CN114487400A - 定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法，包括：试剂一、试剂二与校准品；试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris,另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂，Proclin‑300作为试剂一的防腐剂；试剂二的核心成份为标记有ACE2的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES,另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂；可定量测定样本中新冠中和抗体的浓度，量化评估疫苗免疫效果；操作简便；检测通量高使得一般每台仪器每小时可测试几百上千例样本；测定结果精密度良好；试剂成本较低。

Description

定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法。
背景技术
中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。
中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白。病毒侵入人体之后，免疫细胞把中和蛋白分泌到血液里，中和抗体与血液里的病毒颗粒结合，阻止病毒感染细胞，破坏病毒颗粒，这样就把病毒“中和”掉了。
目前的新冠中和抗体检测主要在生物安全三级实验室(BSL3)内进行。利用活病毒细胞培养的新冠中和试验检测，对实验室等级要求高，严重限制了临床大规模的推广使用。开发出可在生物安全二级实验室(BSL2)或普通实验室开展的快速新冠中和抗体检测方法，具有重要意义。当前也有一些研究团队开发了ELISA类测试，但此种方法操作复杂、耗时较长、对实验操作人源要求较高。也有一些团队开发了侧向层析类的测试，但此种方法不能准确定量、准确度较差，重复性较差。
发明内容
本发明的可定量测定样本中新冠中和抗体的浓度，量化评估疫苗免疫效果；操作简便；检测通量高使得一般每台仪器每小时可测试几百上千例样本；测定结果精密度良好；试剂成本较低。本发明的技术方案如下：
本发明的所述定量测定新冠中和抗体的试剂，包括：
试剂一、试剂二与校准品；
试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin-300作为试剂一的防腐剂；
试剂二的核心成份为标记有ACE2的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES, 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin-300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；
校准品用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
进一步的，所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、EDTA与PMSF中的一种或者几种，所述蛋白酶抑制剂的含量为0.5 mg/L到35mg/L；所述蛋白蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin-300的含量为0.05%v/v。
进一步的，所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin-300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。
进一步的，所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，包括：
制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L且ph值为7.5的Tris、含量为0.5 mg/L的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin-300在常温下混合而成试剂一；
进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
制备试剂二的方法，其包括如下步骤：
步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；
步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；
步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；
步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ugACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；
步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；
步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。
通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
本发明的试剂可有效区分是否已接种新冠疫苗及是否产生相应抗体，并可给出定量结果，有效指导指导个体免疫接种方案的调整，判断是否需要调整免疫接种策略。提升群体免疫保护性的辅助支撑，具有重大意义。 另外，对于治愈后的新冠患者检测，可以判断是否存在再次感染的风险。
附图说明
图1为本发明的的所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法的步骤1到步骤3的流程图。
图2为本发明的所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法的步骤4到步骤6的流程图。
图3为本发明的检测仪器进行检测后得到的的坐标图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
如图1-图3所示，一种定量测定新冠中和抗体的试剂，包括：
试剂一、试剂二与校准品；
试剂一的核心成份为新冠假病毒（市售），试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin-300作为试剂一的防腐剂；
试剂二的核心成份为标记有ACE2（市售）的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin-300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；
校准品用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括EDTA与PMSF，所述EDTA的含量为0.1mMmol /L，所述PMSF的含量为35mg/L；所述蛋白蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin-300的含量为0.05%v/v。
所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin-300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。PBS缓冲剂可以是：含Triton X的质量浓度为1％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液。
所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，包括：
制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L且ph值为7.5的Tris、本实施例中的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin-300在常温下混合而成试剂一；
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
制备试剂二的方法，其包括如下步骤：
步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；
步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；
步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；
步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ugACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；
步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；
步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。下降程度和中和抗体浓度成线性正比关系，具体的正比系数可以通过事先的试验数据来确定。
实施例2：
如图1-图3所示，一种定量测定新冠中和抗体的试剂，包括：
试剂一、试剂二与校准品；
试剂一的核心成份为新冠假病毒（市售德尔塔假病毒），试剂一的缓冲剂为Tris,另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂，Proclin-300作为试剂一的防腐剂；
