CN109900902B

CN109900902B - 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109900902B
Application number: CN201910249603.8A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 董春娜; 李静; 李玲; 王飞; 肖进; 齐鹏
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109900902A

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标猪伪狂犬病毒单克隆抗体、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有利用杆状病毒表达系统及细胞悬浮培养工艺表达的猪伪狂犬病毒gB蛋白，将其纯化后作为包被抗原，同时用作免疫原，制备并筛选出伪狂犬病毒gB蛋白的特异性单克隆抗体并进行过氧化物酶标记作为阻断酶标单抗。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，结果判定采用S/N比值法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达98％以上。

Description

一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用，适用于种猪伪狂犬病毒gB抗体的特异、快速、准确检测。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies)，又名奥耶斯基病(Aujeszky’s disease，AD)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病。该病能够侵害包括猪、牛、绵羊、兔、狐狸、犬猫、雪貂、鼠、水貂等多种动物。猪是天然宿主和储存者，除了猪，其余动物发病后均出现瘙痒、高热和脑脊髓炎症状，甚至可导致死亡。猪感染PRV后主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎与种猪不育，哺乳仔猪出现神经症状后死亡率高，育成育肥猪呼吸道症状，PRV病毒感染易形成潜伏感染，导致长期带毒、向外界排毒；另外，PRV在应激条件下易被激活，可引起反复感染和散毒，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。

在我国，预防、控制和根除伪狂犬病是当前面临的一项艰巨的任务，目前市场上使用的猪伪狂犬疫苗绝大多数是缺失gE基因与TK基因的弱毒疫苗。gB和gD囊膜蛋白是伪狂犬病毒必须的结构蛋白，起着重要的作用，免疫后能产生保护性中和抗体，gB抗体效价与攻毒保护具有明显的相关性。在伪狂犬病防制工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病毒抗体水平是非常重要的环节，对于未接种疫苗的猪只，血清中的猪伪狂犬病毒抗体既可以反映母源抗体的影响，也能够反映隐性感染的情况，这两种抗体的存在都会影响到减毒活疫苗的接种，甚至会使得苗无效，无法产生对病毒的免疫保护，导致免疫失败产生。对于已经接种了疫苗的猪只，猪血清中的伪狂犬病毒抗体水平反应了疫苗的免疫效果，是评价疫苗品质和免疫是否成功的重要指标。

目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备，可用于猪伪狂犬病毒的抗体检测。目前市场上，用于检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒多为间接ELISA抗体检测试剂盒，该方法的敏感性和特异性在检测猪伪狂犬病毒抗体水平上有一定的局限性，对于包被抗原纯度的要求比较高，否则容易出现假阳性和假阴性。

本发明是基于针对猪伪狂犬病毒gB的特异性单克隆抗体的阻断ELISA抗体检测方法，使得该试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测猪伪狂犬病毒gB抗体的阻断ELISA试剂盒。

该试剂盒的优点之一是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗猪伪狂犬病毒gB的单克隆抗体，提高了检测的敏感性和特异性。

基于上述目的，本发明的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以猪伪狂犬病毒gB蛋白为包被抗原的的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为与猪伪狂犬病毒gB蛋白特异性结合的单克隆抗体(PRV-Mc1)制成的酶标抗体。所述酶标抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。

优选的，所述猪伪狂犬病毒gB蛋白的序列为序列表中序列6，为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白。

优选的，与猪伪狂犬病毒gB蛋白特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L；所述重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc1-V_H和所述PRV-Mc1-V_L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc1-V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第53～60位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第95～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第49～58位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93～98位氨基酸所示。

优选的，所述PRV-Mc1-V_H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～124位所示；其PRV-Mc1-V_L的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～115位所示。

所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述猪伪狂犬病毒gB蛋白溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μg猪伪狂犬病毒gB蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清，所述阳性对照血清为所述猪伪狂犬病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(无猪伪狂犬病毒病原体且无疫苗接种)的猪血清。

更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

本发明还要求保护单克隆抗体，其可与猪伪狂犬病毒特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗体：

1)含有重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L；所述重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc1-V_H和所述PRV-Mc1-V_L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc1-V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第26～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第53～60位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第95～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第49～58位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93～98位氨基酸所示。

2)含有重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L；所述PRV-Mc1-V_H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～124位所示；其PRV-Mc1-V_L的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～115位所示。

