CN117990904A - 用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒及其应用。所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于自主研发制备的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1抗体和A型口蹄疫病毒VLPs，研发出一种敏感性和特异性均较好，可以检测A型口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产A型口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，能够方便的用于评价疫苗诱导的抗体是否具有保护作用，其检测结果与传统VNT方法检测结果具有很高的符合率(95.3％)。

Description

用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及一种ELISA检测试剂盒及其应用，特别涉及一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起偶蹄动物(猪、牛、羊等)感染的一类动物传染病。其传播速度快，呈全球分布，对畜牧业的发展影响较大，WOAH将其列为必须上报的动物疫病，也是我国重点防范、优先防治的一类动物疫病。该病在国家动物疫病防治长期发展规划中被确定为首位限期免疫净化防控的病种。口蹄疫病毒有7个血清型，流行具有明显的地域性，其中A、O两型流行区域最广，我国目前主要以O型为主，近5年A型口蹄疫发病率较低，但仍呈零星散发。目前口蹄疫病毒样颗粒疫苗已作为新型疫苗产品成功获得新兽药证书，而该类疫苗在免疫后是否产生中和抗体以及抗体效价是评价疫苗效果的关键指标。
目前，普遍认为FMDV中和抗体检测技术的经典方法是病毒中和实验(Virusneutralization test,VNT)，由于中和性抗体能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原侵入细胞，所以病毒中和试验能最直接的反映出疫苗诱导的抗体是否具有保护作用。但与常用的特异性抗体检测方法酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)相比，存在费时、费力，工作量大，实验步骤复杂、实验条件要求高、依赖于细胞培养、安全性低，结果易受污染及不易推广等缺点。因此，ELISA依然被普遍认为是现阶段评价FMD疫苗免疫水平的首选技术。其中，液相阻断ELISA(LPB-ELISA)是国际上普遍认可的检测口蹄疫血清抗体的标准方法，在疫苗免疫效果评价和血清学诊断方面具有高度的敏感性和特异性。但常规的LPB-ELISA反应的抗体水平通常以特异性抗体为主，并不能真实的反应出中和抗体的情况。长期以来，人们都在寻找一种能够代替传统病毒中和试验的检测方法，既不需要病毒也不需要细胞就能检测到抗体的中和活性。
随着分子生物学技术的发展及抗体研究的不断深入，单域抗体(singledomainantibodie,sdAb)的研究已成为实验研究和诊断应用的重要工具与制剂，单域抗体在调节免疫功能，中和毒素和抗微生物感染等方面具有广阔的应用前景。其中，中和性单域抗体可以识别抗原上的中和表位，利用这一特点，结合液相阻断ELISA，就可以检测血清是否具有中和病毒的活性，从而计算出中和抗体滴度。
目前，尚未有商品化的检测中和抗体的ELISA试剂盒。因此，本发明基于自主研发制备的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1抗体和A型口蹄疫病毒VLPs抗原，研发出一种敏感性和特异性均较好，可以检测口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原按照公开号为CN109799343A，发明名称为“基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行制备。
其中，优选的，所述的液相阻断ELISA试剂盒中还包含生物素标记的Ab1抗体、HRP标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
进一步的，本发明还提出了所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒在制备检测A型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。以及所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒在评价A型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用中的应用。
再进一步的，本发明提出了一种使用所述的试剂盒评价A型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，包括以下步骤：
(1)将A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH9.2)稀释后，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)另准备96孔血清稀释板，将待评价疫苗免疫后的动物血清用PBST从1:4的初始梯度开始2倍稀释，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入A型口蹄疫病毒VLPs抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-VLPs抗原混合物；
(3)次日将步骤(1)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体Ab1的96孔板中，室温反应60min；
(4)将步骤(3)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入生物素标记的Ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；
(5)将步骤(4)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；加入HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；
