CN112394180A - 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒 - Google Patents

一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112394180A
CN112394180A CN202110065490.3A CN202110065490A CN112394180A CN 112394180 A CN112394180 A CN 112394180A CN 202110065490 A CN202110065490 A CN 202110065490A CN 112394180 A CN112394180 A CN 112394180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cov
sars
latex
neutralizing antibody
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110065490.3A
Other languages
English (en)
Inventor
张玉基
叶生宝
王鹏
李叶
徐达
王维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd filed Critical Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Priority to CN202110065490.3A priority Critical patent/CN112394180A/zh
Publication of CN112394180A publication Critical patent/CN112394180A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2中和抗体的检测方法、检测试剂盒，属于生物医学检测技术领域。本发明公开的SARS‑CoV‑2中和抗体的检测方法是基于hACE2‑RBD放大的胶乳增强免疫比浊检测法，检测试剂盒包括SARS‑CoV‑2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球和人hACE2标记的第二胶乳微球。本发明通过在胶乳微球上标记抗原，放大了检测信号，增加了检测的灵敏度，拓宽了检测范围。本发明不仅能够确定被检测者是否为感染者，还能获知被检测者感染风险。本发明对中和抗体的检测还可用于评价接种SARS‑CoV‑2疫苗后临床效果，对SARS‑CoV‑2疫苗的研发与接种，具有重大意义。

Description

一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2是一种β属的新型冠状病毒，呈圆形或椭圆形，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状，可感染哺乳动物和人。SARS-CoV-2感染后，潜伏期为2-14天不等，有个别案例潜伏期甚至达到21天，初期的感染从无症状到部分表现为发烧、干咳、上呼吸道感染、食欲低下、腹泻等特征，部分病例逐渐发展为呼吸窘迫、肺炎、肺部玻璃样病变、咳血等，重症病例伴随淋巴细胞减少、C反应蛋白和乳酸脱氢酶上升。研究结果显示其传染性及致病性强，目前没有特异性抗SARS-CoV-2感染的临床药物，因此，从源头切断传染源，抑制病毒传播，及时有效的检出新型冠状病毒尤为重要。
现有的SARS-CoV-2检测方法主要有核酸检测和抗体检测，其中核酸检测灵敏度高，特异性强，准确度高，但是操作要求相对较高，检测时间长。抗体检测灵敏度较高，特异性较强，但是需要在被感染7-14天后才能出现IgM/IgG抗体。为了增加结果的准确性，必须多次进行检测，在错综复杂抗疫现状中，时间就是生命，及时准确的获知被检测者状况意义重大。另外，现有的检测手段仅限于确定被检测者是否处于感染期，对于普通大众是否存在暴露或者感染的风险，以及愈后患者是否存在再感染的风险是无法获知的，寻找及时、有效、高效的SARS-CoV-2检出方法迫在眉睫。
当SARS-CoV-2在侵入机体时，冠状病毒S蛋白受体结合域（receptor bindingdomain，RBD）可使病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2）结合，此时，病毒刺激机体产生保护性的中和抗体，所谓中和抗体，即当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞，从而发挥抗病毒作用。
胶乳免疫比浊法是一种带载体的免疫比浊法，将待测物质相对应的抗体或抗原包被在直径为50nm~400nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。基本原理：选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，偶联抗原后，当遇到抗体时，都会发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，也就是与抗体量成正比。但是，在实际检测中，该方法检测的线性范围不够宽。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中SARS-CoV-2中和抗体检测响应慢，操作要求高，线性范围窄，仅能确定被检测者是否处于感染期或接种SARS-CoV-2疫苗后是否产生中和抗体，而不能获知被检测者感染风险的技术问题。本发明提供高效、简单、线性范围宽、能够获知被检测者感染风险以及接种SARS-CoV-2疫苗后临床效果的一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒。本发明采用的是在胶乳微球上标记抗原，来检测中和抗体，本发明的技术方案如下。
一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法，其特征在于，基于胶乳免疫比浊法实现SARS-CoV-2中和抗体检测。
一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法，其特征在于，基于胶乳增强免疫比浊法实现SARS-CoV-2中和抗体检测。