通过上述重链可变区和轻链可变区序列，可以与动物源恒定区(如鼠抗体重链和轻链恒定区)连接，制备得到可与猪伪狂犬病毒特异性结合的单克隆抗体。

上述酶联免疫试剂盒在猪伪狂犬病毒gB阻断抗体检测中的应用也属于本发明的保护范围。

上述可以与猪伪狂犬病毒特异性结合的单克隆抗体在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。特别是在制备检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒中的应用。

上述猪伪狂犬病毒gB蛋白为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白，可包括下述步骤：

1)猪伪狂犬病毒总RNA提取：取病毒液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。

2)反转录、PCR扩增及基因测序：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得cDNA，根据GenBank报道(M17321.1)序列设计引物(F1：5’-CCGCCGTGCGGCGCGGCG-3’；R1：5’-CAGGGCGTCGGGGTCCTC-3’)，利用引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取gB基因序列信息。

3)gB基因序列的合成、穿梭载体的构建、重组Bacmid的筛选与提取、重组杆状病毒的拯救：①基因序列的合成：根据测得gB胞外域基因序列，后加入His标签，送北京中美泰和公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化。②穿梭载体的构建：根据gB序列信息以及pFastBacdual载体序列信息，设计相应引物(F2：5’-CTGCCTTTGCGGCGGATGAATTCCCTCCTTGTGGTGCT-3’；R2：5’-CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAGTGATGATGATGATGATGGAAAGGATTGGACAGG-3’)，扩增gB胞外域的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体PH启动子下，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，利用引物进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为2256bp，选取阳性克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×10⁶的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。

4)gB蛋白的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×10⁶的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。20mmol/L Tris 50mmol/L Nacl PH8.0溶液平衡His柱，然后细胞培养的上清挂柱，20mmol/L Tris50mmol/L Nacl PH8.0 300mmol/L咪唑溶液洗脱，进行亲和层析纯化并鉴定，进而获得纯化的猪伪狂犬病毒gB蛋白。

上述的可以与猪伪狂犬病毒gB蛋白特异性结合的单克隆抗体的获得方法如下：按照本领域已知的常规方法筛选本发明猪伪狂犬病毒特异性单克隆细胞株，再采用基因测序的方法测定特异性单克隆细胞株的基因序列，利用基因合成，构建重组表达载体的方法制备稳定表达的单克隆抗体作为本发明的酶标单克隆抗体。具体来讲，本发明猪伪狂犬病毒的特异性单克隆抗体的获得方法，可包括下述步骤：

1)以杆状病毒表达系统表达并纯化的gB蛋白为免疫原，纯度不低于80％，调整抗原浓度至100μg/ml；

2)连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次10μg/只动物；

3)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆；当被免疫动物的血清抗体水平用间接ELISA进行检测效价超过1:50000时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤；经检测，优选分泌PRV-Mc1的单克隆细胞株株能够特异性与猪伪狂犬病毒gB蛋白反应。

4)特异性阳性克隆杂交瘤细胞株总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。

5)反转录、PCR扩增及基因测序：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得杂交瘤细胞的cDNA。针对重链(V_H-1：5’-GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3’；V_H-2：5’-ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’)和轻链(V_L-1：5’-GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3’；V_L-2：5’-CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’)可变区设计通用引物，利用扩增引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取单克隆抗体重链和轻链可变区序列信息。

6)特异性单克隆抗体的基因序列的合成、穿梭载体的构建、重组Bacmid的筛选与提取、重组杆状病毒的拯救：①基因序列的合成：根据已测得单抗PRV-Mc1的重链和轻链可变区的序列，将鼠抗体重链和轻链恒定区的序列补充在可变区部分，然后送往北京中美泰和公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化。②穿梭载体的构建：根据重链和轻链的序列信息以及pFastBacdual载体序列信息，设计相应引物，针对重链(Mc1-HF：5’-TCATACATCTACGCGGCCGCTAGCGAATTGACTTTGCAAG-3’；Mc1-HR：5’-TCCCCCATCTCCCGGTACCCTTACCTGGGCTGA-3’)和轻链(Mc1-LF：5’-CTGCCTTTGCGGCGGATGAATTCAATTCTGCTTTGACAC-3’；Mc1-LR：5’-CTAGTACTTCTCGACAAGCTTAGAGCATTCGGTGGGA-3’)，扩增重链和轻链全长的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体中，其中pFastBacdual载体含有两个启动子，即PH启动子和P10启动子，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为4600bp，阴性克隆为300bp，选取完全无300bp条带的克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×10⁶的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。

7)特异性单克隆抗体的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×10⁶的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。用Na3PO4pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将细胞上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的猪伪狂犬病毒gB特异性单克隆抗体PRV-Mc1。

