CN114740201B - 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。本发明所述试剂盒，具有良好的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也良好。

Description

猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种以动物发热、奇痒及中枢神经障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV的主要宿主，成年猪一般为隐性感染，但终身带毒和排毒，可致妊娠母猪流产、死产或产木乃伊胎。因其具有流行快，传播途径多，病死率高的特点，现在已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。每年给养猪业造成了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织列为二类动物传染病。该病的控制措施主要是隔离感染猪群、疫苗接种和淘汰隐性感染动物。分离伪狂犬病病毒，通过免疫荧光、免疫过氧化物酶活特异性抗血清中和试验对特征性细胞病变加以鉴定。此外，PCR鉴定病毒DNA也比较成熟。可以用病毒中和试验、乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测伪狂犬病抗体。
伪狂犬病可以通过接种疫苗来进行控制，因此区分免疫动物和感染动物就变得非常重要。检测疫苗免疫抗体和自然感染抗体可以通过接种基因缺失疫苗来实现。鉴别诊断方法就是在使用基因缺失疫苗的基础上应用的一类诊断方法。DNA同源重组缺陷型、基因缺失型和天然缺陷型疫苗因缺少特异性糖蛋白(gG、gE或gC)，可以用于鉴别免疫抗体与自然感染抗体。由于PRV中存在多个非必需糖蛋白基因，缺失这些基因的病毒突变株不能产生被缺失基因所编码的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种基因缺失疫苗注射动物后，动物不能产生针对缺失蛋白的抗体。因此，可通过血清学方法将自然感染野毒的血清学阳性猪与注苗猪进行鉴别。
缺失疫苗缺失的糖蛋白基因主要为gE和gI基因，对于使用gE和gI基因双缺失疫苗免疫的养殖场，在检测免疫抗体水平的时候，需要配合使用野毒鉴别试剂盒进行筛选，确定阳性抗体的来源，鉴别区分免疫抗体和自然感染抗体，筛选出隐性感染猪，对野毒阳性猪及时进行淘汰，建立健康的阴性猪群，但市场上常见的商品化鉴别试剂盒多为gE单基因缺失ELISA试剂盒，常常不能满足临床检测的需求。因为在各种特异性糖蛋白中，由于gE蛋白抗体而被目前普遍认为是最重要的感染指标，但是gE抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，有时在感染的猪机体内并不能检测到gE抗体或gE抗体产生的时间延迟，所以，以单独包被gE蛋白的试剂盒检测猪伪狂犬病毒，其结果会出现假阴性，准确性不高。同时由于动物感染后在不同时期会出现不同的蛋白抗体，因此检测单一的蛋白抗体也是不准确的。所以对于诊断猪伪狂犬来说，至少应该检测一种以上的蛋白抗体，来提高检测的准确性。对于那些已经免疫后又感染的动物，由于具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的特异性蛋白，但商品化的ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检。
化学发光免疫分析技术(CLIA)是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发展建立的，具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、试验操作简便、检测速度快等优点。但是化学发光不需要不需要额外的光源或背景荧光，所有的能量都来自于样本本身的化学反应，消除了背景影响，避免了外来因素(光源稳定性、光散射、光波选择器)的干扰，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。同时光信号强度和待测物质的浓度呈线性关系，可以根据仪器的标定曲线，精确算出待测物的浓度。因此敏感性、特异性、稳定性和安全性上明显优于放射性免疫和酶联免疫分析方法。
发明内容
针对猪伪狂犬病毒检测所面临的问题，本发明拟提供一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，诊断能力亦优于其他市售产品。
一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包括化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液；
所述化学发光包被板的包被过程为：将gE纳米抗体和gI纳米抗体加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使gE纳米抗体和gI纳米抗体的浓度均为0.25ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；
所述gE纳米抗体的氨基酸序列为；QVQLQESGGGSVGSSNSCVASGYTNSGGKRWFRQAPGKEREKVAHSSTSTYYADSVKGRFTDSPAKNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWYTGRDEYNYWGQGTQVTVSSAAAY(SEQ ID NO.1)
所述gI纳米抗体的氨基酸序列为：QVQLQESGGGSGVSPNSCVASQSPNSGGKRWFRQAPGVTKVAHSSTSTYYADSVKGQSPTDSPAKNAKNTSPVMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWWYGYNYWKTGVQSSSAAAY(SEQ ID NO.2)；
所述血清稀释液为含5％(v/v)山羊血清和0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
所述发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液；
所述发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween-20，pH＝7.4。
所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液稀释1：100倍后加入到化学发光包被板中，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其优势在于：利用该试剂盒可以确定抗原的来源，鉴别区分免疫样本和自然感染样本，判断被检动物是否感染病毒或接种疫苗，其敏感性、特异性、稳定性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断。
附图说明
上述仅是本发明技术的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明的化学发光试剂盒ROC曲线相关参数
图2是本发明的化学发光试剂盒Youden指数
图3是本发明的化学发光试剂盒敏感性、特异性结果
图4是本发明的化学发光试剂盒重复性检测结果
图5是本发明的化学发光试剂盒与普通gE抗体ELISA试剂盒对伪狂犬病阳性血清参考品(检验用)敏感性比对结果
图6是本发明的化学发光试剂盒与普通gE抗体ELISA试剂盒对已知感染野毒样本的检测结果
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用敏感性、特异性血清均可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中所用血清样品由北京亿森宝生物科技有限公司保存。
实施例1 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒方法的建立
通过棋盘滴定的方法，确定最佳包被浓度及血清稀释倍数。其中，gE纳米抗体和gI纳米抗体分别做了2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml和0.1ug/ml的梯度，阳性对照血清和阴性对照血清分别做了1：10、1：20、1：50、1：100倍稀释。通过综合考虑光指数和信噪比，包被条件确定为gE纳米抗体蛋白0.25ug/ml和gI纳米抗体蛋白0.25ug/ml混合包被。血清稀释倍数为1：100。
实施例2 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒临界值的确定
应用本发明所述试剂盒，对已知背景的血清进行检测。利用试剂盒对150份阳性样品和150份阴性样品进行检测，计算每份样品的S/P值，采用SPSS 16.0软件对所有血清样本的S/P值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。本试验中，曲线下面积为0.972，Youden指数最大的为0.8600，所对应的S/P值为0.201。因此，将本方法的临界值确定为0.20，最终将本诊断试剂盒的判定标准定为：S/P值＜0.20，样品应判定为抗体阴性；S/P值≥0.20，样品应判定为抗体阳性。并且，在此判定标准下，此临界值对应的敏感性为92.67％，特异性为93.33％。证明本诊断方法的准确率极高，该试剂盒具有很高的诊断价值。具体结果见图1、图2。
实施例3 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒灵敏度和特异性检测
将猪伪狂犬病毒阳性血清用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：100倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将稀释好的样品加入化学发光包被板，于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。检测结果用S/P值来评价，S/P公式如下：S/P＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)。结果本发明的猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒具有良好的敏感性，检测猪伪狂犬病毒阳性血清的灵敏度能达到1:1024。本发明的猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒具有良好的特异性，与上述猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品均无交叉反应。因此，本发明的化学发光试剂盒灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它猪常见病毒发生血清交叉学反应，具体结果见图3。
实施例4 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒重复性检测
将10个背景清楚的血清在同一个化学发光包被板上各做5个重复，计算其批内变异系数(CV)。同时将这10个背景清楚的血清在不同的3个批次化学发光包被板上做重复，计算其批间变异系数(CV)。结果批内与批间CV均小于10％，具有良好的重复性，具体结果见图4。
实施例5 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒稳定性检测
将化学发光包被板置于37℃，10天后，检测敏感性和特异性，将猪伪狂犬病毒阳性血清用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：100倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。结果表明，37℃保存10天，化学发光包被板的敏感性和特异性不变。因此，化学发光包被板具有良好的稳定性。
实施例6 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒与普通gE抗体ELISA试剂盒对伪狂犬病阳性血清参考品(检验用)敏感性比对结果
将伪狂犬病阳性血清参考品(检验用)用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。分别用猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒与普通GE抗体ELISA试剂盒对各个稀释度的样品直接进行检测。结果本发明的猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒检测灵敏度能达到1:1024，普通gE抗体ELISA试剂盒检测灵敏度为1:512，本发明的试剂盒敏感性高于普通gE抗体ELISA试剂盒。具体结果见图5。
实施例7 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒与普通gE抗体ELISA试剂盒对已知感染野毒样本检测结果
分别用猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒与普通gE抗体ELISA试剂盒共同检测收集的35份已知感染野毒的样本。结果化学发光试剂盒全部检出，普通gE抗体ELISA试剂盒检出29个，化学发光试剂盒对阳性样本的检出率高于普通gE抗体ELISA试剂盒。具体结果见图6。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
＜110＞北京亿森宝生物科技有限公司重庆市动物疫病预防控制中心
＜120＞猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
＜160＞2
<210>1
<211>120
<212>protein
<213>gE纳米抗体蛋白
<400>1
QVQLQESGGGSVGSSNSCVASGYTNSGGKRWFRQAPGKEREKVAHSSTSTYYADSVKGRFTDSPAKNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWYTGRDEYNYWGQGTQVTVSSAAAY
<210>2
<211>113
<212>protein
<213>gI纳米抗体蛋白
<400>1
QVQLQESGGGSGVSPNSCVASQSPNSGGKRWFRQAPGVTKVAHSSTSTYYADSVKGQSPTDSPAKNAKNTSPVMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWWYGYNYWKTGVQSSSAAAY
SEQUENCE LISTING
<110> 北京亿森宝生物科技有限公司
重庆市动物疫病预防控制中心
<120> 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
<130> 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> gE纳米抗体蛋白
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gly Ser Ser Asn
1 5 10 15
Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Gly Gly Lys Arg Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala His Ser Ser Thr
35 40 45
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Asp Ser Pro
50 55 60
Ala Lys Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
65 70 75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Met Val Gly Ser Ser Asn Phe Gly Asp Ile Trp
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Asp Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
115 120
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> gI纳米抗体蛋白
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Ser Pro Asn
1 5 10 15
Ser Cys Val Ala Ser Gln Ser Pro Asn Ser Gly Gly Lys Arg Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Val Thr Lys Val Ala His Ser Ser Thr Ser Thr
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Gln Ser Pro Thr Asp Ser Pro Ala
50 55 60
Lys Asn Ala Lys Asn Thr Ser Pro Val Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Met Val Gly Ser Ser Asn Phe Gly Asp Ile Trp Trp Tyr
85 90 95
Gly Tyr Asn Tyr Trp Lys Thr Gly Val Gln Ser Ser Ser Ala Ala Ala
100 105 110
Tyr

