CN118050507A - O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒及其应用。所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含用作包被抗体的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、用作反应抗原的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原以及用作检测抗体的生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1抗体和O型口蹄疫病毒VLPs，提出了O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒可用于检测O型口蹄疫病毒中和抗体，能够方便的用于评价一个O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用，敏感性和特异性均较好，且价格低廉，其检测结果与传统VNT方法检测结果具有较高的符合率(90.83％)。
Description
技术领域
本发明涉及一种ELISA检测试剂盒及其应用，特别涉及一种O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起偶蹄动物(猪、牛、羊等)感染的一类动物传染病。其传播速度快，呈全球分布，对畜牧业的发展影响较大。该病在国家动物疫病防治长期发展规划中被确定为首位限期免疫净化防控的病种。口蹄疫病毒有7个血清型，即O、A、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3和C型，各血清型之间无交叉保护。我国目前主要流行O和A型，其中O型口蹄疫流行更广泛，对我国畜牧养殖业造成影响较大。目前口蹄疫病毒样颗粒疫苗已作为新型疫苗产品成功获得新兽药证书，而该类疫苗在免疫后是否产生中和抗体以及抗体效价是评价疫苗效果的关键指标。
目前，普遍认为FMDV中和抗体检测技术的经典方法是病毒中和实验(Virusneutralization test，VNT)，由于中和性抗体能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原侵入细胞，所以病毒中和试验能最直接的反映出疫苗诱导的抗体是否具有保护作用。但与常用的特异性抗体检测方法酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)相比，存在费时、费力，工作量大，实验步骤复杂、实验条件要求高、依赖于细胞培养、安全性低，结果易受污染及不易推广等缺点。因此，ELISA依然被普遍认为是现阶段评价FMD疫苗免疫水平的首选技术。液相阻断ELISA(LPB-ELISA)是国际上普遍认可的检测口蹄疫血清抗体的标准方法，在疫苗免疫效果评价和血清学诊断方面具有高度的敏感性和特异性。但常规的LPB-ELISA反应的抗体水平通常以特异性抗体为主，并不能真实的反应出中和抗体的情况。长期以来，人们都在寻找一种能够代替传统病毒中和试验的检测方法，既不需要病毒也不需要细胞就能检测到抗体的中和活性。
随着分子生物学技术的发展及抗体研究的不断深入，单域抗体(single domainantibodie,sdAb)的研究已成为实验研究和诊断应用的重要工具与制剂，单域抗体在调节免疫功能，中和毒素和抗微生物感染等方面具有广阔的应用前景。其中，中和性单域抗体可以识别抗原上的中和表位，利用这一特点，结合液相阻断ELISA，就可以检测血清是否具有中和病毒的活性，从而计算出中和抗体滴度。
目前，尚未有商品化的检测中和抗体的ELISA试剂盒。因此，本发明基于自主制备的口蹄疫病毒广谱中和抗体和O型口蹄疫病毒VLPs，提出了一种敏感性和特异性均较好，可以检测O型口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含用作包被抗体的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、用作反应抗原的O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及用作检测抗体的生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原按照公开号为CN106479986A，发明名称为“一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途”的专利申请中记载的方法进行制备。
其中，优选的，所述的液相阻断ELISA试剂盒中还包含HRP标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
进一步的，本发明还提出了所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒在制备检测O型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。以及所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒在评价O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用中的应用。
再进一步的，本发明还提出了一种使用所述的试剂盒评价O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，包括以下步骤：