本发明试剂盒的检测程序为：

1)平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。

2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

3)样品稀释：在血清稀释板中将待检血清用样品稀释液进行2倍稀释，阴、阳性对照血清已稀释，可直接使用。

4)加样：取出所需板条，剩余板条装入铝箔袋中封好，置于2～8℃保存备用。将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清加入到抗原包被板中，100μl/孔。每份待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，加样过程时间跨度应尽量短。如图1所示加样：N：表示加阴性对照血清；P：表示加阳性对照血清；S1、S2、S3、S4等表示加各待检血清。

5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应60min。

6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。

7)加酶：各孔加入辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病毒gB蛋白的单克隆抗体100μl(浓度为0.5ug/ml)。

8)温育：置37℃温箱，反应30min。

9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。

10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。

11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应，15分钟内测定结果。

12)试验成立条件：阴性对照OD_450nm值均应≥1.0。阳性对照孔S/N值应≤0.5。

13)判定：在酶标仪上测各孔OD_450nm值。S/N＝样本OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值。通过计算每个样品的S/N值，判定其抗体的有无。阴性：S/N≥0.7；可疑0.6＜S/N＜0.7；阳性S/N≤0.6。

本发明的积极效果在于：本发明提供了猪伪狂犬病毒gB抗体检测的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒是采用猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白和针对gB特异性单克隆抗体制备的阻断法酶联免疫抗体检测试剂盒，可通过检测酶催化底物产生的信号变化来测定样品中猪伪狂犬病毒gB的特异性抗体的含量，且与目前其他病原如猪口蹄疫病毒O型、猪口蹄疫病毒A型、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均不发生交叉反应。

综上所述，本试剂盒采用猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白和针对gB特异性单克隆抗体制备的阻断法酶联免疫抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中猪伪狂犬病毒gB的特异性抗体的含量，与进口试剂盒符合率达98％以上，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

附图说明

图1为本发明试剂盒酶联免疫板加样示意图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、制备猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白

包括下述步骤：

1)取病毒液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。

2)利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得cDNA，根据GenBank报道(M17321.1)序列设计引物(F1：5’-CCGCCGTGCGGCGCGGCG-3’；R1：5’-CAGGGCGTCGGGGTCCTC-3’)，利用引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取gB基因序列信息。

3)根据测得gB胞外域基因序列，后加入His标签，送北京中美泰和公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化，gB蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3(全长序列即为编码序列)所示。

4)根据gB序列信息以及pFastBacdual载体序列信息，设计相应引物(F2：5’-CTGCCTTTGCGGCGGATGAATTCCCTCCTTGTGGTGCT-3’；R2：5’-CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAGTGATGATGATGATGATGGAAAGGATTGGACAGG-3’)，扩增gB胞外域的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体PH启动子下，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。

5)将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，利用引物进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为2256bp，选取阳性克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。

6)重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×10⁶的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。

7)将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×10⁶的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。20mmol/L Tris 50mmol/L NaclPH8.0溶液平衡His柱，然后细胞培养的上清挂柱，20mmol/L Tris 50mmol/L Nacl PH8.0300mmol/L咪唑溶液洗脱，进行亲和层析纯化并鉴定，进而获得纯化的猪伪狂犬病毒gB蛋白，猪伪狂犬病毒gB蛋白的序列如序列表中序列6所示。

实施例2、猪伪狂犬病毒gB蛋白特异性杂交瘤细胞株的筛选

猪伪狂犬病毒gB蛋白特异性杂交瘤细胞株的筛选，包括以下步骤：

1)以实施例1获得的杆状病毒表达系统表达并纯化的gB蛋白为免疫原，纯度不低于80％，调整抗原浓度至100μg/ml；

2)免疫动物为BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次每只小鼠注射gB蛋白10μg；

3)末次免疫后7天，取小鼠尾血分离血清后，用间接ELISA进行检测，效价＞1:50000后，分离免疫动物的脾细胞，将其与生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，用HAT选择性培养基筛选获得杂交瘤细胞；

4)对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆，经检测，最终获得分泌PRV-Mc1的单克隆细胞株株能够特异性与猪伪狂犬病毒gB蛋白反应。具体操作步骤：用猪伪狂犬病毒gB蛋白溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液稀释浓度至2μg/ml，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100μl，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后用铝箔纸进行封袋，置2～8℃保存备用。

