CN114705857B - 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114705857B
CN114705857B CN202210527645.5A CN202210527645A CN114705857B CN 114705857 B CN114705857 B CN 114705857B CN 202210527645 A CN202210527645 A CN 202210527645A CN 114705857 B CN114705857 B CN 114705857B
Authority
CN
China
Prior art keywords
type
mouth disease
serum
foot
disease virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210527645.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114705857A (zh
Inventor
王新杰
曾政
董春霞
骆璐
陈�峰
白雪冬
孙晓明
费磊
陈汇鑫
张远亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Beijing Yisen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Beijing Yisen Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER, Beijing Yisen Biotechnology Co ltd filed Critical CHONGQING ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority to CN202210527645.5A priority Critical patent/CN114705857B/zh
Publication of CN114705857A publication Critical patent/CN114705857A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114705857B publication Critical patent/CN114705857B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。本发明所述试剂盒，能同时检测并区分O型和A型猪口蹄疫病毒，具有良好的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也良好。

Description

猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的,发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV属于小核糖核酸病毒科，口疮病毒属。根据病毒的血清学特性，目前已知全世界有7个主型：A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲I型。同一血清型内又有若干个不同的亚型，各血清型之间几乎没有交叉免疫性，同一血清型内各亚型之间仅有部分交叉免疫性。
口蹄疫是亚洲、非洲和南美洲许多发展中地区偶蹄类动物最具传染性和经济破坏性的疾病之一，我国流行的口蹄疫以A型和O型为主，预防监测和免疫扑杀是我国目前防控口蹄疫的主要手段。我国动物免疫使用的主要为口蹄疫病毒O型-A型二价疫苗。OIE推荐的检测口蹄疫抗体的标准方法为中和试验，但中和试验需要使用活病毒，需在特殊实验室完成，且操作费时，酶联免疫吸附分析法具有操作试验操作简便、检测速度快的优点，因此得到广泛应用。市场上已经有许多检测单一抗体类型的商品化ELISA试剂盒，但这些ELISA方法常常不能满足临床检测的需求，无法判定抗体类型，不利于确认可疑动物、无感染动物和免疫效力的评价。VP1抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，有时在免疫或感染的猪机体内并不能检测到VP1抗体或VP1抗体产生的时间延迟，所以，其结果会出现假阴性，准确性不高。对于那些已经免疫后又感染的动物，由于具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的特异性蛋白，但商品化的ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检。因此，需要一种更敏感性、高效的检测方法，对预防和控制口蹄疫的发生和流行将具有重要意义。
微孔板式化学发光免疫分析技术(CLIA)是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发展建立的，具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、试验操作简便、检测速度快等优点。但是化学发光不需要不需要额外的光源或背景荧光，所有的能量都来自于样本本身的化学反应，消除了背景影响，避免了外来因素(光源稳定性、光散射、光波选择器)的干扰，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。同时光信号强度和待测物质的浓度呈线性关系，可以根据仪器的标定曲线，精确算出待测物的浓度。因此敏感性、特异性、稳定性和安全性上明显优于放射性免疫和酶联免疫分析方法。
目前市面上同时检测和区分猪口蹄疫O型和A型抗体检测的基于化学发光免疫分析方法制备的微孔板式试剂盒还没有。本试剂盒为口蹄疫的诊断提供了更加灵敏、便捷、有效、快速的检测方法，而且更适用于低浓度样本的检测以及疾病的早期诊断，对应预防和控制口蹄疫的发生和流行具有十分重要的意义。
发明内容
针对猪口蹄疫病毒检测所面临的问题，本发明拟提供一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，可以区分猪口蹄疫O型和A型抗体类型，诊断能力亦优于其他市售产品。
一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包括化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液；
所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒O型VP1纳米抗体蛋白，偶数列包被猪口蹄疫病毒A型VP1蛋白；