(1)将O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH9.2)稀释后，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)另准备96孔血清稀释板，将待评价疫苗免疫后的动物血清用PBST从1:2的初始梯度开始2倍稀释，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入O型口蹄疫病毒VLPs抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-VLPs抗原混合物；
(3)次日将步骤(1)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体Ab1的96孔板中，室温反应60min；
(4)将步骤(3)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入生物素标记的Ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；
(5)将步骤(4)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；加入HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；
(6)将步骤(5)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入底物TMB，室温显色3min，每孔加入终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
其中，优选的，所述的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度1μg mL-1；O型口蹄疫病毒VLPs抗原的稀释度为5μg mL-1；生物素标记的Ab1抗体的反应浓度为1.5μg mL-1，HRP标记的链霉亲和素的反应浓度为0.5μg mL-1。
其中，优选的，待检血清中抗体效价≥45判为口蹄疫中和抗体阳性，抗体效价＜45判定为口蹄疫中和抗体阴性，介于二者之间为可疑。
其中，优选的，所述的PBST为含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明基于自主研发制备的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1和O型口蹄疫病毒VLPs抗原，提出了O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒可用于检测O型口蹄疫病毒中和抗体，能够方便的用于评价一个O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用，敏感性和特异性均较好，且价格低廉，其检测结果与传统VNT方法检测结果具有较高的符合率(90.83％)。
附图说明
图1为O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的中和活性鉴定结果；
图2为阴阳性血清效价测定结果图；
图3为交叉反应结果图；
图4为O型NA-ELISA和VNT符合率实验结果图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，仅仅公开几个优选的实施方式，但本发明的内容不应该理解成对本发明实施的限制，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实施例1
1材料与方法
1.1试剂、抗原及抗体、血清
O型口蹄疫病毒VLPs按照公开号为CN106479986A，发明名称为“一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途”的专利申请所公开的方法制备；真核表达的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1(GSSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTPFSGGSINEISINHLGWYRQAPGKERELVAAITRGGSTYYADSVKGRFAISRDDAKKMVYLQMNSLKPEDTAVYYCNGLRASTAQWEESETTWGQGTQVTVSS，SEQ IDNO.1所示)由本实验室制备和保存；96孔酶标板购自康宁公司；碳酸盐粉剂购自SIGMA公司；底物TMB购自SURMODICS公司。
血清来源：400份猪、牛阴性血清由本实验室诊断组筛选，600份血清来自本实验室O型口蹄疫病毒VLPs/灭活疫苗免疫的猪、牛。
1.2 O型口蹄疫病毒VLPs的鉴定
对体外组装好的O型口蹄疫病毒VLPs蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot(鉴定时一抗用O型FMDV阳性猪血清，酶标二抗为抗猪的HRP-IgG，一抗稀释比例为1:1000，酶标二抗稀释比例为1:2000)、DLS鉴定以及本实验室开发的VLPs完整粒子定量方法定量：1，用磷酸盐缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)，4℃过夜包被0.5μg/ml的包被特异抗体；2，PBST(含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。)洗涤后将标准品按指定浓度进行2倍系列修饰，同时将检测抗原稀释至2～4μg/ml，再进行2倍系列稀释，室温孵育45min；3，PBST洗涤后，加入0.25μg/ml检测抗体，37℃孵育30min；4，PBST洗涤后，加入0.0625μg/ml酶标二抗，室温孵育60min，加入TMB室温显色1.5min后终止显色；5，根据标准品OD值和浓度绘制标准曲线，可计算出检测抗原的VLPs含量。
1.3O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的鉴定
