WO2022151562A1 - 同时检测总抗体和中和抗体的方法及产品 - Google Patents
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Abstract
一种抗体的检测方法、检测抗体的组件及其在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。该抗体的检测方法包括:步骤1,使样品与配体或含配体的片段接触,形成第一反应物,并检测第一反应信号;步骤2,再使第一反应物与配体的受体或其片段接触,并检测第二反应信号。该方法能够同时检测总抗体和中和抗体,可以检测疫苗接种后的免疫保护情况。
Description
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种抗体检测方法、组件及应用。
病原微生物侵染细胞过程中病毒表面受体结合蛋白是病原微生物进入细胞的关键“钥匙”,可以打开细胞受体蛋白的“锁”,从而进入细胞并启动其复制过程。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体,能够与病原微生物表面的抗原(配体)结合,从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体,防止侵入细胞。
目前的中和抗体检测主要在生物安全三级实验室(BSL3)内进行。利用活病毒细胞培养的中和试验检测,对实验室等级要求高,严重限制了临床大规模的推广使用。开发出可在生物安全二级实验室(BSL2)或普通实验室开展的快速中和抗体检测方法,具有重要意义。当前也有一些研究团队开发了ELISA类测试,来满足BSL2类检测的需求,但是检测试剂仅能单独检出中和抗体无法同时检测出总抗体。检测总抗体可以反映接种疫苗后是否产生抗体,检测中和抗体可以反映接种疫苗后是否获得中和抗体免疫效果,指导个体免疫接种方案的调整,判断是否需要调整免疫接种策略。从而提升群体免疫保护性的辅助支撑,具有重大意义。检测总抗体和中和抗体不仅能更客观的反应机体当前的免疫情况,还能用于分析机体过去或者未来对病原微生物的免疫判断和预测。
SARS-CoV-2表面棘突S蛋白(spike protein)是冠状病毒表面重要的受体结合位点,其可与细胞表面病毒特异性受体结合、介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附及穿膜;冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBM)可使病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)结合,并使病毒进入宿主细胞。当SARS-CoV-2在侵入机体时,会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体,专门阻止病原微生物进入细胞,防止感染。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标,是疫苗评估和质控的重要依据。
个体接种疫苗后可通过免疫应答产生保护性抗体,即中和抗体,对中和抗体进行滴度测定,可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测,可应用于疫苗的研发评价,以及疫苗接种后,对个体自身免疫效果的评价。另外,对于治愈后的新冠患者检测,可以判断是否存在再次感染的风险。
当前疫苗的开发思路是基于RBD-ACE2侵染机制,其核心片段是针对RBD设计,一些治疗方案也是基于阻断RBD-ACE2途径的抗体开发。
随着新冠疫苗的推广接种,现在急需开发一种方便快捷,无需在BSL3实验室条件下进行总抗体和中和抗体检测的试剂。
现有的新冠抗体检测试剂仅能单独检测总抗体或者中和抗体,总抗体和中和抗体不能够进行同时检测。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明提供了以下至少一种实施方式:
本发明提供了检测方法,包括:
一种抗体的检测方法,所述方法包括:
步骤1:样品与配体或含配体的片段接触,检测反应信号;
步骤2:再与所述配体的受体或其片段接触,检测反应信号。
其特征在于,所述检测方法可以检测中和抗体和/或总抗体,通过步骤1检测的是能够结合所述配体的总抗体,步骤2检测的是结合所述配体的中和抗体。
一些实施方式中,所述配体或含配体的片段可偶联有标记物;可选的标记物是胶乳微球。
在一些实施方式中,所述受体或其片段可偶联有标记物;可选的标记物是胶乳微球。
在一些实施方式中,所述配体或含配体的片段选自SARSr-CoV;具体的配体或含配体的片段是选自含SARS-CoV-2 RBM区的配体。
在一些实施方式中,所述受体或其片段是细胞表面受体或其片段;具体的受体是ACE2或受体片段是含ACE2片段。
在一些实施方式中,样本可以是血液样本、淋巴样本、唾液样本、尿液样本。在一个实施方式中,样本可以是血清。
本发明还提供了一种检测抗体的组件,包含:
(i).配体或含配体的片段,以及
(ii).与(i)的配体结合的受体或其片段。
