CN114002428B - 新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外诊断领域，特别涉及新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒。所述检测装置、检测试剂和试剂盒，操作简单，检测快速，灵敏度高，对流行病的血清学调查有重要的应用价值。

Description

新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，特别涉及新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)对全球经济和人类生活造成了巨大的损害。高效准确的检测对全面掌握感染的严重程度和制定及时有效的应对策略至关重要。

SARS-CoV-2感染的检测主要依靠两种方法，核酸检测(检测病毒RNA)和血清学检测(检测针对SARS-CoV-2抗原的抗体)。核酸检测方法在病毒基因组序列公布后迅速建立起来，并作为COVID-19感染病例的主要诊断工具。然而，COVID-19的诊断和检测，由于核酸检测局限性和许多轻度或无症状感染者的出现，许多病例未被诊断。因此，检测SARS-CoV-2抗原引发的抗体的血清学检测已成为评估SARS-CoV-2在人群中传播的真实程度的关键。血清学研究表明，感染SARS-CoV-2后，抗体会在数周内产生，而且抗体水平在个体之间可能会有显著差异。SARS CoV的研究显示，由于SARS CoV 2与SARS CoV的基因组高度相似性，其表面S蛋白的RBD(Receptor binding domain)结构域直接与宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合进入细胞引起感染，促进病毒感染繁殖及传播。疫苗的有效性就在于诱导机体产生中和抗体，与病毒结构蛋白上的RBD结构域结合，阻断该表位与敏感细胞的细胞膜上的相应受体结合，从而阻止该病毒的入侵，发挥疫苗的保护作用。准确的血清学检测对于制定防治SARS-CoV-2感染的对策至关重要，包括确定和评估用于恢复期血浆治疗的供体以及研制SARS-CoV-2疫苗。

众所周知，目前检测抗体水平最常用的方法是免疫层析和病毒中和实验，但是免疫层析只能在终点读数，且不能精确定量，病毒中和实验作为“金标准”操作复杂，且需要至少48h的培养时间。

因此，提供快速的基于生物膜干涉技术的新冠病毒抗体定量检测试剂、试剂盒或检测装置具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种快速、高通量的检测血清中新冠病毒抗体水平的检测装置、检测试剂和检测试剂盒。所述检测装置、检测试剂和试剂盒，操作简单，检测快速，灵敏度高，对流行病的血清学调查有重要的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了光纤传感器和ICPTS(3-isocyanatepropylTriethoxysilane，3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)在制备新冠病毒抗体检测装置中的应用。

第二方面，本发明还提供了所述的光纤传感器的处理试剂，包括：甲苯配置的2％的ICPTS(3-isocyanatepropyl Triethoxysilane，3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)、重组mFc-ACE2蛋白溶液；

所述重组mFc-ACE2蛋白溶液的浓度为10～100μg/mL。

第三方面，本发明还提供了所述的光纤传感器经所述的处理试剂制备获得的ICPTS光纤传感器。

第四方面，本发明还提供了ICPTS光纤传感器，其制备方法包括：配置甲苯配置的2％的ICPTS(3-isocyanatepropyl Triethoxysilane，3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)，将表面处理后的光纤传感器末端在氩气气氛下浸入2％的ICPTS甲苯溶液中，在20℃±5℃浸泡2小时；经异丙醇清洗、风干，在150℃下烘焙10分钟，并在惰性气氛下储存；在重组mFc-ACE2蛋白溶液中浸泡，所述浸泡的温度为20℃±5℃，所述浸泡的时间为18小时。处理后的光纤探头表面已经固定好重组mFc-ACE2蛋白分子。

第五方面，本发明还提供了所述的ICPTS光纤传感器在制备新冠病毒抗体检测装置中的应用。

第六方面，本发明还提供了所述的ICPTS光纤传感器的处理试剂，包括：重组mFc-ACE2蛋白溶液、BSA溶液和蔗糖溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组mFc-ACE2蛋白溶液的浓度为10～100μg/mL，所述BSA溶液的浓度为10％，所述蔗糖溶液的浓度为15％。

第七方面，本发明还提供了所述的ICPTS光纤传感器经所述的处理试剂制备获得的光纤生物传感器。

第八方面，本发明还提供了光纤生物传感器，其制备方法包括：取所述ICPTS光纤传感器没入浓度为10～100μg/mL的重组mFc-ACE2蛋白溶液中，20℃±5℃静置18h；再没入10％的BSA溶液中，20℃±5℃静置20～30min；用PBST和去离子水洗涤；再没入浓度为15％的蔗糖溶液中，20℃±5℃静置20～30min；20℃±5℃晾干，置于2～8℃干燥保存。