对哺乳动物细胞Expi-293-F表达系统表达并纯化的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1进行SDS-PAGE鉴定，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度，病毒中和试验鉴定其中和活性，鉴定时选用O型FMDV流行毒株。
1.4液相阻断ELISA方法的建立
液相阻断ELISA用O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1作为捕获抗体，O型口蹄疫病毒VLPs抗原作为反应抗原，生物素标记的Ab1抗体作为检测抗体(一抗)，HRP标记的链霉亲和素为二抗。
将O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH9.2)稀释成1μg·mL-1，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；洗涤，次日将孔中液体倒掉，加入PBST(含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。)洗涤3-4次，每次每孔加入液体300μL，吸水纸上拍干；准备96孔血清稀释板，将待检血清用PBS从1:2的初始梯度开始2倍稀释(自96孔板A-H排)，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入50μL 5μg·mL-1的O型口蹄疫病毒VLPs抗原进行阻断反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-VLPs抗原混合物；次日将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入包被特异中和抗体的96孔板，室温反应60min；同上洗涤；每孔加入100μL 1.5μg·mL-1生物素标记的Ab1抗体对阻断反应后VLPs上所剩余的中和表位进行识别，室温反应60min；同上洗涤，加入100μL0.5μg·mL-1HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色5min。每孔加入50μL终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
1.4.1生物素标记的Ab1抗体工作浓度及HRP标记的链霉亲和素稀释比例的初步确定
采用棋盘交叉滴定法。1.生物素标记的Ab1抗体用碳酸盐缓冲溶液进行不同梯度稀释，即0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、1.5μg·mL-1、2μg·mL-1、2.5μg·mL-1、3μg·mL-1，每个梯度在酶标板中加1列，进行4℃过夜包被；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干；3.加入用PBST稀释的HRP标记的链霉亲和素，即0.1μg·mL-1、0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、0.75μg·mL-1、1μg·mL-1、1.25μg·mL-1，手动或用微量振荡器轻轻震荡混匀30s-60s，室温反应60min；4.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1至2min；5.显色完后每孔加入50μL终止液，轻微震荡混匀，不要产生汽包，酶标仪上450nm处读取样品OD值。
1.4.2 O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1包被和O型口蹄疫病毒VLPs抗原使用浓度的初步确定
采用棋盘交叉滴定法。1.O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液进行不同梯度稀释，即0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、1.5μg·mL-1、2μg·mL-1、2.5μg·mL-1，3μg·mL-1，每个梯度在酶标板中加1列，进行4℃过夜包被；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干；3.每1列加入用PBST稀释的O型口蹄疫病毒VLPs抗原，即1μg·mL-1、2μg·mL-1、3μg·mL-1、4μg·mL-1、5μg·mL-1、6μg·mL-1，室温反应60min；4.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的最佳比例的生物素标记的Ab1抗体，室温反应60min；50.同上洗涤，每孔加入100μL用PBST稀释的最佳比例的HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；6.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色1至2min；7.显色完后每孔加入50μL终止液，轻微震荡混匀，不要产生汽包，酶标仪上450nm处读取样品OD值。O型口蹄疫病毒VLPs抗原OD值达到1.5以上的某一最低浓度对应的特异中和抗体Ab1的最高稀释度为其最佳包被浓度。在其它试剂使用浓度确定后，每一批O型口蹄疫病毒VLPs抗原的工作浓度都要滴定，以达到对应标配阳性血清效价对应最低浓度为其工作浓度。
1.4.3各试剂最适使用浓度的确定