试剂二的核心成份为标记有ACE2（市售）的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin-300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；
校准品用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括EDTA与亮抑蛋白肽酶，所述EDTA的含量为0.1mMmol /L，所述亮抑蛋白肽酶的含量为0.5mg/L；所述蛋白蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin-300的含量为0.05%v/v。
所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin-300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。PBS缓冲剂可以是：含Triton X的质量浓度为1％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液。
所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，包括：
制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L且ph值为7.5的Tris、本实施例中的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin-300在常温下混合而成试剂一；
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
制备试剂二的方法，其包括如下步骤：
步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；
步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；
步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；
步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ugACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；
步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；
步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。下降程度和中和抗体浓度成线性正比关系，具体的正比系数可以通过事先的试验数据来确定。
实施例3：
如图1-图3所示，一种定量测定新冠中和抗体的试剂，包括：
试剂一、试剂二与校准品；
试剂一的核心成份为新冠假病毒（市售奥密克戎假病毒），试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin-300作为试剂一的防腐剂；
试剂二的核心成份为标记有ACE2（市售）的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin-300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；
校准品用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括EDTA与亮抑蛋白肽酶，所述胃蛋白酶抑制剂的含量为0.7mMmol /L，所述亮抑蛋白肽酶的含量为0.5mg/L；所述蛋白蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin-300的含量为0.05%v/v。
所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin-300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。PBS缓冲剂可以是：含Triton X的质量浓度为1％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液。
所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，包括：
制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L且ph值为7.5的Tris、本实施例中的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin-300在常温下混合而成试剂一；
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
制备试剂二的方法，其包括如下步骤：
步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；
步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；
步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；
步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ugACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；
步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；
步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体（市售）稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
所述定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。下降程度和中和抗体浓度成线性正比关系，具体的正比系数可以通过事先的试验数据来确定。
把实施例1中得到的试剂用检测仪器来进行检测：
该检测仪器为：全自动生化分析仪（如日立7180）：
测试参数如下：
检测方法：终点法
测试时间：10min
波长：0/600nm
读点:18-34
样本量(校准品):8ul
试剂体积比（试剂一的体积R1/试剂二的体积R2）: 150/50
反应方向:下降（-）
结果单位：ng/ml
定标方式:spline
检测仪器进行检测后得到的定标结果如表1所示：
表1
标准品浓度ng/ml Abs-17 Abs-18 Abs-33 Abs-34 ΔA
0 10683 10823 19911 19863 9134
25 10364 10254 16850 16913 6573
50 10136 10013 15345 15460 5328
200 9864 9855 11438 11496 1608
500 9135 9106 9645 9546 475
1000 8862 8762 8972 9056 202
实施例1的试剂测试30例已接种新冠疫苗人群样本的结果如表2所示： 表2
样本编号 Abs-17 Abs-18 Abs-33 Abs-34 ΔA 测值ng/ml
ZH-1 10036 10121 10905 10918 833 366.89
ZH-2 10056 10162 10697 10752 615 454.14
ZH-3 9863 9924 10316 10396 462 543.85
ZH-4 10036 10056 11257 10399 782 384.28
ZH-5 9654 9685 10045 10065 385 603.67
ZH-6 10054 10086 11006 11010 938 335.39
ZH-7 10086 10152 10928 10936 813 373.52
ZH-8 9863 9898 10391 10397 513 510.32
ZH-9 9541 9581 9997 10008 441 558.96
ZH-10 10086 10166 11740 11795 1642 208.65
ZH-11 10196 10322 11841 11861 1592 214.71
ZH-12 10032 10124 10911 10966 860 358.27
ZH-13 10132 10246 11028 11085 867 356.10
ZH-14 9954 10106 10496 10563 500 518.47
ZH-15 9861 9998 10225 10296 331 654.14
ZH-16 9612 9765 10199 10236 529 500.62
ZH-17 9634 9725 10118 10181 470 538.31
ZH-18 9801 9915 10457 10495 618 452.67
ZH-19 8852 8932 9062 9171 225 782.94
ZH-20 10365 10502 12015 12085 1617 211.64
ZH-21 9843 9952 10356 10365 463 543.15
ZH-22 9369 9562 10121 10134 662 432.12
ZH-23 10985 11268 13191 13296 2117 162.79
ZH-24 9764 9815 10690 10732 922 339.86