(6)将步骤(5)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入底物TMB，室温显色3min，每孔加入终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
其中，优选的，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为0.25～2μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为0.8-2.5μg·mL-1、生物素标记的Ab1抗体的浓度为0.25～0.5μg·mL-1，HRP标记的链霉亲和素的浓度为0.25-0.5μg·mL-1。
其中，优选的，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为1μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为2μg·mL-1。
其中，优选的，所述的PBST为含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明基于自主研发制备的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1抗体和A型口蹄疫病毒VLPs抗原，研发出一种敏感性和特异性均较好，可以检测A型口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产A型口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，能够方便的用于评价疫苗诱导的抗体是否具有保护作用，其检测结果与传统VNT方法检测结果具有很高的符合率(95.3％)。
附图说明
图1为A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的中和活性鉴定结果；
图2为阴阳性血清效价测定结果图；
图3为交叉反应结果图；
图4为A型NA-ELISA和VNT符合率实验结果图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，仅仅公开几个优选的实施方式，但本发明的内容不应该理解成对本发明实施的限制，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实施例1
1材料与方法
1.1试剂、抗原及抗体、血清
A型口蹄疫病毒VLPs抗原按照公开号为CN109799343A，发明名称为“基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行原核表达纯化并组装；真核表达的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1(GGSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVYSGFTFGHYSMGWYRQAPGKEREF VAAIRRSDGSTDYADSTVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATVRRVATLSGSSSWGQGTQVTVSS，SEQ ID NO.1所示)由本实验室制备和保存；酶抗体购自SIGMA公司，96孔酶标板购自康宁公司；碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液粉剂购自SIGMA公司；底物TMB购自SURMODICS公司；Micro BCAProteinAssay kit购自Thermo公司。
血清来源：18份阴性筛选(特异性抗体血清效价<1:8)与22份VLPs免疫猪阳性血清均由本实验室诊断组筛选测定，200份FMDVAVLPs免疫牛和猪血清来自本实验室。
1.2A型口蹄疫病毒VLPs抗原的鉴定
对体外组装好的A型口蹄疫病毒VLPs蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot(鉴定时一抗用A型FMDV阳性猪血清，酶标二抗为抗猪的HRP-IgG，一抗稀释比例为1:1000，酶标二抗稀释比例为1:2000)、DLS鉴定、透射电子显微镜鉴定、BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度，基于BCA测的浓度用本实验室开发的VLPs完整粒子定量方法定量：1，用磷酸盐缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)，4℃过夜包被终浓度为0.5μg/ml的包被抗体；2，PBST(含0.05％v/vTween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。)洗涤后将标准品按指定浓度进行2倍系列稀释，同时将检测抗原稀释为10、25、50μg/ml，再进行2倍系列稀释，室温孵育45min；3，PBST洗涤后，加入终浓度为0.25μg/ml检测抗体，室温孵育60min；4，PBST洗涤后，加入终浓度为0.25μg/ml酶标二抗，室温孵育60min，加入TMB室温显色1.5min后终止显色；5，根据标准品OD值和浓度绘制标准曲线，可计算出检测抗原的VLPs含量。
1.3A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的鉴定
对哺乳动物细胞Expi-293-F表达系统表达并纯化的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1进行SDS-PAGE鉴定，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度，病毒中和试验鉴定其中和活性，鉴定时选用A型FMDV毒株。
1.4用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA(NA-ELISA)方法的建立
液相阻断ELISA用A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1作为包被抗体，A型口蹄疫病毒VLPs抗原作为反应抗原，生物素标记的Ab1抗体作为检测抗体(一抗)，HRP标记的链霉亲和素为二抗。