O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用碳酸盐缓冲溶液稀释至使用浓度过夜包被酶标板，同时在稀释板上对标准血清进行稀释：阳性血清1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512，阴性血清1:4、1:8、1:16、1:32，每孔50μL血清并另加入每孔50μL O型口蹄疫病毒VLPs抗原(经初步确定的VLPs使用浓度)，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜反应；2.次日将孔中液体倒掉，用PBST洗涤3-4次，每次每孔加入PBST液体300μL，吸水纸上拍干，将稀释板中的待检血清-VLPs抗原混合液移入酶标板中，每孔50μL，纯抗原孔为稀释到工作浓度的O型口蹄疫病毒VLPs。每组三列标准样品，分别为：1列O型口蹄疫病毒强阳性血清，1列O型口蹄疫病毒弱阳性血清，半列O型口蹄疫病毒阴性血清，半列纯抗原，室温反应60min；3.洗板后加入用PBST稀释到工作浓度的生物素标记的特异中和抗体Ab1，每孔100μL，室温反应60min；4.同上洗涤，加入用PBST稀释到工作浓度的HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；5.同上洗涤，每孔加入100μL底物TMB，室温显色5min。每孔加入50μL终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。6.根据对照阴阳性血清的实际中和效价调整最终的各试剂反应浓度和O型口蹄疫病毒VLPs的稀释度。
1.4.4判断标准、特异性及敏感性的确定
用上述的所得到试验条件进行液相阻断ELISA试验，检测共200份O型口蹄疫病毒阳性血清、200份O型口蹄疫病毒阴性血清。计算各样品的滴度，根据滴度的Log10对数统计分析结果，绘制ROC曲线，计算阴性阳性的阈值，并计算该方法的特异性和敏感性。
1.4.5交叉反应试验
用建立的液相阻断ELISA方法分别检测3份O型FMDV阳性血清和32份常见猪病阳性血清(猪圆环病毒2型、猪细小病毒病、猪流行性腹泻病、猪蓝耳病、猪瘟、猪传染性胸膜肺炎、猪乙型脑炎、猪大肠杆菌病、副猪嗜血杆菌病)，计算待检抗体滴度，根据结果判断该方法是否存在交叉反应。
1.4.6血清的中和抗体滴度加测
用建立的液相阻断ELISA，分别检测猪、牛的O型口蹄疫疫苗免疫血清共600份。计算各样品的滴度，分析统计结果。
1.5 VNT符合率试验
用本发明建立的方法与VNT同时检测猪、牛O型血清600份，分析统计结果，计算该方法与VNT的符合率。VNT步骤为将待测血清置于56℃金属浴上灭能30min，采用已知毒价TCID50为10-6的O型FMDV毒株和BHK细胞。将待检血清使用无血清DMEM在96孔板中做8个倍比稀释：1/8；1/16；1/32；1/64；1/128；1/256；1/512；1/1024；每个稀释度3个复孔；每孔加入50μl 100TCID50病毒液，轻拍板子混匀血清及病毒液，细胞培养箱中孵育1h；将细胞消化制成细胞悬液，每孔加入50μl细胞悬液，轻拍板子混匀细胞悬液、病毒液及待检血清；置于细胞培养箱中培养48h-72h，而后统计细胞病变孔数及未病变孔数；采用Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。并作病毒回归实验，将病毒做10倍连续的倍比稀释(无血清DMEM)：105TCID50、104TCID50、103TCID50、102TCID50、10TCID50、10-1TCID50，96孔板中每孔加入50μl稀释的病毒液，每个稀释度8个复孔，其他孔用无血清DMEM补齐50μl；将长满的细胞消化重悬，每孔加入50ul细胞悬液；轻拍板子混匀细胞悬液和病毒液，置于细胞培养箱中培养48h-72h，而后统计细胞病变孔数及未病变孔数。使用GraphPadPrism(6.0版)软件(SanDiego，CA，USA)进行统计分析，包括Pearson系数检验和ROC曲线分析。
2结果
2.1.O型口蹄疫病毒VLPs蛋白鉴定结果
将纯化并体外组装完成的O型口蹄疫病毒VLPs进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化及体外组装完成后得到目的蛋白条带大小与理论值符合。Western Blot结果显示该VLPs与O型FMDV阳性血清发生特异性反应，可作为O型FMD VLPs液相阻断ELISA中和抗体检测方法的反应抗原。
2.2 O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的鉴定
图1显示是Ab1对FMDV O的中和作用，Neu50值表示要中和50％的病毒滴度所需的抗体浓度。经计算，Ab1的Neu50为0.8μmol/L。
2.3液相阻断ELISA最佳试验条件筛选结果
本发明通过交叉棋盘滴定及方阵滴定等方法开展试验。将所得的结果统计分析，对液相阻断ELISA最佳试验条件进行筛选，得到液相阻断ELISA方法最佳试验条件：O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的最佳包被浓度1μg mL-1；O型口蹄疫病毒VLPs最佳稀释度为5μgmL-1；生物素标记的Ab1抗体最佳反应浓度为1.5μg mL-1，HRP标记的链霉亲和素为0.5μgmL-1。
2.4判断标准的确定
效价判定：用上述步骤进行液相阻断ELISA试验，以O型口蹄疫病毒VLPs抗原对照4孔OD值平均值的1/2为基础值，将基础值的50％定为临界值，被检血清OD值如果恰好与临界值相同则中和抗体效价为对应的稀释倍数，若被检血清的OD值处于两个稀释倍数中间，则效价为相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价≥45判为口蹄疫中和抗体阳性，抗体效价＜45判定为口蹄疫中和抗体阴性。介于二者之间为可疑。
用建立的方法检测400份动物血清，其中包括200份O型FMDV阴性血清和200份FMDV中和抗体阳性血清，统计检测结果并绘制ROC曲线。为了使检测有效，抗原对照的平均OD值需要为1.5以上。强阳性血清对照的效价均≥2.7log10，弱阳性血清对照的效价≥1.8log10，阴性血清对照的效价＜0.9log10。经过ROC曲线分析，当Cut-off值为1.65log10时，AUC具有最大面积0.998，灵敏度和特异性值最佳，分别为100％和99.21％(图2)。因此确定临界值为1.35log10。