在一些实施方式中,抗体检测组件中,配体或含配体的片段偶联有标记物,在一些实施例中标记物是胶乳微球。
在一些实施方式中,与(i)的配体结合的受体或其片段偶联有标记物,在一些实施例中标记物是胶乳微球。
在一些实施方式中,抗体检测组件中,配体或含配体的片段选自SARSr-CoV,具体的选自含SARS-CoV-2 RBM区的配体。
SARS-CoV-2包含SARS-CoV-2及其变异株。
在一些实施例中,抗体检测组件中,受体或其片段是细胞表面受体或其片段,具体的受体是ACE2或受体片段是含ACE2的片段。
本发明的优点在于:不仅能够同时检测样品中的总抗体和中和抗体,而且在数据判读上也能够带来方便,同时检测总抗体和中和抗体可以对测试结果纠偏,例如当总抗体检测为阴性,而中和抗体为阳性时,可以反馈检测结果存在异常,需要复检。
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合区RBD(core+RBM)与ACE2复合物晶体结构及作用界面电子密度图。
图2示出本发明同时检测总抗体和中和抗体中总抗体与发光平台总抗体检测的相关性。
图3示出本发明同时检测总抗体和中和抗体中中和抗体与发光平台中和抗体检测的相关性。
图4示出本发明检测阴性样本和阳性样本抑制率分布散点图。
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
本发明实施例能够检出待测样品中的总抗体和中和抗体水平,具有更高的灵敏度和/或特异性。本发明的方法和组件有通用性,不限于特定的免疫检测平台,不限于特定物种。
本文中,术语“受体”是指存在于胞膜或胞内的,能与细胞外专一信号分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应,使细胞对外界刺激产生相应的效应的特殊蛋白质。
本文中,术语“配体”指的是能够与“受体”结合的蛋白或蛋白片段。
本文中,术语“总抗体”指的是能够与“配体”结合的所有抗体的集合,术语“中和抗体”是指能够与“受体”竞争性结合“配体”的抗体。
本文中,“标记物”可理解为能够直接产生信号;或直接或间接促发特定物质产生信号,标记物可直接或间接连接至被标记物上。例如通常用于免疫检测的标记物,包括金属粒子、荧光标记物、发色团标记物、电子致密标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物、放射 性标记物、核酸标记物、多肽标记物或酶,但不限于此。在一些实施方式中,标记物可以是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶乳微球、三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物。
本文中,“检测信号”可理解为采取能够识别信号物质的方式,获取或识别检测信号强弱或水平。
本文中,术语“片段”指的是至少含有结合区段的氨基酸片段。
本文中,“接触”可理解为允许其发生结合。接触时间不作具体限定,不同的实施方式和检测平台,接触时间有所差异,但属于本领域技术人员可以理解的范畴。
本文中,ACE2不限定物种,根据待检样品的物种来源可以选择不同物种的ACE2,例如哺乳动物,非冷血飞行动物,蝙蝠和鸟类等,在一些实施方式中,使用人的ACE2,进行人样品的冠状病毒中和抗体检测。
本文中,如图1所示,RBM区是RBD中与ACE2能够结合的区段,RBD中和抗体和ACE2能够竞争结合RBM区。
本文中“SARSr-CoV”是指严重急性呼吸综合征相关冠状病毒,包括但不仅限于SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV。
在一些实施方式中,本发明提供一种抗体检测方法,包括:
步骤1:使样品与配体或含配体的片段接触,形成第一反应物,并检测第一反应信号;
步骤2:使第一反应物与配体的受体或其片段接触,形成第二反应物,并检测第二反应信号。
上述检测方法通过步骤1检测结合配体的总抗体,步骤2检测的是结合配体的中和抗体。按照本申请所提供的检测方法能够检测中和抗体和/或总抗体。
本文中,待测样品应当理解为可能含有抗体的样品,样品可以是血清、血浆、全血、口腔黏膜渗出液、淋巴液、唾液、尿液,不限于此。
本文中检测反应信号可以是采用比浊、吸光度、散色比、核磁共振等已知的检测手段检测信号值的改变。
在一些实施方式中,通过在受体和/或配体上偶联胶乳微球进一步放大反应信号,通过免疫比浊的检测方式检测总抗体和中和抗体。
本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述,很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而,本申请的示例性实施方式是示例性的,非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化,而不脱离本申请的宗旨和范围。
实施例
实施例1 抗体检测
在本实施例中,申请人提出一种同时检测SARS-CoV-2总抗体和中和抗体的方法和组件。
1.1 材料和方法
重组人ACE2、重组RBD抗原、新冠中和抗体标准品(G3)、胶乳微球均购自广东菲鹏生物有限公司。仪器:全自动生化分析仪。