优选的，所述胶乳增强免疫比浊法为基于hACE2-RBD放大的胶乳增强免疫比浊检测，包括如下步骤：
制备试剂R1：第一胶乳微球标记SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD；
制备试剂R2：第二胶乳微球标记人hACE2；
两种标记胶乳微球形成竞争性比浊。
优选的，所述第一胶乳微球标记方法为：先将第一胶乳微球进行活化，在胶乳溶液中加入0.05~0.2M EDC，所述EDC的pH值范围为6.0~6.5，室温下，以转速100~500r/min的条件下搅拌反应0.5h，然后加入0.01~0.2M NHS反应10~30min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1~2h，等反应结束后加入封闭剂封闭2~3h，37℃老化12~48h即完成标记；
所述第二胶乳微球标记方法为：将第二胶乳微球活化，加入hACE2进行偶联，经过封闭后37℃老化12~48h。
一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包括SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球，所述试剂R2包括人hACE2标记的第二胶乳微球。
优选的，所述试剂R1中SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球的质量比为0.15%～0.35％，所述试剂R2中人hACE2标记的第二胶乳微球的质量比为0.05-0.35%。
优选的，所述第一胶乳微球和第二胶乳微球为聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的一种或多种，所述第一胶乳微球和第二胶乳微球均为羧基修饰微球。
优选的，所述第一胶乳微球的直径为100nm～400nm，所述第二胶乳微球的直径为50nm～200nm。
优选的，所述试剂R1和试剂R2还分别包括缓冲液、糖、盐、稳定剂、防腐剂、表面活性剂，所述缓冲液pH范围为6.0~7.5，所述糖的质量比为1％~5％，所述盐的质量比为1％~3％，所述稳定剂的质量比为0.5％~2％，所述防腐剂的体积比为0.5‰~2‰，所述表面活性剂的体积比为0.1‰~10‰。
优选的，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液的一种；所述糖为蔗糖，海藻糖中的一种或多种；所述盐为氯化钠、氯化钾的一种或多种；所述稳定剂为牛血清白蛋白（BSA）；所述防腐剂为叠氮化钠、Proclin-300中的一种或多种；所述表面活性剂为NP40、曲拉通X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）中的一种或多种。
优选的，所述SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒还包括标准品和质控品，所述标准品为一系列低滴度到高滴度的SARS-CoV-2中和抗体溶液。
通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
（1）试剂R1中含有SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）标记的胶乳微球，能够与R2试剂中的hACE2-胶乳微球复合物形成竞争性比浊，放大了检测信号，拓宽了检测的线性范围。
（2）通过胶乳微球上标记抗原，实现中和抗体的检测，本发明不仅能够确定被检测者是否为感染者，还能获知被检测者感染风险。
（3）人接种疫苗后，机体通过免疫应答反应产生保护作用的中和抗体，本发明对中和抗体的检测还可用于评价接种SARS-CoV-2疫苗后临床效果，对SARS-CoV-2疫苗的研发与接种，具有重大意义。
（4）本发明不仅能够实现SARS-CoV-2中和抗体的定性分析，还能能够实现SARS-CoV-2中和抗体的定量分析，对抗疫研究性具有助推作用。
（5）本发明所用的试剂及材料为实验室常见的试剂及材料，方法简单，实验条件要求不高，灵敏度高，响应快，5分钟即可完成一个样品的检测，并且检测结果重复性好、准确度高。
（6）本发明所公开的试剂盒适用性强，既可以在通用的大型自动生化分析仪上运用，也可以在特定蛋白分析仪等小型的设备上采用，可以很好地满足从大型三甲医院到社区基层医院的使用需求。
（7）本发明操作简单，普适性强，对操作者进行简单培训即可掌握好使用方法，极适用于缓解抗疫工作响应急、时间紧、工作量大、工作人员数量紧张等特征。
附图说明
图1是各大分子结构示意图，图中a为SARS-CoV-2中和抗体，b为第二胶乳微球，c为第一胶乳微球，A为RBD标记微球，B为hACE2标记微球；
图2是产生中和抗体，不形成比浊原理示意图；
图3是未产生中和抗体，形成比浊原理示意图；
图4是实施例1中胶乳试剂建立的定标曲线；
图5是实施例1线性范围曲线图；
图6是实施例1线性相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
图1至图3是本发明提供的技术方案的技术原理：当被测样品中含有SARS-CoV-2中和抗体时，试剂R1中胶乳微球-RBD与中和抗体结合，不形成比浊；当被测样品中不含有SARS-CoV-2中和抗体时，试剂R1中的RBD和试剂R2中的hACE2交联，形成比浊；通过透射的吸光度或者散射光强度的变化值实现SARS-CoV-2中和抗体的定性和定量分析。
实施例1 试剂制备1
试剂R1的制备
试剂盒中R1中偶联SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的胶乳微球球径为278nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0113，厂家JSRLife Sciences Corporation）。
标记：将球径为278nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.1M Hepes溶液（pH=7.5），在胶乳溶液中加入0.1M EDC（pH 6.3）37℃活化0.5h，在均速搅拌仪上（300r/min）搅拌反应0.5h，然后加入0.01M NHS后反应20min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1.5h，等反应结束后加入封闭剂封闭2.5h，最后37℃老化24h。