将A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH9.2)稀释成1μg·mL-1，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；准备96孔血清稀释板，将待检血清用PBST(含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4。)从1:4的初始梯度开始2倍稀释(自96孔板A-H排)，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入50μL 2μg·mL-1的A型口蹄疫病毒VLPs抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜；洗涤，次日将孔中液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，每次每孔加入液体300μL，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体的96孔板，室温反应60min；同上洗涤；每孔加入100μL 0.5μg·mL-1生物素标记的Ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；同上洗涤，加入100μL 0.25μg·mL-1HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色3min。每孔加入50μL终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
1.5各试剂工作浓度的初步确定
采用棋盘交叉滴定法，基于双抗体夹心原理：
1.5.1A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1和A型口蹄疫病毒VLPs抗原工作浓度范围的初步确定
A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液稀释成终浓度8μg·mL-1，第1列每孔加入200μL稀释后的Ab1抗体，其余孔每孔加入100μLPBST，从第1列吸出100μL开始2倍稀释(自96孔板1-6列)，每孔100μL，进行4℃过夜孵育；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干，A型口蹄疫病毒VLPs抗原用PBST缓冲溶液稀释成终浓度5μg·mL-1，第1行每孔加入125μL稀释后的VLPs抗原，其余孔每孔加入75μLPBST，从第1行吸出50μL开始2.5倍稀释(自96孔板A-H行)，每孔75μL，室温反应45min；3.同上洗涤，加入用PBST稀释的生物素标记的Ab1抗体终浓度为1μg·mL-1，室温反应60min；4.同上洗涤，加入用PBST稀释的HRP标记的链霉亲和素终浓度1μg·mL-1，室温反应60min；5.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1.5min。每孔加入50μL终止液，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。根据OD450分析结果，确定A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为0.25～2μg·mL-1，确定A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为0.8-2.5μg·mL-1。
1.5.2生物素标记的Ab1抗体及HRP标记的链霉亲和素工作浓度范围的初步确定
A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液稀释成终浓度0.25μg·mL-1，每孔100μL，进行4℃过夜孵育；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干，2.A型口蹄疫病毒VLPs抗原用PBST缓冲溶液稀释成终浓度0.8μg·mL-1，每孔100μL，室温反应45min；3.将生物素标记的Ab1抗体用PBST进行不同浓度稀释，即0.03125μg·mL-1、0.0625μg·mL-1、0.125μg·mL-1、0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1，每个梯度在酶标板中加1列，室温反应60min；4.同上洗涤，加入用PBST稀释的HRP标记的链霉亲和素，即0.03125μg·mL-1、0.0625μg·mL-1、0.125μg·mL-1、0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1，每个梯度在酶标板中加1行，室温反应60min；5.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1.5min。每孔加入50μL终止液，酶标仪上450nm处读取样品OD值。根据OD450分析结果，确定生物素标记的Ab1抗体的浓度为0.25～0.5μg·mL-1，确定HRP标记的链霉亲和素的浓度为0.25-0.5μg·mL-1。
1.6各试剂最佳工作浓度的确定
1.6.1包被抗体最佳工作浓度的确定
A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液进行不同终浓度稀释，即0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、2μg·mL-1，每个浓度在酶标板中加2行，进行4℃过夜包被；同时在稀释板上对标准阴阳性血清均进行稀释：1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1024、2048、4096，每孔50μL血清并另加入每孔50μLA型口蹄疫病毒VLPs抗原终浓度为2μg·mL-1(经初步确定的VLPs最低工作浓度)，每个包被抗体浓度做4孔抗原对照，用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜反应；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体的96孔板，室温反应60min；4.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的终浓度为0.25μg·mL-1生物素标记的Ab1抗体，室温反应60min；5.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的终浓度为0.25μg·mL-1HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；6.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1至2min；7.显色完后每孔加入50μL终止液(不要产生汽泡)，酶标仪上450nm处读取样品OD值。观察标准阴阳性血清效价差距最大，或OD450值差距大为最佳条件，A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的最佳包被浓度为1μg·mL-1。