取细胞培养上清加入包被有病毒抗原的酶标板中，37℃反应30分钟，用洗涤液(含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，使用时用双蒸水稀释20倍。)洗板4次，拍干后，向每孔加入1:5000稀释的兔抗鼠IgG-HRP标记物(购自美国Sigma公司)，37℃反应30分钟，用洗涤液4次，拍干后，向每孔加入底物液A(为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液)和底物液B(为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)各50μl底物工作液，37℃避光反应15分钟。向每孔加入50μl终止液(2mol/L的硫酸溶液)，振荡混匀终止反应。15分钟内测定每孔的OD_450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准，测定细胞培养上清中特异性单克隆抗体效价，最后获得1株特异性细胞克隆，与猪伪狂犬病毒gB蛋白有强烈信号反应，将这株编号为PRV-Mc1。

实施例3、猪伪狂犬病毒gB的特异性杂交瘤细胞株的基因测序、单克隆抗体重组表达系统的建立及单克隆抗体的纯化

猪伪狂犬病毒gB的特异性杂交瘤细胞株的基因测序、单克隆抗体重组表达系统的建立及单克隆抗体的纯化，包括以下步骤：

1)特异性阳性克隆杂交瘤细胞株总RNA提取、反转录、PCR及序列测定：

①总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。

②反转录：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得杂交瘤细胞的cDNA。

③PCR反应及其产物的克隆测序：针对重链和轻链可变区设计通用引物，序列信息如下：

表1重链及轻链可变区通用引物

名称	序列(5’-3’)
		V<sub>H</sub>-1(正向)	GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG
V<sub>H</sub>-2(反向)	ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
		V<sub>L</sub>-1(正向)	GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC
V<sub>L</sub>-2(反向)	CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC

利用扩增引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取单克隆抗体重链和轻链可变区序列信息。

单克隆抗体PRV-Mc1含有重链可变区PRV-Mc1-V_H、轻链可变区PRV-Mc1-V_L，其PRV-Mc1-V_H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～124位所示；其PRV-Mc1-V_L的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～115位所示。

所述重链可变区PRV-Mc1-V_H和轻链可变区PRV-Mc1-V_L均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc1-V_H和所述PRV-Mc1-V_L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc1-V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第53～60位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第95～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQID No.2的第49～58位氨基酸所示；所述PRV-Mc1-V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93～98位氨基酸所示。

2)特异性单克隆抗体的基因序列的合成及重组表达系统的建立

①基因序列的合成：根据已测得单抗PRV-Mc1的重链和轻链可变区的序列，将鼠抗体重链和轻链恒定区的序列补充在可变区部分，然后送往北京中美泰和公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化，PRV-Mc1重链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4(全长序列即为编码序列)所示，轻链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5(全长序列即为编码序列)所示。

②穿梭载体的构建：根据重链和轻链的序列信息以及pFastBacdual(购自ThermoFisher公司，货号10712024)载体序列信息，设计相应引物(序列见下表2)，扩增重链和轻链全长的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体中，其中pFastBacdual载体含有两个启动子，即PH启动子和P10启动子，并且在PH启动子序列后面含有GP67信号肽序列信息，P10启动子序列后面含有HDM信号肽序列信息，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。

表2表达载体构建引物序列信息

名称	序列(5’-3’)
		PRV-Mc1-HF	TCATACATCTACGCGGCC<u>GCTAGC</u>GAATTGACTTTGCAAG
PRV-Mc1-HR	TCCCCCATCTCCC<u>GGTACC</u>CTTACCTGGGCTGA
		PRV-Mc1-LF	CTGCCTTTGCGGCGGAT<u>GAATTC</u>AATTCTGCTTTGACAC
PRV-Mc1-LR	CTAGTACTTCTCGAC<u>AAGCTT</u>AGAGCATTCGGTGGGA

③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，利用M13引物进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为4600bp，阴性克隆为300bp，选取完全无300bp条带的克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。

④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×10⁶的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。

3)特异性单克隆抗体的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×10⁶的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。用Na₃PO₄pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将细胞上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的猪伪狂犬病毒gB特异性单克隆抗体PRV-Mc1。用紫外分光光度计测定OD_280nm值，用该OD_280nm值除以经验系数1.48即为单克隆抗体的浓度，单位为mg/ml。结果显示，PRV-Mc1分泌的单克隆抗体浓度为3.11mg/ml。

实施例4、制备猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒

1)用猪伪狂犬病毒gB纯化蛋白制备抗原包被板：将gB纯化蛋白用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成1μg/ml的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。

2)制备辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒gB特异性单克隆抗体

将猪伪狂犬病毒gB特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，-20℃以下保存。具体步骤如下：

①将5mg HRP溶于0.2ml含有1.25％戊二醛的0.1mol/L pH值6.8的PBS缓冲液中，置室温偶联18个小时，充分透析出去多余戊二醛；

②加生理盐水至1ml，然后加入2.5mg纯化的猪伪狂犬病毒gB的特异性单克隆抗体及0.1mlpH值9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，置于2～8℃放置24小时；