所述包被过程为：将O型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中。将A型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；
所述O型VP1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：LQEWGAGLYSWALKPTSELSLTPGKGDQWGQGTLVTVLEWIYGSWIRQPGEIWNHDGFNPVASLKSQFSLKSLSVTATAADVYYCAEGRWEDSLRVTISVDTSNNSKNNSSASTKG(SEQ ID NO.1)；
所述A型VP1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：LQERRAVTLDGLQESGGTPGGAVCKALSLSGFIFSSYDMAWVRQAPSKGYVLEASISSGGSFTYYGAAVKGGRTIISRDGTNGQSTVRLQLNRAEDAGTFYCAKAADSDNLYAWSADNIDAWGHEVIVSSLDKG(SEQ ID NO.2)；
所述血清稀释液为含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
所述发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液；
所述发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween-20，pH＝7.4。
所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100uL分别加入到化学发光包被板奇数列和偶数列中，同时在奇数列设置O型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，在偶数列设置A型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其优势在于：利用该试剂盒可以检测口蹄疫病毒感染或接种疫苗后产生的结构蛋白VP1抗原，判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫苗，与口蹄疫病毒非结构蛋白试剂盒联用，不仅能区分病毒感染及疫苗免疫动物，同时能区分出VP1抗原类型。其敏感性、特异性、稳定性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断。
附图说明
上述仅是本发明技术的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明的化学发光试剂盒样品加样记录表，其中，P(O)为O型阳性对照孔；P(A)为A型阳性对照孔；N为阴性对照孔；S1，S2，S3，S4……等为待检样品孔，依次类推。
图2是本发明的化学发光试剂盒敏感性、特异性结果
图3是本发明的化学发光试剂盒重复性结果
图4是本发明的化学发光试剂盒与普通O型VP1抗体或A型VP1抗体ELISA试剂盒对已知抗体阳性样本的检测结果
图5是本发明的化学发光试剂盒与普通ELISA试剂盒对O型或A型阳性血清敏感性比对结果。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用敏感性、特异性血清均可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中所用血清样品由北京亿森宝生物科技有限公司保存。
实施例1一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒方法的建立
通过棋盘滴定的方法，确定最佳包被浓度及血清稀释倍数。其中，O型VP1纳米抗体蛋白和A型VP1纳米抗体蛋白分别做了2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml和0.1ug/ml的梯度，O型阳性对照血清、A型阳性对照和阴性对照血清分别做了1：10、1：20、1：50、1：100倍稀释。通过综合考虑光指数和信噪比，包被条件确定为O型VP1纳米抗体蛋白1ug/ml包被，A型VP1蛋白1ug/ml包被。血清稀释倍数为1：50。
实施例2一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒临界值的确定
应用本发明所述试剂盒，对已知背景的血清进行检测。利用试剂盒对100份O型阳性样品、100份A型阳性样品和150份阴性样品进行检测，计算每份样品的S/P值，采用SPSS16.0软件对所有血清样本的S/P值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。最终将本试剂盒的判定标准定为：S/P值＜0.45，样品判定为抗体阴性；S/P值≥0.45，样品判定为O型或A型抗体阳性。在此判定标准下，临界值对应的O型抗体检测敏感性为92.22％，特异性为93.16％；A型抗体检测敏感性为93.11％，特异性为92.54％。证明本诊断方法的准确率高，该试剂盒具有很高的诊断价值。
实施例3一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒灵敏度和特异性检测
将猪口蹄疫病毒O型和A型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时分别设置O型和A型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将稀释好的样品分别加入化学发光包被板的奇数列和偶数列，于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。检测结果用S/P值来评价，S/P公式如下：S/P＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)。结果本发明的猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的敏感性，检测猪口蹄疫病毒O型和A型的灵敏度均能达到1:1024。本发明的猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的特异性，与上述猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品均无交叉反应。因此，本发明的化学发光试剂盒灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它猪常见病毒发生血清交叉学反应。具体结果见图2。