Claims (6)

1.一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液，其特征在于：
所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被gE纳米抗体和gI纳米抗体；
其中，gE纳米抗体的氨基酸序列为：QVQLQESGGGSVGSSNSCVASGYTNSGGKRWFRQAPGKEREKVAHSSTSTYYADSVKGRFTDSPAKN AKNTLYLQMNSLK PEDTAMVGSSNFGDIWYTGRDEYNYWGQGTQVTVSSAAAY；
gI纳米抗体的氨基酸序列为：QVQLQESGGGSGVSPNSCVASQSPNSGGKRWFRQAPGVTKVAHSSTSTYYADSVKGQSPTDSPAKNAK NTSPVMNSLKPE DTAMVGSSNFGDIWWYGYNYWKTGVQSSSAAAY；
所述化学发光包被的联合包被过程为：将gE纳米抗体和gI纳米抗体加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使gE纳米抗体和gI纳米抗体的浓度均为0.25ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；
所述阳性对照血清是经伪狂犬病毒免疫健康猪获得的猪血清；
所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清；
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。
2.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其中，血清稀释液为含5％v/v山羊血清和0.5％v/v Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
3.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其中，发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其中，发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
5.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其中，10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％v/v Tween-20，pH＝7.4。
6.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：100倍稀释后加入到化学发光包被板中，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102608315A (zh) * 2012-02-21 2012-07-25 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101551397A (zh) * 2009-05-13 2009-10-07 郑州安图绿科生物工程有限公司 丙型肝炎病毒抗体化学发光定性检测试剂盒
CN103353526B (zh) * 2013-07-23 2015-10-21 河南枫华生物科技有限公司 一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒
CN203838160U (zh) * 2014-03-12 2014-09-17 武汉中博生物股份有限公司 猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒
CN106226519A (zh) * 2016-07-18 2016-12-14 洛阳现代生物技术研究院有限公司 一种o型口蹄疫病毒抗体化学发光检测试剂盒
CN207623349U (zh) * 2017-10-09 2018-07-17 浙江海隆生物科技有限公司 一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒
CN109900902B (zh) * 2019-03-29 2020-06-09 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN109900903B (zh) * 2019-03-29 2020-06-09 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
AU2020102599A4 (en) * 2020-10-05 2020-11-26 Sichuan Agricultural University Indirect ELISA Detection Method and Application of DHAV-3 Antibody Based on VP2 or VP4 Recombinant Protein Antigen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102608315A (zh) * 2012-02-21 2012-07-25 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用

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