本实施例中反应液R1包括RBD标记的胶乳微球、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂（封闭剂）、防腐剂和表面活性剂。其中RBD标记的胶乳微球质量比为0.15％；缓冲溶液是0.1MHepes，pH＝7.5；糖是海藻糖，其质量比为3％；盐是氯化钠，其质量比为1％；封闭剂（即稳定剂）为牛血清白蛋白，其质量比为1%；防腐剂是ProClin 300，其体积比为1‰，表面活性剂是曲拉通X-100，体积比为1‰。
试剂R2的制备
试剂盒中R2中偶联hACE2的胶乳微球球径为84nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0011，厂家JSR Life Sciences Corporation）。
标记：将0.1L球径为84nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.5L的0.1M Hepes溶液（pH=7.5）中37℃活化0.5h，接着加入100mg hACE2蛋白，然后加入1.4L封闭剂，搅拌2小时后37℃老化12h。
本例中反应液R2包括hACE2-胶乳微球复合物、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。其中胶乳微球含量0.15％（质量比）；缓冲溶液是0.1M Hepes（pH＝7.5）；糖是海藻糖，其质量比是4％；盐是氯化钠，其质量比为2.0％；封闭剂（即稳定剂）是牛血清白蛋白，质量比为1％；防腐剂是ProClin 300，体积比为1‰，表面活性剂是曲拉通X-100，体积比为1‰。
标准品的制备
将市售的SARS-CoV-2中和抗体用标准品稀释液配制成一系列标准品，滴度分别为0，1:100，1:300，1:500，1:1000，1:10000；标准品稀释液的组成是50mM PBS pH7 .4，0.1％（体积比）Proclin 300，0.1％（体积比）曲拉通X-100，1.8％（质量比）氯化钠，1％（质量比）牛血清白蛋白。
质控品的制备
将SARS-CoV-2中和抗体用标准品稀释液稀释成滴度1:100和1:3000，分别作为低值质控品和高值质控品。
实施例2 试剂制备2
试剂R1的制备
试剂盒中R1中偶联SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的胶乳微球球径为100nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0113，厂家JSRLife Sciences Corporation）。
标记：将球径为100nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.1M磷酸缓冲液（pH=6.8），在胶乳溶液中加入0.05M EDC（pH 6.0）37℃活化0.5h，在均速搅拌仪上（100r/min）搅拌反应0.5h，然后加入0.01M NHS后反应10min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1h，等反应结束后加入封闭剂封闭2h，最后37℃老化12h。
本实施例中反应液R1包括RBD标记的胶乳微球、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂（封闭剂）、防腐剂和表面活性剂。其中RBD标记的胶乳微球质量比为0.35％；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液，pH＝6.8；糖是海藻糖，其质量比为5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）为牛血清白蛋白，其质量比为2%；防腐剂是ProClin 300，其体积比为2‰，表面活性剂是NP40，体积比为10‰。
试剂R2的制备
试剂盒中R2中偶联hACE2的胶乳微球球径为50nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0011，厂家JSR Life Sciences Corporation）。
标记：将0.1L球径为50nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.5L的0.1M 磷酸缓冲液（pH=6.8）中37℃活化0.5h，接着加入100mg hACE2蛋白，然后加入1.4L封闭剂，搅拌2小时后37℃老化12h。
本例中反应液R2包括hACE2-胶乳微球复合物、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。其中胶乳微球含量0.35％（质量比）；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液（pH＝6.8）；糖是海藻糖，其质量比是5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）是牛血清白蛋白，质量比为2％；防腐剂是ProClin 300，体积比为2‰，表面活性剂是曲拉通X-100，体积比为10‰。
标准品的制备
与实施例1相同。
质控品的制备
与实施例1相同。
实施例3 试剂制备3
试剂R1的制备
试剂盒中R1中偶联SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的胶乳微球球径为400nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0113，厂家JSRLife Sciences Corporation）。
标记：将球径为400nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.1M MES缓冲液（pH=6.0），在胶乳溶液中加入0.2M EDC（pH 6.5）37℃活化0.5h，在均速搅拌仪上（500r/min）搅拌反应0.5h，然后加入0.2M NHS后反应30min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应2h，等反应结束后加入封闭剂封闭3h，最后37℃老化48h。