③加入0.1ml 0.3mol/L的赖氨酸溶液，室温放置2小时；

④用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。用酶标记物稀释液按一定比例稀释后即为酶标记物的工作液(0.5ug/ml)。

3)阳性对照血清：是以猪伪狂犬病毒人工感染后采集猪血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。

4)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。

5)样品稀释液的制备为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。

6)底物液A的制备为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)

7)底物液B的制备为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。

8)20倍浓缩洗涤液的制备为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。

9)终止液的制备2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。

10)根据需要，试剂盒中还可以有样品稀释板(2块，96孔/块)，用于样品的稀释。

实施例5、猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法

5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应60min。

7)加酶：各孔加入实施例4中制备的酶标记物的工作液100μl。

8)温育：置37℃温箱，反应30min。

实施例6、敏感性试验

使用按照实施例4的方法制备的3批猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒(批次ZM2018001、ZM2018002、ZM2018003)，按照实施例5的使用方法对猪伪狂犬病毒感染猪血清20份、猪伪狂犬病毒弱毒疫苗免疫血清20份进行检测，实验结果见表3，本发明的试剂盒共检测出39份，有1份未检出，结果表明本试剂盒对40份已知阳性血清的敏感性为97.5％。

表3敏感性检测结果

试剂盒批号	检出率	敏感性
			ZM2018001	39/40	97.5％
ZM2018002	39/40	97.5％
			ZM2018003	39/40	97.5％

实施例7、特异性试验

使用按照实施例4的方法制备的3批猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒(批次ZM2018001、ZM2018002、ZM2018003)，按照实施例5的使用方法对50份健康猪血清、2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(PRRS)，分别进行检测。

试剂盒的特异性检测结果如下表(表4)显示，对50份健康猪血清的检测结果显示，3批试剂盒的特异性均为100.0％。对2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(PRRS)的检测结果均显示为阴性，因此3批试剂盒对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。

表4猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒特异性检测结果

实施例8、符合率试验

采用美国进口试剂盒IDEXX的猪伪狂犬病毒gB抗体检测试剂盒和本发明的试剂盒同时对50份健康猪血清、25份病毒感染血清、30份疫苗免疫血清同时进行检测，比较2种试剂盒检测结果的符合率。

美国进口试剂盒操作方法(采取“短期孵育模式”)：

1)分别加100μl稀释好的阴性对照(2倍稀释)至合适的双孔中。

2)分别加100μl稀释好的阳性对照(2倍稀释)至合适的双孔中。

3)加100μl稀释好样品(2倍稀释)至相应的孔。

4)血清或血浆样本可在18～26℃孵育60分钟(±5分钟)(“短期孵育模式”)。

5)每孔用大约300μl洗涤溶液洗涤微孔3～5次。每次洗涤后，甩掉孔内的液体。每次洗涤之间和加入酶标抗体前，避免板孔变干。在最后一次甩板后，在吸水材料上扣板，彻底去掉剩余的液体。

6)每孔加入100μl酶标抗体。

7)在18～26℃条件下孵育20分钟(±1分钟)。

8)重复步骤5。

9)每孔加入100μlTMB底物溶液，18～26℃条件下孵育15分钟(±1分钟).

10)每孔加入50μl终止液终止反应，在650nm下测量记录样品和对照的吸光值A(650)。

11)计算结果：分别计算阴性对照和阳性对照均值，要求阴性对照均值-阳性对照均值差大于等于0.3。短期孵育模式：样品S/N＞0.7，判为阴性；0.6＜S/N≤0.7，判为可疑，S/N≤0.6判为阳性。

本发明试剂盒和美国进口试剂盒IDEXX的猪伪狂犬病毒gB抗体检测试剂盒对50份健康猪血清、25份病毒感染血清、30份疫苗免疫血清的检测结果见表5，本发明试剂盒和美国进口试剂盒IDEXX的猪伪狂犬病毒gB抗体检测试剂盒检测为阳性的血清份数均为54份，检测为阴性的血清份数均为51份。105份待检血清中，两种试剂盒检测结果一致的血清份数是103份，符合率为98.1％。

表5符合率试验结果

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

<130> WHOI190020

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Leu Thr Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Val Val Lys Pro Ser Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Tyr Gln Arg Thr Thr Arg Pro Tyr

20 25 30

Ala Tyr Phe Trp Tyr Arg Gln Gly Ser Gly Lys Gly Ser Glu Trp Ile

35 40 45

Glu Ser Ile Asn Pro Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Trp Pro Gly Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ser Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Arg Tyr Cys Ala Ser Lys

85 90 95

Ser Leu Ala Ile Val Tyr Tyr Trp Asn Thr Asp Trp Arg Gln Gly Gln

100 105 110

Leu Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Lys Gly

115 120

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Ser Ala Leu Thr Gln Pro Glu Ser Val Pro Gly Ala Thr Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Tyr Ser Glu Asn Phe Gly Trp Gln

20 25 30

Phe Gln Val Trp Tyr Pro Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Lys Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Phe Phe Val Pro Thr Ser Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ile Ile Ala Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Phe Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Thr Lys Gly Leu

85 90 95

Arg Gly Val Val Phe Gly Arg Gly Thr Arg Leu Thr Arg Leu Tyr Gln

100 105 110

Pro Thr Tyr

115

<210> 3

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctccttgtg gtgctgctgc tgttacacgc gctgcttctg catctcctac tcccggaaca 60

ggagcaactc ctaacgatgt gtctgccgag gcctctttgg aagagattga ggctttcagc 120

cctggtcctt ctgaggctcc tgatggagaa tatggcgact tggacgccag gacagcagtt 180

agagccgcag ccacagaaag agacaggttc tacgtgtgtc cacctccttc tggttccaca 240

gtggttagat tggagcctga acaggcctgt cccgagtact cacagggtag aaacttcaca 300

gagggtatcg ccgttctctt caaggagaac atcgctccac acaagttcaa agcccacatc 360

tactacaaga atgtgatcgt gaccaccgtc tggagcggct caacctatgc cgcaattacc 420

aataggttca cagaccgcgt cccagttccc gtccaggaga ttactgacgt tatcgaccgc 480

agaggaaagt gtgtgagcaa agccgagtac gttaggaata accataaggt gactgctttc 540

gaccgcgacg agaacccagt ggaggtggac ttgaggccct caagactgaa cgctctggga 600

accagaggat ggcatactac caacgacact tacaccaaga tcggagctgc tggcttctat 660

catactggca cttcagtcaa ttgtatcgtc gaagaggtcg aagctcgcag cgtctatcca 720

tacgattctt tcgctctgtc tacaggtgac atcgtgtaca tgtctccctt ctatggattg 780

cgcgaaggag cccacggtga acacattggc tatgcacccg gtagatttca acaggtcgaa 840

cactactacc ctattgatct cgatagcaga ttgagggctt ccgagagcgt caccaggaac 900

ttcctgagga caccacactt cacagtcgct tgggactggg ctcccaagac aagaagggtt 960

tgctccctcg ccaaatggag ggaggccgag gaaatgacca gggacgaaac tagggatggt 1020

agcttcagat tcaccagcag agccctgggt gcatcctttg tttctgacgt cacacaactg 1080

gacctccagc gcgtgcatct cggtgattgc gtgctgagag aggcttccga agcaatcgac 1140

gctatctata ggaggaggta taactcaacc catgtgctgg caggcgacag accagaagtc 1200

tacctcgcta gaggaggctt cgtggttgcc tttagacctc tcatctcaaa tgagctggcc 1260

cagctgtacg ctagggaact ggagaggctg ggtctggcag gagttgttgg ccctgctgca 1320

cccgctgccg caagaagagc acgcaggagc ccaggaccag ctggcactcc cgagccacca 1380

gctgttaacg gcacaggcca cctgcgcatc accactggta gcgcagaatt tgcaaggttg 1440

caattcactt acgaccacat ccaggcacac gtgaacgaca tgctgggaag gattgccgct 1500

gcctggtgcg aattgcagaa taaggacaga actctgtggt cagaaatgtc tcgcctgaac 1560

ccttctgccg tggcaacagc agctctcggc cagagggtgt ctgctagaat gctgggtgac 1620

gtgatggcca ttagcagatg cgtggaagtg agaggtggtg tgtacgttca gaactcaatg 1680

cgcgttcctg gagaaagagg cacatgctac tctcgcccac tcgtgacctt tgaacacaac 1740

ggtactggtg tcattgaggg tcaactcggt gacgacaatg aactgctcat ttctagggat 1800

ctgatcgagc catgtaccgg caaccacaga cgctacttca agctgggctc cggctatgtg 1860

tactacgagg attacaacta cgttagaatg gtggaggtcc ctgagacaat ttccactaga 1920

gtcacattga acttgacctt gctcgaagat cgcgaatttc tgccattgga ggtctacaca 1980

cgcgaggaat tggctgacac aggcttgctg gattacagcg agatccagag gagaaatcag 2040

ctccatgctc tcaagttcta tgacattgac agggtggtta aggtggacca taacgtcgtg 2100

ttgctgagag gaatcgcaaa cttcttccaa ggcctgggcg atgttggtgc agccgtggga 2160

aaggttgttc tgggtgctac tggtgctgtt atctcagctg ttggcggaat ggtgagcttc 2220

ctgtccaatc ctttccatca tcatcatcat cactaa 2256

<210> 4

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattgactt tgcaagaatg gggagcaggt gtcgttaagc cttctctgac attgtccctg 60

acatgcggag tctaccagag gactaccagg ccatacgcct acttctggta tcgccagggc 120

agcggcaaag gatctgaatg gattgagagc attaacccag gatcagctct gtatgagtgg 180

cctggattga agagcagagt cacctcctcc gtcgatacta gcgacaacca gttctcactg 240

aaattgtcag tgaccgctgc tgatacagca agatactgtg cctcaaagtc actggctatt 300

gtctactact ggaacaccga ctggaggcag ggccagctga ccttggtgac agtgtcctca 360

gcttccaagg gtccatctgt gttccctttg gctccatcta gcaagagcac tagcggagga 420

acagctgccc tcggttgttt ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtttcctgg 480

aactccggag cactgacctc tggtgttcac accttcccag ccgtcttgca gtcctcaggt 540

ctgtattccc tgtcatccgt cgtgacagtt ccttcttcct ccctgggaac tcagacctat 600

atctgcaacg tcaaccacaa gccatccaat actaaggtcg ataagaaagt tgaaccaaag 660

tcatgtgaca agacccatac ctgccctcca tgcccagctc ctgaactgct gggtggtcca 720

tctgtgttcc tgttcccacc aaagcctaaa gacaccctga tgatttccag aacaccagaa 780

gtcacatgcg tcgtcgttga cgtctcacat gaggacccag aagttaagtt caactggtac 840

gtcgatggtg ttgaggtcca caacgctaag acaaagccaa gggaggaaca gtacaattca 900

acttacaggg tggtttcagt cctcaccgtc ctccaccaag actggctgaa cggcaaagag 960

tataagtgca aagtgtcaaa caaggcactg cctgcaccaa ttgagaagac catctccaaa 1020

gctaagggcc agcccagaga acctcaagtg tatacattgc ctccatccag ggacgaactg 1080

accaagaacc aggtgagcct gacttgcctg gtcaaaggct tctacccttc cgatattgcc 1140

gtcgagtggg agtccaacgg acagcccgag aataactaca agaccacacc tcccgtgttg 1200

gattctgacg gctccttctt tctgtattct aagctcactg tggataagag ccgctggcag 1260

caaggaaacg tctttagctg ttcagtcatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag 1320

aagagcttga gcctcagccc aggtaag 1347

<210> 5

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattctgctt tgacacaacc tgaatccgtg cctggtgcta ctggtcaaag agtgacaatc 60

tcttgtacca ggtactccga gaacttcggt tggcagtttc aggtctggta tccacagttg 120

ccaggaactg ctcccaagaa attgatctat ggaaacttct ttgtgcccac ttccgtgccc 180

gacagattct ccggctcagg ctctggcacc tcagcatcac tgattatcgc aggtctgcaa 240

gcctttgacg agacagatta ctactgccaa tccggaacta aaggactgag aggagtggtg 300

ttcggtcgcg gtactaggct caccaggttg taccagccca catacgctcc ttcagtcact 360

ctgttccctc cctctagcga agaactccag gctaacaagg ctaccttggt gtgtttgatt 420

tccgacttct accctggtgc cgtcaccgtc gcctggaaag ctgatagctc tcccgtgaag 480

gctggcgtgg agacaaccac accaagcaag caaagcaaca acaaatacgc agcatcatcc 540

tacctgtcac tgacacccga acagtggaaa tctcacagat cctattcttg ccaggtcaca 600

catgaaggct caactgtgga gaagactgtg gctcccaccg aatgctct 648

<210> 6

<211> 751

<212> PRT

<213> 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)

<400> 6

Pro Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala Ala Ser Ala Ser Pro

1 5 10 15

Thr Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asn Asp Val Ser Ala Glu Ala Ser

20 25 30

Leu Glu Glu Ile Glu Ala Phe Ser Pro Gly Pro Ser Glu Ala Pro Asp

35 40 45

Gly Glu Tyr Gly Asp Leu Asp Ala Arg Thr Ala Val Arg Ala Ala Ala

50 55 60

Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Ser Gly Ser Thr

65 70 75 80

Val Val Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ala Cys Pro Glu Tyr Ser Gln Gly