第九方面，本发明还提供了新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒，所述检测装置包括所述的ICPTS光纤传感器，或所述的光纤生物传感器；

所述检测试剂包括所述的处理试剂，或所述的处理试剂；

所述检测试剂盒包括所述检测装置和/或所述检测试剂。

第十方面，本发明还提供了新冠病毒抗体的检测方法，基于本发明上述提供的检测装置、检测试剂或检测试剂盒，对待测样本进行检测。

本发明的有益效果包括但不限于：

本发明所述检测装置和方法检测时间短，整个检测过程仅需10min左右，且检测灵敏度和特异性均较好，可以做大通量检测。

本发明所述的检测装置和方法可以对免疫后人群的中和抗体进行精确定量，而胶体金和免疫荧光检测只能够在反应终点读数，定量结果不准确。

本发明所述检测装置和方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，可实现高通量样品快速检测。

根据样品中SARS-CoV-2-RBD蛋白中和抗体的浓度，从而可以得到接种疫苗后的人群中新型冠状病毒中和抗体水平，可以对疫苗的免疫效果进行评价，这对流行病学调查以及疫情防控意义重大。

本发明所述检测装置和方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示厚度与标准品浓度关系；

图2示亲和抗体结合标准曲线。

具体实施方式

本发明公开了新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的新冠病毒抗体的检测装置、检测试剂或检测试剂盒中，所用试剂或原料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1光纤生物传感器的制备

将ICPTS光纤传感器没入重组mFc-ACE2蛋白溶液中，室温静置18h；再将光纤生物传感器没入10％的BSA溶液中，室温静置20～30min；用PBST和去离子水洗涤；再将光纤生物传感器没入蔗糖溶液中，室温静置20～30min；室温晾干，置于2～8℃干燥保存。

所述的ICPTS光纤传感器是将表面处理后的光纤传感器末端在氩气气氛下浸入2％的ICPTS甲苯溶液中，在室温下浸泡2小时。然后用异丙醇清洗并风干，在150℃下烘焙10分钟，并在惰性气氛下储存。再将微纳光纤传感器浸泡在重组mFc-ACE2蛋白溶液中，室温18小时。处理后的光纤探头表面已经固定好重组mFc-ACE2蛋白分子；重组mFc-ACE2蛋白，为购买获得，其浓度为10～100μg/mL，蔗糖溶液浓度为15％。

实施例2样本准备

将接受过SARS CoV 2灭活病毒疫苗免疫后，且经过病毒中和实验验证有病毒阻断能力人血样本作为阳性样本，将血液样本收集到血清凝胶管(BD

8.5ml)中，Becton Dickinson)或肝素血浆管(BD />

4.0ml)中，根据标准化操作程序和制造商的建议，样品在 1885～2500g离心10分钟，取上层血清做1:10倍稀释(稀释液含有0.01～0.2mol/L磷酸盐缓冲液，10～100ng S-RBD-mFc重组蛋白，0.2～10mL/LTween20和0.5～5mL/L Proclin 300，pH为6.5～8.5)，作为待测样本。同时采取未注射过新冠疫苗且未感染过SARS CoV 2病毒的健康人样本作为阴性样本。重组S-RBD-mFc蛋白，为购买获得，其浓度为0.01～1mg/mL。

实施例3标准曲线制作

SARS-CoV-2-RBD中和抗体(Sinobiological,40592-MM57)为鼠单抗，在本检测方法中作为标准品，其浓度为1mg/mL。通过比较不同抗体浓度下荧光素酶报告子的相对光单位(RLU)来确定抑制率，中和抗体40592-MM57的IC50为0.41μg/mL。

标准曲线的制作，采用本实验自主研发的生物分子相互作用仪对梯度稀释的标准品溶液进行检测，绘制标准曲线。具体过程为：首先将8个光纤传感器没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；然后将平衡后的8个载有重组ACE2-mFc蛋白的光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、3.125μg/mL、15.625μg/mL的标准品溶液中60～300s进行梯度标准品的检测，标准品稀释液含有0.01～0.2mol/L磷酸盐缓冲液，10～100ng S-RBD-mFc重组蛋白，0.2～10mL/L Tween-20和0.5～5mL/L Proclin300，pH为6.5～8.5。检测结果如图1所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系(图2)。梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30～100s进行再生；再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30～100s进行平衡。

所述的具体过程可通过操作软件设置后仪器自动操作进行；甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5～3.0；光纤传感器经过再生后可重复使用；

最终经过线性拟合得到标准品浓度与检测信号之间的信号关系为：

Y＝4.2-0.97lnX(Y表示生物膜厚度信息，X表示标准品浓度)。

实施例4样品检测

采用本实验自主研发的生物分子相互作用仪对步骤(2)的样品进行检测；检测过程为光纤生物传感器端面已经结合有重组ACE2-mFc蛋白且经过BSA封闭。将生物传感器在PBS缓冲液中平衡5～10min；

平衡后的光纤传感器没入步骤2的样品中60～300s进行检测，读取阳性对照、阴性对照和样本的最终生物膜厚度(nm)值；

检测后的光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30～100s进行再生；再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30～100s进行平衡；

将检测得到的生物膜厚度数据值(nm)代入根据标准曲线所得出的对数函数中，求得样品中SARS CoV 2-RBD蛋白中和抗体的浓度。

计算SARS CoV 2中和抗体检测的阳性cutoff和阴性cutoff值，可以用来解释抑制率。

实施例5阳性检出率(灵敏度)和阴性检出率(特异性)判定

其中单次检测中阴性对照品及样本的生物膜厚度值(nm)用于计算待测样本血清中的抗体抑制率，阳性对照品的生物膜厚度值(nm)仅用于检测有效性判断；当中和抗体浓度为0时，ACE2-mFc与S-RBD-mFc接近100％结合，生物膜厚度为最大值；随着中和抗体浓度的升高，传感器端的ACE2-mFc被竞争性的与S-RBD-mFc结合，生物膜厚度逐渐下降。

待测样本中抗体抑制率的计算方法如下：

阳性样本：

抑制率＝(1－样品nm/阴性对照nm)×100％

结果判定标准：

抑制率≥20％：阳性，抑制率＜20％：阴性。

计算得到当检测信号≥3.44nm时，判定结果为阴性；将3.44nm代入步骤3中的函数(Y＝4.2–0.97lnX)，计算得到检测下限为5.75ng/ml.

当检测信号＜3.44nm时，判定结果为阳性；假设极限值为0nm，将0nm代入步骤3中的函数(Y＝4.2–0.97lnX)，计算得到检测上限为20.89μg/ml。

实施例6酶联免疫吸附测定ELISA

RBD中和抗体标准品溶液为：浓度为1mg/mL的RBD中和抗体溶液；

阴性对照为正常人新冠病毒SARS CoV 2抗体阴性血清；

包被缓冲液：即碳酸盐缓冲溶液，含Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.94g、并调整pH值为9.6，加去离子水定容到1000mL，0.45μm滤膜过滤除菌；

封闭液：为含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓PBS冲液，所述牛血清白蛋白在所述封闭液中的终浓度为1～10％，所述终浓度为质量百分比浓度。

样品稀释液：含NaCl 8g、NaH₂ PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX 100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH7.4，用去离子水定容到1000mL，0.45μm滤膜过滤除菌。

洗涤液：含NaCl 8.0g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、Tween-200.5mL，pH7.4～7.6，加去离子水定容到1000mL，0.45μm滤膜过滤除菌；

TMB底物显色液由显色液A和显色液B组成，显色液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；显色液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显色液A与显色液B按体积比1:1混合；终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液。

间接ELISA操作步骤：用包被缓冲液将S-RBD-mFc蛋白稀释到100ng/μl，然后加入到酶标板孔中，每孔100μl，4℃反应过夜；1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭2h,洗涤3次，每次2min；将待检血清用样本稀释液稀释液按1:10稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h，洗涤酶标板；用抗体稀释液(1％BSA/PBST)将辣根过氧化物酶HRP标记的抗体鼠抗人IgG(0.8mg/ml)按照1:5000稀释，每孔加100μl，37℃孵育30min，洗涤酶标板；每孔加入TMB底物显色液50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟，每孔加入2M硫酸终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光值(OD_450nm值)。

实施例7验证本实施例检测结果的真实性

以酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测步骤3中梯度稀释的标准品，绘得标准曲线。再用ELISA方法测得8个待检人员1-8号唾液中的新冠病毒中和抗体含量分别为见下表。本发明测得的膜厚度结果代入函数。

与本发明测得的结果一致。列表如下：

表1与ELISA检测结果对比

实施例8试剂盒精密度、准确度、灵敏度

1)精密度试验

根据上述的制备方法制备不同批次(001批、002批、003批)的试剂盒，从中各抽取3个试剂盒，进行试验，测定103.75ng/ml RBD中和抗体标准品的浓度值，用8根探针代表重复8次，分别计算变异系数(CV％)。通过试验考察(表2、表3)，该检测方法的批内变异系数为，3.81±1.05％，批间变异系数为6.94±1.08％，满足批内精密度小于10％，批间精密度小于15％的要求。

表2批内精密度测定结果

表3批间精密度测定结果

2)灵敏度和特异性试验

表4本发明试剂盒与病毒中和实验对比

灵敏度计算：108/(108+9)×100％＝96.4％。

特异性计算：294/(294+3)×100％＝98.99％。

总符合率：(108+297)/(108+4+294+3)×100％＝99.04％。

以上实验结果说明，本发明提供的检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法，与中和抗体检测金标准有很好的一致性，可以用于接种新型冠状病毒疫苗后中和抗体产生评估，其灵敏度、特异性均较好，利于临床准确评估疫苗效果。且此方法还具有操作简便，反应时间迅速，最快可以在10min内得出结果，可以做大通量监测，大大节约检测的人力物力，是比较理想的检测中和抗体水平的方法，对疫情防控意义重大。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.光纤传感器和ICPTS在制备新冠病毒抗体检测装置中的应用；

在制备所述新冠病毒抗体检测装置中使用处理试剂处理所述光纤传感器；

所述光纤传感器的处理试剂包括：2%的ICPTS甲苯溶液、重组mFc-ACE2蛋白溶液；

所述重组mFc-ACE2蛋白溶液的浓度为10~100μg/mL。

2.如权利要求1所述的光纤传感器的处理试剂，其特征在于，包括：2%的ICPTS甲苯溶液、重组mFc-ACE2蛋白溶液；

所述重组mFc-ACE2蛋白溶液的浓度为10~100μg/mL。

3.如权利要求1所述的光纤传感器经如权利要求2所述的处理试剂制备获得的ICPTS光纤传感器。

4.ICPTS光纤传感器，其特征在于，其制备方法包括：将表面处理后的光纤传感器末端在氩气气氛下浸入2%的ICPTS甲苯溶液中，在20℃±5℃下浸泡2小时；经异丙醇清洗、风干，在150°C下烘焙10分钟，并在惰性气氛下储存；在重组mFc-ACE2蛋白溶液中浸泡，所述浸泡的温度为20℃±5℃，所述浸泡的时间为18小时。

5.如权利要求3或4所述的ICPTS光纤传感器在制备新冠病毒抗体检测装置中的应用。

6.如权利要求3或4所述的ICPTS光纤传感器的处理试剂，其特征在于，包括：重组mFc-ACE2蛋白溶液、BSA溶液和蔗糖溶液。

7.如权利要求6所述的处理试剂，其特征在于，所述重组mFc-ACE2蛋白溶液的浓度为10~100μg/mL，所述BSA溶液的浓度为10%，所述蔗糖溶液的浓度为15％。

8.如权利要求3或4所述的ICPTS光纤传感器经如权利要求6或7所述的处理试剂制备获得的光纤生物传感器。

9.光纤生物传感器，其特征在于，其制备方法包括：取权利要求3或4所述的ICPTS光纤传感器没入浓度为10~100μg/mL的重组mFc-ACE2蛋白溶液中，20℃±5℃静置18h；再没入10％的BSA溶液中，20℃±5℃静置20~30min；用PBST和去离子水洗涤；再没入浓度为15％的蔗糖溶液中，20℃±5℃静置20~30min；20℃±5℃晾干，置于2～8℃干燥保存。

10.新冠病毒抗体的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括如权利要求3或4所述的ICPTS光纤传感器，或如权利要求8或9所述的光纤生物传感器。

11.新冠病毒抗体的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括如权利要求2所述的处理试剂，或如权利要求6或7所述的处理试剂。

12.新冠病毒抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求10所述的检测装置和/或如权利要求11所述的检测试剂。

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