本实施例中反应液R1包括RBD标记的胶乳微球、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂（封闭剂）、防腐剂和表面活性剂。其中RBD标记的胶乳微球质量比为0.25％；缓冲溶液是0.1M MES缓冲液，pH＝6.0；糖是蔗糖，其质量比为1％；盐是氯化钾，其质量比为2％；封闭剂（即稳定剂）为牛血清白蛋白，其质量比为0.5%；防腐剂是叠氮化钠，其体积比为0.5‰，表面活性剂是十二烷基硫酸钠，体积比为0.1‰。
试剂R2的制备
试剂盒中R2中偶联hACE2的胶乳微球球径为200nm的表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（分类号P0011，厂家JSR Life Sciences Corporation）。
标记：将0.1L球径为200nm表面羧基修饰的聚苯乙烯胶乳微球在0.5L的0.1M MES缓冲液（pH=6.0）中37℃活化0.5h，接着加入100mg hACE2蛋白，然后加入1.4L封闭剂，搅拌2小时后37℃老化12h。
本例中反应液R2包括hACE2-胶乳微球复合物、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。其中胶乳微球含量0.05％（质量比）；缓冲溶液是0.1M MES缓冲液（pH＝6.0）；糖是蔗糖，其质量比是1％；盐是氯化钾，其质量比为1.0％；封闭剂（即稳定剂）是牛血清白蛋白，质量比为0.5％；防腐剂是叠氮化钠，其体积比为0.5‰，表面活性剂是十二烷基硫酸钠，体积比为0.1‰。
标准品的制备
与实施例1相同。
质控品的制备
与实施例1相同。
实施例4 试剂制备4
试剂R1的制备
试剂盒中R1中偶联SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的胶乳微球球径为100nm的表面羧基修饰的聚丙烯酸酯微球。
标记：将球径为350nm表面羧基修饰的聚丙烯酸酯微球在0.1M磷酸缓冲液（pH=6.8），在胶乳溶液中加入0.05M EDC（pH 6.0）37℃活化0.5h，在均速搅拌仪上（100r/min）搅拌反应0.5h，然后加入0.01M NHS后反应10min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1h，等反应结束后加入封闭剂封闭2h，最后37℃老化12h。
本实施例中反应液R1包括RBD标记的胶乳微球、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂（封闭剂）、防腐剂和表面活性剂。其中RBD标记的胶乳微球质量比为0.35％；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液，pH＝6.8；糖是海藻糖，其质量比为5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）为牛血清白蛋白，其质量比为2%；防腐剂是ProClin 300，其体积比为2‰，表面活性剂是NP40，体积比为5‰。
试剂R2的制备
试剂盒中R2中偶联hACE2的胶乳微球球径为50nm的表面羧基修饰的聚丙烯酸酯微球。
标记：将0.1L球径为150nm表面羧基修饰的聚丙烯酸酯微球在0.5L的0.1M 磷酸缓冲液（pH=6.8）中37℃活化0.5h，接着加入100mg hACE2蛋白，然后加入1.4L封闭剂，搅拌2小时后37℃老化12h。
本例中反应液R2包括hACE2-胶乳微球复合物、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。其中胶乳微球含量0.25％（质量比）；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液（pH＝6.8）；糖是海藻糖，其质量比是5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）是牛血清白蛋白，质量比为2％；防腐剂是ProClin 300，体积比为2‰，表面活性剂是曲拉通X-100，体积比为5‰。
标准品的制备
与实施例1相同。
质控品的制备
与实施例1相同。
实施例5 试剂制备5
试剂R1的制备
试剂盒中R1中偶联SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的胶乳微球球径为200nm的表面羧基修饰的聚丙烯酸微球。
标记：将球径为200nm表面羧基修饰的聚丙烯酸微球在0.1M磷酸缓冲液（pH=6.8），在胶乳溶液中加入0.05M EDC（pH 6.0）37℃活化0.5h，在均速搅拌仪上（100r/min）搅拌反应0.5h，然后加入0.01M NHS后反应10min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1h，等反应结束后加入封闭剂封闭2h，最后37℃老化12h。
本实施例中反应液R1包括RBD标记的胶乳微球、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂（封闭剂）、防腐剂和表面活性剂。其中RBD标记的胶乳微球质量比为0.25％；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液，pH＝6.8；糖是海藻糖，其质量比为5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）为牛血清白蛋白，其质量比为2%；防腐剂是ProClin 300，其体积比为2‰，表面活性剂是NP40，体积比为3‰。
试剂R2的制备
试剂盒中R2中偶联hACE2的胶乳微球球径为50nm的表面羧基修饰的聚丙烯酸微球。
标记：将0.1L球径为130nm表面羧基修饰的聚丙烯酸微球在0.5L的0.1M 磷酸缓冲液（pH=6.8）中37℃活化0.5h，接着加入100mg hACE2蛋白，然后加入1.4L封闭剂，搅拌2小时后37℃老化12h。
本例中反应液R2包括hACE2-胶乳微球复合物、缓冲溶液、糖、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。其中胶乳微球含量0.35％（质量比）；缓冲溶液是0.1M 磷酸缓冲液（pH＝6.8）；糖是海藻糖，其质量比是5％；盐是氯化钠，其质量比为3％；封闭剂（即稳定剂）是牛血清白蛋白，质量比为2％；防腐剂是ProClin 300，体积比为2‰，表面活性剂是曲拉通X-100，体积比为3‰。
标准品的制备
与实施例1相同。
质控品的制备
与实施例1相同。