85 90 95

Arg Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Leu Phe Lys Glu Asn Ile Ala

100 105 110

Pro His Lys Phe Lys Ala His Ile Tyr Tyr Lys Asn Val Ile Val Thr

115 120 125

Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala Ile Thr Asn Arg Phe Thr

130 135 140

Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gln Glu Ile Thr Asp Val Ile Asp Arg

145 150 155 160

Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val Arg Asn Asn His Lys

165 170 175

Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro Val Glu Val Asp Leu Arg

180 185 190

Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg Gly Trp His Thr Thr Asn

195 200 205

Asp Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala Gly Phe Tyr His Thr Gly Thr

210 215 220

Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu Ala Arg Ser Val Tyr Pro

225 230 235 240

Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp Ile Val Tyr Met Ser Pro

245 250 255

Phe Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Ala His Gly Glu His Ile Gly Tyr Ala

260 265 270

Pro Gly Arg Phe Gln Gln Val Glu His Tyr Tyr Pro Ile Asp Leu Asp

275 280 285

Ser Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Arg Asn Phe Leu Arg Thr

290 295 300

Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala Pro Lys Thr Arg Arg Val

305 310 315 320

Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu Glu Met Thr Arg Asp Glu

325 330 335

Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser Arg Ala Leu Gly Ala Ser

340 345 350

Phe Val Ser Asp Val Thr Gln Leu Asp Leu Gln Arg Val His Leu Gly

355 360 365

Asp Cys Val Leu Arg Glu Ala Ser Glu Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Arg

370 375 380

Arg Arg Tyr Asn Ser Thr His Val Leu Ala Gly Asp Arg Pro Glu Val

385 390 395 400

Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala Phe Arg Pro Leu Ile Ser

405 410 415

Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu

420 425 430

Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Arg Arg Ala Arg

435 440 445

Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu Pro Pro Ala Val Asn Gly

450 455 460

Thr Gly His Leu Arg Ile Thr Thr Gly Ser Ala Glu Phe Ala Arg Leu

465 470 475 480

Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Ala His Val Asn Asp Met Leu Gly

485 490 495

Arg Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn Lys Asp Arg Thr Leu

500 505 510

Trp Ser Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser Ala Val Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Gly Gln Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Ile

530 535 540

Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val Tyr Val Gln Asn Ser Met

545 550 555 560

Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Thr

565 570 575

Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val Ile Glu Gly Gln Leu Gly Asp Asp

580 585 590

Asn Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp Leu Ile Glu Pro Cys Thr Gly Asn

595 600 605

His Arg Arg Tyr Phe Lys Leu Gly Ser Gly Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp

610 615 620

Tyr Asn Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro Glu Thr Ile Ser Thr Arg

625 630 635 640

Val Thr Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu

645 650 655

Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr

660 665 670

Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Ala Leu Lys Phe Tyr Asp

675 680 685

Ile Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn Val Val Leu Leu Arg Gly

690 695 700

Ile Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp Val Gly Ala Ala Val Gly

705 710 715 720

Lys Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val Ile Ser Ala Val Gly Gly

725 730 735

Met Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe His His His His His His

740 745 750

Claims

1.一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标抗体；其中，所述酶联反应板包被有猪伪狂犬病毒gB蛋白，酶标抗体为用酶标记的抗猪伪狂犬病毒gB蛋白的单克隆抗体；所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪伪狂犬病毒gB蛋白为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得；所述猪伪狂犬病毒gB蛋白的序列为序列表中序列6；所述抗猪伪狂犬病毒gB蛋白的单克隆抗体，含有重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；

所述重链可变区和所述轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26~35位氨基酸所示；

所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第53~60位氨基酸所示；

所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第95~109位氨基酸所示；

所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24~35位氨基酸所示；

所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第49~58位氨基酸所示；

所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93~98位氨基酸所示。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1~124位所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1~115位所示。

3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述猪伪狂犬病毒gB蛋白溶于100μl的 pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg~1μg 猪伪狂犬病毒gB蛋白，2~8℃下放置8~12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

4.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

5.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％~1.2％的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清；所述阳性对照血清为猪伪狂犬病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无猪伪狂犬病毒病原体且无疫苗接种的猪血清。

7.根据权利要求1~6中任一项所述的猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒感染或疫苗接种的待测样品的试剂中的应用，其中，待测样品为感染野毒株或应用过普通的弱毒疫苗、灭活疫苗或应用过非gE缺失疫苗猪只血清。