1.2 ACE2偶联胶乳微球
1)390μL交联液(50mM HEPES,pH6.1),加入100μL胶乳微球(JSR),在摇床上震荡混匀,为胶乳微球液;
2)胶乳微球液中加入13μL的EDAC溶液,37摄氏度震荡活化1小时;
3)加入50μL ACE2(2mg/ml)到胶乳微球液中,37摄氏度震荡交联4小时;
4)加入50μL的TW-20溶液,37摄氏度震荡封闭1小时;
5)将交联液体加入到离心管中,离心后,小心用移液枪弃上清;
6)加入2mL清洗液(50mM甘氨酸+0.1%NaN
3,pH8.0),旋涡震荡,再离心一次,小心弃上清;
7)加入5mL胶乳微球悬浮液(50mM甘氨酸+0.1%BSA+10%蔗糖+0.1%NaN
3,pH8.0),超声分散处理。
1.3 RBD偶联胶乳微球
1)390μL交联液(50mM HEPES,pH6.1),加入100μL胶乳微球(JSR),在摇床上震荡混匀,为胶乳微球液;
2)胶乳微球液中加入13μL的EDAC溶液,37摄氏度震荡活化1小时;
3)加入50μL RBD(2mg/ml)到胶乳微球液中,37摄氏度震荡交联4小时;
4)加入50μL的TW-20溶液,37摄氏度震荡封闭1小时;
5)将交联液体加入到离心管中,离心后,小心用移液枪弃上清;
6)加入2mL清洗液(50mM甘氨酸+0.1%NaN3,pH8.0),旋涡震荡,再离心一次,小心弃上清;
7)加入5mL胶乳微球悬浮液(50mM甘氨酸+0.1%BSA+10%蔗糖+0.1%NaN3,pH8.0),超声分散处理。
1.4 标准品制备
用基质血清将中和抗体G3标准品(购自菲鹏生物)稀释成以下不同浓度:0、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml。
1.5 上机测试
仪器:全自动生化分析仪
检测流程:吸取样本盘上的样本15μL,同时吸取R1 135μL,加入比色杯中,机械搅拌,37℃下孵育5分钟;在比色杯中加入R2 15μL,机械搅拌;仪器记录下从加入样本开始算起的7分30秒和13分钟30秒的吸光度值,差值就是样本的反应度,反应度和样本中总抗浓度成正比关系。持续反应10分钟后,在比色杯中加入R3 50μL,机械搅拌;仪器记录下从加入样本开始算起的15分30秒和26分钟的反应度值,差值就是样本的反应度,反应度和样本中中和抗体浓度成反比关系。
加样比S:R1:R2:R3=15:135:15:50;
波长:570nm;
空白时间1:51-51;
反应时间1:90-90;
空白时间2:104-104;
反应时间2:172-172;
R1:Tris缓冲液;
R2:RBD偶联胶乳微球试剂;
R3:ACE2偶联胶乳微球试剂。
表1:检测标准品中的总抗体和中和抗体
注:抑制率=1-样本检测信号/阴性检测信号
分析表1数据可知,测试样品为中和抗体的标准品,在25ng/ml的标准浓度仍能够检测出17%的抑制率,也就是说按发明所制备的试剂及方法进行检测,灵敏度至少能够到达25ng/ml。
上表1中读点的涵义,以读点1为例进行说明:全自动生化分析仪在读取信号时,从加入样本的0s开始算起,每间隔一定时间读取一次,比如每9s读一次,那么读点1中对应的数字51的意思就是第50次读取的信号,读取时间为加入样本的后450s的时间点(即7分30秒)。其他读点以此类推。
实施例2 临床样本抗体检测
2.1 试剂制备 按照实施例1中的方法,制备以下试剂:
R1:Tris缓冲液
R2:RBD偶联胶乳微球试剂
R3:ACE2偶联胶乳微球试剂
2.2 采集接种新冠疫苗后血清样本23例
2.3 上机测试
仪器:迈瑞BS480
检测流程:吸取样本盘上的样本15μL,同时吸取R1 135μL,加入比色杯中,机械搅拌,37℃下孵育5分钟;在比色杯中加入R2 15μL,机械搅拌;仪器记录下从加入样本开始算起的7分30秒和13分钟30秒的吸光度值,差值就是样本的反应吸光度,吸光度和样本中总抗浓度在特定条件下成正比关系。持续反应10分钟后,在比色杯中加入R3 50μL,机械搅拌;仪器记录下从加入样本开始算起的15分30秒和26分钟的吸光度值,差值就是样本的反应吸光度,吸光度和样本中中和抗体浓度在特定条件下成正比关系。
加样比S:R1:R2:R3=15:135:15:50
波长:570nm
空白时间1:51-51
反应时间1:90-90
空白时间2:104-104
反应时间2:172-172
R1:Tris缓冲液
R2:RBD偶联胶乳微球试剂
R3:ACE2偶联胶乳微球试剂
对比例1 用现有的发光平台检测临床样本总抗体
3.1 化学发光总抗体检测:反应杯中加入样品50μL,再加入50μL磁珠包被的RBD(0.25mg/ml)和40μL吖啶酯标记的Anti-human IgG标记液(0.1μg/ml),37℃反应15min,检测发光值。
3.2 化学发光中和抗体检测:反应杯中加入样品50μL,再加入50μL磁珠包被的ACE2(0.25mg/ml)和40μL吖啶酯标记的RBD标记液(0.1μg/ml),37℃反应15min,检测发光值。
检测结果如下:
表2:总抗体检测数据对比
样本 | 实施例2 Au/ml | 对比例1 Au/ml |
V-01 | 6.0 | 6.24 |
V-02 | 5.8 | 2.28 |
V-03 | 6.5 | 5.55 |
V-04 | 6.7 | 2.97 |
V-05 | 16.4 | 14.46 |
V-06 | 5.9 | 2.61 |
V-07 | 5.4 | 3.15 |
V-08 | 9.1 | 7.08 |
V-09 | 3.0 | 1.89 |
V-10 | 12.2 | 7.05 |
V-11 | 3.3 | 2.01 |
V-12 | 1.7 | 1.77 |
V-13 | 2.2 | 1.44 |
V-14 | 2.0 | 1.24 |
V-15 | 4.7 | 1.95 |
V-16 | 3.8 | 1.89 |
V-17 | 15.3 | 7.77 |
V-18 | 13.7 | 13.32 |
V-19 | 8.7 | 4.92 |
V-20 | 6.7 | 3.81 |
V-21 | 10.4 | 3.15 |
V-22 | 31.3 | 17.07 |
V-23 | 12.2 | 6.72 |
表3 中和抗体检测数据对比
注:抑制率=1-样本反应度/PBS的反应度
分析:本发明制备的抗体检测试剂能够同时检测出样品中的总抗体和中和抗体,并且,如图2和图3所示,与高灵敏度的化学发光平台单独检测总抗体相关性R
2到达0.81和中和抗体的相关性R
2到达0.78,符合度一致。
实施例3 用50例阴性样本和23例阳性样本(接种疫苗)检测实施例1制备的试剂。
结果如4所示。从图4可以看到,本发明制备的试剂及检测方法能够很好的区分阴性和阳性样本,反应特异性高。并且对不同的阳性样本也有较高的区分度,反应检测线性范围宽。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
- 一种抗体的检测方法,所述检测方法包括:步骤1:使样品与配体或含配体的片段接触,形成第一反应物,并检测第一反应信号;步骤2:再使所述第一反应物与所述配体的受体或其片段接触,并检测第二反应信号。
- 根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法用于检测中和抗体和/或总抗体。
- 根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述配体或含配体的片段可偶联有标记物;可选的,所述标记物是胶乳微球。
- 根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法,其特征在于,所述受体或其片段可偶联有标记物;可选的,所述标记物是胶乳微球。
- 根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法,其特征在于,所述配体或含配体的片段来自病原体;可选的,病原体是SARSr-CoV;可选的,所述配体或含配体的片段选自含所述SARSr-CoV中RBM区的配体;可选的,所述配体或含配体的片段选自含SARS-CoV-2 RBM区的配体。
- 根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法,其特征在于,所述受体或其片段是细胞表面受体;可选的,所述受体是ACE2。
- 一种检测抗体的组件,包含:(i).配体或含配体的片段,以及(ii).与(i)的配体结合的受体或其片段。
- 根据权利要求7所述的组件,其特征在于:所述配体或含配体的片段偶联有标记物;可选的,所述标记物是乳胶微球;
- 根据权利要求7或8所述的组件,其特征在于:与(i)的配体结合的受体或其片段偶联有标记物;可选的,所述标记物是胶乳微球。
- 根据权利要求7至9中任一项所述的组件,其特征在于,所述配体或含配体的片段来自病原体;可选的,所述配体或含配体的片段选自含SARSr-CoV中RBM区的配体;可选的,所述配体或含配体的片段选自含SARS-CoV-2 RBM区的配体。可选的,所述受体或其片段是细胞表面受体或其片段;可选的,所述受体是ACE2。
- 权利要求1至6中任一项所述的检测方法或权利要求7至10中任一项所述的组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。
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121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21918761 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
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NENP | Non-entry into the national phase |
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122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
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