1.6.2A型口蹄疫病毒VLPs抗原最佳工作浓度的确定
A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液稀释成终浓度1μg·mL-1，每孔100μL，进行4℃过夜包被；同时在稀释板上对标准阴阳性血清均进行稀释：1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1024，每孔50μL血清并另加入每孔50μLA型口蹄疫病毒VLPs抗原不同终浓度稀释，即1μg·mL-1、2μg·mL-1、3μg·mL-1、4μg·mL-1、5μg·mL-1，每个浓度在酶标板中加2行，每个VLPs抗原浓度做4孔抗原对照，用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜反应；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体的96孔板，室温反应60min；4.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的终浓度为0.25μg·mL-1生物素标记的Ab1抗体，室温反应60min；50.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的终浓度为0.25μg·mL-1HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；6.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1至2min；7.显色完后每孔加入50μL终止液(不要产生汽泡)，酶标仪上450nm处读取样品OD值。观察标准阴阳性血清效价差距最大，或OD450值差距大为最佳条件，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的最佳浓度为2μg·mL-1。
1.7判断标准、特异性及敏感性的确定
用上述的所得到试验条件进行液相阻断ELISA试验，检测共22份A型VLPs免疫后特异性抗体阳性血清、18份阴性筛选且特异性抗体阴性血清。计算各样品的滴度，根据滴度的Log10对数统计分析结果，绘制ROC曲线，计算阴性阳性的阈值，并计算该方法的特异性和敏感性。
1.8交叉反应试验
用建立的液相阻断ELISA方法分别检测3份A型FMDV阳性血清和24份常见猪病阳性血清(猪圆环病毒2型、猪细小病毒病、猪流行性腹泻病、猪蓝耳病、猪瘟、猪传染性胸膜肺炎、猪乙型脑炎、猪大肠杆菌病、副猪嗜血杆菌病)，计算待检抗体滴度，根据结果判断该方法是否存在交叉反应。
1.9血清的中和抗体滴度加测
用建立的液相阻断ELISA方法分别检测猪、牛的A型口蹄疫疫苗免疫血清共200份。计算各样品的滴度，分析统计结果。
1.10VNT符合率试验
用本发明建立的液相阻断ELISA方法与VNT同时检测猪、牛A型口蹄疫疫苗免疫血清200份，分析统计结果，计算该方法与VNT的符合率。VNT步骤为：将待测血清置于56℃金属浴上灭能30min，采用已知毒价TCID50为10-6的A型FMDV毒株和BHK细胞。将待检血清使用无血清DMEM在96孔板中做8个倍比稀释：1/8；1/16；1/32；1/64；1/128；1/256；1/512；1/1024；每个稀释度2个复孔；每孔加入50μl 100TCID50病毒液，轻拍板子混匀血清及病毒液，细胞培养箱中孵育1h；将细胞消化制成细胞悬液，每孔加入50μl细胞悬液，轻拍板子混匀细胞悬液、病毒液及待检血清；置于细胞培养箱中培养48h-72h，而后统计细胞病变孔数及未病变孔数；采用Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。并作病毒回归实验，将病毒做10倍连续的倍比稀释(无血清DMEM)：100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50，96孔板中每孔加入50μl稀释的病毒液，每个稀释度8个复孔，其他孔用无血清DMEM补齐50μl；将长满的细胞消化重悬，每孔加入50ul细胞悬液；轻拍板子混匀细胞悬液和病毒液，置于细胞培养箱中培养48h-72h，而后统计细胞病变孔数及未病变孔数。使用GraphPad Prism(6.0版)软件(San Diego，CA，USA)进行统计分析，包括Pearson系数检验和ROC曲线分析。
2结果
2.1.A型口蹄疫病毒VLPs蛋白鉴定结果
将纯化并体外组装完成的A型口蹄疫病毒VLPs蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化及体外组装完成后得到目的蛋白条带大小与理论值符合。WesternBlot结果显示A型口蹄疫病毒VLPs与A型FMDV阳性血清能够发生特异性反应，可作为A型FMDVVLPs液相阻断ELISA中和抗体检测方法的反应抗原。
2.2A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的鉴定
A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1对FMDVA的中和作用如图1所示，Neu50值表示要中和50％的病毒滴度所需的抗体浓度。经计算，Ab1的Neu50为1.2μmol/L。
2.3液相阻断ELISA最佳试验条件筛选结果
本发明通过交叉棋盘滴定及方阵滴定等方法开展试验。将所得的结果统计分析，对液相阻断ELISA最佳试验条件进行筛选，得到液相阻断ELISA方法最佳试验条件：包被抗体Ab1最佳包被浓度1μg mL-1；A型口蹄疫病毒VLPs抗原最佳稀释度为2μgmL-1；检测抗体最佳反应浓度为0.5μg mL-1，HRP标记的链霉亲和素为0.25μgmL-1。