2.5交叉试验结果
采用本发明所建立的方法检测35份不同猪病的阳性血清，包括3份O型FMDV阳性血清和其他32份猪病阳性血清。检测后计算各血清均小于1：8，表明该检测方法特异性好，无交叉反应(图3)。
2.6 VNT和液相阻断ELISA(NA-ELISA)符合率
VNT检测1.65的滴度分别被认为是区分阳性阴性血清的阈值。Pearson系数检验用于确定NA-ELISA滴度与VNT滴度之间的相关性，P值为0.05被认为具有统计学意义。通过O型FMDVVLPs液相阻断ELISA中和抗体检测(TypeO NA-ELISA)和VNT对来自免疫了FMDV O VLPs疫苗的牛和猪的共600份血清样品进行测定。O型NA-ELISA和VNT的结果的一致率为90.83％(545/600)。通过比较个体水平的数据，计算NA-ELISA结果与VNT结果之间的Pearson相关系数。NA-ELISA的结果显示与VNT的结果具有统计学显着相关性(r＝0.9722，P<0.0001)(图4)。
Claims (9)
1.一种O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含用作包被抗体的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、用作反应抗原的O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及用作检测抗体的生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原按照公开号为CN106479986A，发明名称为“一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途”的专利申请中记载的方法进行制备。
3.如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中还包含HRP标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
4.权利要求1-3任一项所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒在制备检测O型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的O型口蹄疫病毒中和抗体液相阻断ELISA检测试剂盒在评价O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用中的应用。
6.一种使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒评价O型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1用0.1mol/LpH9.2的碳酸盐缓冲溶液稀释后，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜；
(2)另准备96孔血清稀释板，将待评价疫苗免疫后的动物血清用PBST从1:2的初始梯度开始2倍稀释，每孔50μL，稀释完毕后每孔同时各加入O型口蹄疫病毒VLPs抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-VLPs抗原混合物；
(3)次日将步骤(1)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；之后将待检血清-VLPs抗原混合物按照原位每孔50μL移入含有包被抗体Ab1的96孔板中，室温反应60min；
(4)将步骤(3)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入生物素标记的Ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；
(5)将步骤(4)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；加入HRP标记的链霉亲和素，室温反应60min；
(6)将步骤(5)酶标板中的液体倒掉，加入PBST洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入底物TMB，室温显色3min，每孔加入终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品OD值。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的O型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度1μgmL-1；O型口蹄疫病毒VLPs抗原的稀释度为5μg mL-1；生物素标记的Ab1抗体的反应浓度为1.5μg mL-1，HRP标记的链霉亲和素的反应浓度为0.5μgmL-1。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，待检血清中抗体效价≥45判为口蹄疫中和抗体阳性，抗体效价＜45判定为口蹄疫中和抗体阴性，介于二者之间为可疑。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PBST为含0.05％v/vTween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
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