ZH-25 9452 9526 10369 10986 1189 277.29
ZH-26 9612 9725 10003 10025 345 640.26
ZH-27 9345 9456 10373 10456 1014 315.58
ZH-28 11432 11465 13465 13652 2110 163.34
ZH-29 11213 11346 13153 13269 1931 178.59
ZH-30 9856 9969 10510 10610 647 438.92
实施例1的试剂测试30例未接种新冠疫苗人群样本的结果如表3所示： 表3
样本编号 Abs-17 Abs-18 Abs-33 Abs-34 ΔA 测值ng/ml
YX-1 10673 10741 19602 19639 8914 2.21
YX-2 10394 10404 18904 18943 8525 6.14
YX-3 10256 10324 18923 19007 8675 4.66
YX-4 10369 10486 19182 19269 8798 3.42
YX-5 10354 10422 19045 19085 8677 4.64
YX-6 10268 10396 19164 19201 8851 2.87
YX-7 10456 10554 19221 19272 8742 3.98
YX-8 10354 10632 19399 19436 8925 2.09
YX-9 10780 10848 19102 19139 8307 8.29
YX-10 10690 10805 19124 19156 8393 7.44
YX-11 10682 10750 19210 19247 8513 6.26
YX-12 10681 10749 19111 19148 8415 7.22
YX-13 10546 10614 18913 18924 8339 7.97
YX-14 10561 10629 19381 19418 8805 3.34
YX-15 10581 10649 19671 19708 9075 0.33
YX-16 10512 10691 19001 19066 8432 7.06
YX-17 10736 10885 19513 19550 8721 4.19
YX-18 10715 10851 19167 19204 8403 7.34
YX-19 10381 10391 19312 19349 8945 1.87
YX-20 10369 10396 19213 19274 8861 2.77
YX-21 10396 10436 19115 19152 8718 4.22
YX-22 10346 10399 19276 19313 8922 2.12
YX-23 10276 10410 19375 19471 9080 0.26
YX-24 10561 10711 19182 19219 8565 5.75
YX-25 10554 10662 19561 19598 8972 1.58
YX-26 10561 10610 19298 19335 8731 4.09
YX-27 10327 10334 19285 19301 8963 1.68
YX-28 10167 10261 19052 19089 8857 2.81
YX-29 10651 10681 19575 19644 8944 1.88
YX-30 10357 10369 19363 19400 9019 1.04
本试剂可有效区分是否已接种新冠疫苗及是否产生相应抗体，并可给出定量结果，有效指导指导个体免疫接种方案的调整，判断是否需要调整免疫接种策略。提升群体免疫保护性的辅助支撑，具有重大意义。 另外，对于治愈后的新冠患者检测，可以判断是否存在再次感染的风险。
本发明的思想为：
SARS-CoV-2的S蛋白被认为是诱导中和抗体的主要抗原，目前已建立的基本都是基于ELISA等技术的免疫检测方法, 虽在用于评估疫苗免疫后产生的保护性免疫应答或患者体内的保护性免疫应答。但都是针对S蛋白特定区域的结合抗体而非真正的中和抗体，也就难以预测抗体对病毒的中和作用以及对宿主的保护效果。评估SARS-CoV-2疫苗诱导的中和抗体的最直接方法是使用活病毒的感染中和试验或感染抑制试验，但是活病毒的操作必须在BSL-3实验室中进行，受实验条件和病毒来源等因素的限制。另外, 由于病毒株，培养条件和结果解释标准的不同，不同实验室的活病毒检测结果常常存一定的差异。
SARS-CoV-2假病毒系统，该系统利用在复制缺陷型病毒的表面表达新冠病毒刺突蛋白（Spike蛋白）形成嵌合病毒颗粒。与靶细胞过表达的ACE2结合，高度模拟新冠病毒通过Spike结合ACE2 对目的细胞的入侵过程。该假病毒系统因为其生物安全性和稳定性等优点，已被广泛应用到疫苗研发，抗体中和研究，模拟病毒侵染细胞功能实验，检测试剂盒阳性参照等，是新冠病毒研究、药物和疫苗研发的得力工具。另外可根据不同新冠病毒变种的S蛋白不同，设计出不同突变的假病毒用于体外测定。
个体接种疫苗后可通过免疫应答产生保护性抗体，即中和抗体，对中和抗体进行滴度测定，可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测，可应用于疫苗的研发评价，以及疫苗接种后，对个体自身免疫效果的评价。另外，对于治愈后的新冠患者检测，可以判断是否存在再次感染的风险。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然能对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，包括：试剂一、试剂二与校准品；
试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin-300作为试剂一的防腐剂；
试剂二的核心成份为标记有ACE2的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin-300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；
校准品用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
2.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、EDTA与PMSF中的一种或者几种，所述蛋白酶抑制剂的含量为0.5 mg/L到35mg/L；所述蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin-300的含量为0.05%v/v。
3.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin-300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。
4.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
5.一种定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，其特征在于，包括：
制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L 且ph值为7.5的Tris、含量为0.5 mg/L的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin-300在常温下混合而成试剂一。
6.根据权利要求5所述的定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，其特征在于，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
制备试剂二的方法，其包括如下步骤：
步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；
步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃ 环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；
步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；
步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ug ACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；
步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；
步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
7.根据权利要求5所述的定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，其特征在于，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：
校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
8.一种定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法，其特征为，该方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。
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