2.4判断标准的确定
效价判定：用上述步骤进行液相阻断ELISA试验，以A型口蹄疫病毒VLPs抗原对照4孔OD值平均值的50％定为临界值，被检血清OD值如果恰好与临界值相同则中和抗体效价为对应的稀释倍数，若被检血清的OD值处于两个稀释倍数中间，则效价为相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价≥90判为口蹄疫中和抗体阳性，抗体效价≤45判定为口蹄疫中和抗体阴性。介于二者之间为可疑。
该分析共使用40份血清样本，其中18份来自阴性筛选血清(特异性抗体血清效价<1:8)，22份来自VLPs免疫猪血清，初步确定阻断ELISA的截止值、特异性和敏感性，用血清效价以10为底的对数表示。为了使检测有效，抗原对照的平均OD值需要为1.5以上。强阳性血清对照的效价均≥2.7log10，弱阳性血清对照的效价≥1.95log10，阴性血清对照的效价≤1.65log10，阻断ELISA的ROC曲线下面积(AUC)为0.1(P<0.0001)。根据ROC曲线分析，取约登指数最大为Cut-off最佳，当阻断型ELISA的截止值为1.725(1:45-1:64之间)时，特异性和灵敏度值最佳，特异性和灵敏度分别为100％和100％(图2)。
2.5交叉试验结果
采用本研究所建立的方法检测27份不同猪病的阳性血清，包括3份A型FMD阳性血清和其他24份猪病阳性血清。检测后计算各血清滴度，其他血清滴度均小于1:8(标记0.0)，表明该检测方法特异性好，无交叉反应(图3)。
2.6VNT和液相阻断ELISA(NA-ELISA)符合率
VNT检测1.725的滴度分别被认为是区分阳性阴性血清的阈值。Pearson系数检验用于确定NA-ELISA滴度与VNT滴度之间的相关性，P值为0.05被认为具有统计学意义。通过A型FMD VLPs液相阻断ELISA中和抗体检测(Type ANA-ELISA)和VNT对来自免疫了FMDV OVLPs疫苗的牛和猪的共200份
血清样品进行测定。A型NA-ELISA和VNT的结果的一致率为95.3％(190/200)。通过比较个体水平的数据，计算NA-ELISA结果与VNT结果之间的Pearson相关系数。NA-ELISA的结果显示与VNT的结果具有统计学显着相关性(r＝0.9722，P<0.0001)(图4)。

Claims (9)

1.一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原按照公开号为CN109799343A，发明名称为“基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行制备。
3.如权利要求1所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中还包含HRP标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
4.权利要求1-3任一项所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒在制备检测A型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒在评价A型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用中的应用。
6.一种使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒评价A型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用0.1mol/LpH9.2的碳酸盐缓冲溶液稀释后，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)另准备96孔血清稀释板，将待评价疫苗免疫后的动物血清用PBST从1:4的初始梯度开始2倍稀释，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入A型口蹄疫病毒VLPs抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-VLPs抗原混合物；
(3)次日将步骤(1)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体Ab1的96孔板中，室温反应60min；
(4)将步骤(3)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入生物素标记的Ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；
(5)将步骤(4)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；加入HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；
(6)将步骤(5)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入底物TMB，室温显色3min，每孔加入终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为0.25～2μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为0.8-2.5μg·mL-1，生物素标记的Ab1抗体的浓度为0.25～0.5μg·mL-1，HRP标记的链霉亲和素的浓度为0.25-0.5μg·mL-1。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为1μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为2μg·mL-1。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PBST为含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
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