实施例6 建立定标曲线
在生化仪上建立定标曲线将6个SARS-CoV-2中和抗体标准品S，滴度从0到1:10000，放于生化仪（本实施例中使用日立全自动生化仪7180）中样品盘内，分别与配制的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂R1和反应液R2反应，S:R1:R2＝2ul:150ul:150ul，进行检测，记录反应度，试剂参数设置完成和试剂位置放置正确后，生化分析仪自动完成吸取试剂和采样步骤，整个过程大约耗时10-12分钟。检测波长为600nm，采用两点终点法，反应时间5min，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线，如图4所示。
实施例7 灵敏度分析
使用实施例1的试剂，选用零值标准品作为空白样本测试，在全自动生化分析仪（日立7180）上测试，温度37℃，600nm波长，1cm光径条件下，测试吸光度值。重复测试20次，根据图4建立的定标曲线，计算20次测试结果的平均值和标准差（SD），作为试剂的分析灵敏度（空白限）。3组测试结果如表1所示，显示分析灵敏度分别为0.9575、0.9425和 0.9376。
表1
Figure 361248DEST_PATH_IMAGE002
实施例8 线性范围测定
低滴度SARS-CoV-2校准品:1:100（L）与1:3000（H）的高滴度SARS-CoV-2标准品，分别制成（5L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，L+4H，5H）共6个不同的稀释浓度滴度。使用实施例1中制备的试剂分别对这些样品进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。以稀释滴度的倒数为自变量，以检测结果均值的倒数为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r）。线性范围曲线如图5所示，线性方程为y＝0.9708x+7.445，相关系数R2＝0.9975，线性范围宽。
实施例9重复性试验
用实施例1中制备的试剂测试SARS-CoV-2中和抗体滴度为1:100的低水平滴度的控制物质和SARS-CoV-2中和抗体滴度为1:1000高水平滴度的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值的倒数和标准差（SD）。按式（1）计算变异系数（CV）。测试结果见表2。根据测量结果，计算出变异系数CV＝5.75％和2.10％，符合试剂CV≤10％的技术要求。
Figure 278389DEST_PATH_IMAGE003
…………式（1）
式中：CV：变异系数；
Figure 995809DEST_PATH_IMAGE004
：测量值的平均值；
s：标准差。
表2
Figure 391018DEST_PATH_IMAGE006
实施例10 相关性性分析
在本实施例中，我们收集了64个临床样本，采用实施例1中的试剂设备进行检测，检测结果与的假病毒检测结果中和抗体滴度（数据来源湖南大学）进行了相关性分析。分析结果如图6所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为 y＝0.9636x+0.5557，其中Y轴截距0.5557，斜率为0.9636，相关系数R2＝0.9911。这个结果表明本发明中的试剂盒和假病毒检测结果相关性高，准确性非常一致。
分别以实施例2-实施例5的试剂重复实施例6到实施例10的步骤，得到的实验结果与实施例1一致，此处不再赘述。
本发明采用的hACE2的基因为19-620。
以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法，其特征在于，基于胶乳增强免疫比浊法实现SARS-CoV-2中和抗体检测，所述胶乳增强免疫比浊法为基于hACE2-RBD放大的胶乳增强免疫比浊检测，包括如下步骤：
制备试剂R1：第一胶乳微球标记SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD；
制备试剂R2：第二胶乳微球标记人hACE2；
两种标记胶乳微球形成竞争性比浊。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2中和抗体的检测方法，其特征在于，所述第一胶乳微球标记方法为：先将第一胶乳微球进行活化，在胶乳溶液中加入0.05~0.2M EDC，所述EDC的pH值范围为6.0~6.5，室温下，以转速100~500r/min的条件下搅拌反应0.5h，然后加入0.01~0.2M NHS反应10~30min，之后加入RBD蛋白进行偶联反应1~2h，等反应结束后加入封闭剂封闭2~3h，37℃老化12~48h即完成标记；
所述第二胶乳微球标记方法为：将第二胶乳微球活化，加入hACE2进行偶联，经过封闭后37℃老化12~48h。
3.一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包括SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球，所述试剂R2包括人hACE2标记的第二胶乳微球。
4.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球的质量比为0.15%～0.35％，所述试剂R2中人hACE2标记的第二胶乳微球的质量比为0.05~0.35%。
5.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述第一胶乳微球和第二胶乳微球为聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的一种或多种，所述第一胶乳微球和第二胶乳微球均为羧基修饰微球。
6.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述第一胶乳微球的直径为100nm～400nm，所述第二胶乳微球的直径为50nm～200nm。
7.根据权利要求3-6任意一项权利要求所述的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2还分别包括缓冲液、糖、盐、稳定剂、防腐剂、表面活性剂，所述缓冲液pH范围为6.0~7.5，所述糖的质量比为1％~5％，所述盐的质量比为1％~3％，所述稳定剂的质量比为0.5％~2％，所述防腐剂的体积比为0.5‰~2‰，所述表面活性剂的体积比为0.1‰~10‰。
8.根据权利要求3-6任意一项权利要求所述的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品和质控品，所述标准品为一系列低滴度到高滴度的SARS-CoV-2中和抗体溶液。
CN202110065490.3A 2021-01-19 2021-01-19 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒 Pending CN112394180A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110065490.3A CN112394180A (zh) 2021-01-19 2021-01-19 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110065490.3A CN112394180A (zh) 2021-01-19 2021-01-19 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112394180A true CN112394180A (zh) 2021-02-23

Family

ID=74625391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110065490.3A Pending CN112394180A (zh) 2021-01-19 2021-01-19 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112394180A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113009154A (zh) * 2021-02-25 2021-06-22 山东莱博生物科技有限公司 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
CN113514636A (zh) * 2021-03-03 2021-10-19 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) 一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN114487400A (zh) * 2022-04-01 2022-05-13 南京立顶医疗科技有限公司 定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法
WO2022109751A1 (en) * 2020-11-27 2022-06-02 The University Of Western Ontario Point-of-care testing for sars-cov antibodies
CN114702575A (zh) * 2022-01-24 2022-07-05 广东医科大学 抗SARS-CoV-2 S蛋白的纳米抗体、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及应用
WO2022151562A1 (zh) * 2021-01-12 2022-07-21 广东菲鹏生物有限公司 同时检测总抗体和中和抗体的方法及产品
CN117192134A (zh) * 2023-09-14 2023-12-08 宁波美康盛德生物科技有限公司 一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915848A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 中国医学科学院病原生物学研究所 Rbd蛋白在制备sars病人辅助诊断试剂中的应用
CN111208303A (zh) * 2020-01-17 2020-05-29 叶卫玲 一种定量检测抗环胍氨酸多肽抗体的检测方法及试剂盒
CN111505277A (zh) * 2020-03-10 2020-08-07 四川省人民医院 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111562368A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒
CN112010965A (zh) * 2020-05-15 2020-12-01 潍坊医学院 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白RBD区的单克隆抗体及其应用
CN112114141A (zh) * 2020-09-11 2020-12-22 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915848A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 中国医学科学院病原生物学研究所 Rbd蛋白在制备sars病人辅助诊断试剂中的应用
CN111208303A (zh) * 2020-01-17 2020-05-29 叶卫玲 一种定量检测抗环胍氨酸多肽抗体的检测方法及试剂盒
CN111505277A (zh) * 2020-03-10 2020-08-07 四川省人民医院 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒
CN112010965A (zh) * 2020-05-15 2020-12-01 潍坊医学院 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白RBD区的单克隆抗体及其应用
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111562368A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒
CN112114141A (zh) * 2020-09-11 2020-12-22 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
魏萍: "《临床医技新编》", 31 March 2016 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022109751A1 (en) * 2020-11-27 2022-06-02 The University Of Western Ontario Point-of-care testing for sars-cov antibodies
WO2022151562A1 (zh) * 2021-01-12 2022-07-21 广东菲鹏生物有限公司 同时检测总抗体和中和抗体的方法及产品
CN113009154A (zh) * 2021-02-25 2021-06-22 山东莱博生物科技有限公司 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
CN113009154B (zh) * 2021-02-25 2024-01-30 山东莱博生物科技有限公司 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
CN113514636A (zh) * 2021-03-03 2021-10-19 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) 一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN114702575A (zh) * 2022-01-24 2022-07-05 广东医科大学 抗SARS-CoV-2 S蛋白的纳米抗体、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及应用
CN114702575B (zh) * 2022-01-24 2023-05-23 广东医科大学 抗SARS-CoV-2 S蛋白的纳米抗体、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及应用
CN114487400A (zh) * 2022-04-01 2022-05-13 南京立顶医疗科技有限公司 定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法
CN117192134A (zh) * 2023-09-14 2023-12-08 宁波美康盛德生物科技有限公司 一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112394180A (zh) 一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒
CN113009154B (zh) 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
US20190219569A1 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
CN113009153A (zh) 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用
CN111983217B (zh) 一种样本处理液及其应用
CN107727869A (zh) 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法
CN111812336A (zh) 用于检测冠状病毒抗体的检测试剂盒及其制备方法
US20210349105A1 (en) Sars-cov-2 immunoassay and materials therefor
CN110806487A (zh) 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法
CN115993451B (zh) 一种甲型流感病毒和腺病毒抗原定量检测试剂盒、制备方法及定量检测方法
US20230049153A1 (en) Quantitative kit for myxovirus resistance protein 1
CN115629212A (zh) 一种猴痘病毒抗原检测试剂、试剂盒及制备方法
CN114814214A (zh) 一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒及制备方法
CN113321715A (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
CN108362892B (zh) 一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂
CN112698034B (zh) 一种癌胚抗原cea的检测试剂盒
CN108872609A (zh) 一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒
CN114965986A (zh) 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒
CN110244042B (zh) 羊腐败梭菌的间接elisa检测试剂盒
CN113075405A (zh) 一种乙肝病毒表面抗原检测试剂盒及其制备方法
Wielaard et al. A sol-particle immunoassay for determination of anti-rubella antibodies; development and clinical validation
CN114740201B (zh) 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
CN113189343A (zh) 一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒
CN114002428B (zh) 新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒
JP4556605B2 (ja) 標的物質の測定方法および測定試薬

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210223