实施例4一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒重复性检测
将10个背景清楚的血清在同一个化学发光包被板上各做5个重复，计算其批内变异系数(CV)。同时将这10个背景清楚的血清在不同的3个批次化学发光包被板上做重复，计算其批间变异系数(CV)。结果批内与批间CV均小于10％，具有良好的重复性。具体结果见图3。
实施例5一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒稳定性检测
将化学发光包被板置于37℃，10天后，检测敏感性和特异性，将猪口蹄疫病毒O型和A型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时设置分别设置O型和A型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。结果表明，37℃保存10天，化学发光包被板的敏感性和特异性不变。因此，化学发光包被板具有良好的稳定性。
实施例6猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通O型VP1抗体ELISA试剂盒和A型VP1抗体ELISA试剂盒对已知O型和A型抗体均为阳性样本的检测结果
分别用猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通O型VP1抗体ELISA试剂盒和A型VP1抗体ELISA试剂盒检测收集的21份已知抗体阳性样本，结果化学发光试剂盒全部检出，普通O型VP1抗体ELISA试剂盒检出O型抗体阳性17份，普通A型VP1抗体ELISA试剂盒检出A型抗体阳性18份，化学发光试剂盒对阳性样本的检出率高于普通O型或A型VP1抗体ELISA试剂盒。具体结果见图4。
实施例7猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通ELISA试剂盒对O型和A型阳性血清敏感性比对结果
将猪口蹄疫病毒O型和A型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。分别用猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒、普通O型VP1抗体ELISA试剂盒和A型VP1抗体ELISA试剂盒检测各个稀释度的样本。结果化学发光试剂盒检测猪口蹄疫病毒O型和A型的灵敏度均能达到1:1024，普通O型VP1抗体试剂盒检测猪口蹄疫病毒O型的灵敏度能达到1:512，普通A型VP1抗体试剂盒检测猪口蹄疫病毒A型的灵敏度能达到1:512。化学发光试剂盒灵敏度更高。具体结果见图5。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Figure BDA0003645203580000071
SEQUENCE LISTING
<110> 北京亿森宝生物科技有限公司
重庆市动物疫病预防控制中心
<120> 猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用
<130> CP122030492C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> O型VP1纳米抗体蛋白
<400> 1
Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Tyr Ser Trp Ala Leu Lys Pro Thr
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ser Leu Thr Pro Gly Lys Gly Asp Gln Trp Gly Gln Gly
20 25 30
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Trp Ile Tyr Gly Ser Trp Ile Arg Gln
35 40 45
Pro Gly Glu Ile Trp Asn His Asp Gly Phe Asn Pro Val Ala Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Ser Leu Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala
65 70 75 80
Asp Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Gly Arg Trp Glu Asp Ser Leu Arg Val
85 90 95
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Ser Lys Asn Asn Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly
115
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> A型VP1纳米抗体蛋白
<400> 2
Leu Gln Glu Arg Arg Ala Val Thr Leu Asp Gly Leu Gln Glu Ser Gly
1 5 10 15
Gly Thr Pro Gly Gly Ala Val Cys Lys Ala Leu Ser Leu Ser Gly Phe
20 25 30
Ile Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys
35 40 45
Gly Tyr Val Leu Glu Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly Gly Arg Thr Ile Ile Ser Arg Asp Gly
65 70 75 80
Thr Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Arg Ala Glu Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Phe Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Asp Ser Asp Asn Leu Tyr
100 105 110
Ala Trp Ser Ala Asp Asn Ile Asp Ala Trp Gly His Glu Val Ile Val
115 120 125
Ser Ser Leu Asp Lys Gly
130

