病毒悬液的浓度,又称病毒的 效价。
阈值:阈值是指一个效应能够产生的最低值或最高值。又名临界值。
本发明的技术方案如下所示:
鸡IgY荧光微球标记物的制备
利用EDC在50mM Hepes缓冲液条件下充分活化羧基乳胶微球,向已充 分活化的微球中加入鸡IgY,在室温条件下鸡IgY与羧基乳胶微球发生化学偶 联,形成鸡IgY-羧基乳胶微球复合物;向已充分偶联的鸡IgY-羧基乳胶微球 溶液中加入荧光染料(品名:Dylight800 NHS Ester;厂家:Thermo Scientific; 货号:46421;加入量:每100μg抗原或者抗体加入7μg染料),在室温条件 下荧光染料与鸡IgY发生化学偶联反应,形成鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光 复合物;之后通过封闭及悬浮程序即可完成鸡IgY荧光微球标记物的制备。
其中:
封闭:每100ug标记抗原或者抗体加入100ul封闭剂(1%酪蛋白水溶液 或者1%牛血清白蛋白水溶液),室温作用1h。
悬浮:利用悬浮液对封闭后微球进行重悬,每100ug标记抗原或者抗体 加入100ul悬浮液,2-8℃静置过夜反应。(悬浮液:20mM硼酸缓冲液10% 蔗糖5%海藻糖1%牛血清白蛋白2%Tween20 pH8.0)。
鸡IgY荧光微球标记物荧光垫的制备
将实施例1制备的鸡IgY荧光微球标记物经悬浮液稀释,并均匀涂布于 玻璃纤维材质的荧光垫上,55℃2h烘干即可。
其中:
悬浮液:20mM硼酸缓冲液,10%蔗糖,5%海藻糖,1%牛血清白蛋白, 2%Tween20,pH8.0,稀释倍数为3000倍稀释。
SRBD抗原荧光微球标记物的制备
利用EDC在50mM Hepes缓冲液条件下充分活化羧基乳胶微球,在利用赖氨 酸作为中间搭桥分子的条件下,加入荧光染料(品名:Dylight800 NHS Ester 厂家:ThermoScientific货号:46421加入量:每100μg抗原或者抗体加入 7μg染料),在室温条件下发生化学偶联形成荧光微球;利用EDC在50mM Hepes缓冲液条件下充分活化羧基乳胶荧光微球,加入SRBD抗原,在室温 条件下,SRBD抗原与羧基乳胶荧光微球上赖氨酸羧基发生化学偶联,形成 SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物;之后通过封闭及悬浮程序即可完成 SRBD荧光微球标记物的制备。
其中:
封闭:每100ug标记抗原或者抗体加入100ul封闭剂(1%酪蛋白水溶液 或者1%牛血清白蛋白水溶液),室温作用1h。
悬浮:利用悬浮液对封闭后微球进行重悬,每100ug标记抗原或者抗体 加入100ul悬浮液,2-8℃静置过夜反应。(悬浮液:20mM硼酸缓冲液,10% 蔗糖,5%海藻糖,1%牛血清白蛋白,2%Tween20,pH8.0)。
包被:
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,C线包被缓冲液的配方为: 10mMPBS,5%海藻糖,pH7.5;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,T线包被缓冲液的配方为:10mM PBS,5%海藻糖,pH7.5。
65℃2h烘干即可。
冻干反应管的制备
将实施例3制得的SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物利用含有BSA海 藻糖TritonX-100等物质的冻干液(20mM BB缓冲液,2%海藻糖,2%牛血 清白蛋白,0.5%TritonX-100,pH7.5)进行稀释,分装入冻干反应管内,按照 冻干程序(-70℃冷冻2h,-40℃真空度10Pa以下冻干16h。)进行冻干操作, 即得到冻干反应管。
新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备
(1)将鸡IgY以及SRBD抗原按照实施例1、实施例3记载的的荧光微球标 记方法进行鸡IgY荧光微球标记物、SRBD荧光微球标记物的制备。
(2)将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得包被膜。
(3)其中(1)中鸡IgY荧光微球标记物与(2)中包被膜组成新型冠状病毒 中和抗体检测试纸卡。
其中(1)中SRBD荧光微球标记物与冻干液(20mM BB缓冲液,2%海 藻糖,2%牛血清白蛋白,0.5%TritonX-100,pH7.5)形成冻干反应管。
其中(3)、(4)与稀释液(10mM PBS缓冲液,1%牛血清白蛋白,1% 酪蛋白,0.1%蔗糖,0.4%Tween-20,pH7.0)及检测试剂盒说明书形成新型冠 状病毒中和抗体检测试剂盒。
本发明提供的新型冠状病毒中和抗体的检测组合物、检测试剂、检测试 剂盒中,所用原料及试剂均可由市场购得。其中,SRBD与ACE2的购自:珠 海博美生物科技有限公司。
对本发明出现的试剂配方或厂家说明如下:
荧光染料——品名:Dylight800 NHS Ester;厂家:Thermo Scientific;货 号:46421;加入量:每100μg抗原或者抗体加入7μg染料。
缓冲液——50mM Hepes。
封闭剂——1%酪蛋白水溶液或者1%牛血清白蛋白水溶液。
悬浮液——20mM硼酸缓冲液,10%蔗糖,5%海藻糖,1%牛血清白蛋白, 2%Tween20,pH8.0。
C线包被缓冲液——10mM PBS,5%海藻糖,pH7.5。
T线包被缓冲液——10mM PBS,5%海藻糖,pH7.5。
冻干液——20mM BB缓冲液,2%海藻糖,2%牛血清白蛋白, 0.5%TritonX-100,pH7.5。
稀释液——10mM PBS缓冲液,1%牛血清白蛋白,1%酪蛋白,0.1%蔗糖, 0.4%Tween-20,pH7.0。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1鸡IgY荧光微球标记物的制备
鸡IgY与荧光微球偶联:
微球使用IMMUTEXTMP0112(w%=5%),使用前利用缓冲液稀释10 倍至w%=0.5%
缓冲液使用1M hepes(Life Technologies Corporation.REF:15630-080),使 用前用dH2O稀释20倍至50mM。
EDC(Sigma-Aldrich E7750-5g)利用dH20配制50mg/mL的母液,使用 之前利用缓冲液稀释10倍至5mg/mL。
荧光染料:Dylight800 Thermo Scientific Prod#46421DylightTM800 NHSEster
赖氨酸(Sigma-Aldrich L5751-25G)利用dH20配制100mg/mL的母液, 使用之前利用1*PBS溶液稀释685倍。
标记步骤:(以标记100ul微球溶液为例)
1、加入10μL P0112至90μL缓冲液中,将微球稀释至w%=0.5%;
2、将EDC母液利用缓冲液稀释10倍至5mg/mL,取20μL加入至已稀释 的微球溶液中,室温震荡活化30min;
3、14680rpm*10min离心弃上清,使用100μL缓冲液溶液复溶;
4、加入100μg鸡IgY,室温震荡结合1h;
5、14680rpm*10min(5min-10min)离心弃上清,使用100μL缓冲液复 溶;
6、加入7μL Dylight800,避光静置1h;
7、14680rpm*10min(5min-10min)离心弃上清,使用100μL封闭剂(1% 酪蛋白水溶液或者1%牛血清白蛋白水溶液)溶液复溶;
8、室温震荡封闭1h;
9、14680rpm*10min(10-15min)离心弃上清,使用100μL悬浮液复溶;
10、4度静置保存。
向已充分偶联的鸡IgY-羧基乳胶微球溶液中加入荧光染料(品名: Dylight800NHS Ester;厂家:Thermo Scientific;货号:46421;加入量:每 100μg抗原或者抗体加入7μg染料),在室温条件下荧光染料与鸡IgY发生化 学偶联反应,形成鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合物;之后通过封闭及悬 浮程序即可完成鸡IgY荧光微球标记物的制备。
其中:
封闭:每100ug标记抗原或者抗体加入100ul封闭剂(1%酪蛋白水溶液 或者1%牛血清白蛋白水溶液),室温作用1h。
悬浮:利用悬浮液对封闭后微球进行重悬,每100ug标记抗原或者抗体 加入100ul悬浮液,2-8℃静置过夜反应。(悬浮液:20mM硼酸缓冲液10% 蔗糖5%海藻糖1%牛血清白蛋白2%Tween20 pH8.0)。
实施例2鸡IgY荧光微球标记物荧光垫的制备
将实施例1制备的鸡IgY荧光微球标记物经悬浮液稀释,并均匀涂布于 玻璃纤维材质的荧光垫上,55℃2h烘干即可。
其中:
悬浮液:20mM硼酸缓冲液,10%蔗糖,5%海藻糖,1%牛血清白蛋白, 2%Tween20,pH8.0,稀释倍数为3000倍稀释。
实施例3 SRBD抗原荧光微球标记物的制备
利用EDC在50mM Hepes缓冲液条件下充分活化羧基乳胶微球,在利用 赖氨酸作为中间搭桥分子的条件下,加入荧光染料(品名:Dylight800 NHS Ester厂家:ThermoScientific货号:46421加入量:每100μg抗原或者 抗体加入7μg染料),加入7μLDylight800,避光静置1h;在室温条件下发 生化学偶联形成荧光微球;利用EDC在50mMHepes缓冲液条件下充分活化 羧基乳胶荧光微球,加入SRBD抗原,在室温条件下,SRBD抗原与羧基乳 胶荧光微球上赖氨酸羧基发生化学偶联,形成SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光 复合物;之后通过封闭及悬浮程序即可完成SRBD荧光微球标记物的制备。
具体的:
封闭:每100ug标记抗原或者抗体加入100ul封闭剂(1%酪蛋白水溶液 或者1%牛血清白蛋白水溶液),室温作用1h。
悬浮:利用悬浮液对封闭后微球进行重悬,每100ug标记抗原或者抗体 加入100ul悬浮液,2-8℃静置过夜反应。(悬浮液:20mM硼酸缓冲液,10% 蔗糖,5%海藻糖,1%牛血清白蛋白,2%Tween20,pH8.0)。
其中:
SRBD与荧光微球偶联具体为:
标记步骤:(以标记100ul微球溶液为例)
1、加入10μL P0112羧基乳胶微球至90μL 50mM hepes中,将微球稀释 至w%=0.5%;
2、将EDC母液利用50mM hepes稀释10倍至5mg/mL,取20μL加入至 已稀释的微球溶液中,室温震荡活化30min;
3、14680rpm*10min离心弃上清,使用100μL 50mM hepes溶液复溶;
4、取1μL赖氨酸母液加入至684μL的1*PBS溶液,制成赖氨酸溶液;
5、在微球溶液中加入10μL赖氨酸溶液,室温震荡结合30min;
6、14680rpm*10min离心弃上清,使用100μL 50mM hepes溶液复溶;
7、加入7μL Dylight800,避光静置1h;
8、14680rpm*10min离心弃上清,使用100μL 50mM hepes溶液复溶;
9、将EDC母液利用50mM hepes稀释10倍至5mg/mL,取20μL EDC加 入至8的溶液中,室温震荡活化30min;
10、14680rpm*10min离心弃上清,使用100μL 50mM hepes溶液复溶;
11、加入100ug SRBD抗原,室温震荡结合1h;
12、14680rpm*(5-10min)离心弃上清,使用100ul封闭剂(1%酪蛋白 水溶液或者1%牛血清白蛋白水溶液)重悬,置于4度过夜静置封闭;
13、14680rpm*(10-15min)离心弃上清,使用100μL悬浮液复溶。
实施例4包被:
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,C线包被缓冲液的配方为: 10mMPBS,5%海藻糖,pH7.5;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,T线包被缓冲液的配方为:10mM PBS,5%海藻糖,pH7.5。
65℃2h烘干即可。
实施例5冻干反应管的制备
将实施例3制得的SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物利用含有BSA海 藻糖TritonX-100等物质的冻干液(20mM BB缓冲液,2%海藻糖,2%牛血 清白蛋白,0.5%TritonX-100,pH7.5)进行稀释,分装入冻干反应管内,按照 冻干程序(-70℃冷冻2h,-40℃真空度10Pa以下冻干16h。)进行冻干操作, 即得到冻干反应管。
实施例6新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备
(1)将鸡IgY以及SRBD抗原按照实施例1、实施例3记载的的荧光微球标 记方法进行鸡IgY荧光微球标记物、SRBD荧光微球标记物的制备。
(2)将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得包被膜。
(3)其中(1)中鸡IgY荧光微球标记物与(2)中包被膜组成新型冠状病毒 中和抗体检测试纸卡。
(4)其中(1)中SRBD荧光微球标记物与冻干液(20mM BB缓冲液,2% 海藻糖,2%牛血清白蛋白,0.5%TritonX-100,pH7.5)形成冻干反应管。
(5)其中(3)、(4)与稀释液(10mM PBS缓冲液,1%牛血清白蛋白,1% 酪蛋白,0.1%蔗糖,0.4%Tween-20,pH7.0)及检测试剂盒说明书形成 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
效果例1疫苗免疫后样本检测结果
检验方法:
1.仪器准备:连接仪器电源及扫码枪,打开仪器开关,仪器自动进入自检 程序。待自检程序完成后,点击“进入检测”,并使用扫码枪扫描试剂盒配套二 维码,核对项目名称及试剂编号是否正确,输入待测样本编号。
2.冻干管复溶:1人份的冻干管中,加入100ul稀释液(10mM PBS缓冲 液,1%牛血清白蛋白,1%酪蛋白,0.1%蔗糖,0.4%Tween-20,pH7.0)。
3.样本处理:15ul待测血清或者血浆加入到复溶冻干管中,涡旋混匀,室 温(10℃~30℃)静置15分钟。
4.加样:取80ul步骤3冻干管内溶液加入试纸条样品孔中,水平放置, 层析10分钟。
5.检测:将试纸条插入荧光检测仪中,点击“即时检测”,检测器对试纸卡 进行检测,检测结果显示在屏幕上。
6.结果解释:”阳性“表示该份样本中含有新冠中和抗体;”阴性“表示该份 样本中不含新冠中和抗体或中和抗体水平低于检测限。
注释:
荧光检测器通过扫描试纸卡质控线(C线)处的荧光强度,并经过信号 转化,峰面积积分,获得C面积;
荧光检测器通过扫描试纸卡检测线(T线)处的荧光强度,并经过信号转 化,峰面积积分,获得T面积;
通过计算T面积与C面积的比值,获得T/C;
通过检测大量未免疫疫苗临床血清的T/C值,并求取他们T/C值的平均 值,获得阴性T/C平均值;求取他们T/C值的SD,获得阴性T/C SD;
通过公式阴性T/C平均值-2*阴性T/C SD,获得抑制率的cut off值;
通过比较待测样本T/C值与cut off值的高低来判定待测样本的阴阳性;
若待测样本T/C值小于cut off值则判定为阳性;
若待测样本T/C值大于cut off值则判定为阴性。
表1
效果例2临床血清/血浆(未经免疫样本)
检验方法:
1.仪器准备:连接仪器电源及扫码枪,打开仪器开关,仪器自动进入自检 程序。待自检程序完成后,点击“进入检测”,并使用扫码枪扫描试剂盒配套二 维码,核对项目名称及试剂编号是否正确,输入待测样本编号。
2.冻干管复溶:1人份的冻干管中,加入100ul稀释液。
3.样本处理:15ul待测血清或者血浆加入到复溶冻干管中,涡旋混匀,室 温(10℃~30℃)静置15分钟。
4.加样:取80ul步骤3冻干管内溶液加入试纸条样品孔中,水平放置, 层析10分钟。
5.检测:将试纸条插入荧光检测仪中,点击“即时检测”,检测器对试纸卡 进行检测,检测结果显示在屏幕上。
6.结果解释:”阳性“表示该份样本中含有新冠中和抗体;”阴性“表示该份 样本中不含新冠中和抗体或中和抗体水平低于检测限。
注释:
荧光检测器通过扫描试纸卡质控线(C线)处的荧光强度,并经过信号 转化,峰面积积分,获得C面积;
荧光检测器通过扫描试纸卡检测线(T线)处的荧光强度,并经过信号转 化,峰面积积分,获得T面积;
通过计算T面积与C面积的比值,获得T/C;
通过检测大量未免疫疫苗临床血清的T/C值,并求取他们T/C值的平均 值,获得阴性T/C平均值;求取他们T/C值的SD,获得阴性T/C SD;
通过公式阴性T/C平均值-2*阴性T/C SD,获得抑制率的cut off值;
通过比较待测样本T/C值与cut off值的高低来判定待测样本的阴阳性;
若待测样本T/C值小于cut off值则判定为阳性;
若待测样本T/C值大于cut off值则判定为阴性。
表2
T/C平均值 1.008358125
T/C SD 0.167406641
Cut off值=平均值-2*SD 0.673544844
符合率的统计表:
表3
方法 | 阴性样本 | 阴性符合率 | 阳性样本 | 阳性符合率 | 总符合率 |
免疫荧光竞争法 | 47 | 98% | 55 | 100% | 99% |
假病毒微量中和 | 48 | 100% | 55 | 100% | 100% |
ND50为假病毒中和滴度实验结果,上述结果由中科国邦(北京)检验检 测有限公司提供。目前,有效保护新冠病毒感染的中和抗体滴度水平尚未明 确。据公开文章报道,我国新冠灭活疫苗II期临床试验志愿者中和抗体滴度 均值在104-218之间(接种2针疫苗后14天检测数据)(来源Lancet Infect Dis.2020Oct 15;S1473-3099(20)30831-8)。该方法检测下限ND50=30。
综上:由于免疫荧光竞争法与假病毒微量中和方法的阳性符合率为 100%,可推测免疫荧光竞争法的检测下限应与假病毒微量中和方法检测下限 一致为ND50=30。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润 饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.新型冠状病毒中和抗体的检测组合物,其特征在于,包括:鸡IgY荧光微球标记物和SRBD抗原荧光微球标记物;
所述鸡IgY荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球;活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物。
2.如权利要求1所述的检测组合物的制备方法,其特征在于,所述鸡IgY荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球;活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物。
3.如权利要求1所述的检测组合物在制备检测新型冠状病毒中和抗体的检测试剂、检测装置或检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述检测装置包括检测芯片、检测试纸卡或检测中通用的装置。
5.检测新型冠状病毒中和抗体的检测试剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的检测组合物以及检测中可接受的助剂或辅料。
6.检测新型冠状病毒中和抗体的检测装置,其特征在于,包括如权利要求1所述的检测组合物以及检测中可接受的载体。
7.如权利要求6所述的检测装置,其特征在于,其为检测试纸卡,其制备方法包括:
步骤1:制备所述鸡IgY荧光微球标记物:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
步骤2:将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得包被膜;其中,
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,并在包被缓冲液中加入海藻糖做为保护剂;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,并在包被缓冲液中加入海藻糖做为保护剂;
65℃2h烘干;
步骤3:取步骤1制得的所述鸡IgY荧光微球标记物与步骤2制得的所述包被膜组成所述检测试纸卡。
8.检测新型冠状病毒中和抗体的检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的检测组合物以及检测中可接受的助剂、辅料或载体。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求6或7所述的检测装置和冻干反应装置;
所述冻干反应装置包括如权利要求1所述的SRBD抗原荧光微球标记物和冻干液。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:制备鸡IgY荧光微球标记物和SRBD抗原荧光微球标记物;
所述鸡IgY荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球与鸡IgY偶联制得鸡IgY-羧基乳胶微球复合物,再与荧光染料偶联,制得鸡IgY-羧基乳胶微球免疫荧光复合物,封闭、悬浮,制得所述鸡IgY荧光微球标记物;
所述SRBD抗原荧光微球标记物的制备方法包括:取活化的羧基乳胶微球,以赖氨酸作为中间搭桥分子,与荧光染料偶联制得羧基乳胶荧光微球;活化所述羧基乳胶荧光微球,与SRBD抗原偶联,制得SRBD-羧基乳胶微球免疫荧光复合物;封闭、悬浮制得所述SRBD抗原荧光微球标记物;
步骤2:将羊抗鸡IgY以及ACE2抗原在硝酸纤维素膜上进行包被,制得包被膜;其中,
C线:在硝酸纤维素膜上包被羊抗鸡IgY多抗,并在包被缓冲液中加入海藻糖做为保护剂;
T线:在硝酸纤维素膜上包被ACE2抗原,并在包被缓冲液中加入海藻糖做为保护剂;
65℃2h烘干;
步骤3:取步骤1制得的所述鸡IgY荧光微球标记物与步骤2制得的所述包被膜组成所述检测试纸卡;
步骤4:取如权利要求1所述的SRBD抗原荧光微球标记物和冻干液制得所述冻干反应装置;
步骤5:取步骤3制得的所述检测试纸卡和步骤4制得的所述冻干反应装置,制得所述检测试剂盒。
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