Claims (6)

1.一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液，其特征在于：
所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒O型VP1纳米抗体，偶数列包被猪口蹄疫病毒A型VP1纳米抗体；
其中，猪口蹄疫病毒O型VP1纳米抗体的氨基酸序列为：LQEWGAGLYSWALKPTSELSLTPGKGDQWGQGTLVTVLEWIYGSWIRQPGEIWNHDGFNPVASLKSQ FSLKSLSVTATAA DVYYCAEGRWEDSLRVTISVDTSNNSKNNSSASTKG；
猪口蹄疫病毒A型VP1纳米抗体的氨基酸序列为：LQERRAVTLDGLQESGGTPGGAVCKALSLSGFIFSSYDMAWVRQAPSKGYVLEASISSGGSFTYYGAA VKGGRTIISRDGTNGQSTVRLQLNRAEDAGTFYCAKAADSDNLYAWSADNIDAWGHEVIVSSLDKG；所述包被过程为：将O型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中；将A型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；
所述O型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；
所述A型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；
所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清；
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。
2.如权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中血清稀释液为含5％v/v酪蛋白和0.5％v/v Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
3.如权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
5.如权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％v/vTween-20，pH＝7.4。
6.如权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100uL分别加入到化学发光包被板奇数列和偶数列中，同时在奇数列设置O型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，在偶数列设置A型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照；将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
CN202210527645.5A 2022-05-16 2022-05-16 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用 Active CN114705857B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210527645.5A CN114705857B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210527645.5A CN114705857B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114705857A CN114705857A (zh) 2022-07-05
CN114705857B true CN114705857B (zh) 2023-03-21

Family

ID=82176960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210527645.5A Active CN114705857B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114705857B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN204882568U (zh) * 2015-07-02 2015-12-16 深圳市绿诗源生物技术有限公司 猪o型口蹄疫病毒抗体的elisa检测试剂盒

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106226519A (zh) * 2016-07-18 2016-12-14 洛阳现代生物技术研究院有限公司 一种o型口蹄疫病毒抗体化学发光检测试剂盒
CN106706903A (zh) * 2016-11-25 2017-05-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒
CN106596932B (zh) * 2016-11-25 2019-01-25 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪口蹄疫3abc和2c抗体化学发光检测试剂盒
CN109232720B (zh) * 2018-09-13 2021-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫O型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
CN109187993B (zh) * 2018-09-13 2020-06-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫A型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
CN109187967B (zh) * 2018-09-19 2021-10-01 郑州大学 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法
CN110297091B (zh) * 2019-07-17 2020-12-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒
CN111208302B (zh) * 2020-01-14 2021-04-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫o型抗体的化学发光检测试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN204882568U (zh) * 2015-07-02 2015-12-16 深圳市绿诗源生物技术有限公司 猪o型口蹄疫病毒抗体的elisa检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN114705857A (zh) 2022-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113009153B (zh) 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用
CN111929433B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
Chen et al. Differential diagnosis of PRV-infected versus vaccinated pigs using a novel EuNPs-virus antigen probe-based blocking fluorescent lateral flow immunoassay
CN113215107B (zh) 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法
CN113030483B (zh) 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用
Jiang et al. A simple and rapid colloidal gold-based immunochromatogarpic strip test for detection of FMDV serotype A
CN113321715B (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
Shi et al. A chemiluminescent magnetic microparticle immunoassay for the detection of antibody against African swine fever virus
CN114705857B (zh) 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用
CN117229367A (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽及elisa抗体检测试剂盒
Malbec et al. Agrodiag PorCoV: A multiplex immunoassay for the differential diagnosis of porcine enteric coronaviruses
Kahane et al. Detection of IgG antibodies specific for measles virus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
CN114740201B (zh) 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用
Afzal et al. Rapid antibody diagnostics for SARS-CoV-2 adaptive immune response
ES2674672T3 (es) Péptidos de interferencia y procedimiento de detección de microorganismos
CN116848410A (zh) 用于检测血清学样品中的抗体的基于tr-fret的分析
CN113607957A (zh) 一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒
CN111474363A (zh) 一种新型冠状病毒检测方法
CN109444411A (zh) 一种犬细小病毒抗体化学发光定量检测试剂盒
CN113248580B (zh) 一种诊断标志物及其在新型冠状病毒灭活疫苗保护效果评估中的应用
Ma et al. A chemiluminescence immunoassay for rapid detection of classical swine fever virus E2 antibodies in pig serum samples
CN109342726A (zh) 一种犬腺病毒ⅱ型检测试剂盒和方法
CN113721032B (zh) 一种新型冠状病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用
CN117886900B (zh) 一种猫杯状病毒vp1蛋白截短体及其应用
CN112444626B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant