CN116848410A - 用于检测血清学样品中的抗体的基于tr-fret的分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测患者液体样品中的SARS‑CoV‑2、SARS CoV‑1和MERS‑CoV抗体的均相的、时间分辨的、基于福斯特共振能量转移(TR‑FRET)的方法。

Description

用于检测血清学样品中的抗体的基于TR-FRET的分析

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年8月17日提交的美国临时申请号63/066,632的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用的方式整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2021年8月13日，命名为52095_707001WO_ST25.txt，大小为56.3KB字节。

背景技术

目前的疫情，被称为冠状病毒疾病2019，或COVID-19，是由急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。有效的治疗选择是有限的。虽然疫苗是最终目标，但开发最少也要数月，甚至数年。此外，是否会引发长期免疫还有待证明。因此，更好地了解这种病毒、这种病毒引起的疾病、宿主对这种病毒的免疫反应以及保护性抗体在未接种疫苗的和未来接种疫苗的个体中的广泛存在仍然至关重要。

基于核酸的病毒RNA检测是检测SARS-CoV-2感染患者的主要方法。然而，这些测试只能在持续时间相对较短的疾病活跃期检测感染。在这方面，强有力的血清学试验已被证明是有利的。它们可以检测新型冠状病毒特异性抗体的存在，并且能够检测出曾经感染过的个体，即使没有症状。因此，它们已经成为管理当前疫情的重要诊断工具。

例如，用于检测SARS-CoV-2抗体的多种血清学试验目前正在临床研究中进行测试。这些主要属于酶联免疫吸附测定(ELISA)组。ELISA检测形式已经成为诊断行业中抗体检测的金标准。尽管如此，ELISA仍有一些常见的局限性，其中包括检测形式固有的处理时间和成本。例如，ELISA测试相对较慢(每次运行大约4-6小时)，并且需要专门的自动化操作。在检测SARS-CoV-2抗体的情况下，从广泛使用和可以被检测的个体数量的观点来看，这些限制被证明是很成问题的。

发明内容

本发明包括快速混合读取分析，其可以在非常小体积的液体样品中以高灵敏度和特异性准确检测患有β冠状病毒(β-CoV)感染的患者中的血清转化，所述β-CoV感染例如急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)感染。本试验解决了对稳健、简单实施和可扩展的血清学试验的重要需求。

本发明利用了一种称为福斯特共振能量转移的现象，也称为荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一个依赖于距离的物理过程。当激发的分子荧光团(本文称为供体荧光团)与另一个荧光团(本文称为受体荧光团)非常接近(例如，在10nm内)时，能量通过分子间长程偶极-偶极耦合从供体非辐射地转移到受体。在特征波长的激发下，供体荧光团吸收的能量被转移到受体，受体又发射该能量，在本文中称为FRET信号。所述信号的性质以及检测或测量所述信号的方法是本领域已知的。如本文更详细解释的，测定也是时间分辨的(TR)，这提供了更高的灵敏度和准确度。此外，本发明的方法(测定)是均相的，其允许快速反应时间(例如，花费几秒到几分钟)，可以预先混合的样品和试剂的单一孵化，并且没有固相或任何洗涤步骤。

因此，本发明的一个方面提供了用于检测患者液体样品中的β冠状病毒(β-CoV)(例如，SARS-CoV-2)抗体的均相的、基于TR-FRET的方法。通过本发明方法检测的β冠状病毒(β-CoV)(例如SARS CoV-2)抗体在本文中被称为第一抗体。为了测试来自患者的体液样品，本发明的方法使用两种试剂，每种试剂结合β冠状病毒(β-CoV)(例如SARS CoV-2)抗体。其中一种试剂包括β冠状病毒(β-CoV)(例如SARS CoV-2)抗原。如本文所用，β冠状病毒(β-CoV)抗原是指能够在感染β冠状病毒(β-CoV)如SARS-CoV-2的患者中引发抗体应答的任何蛋白质或其部分。第二试剂可以包括相同的β冠状病毒(β-CoV)抗原。在一些实施方案中，所述第二试剂可以包括与第一抗体结合的第二抗体。在一些实施方案中，所述第二试剂可以包括结合第一抗体的纳米抗体(nanobody)。试剂用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记。“差异化”是指用足以产生可检测的FRET信号的相对浓度的荧光团供体和荧光团受体来标记两种试剂。因此，在第一和第二试剂都包含β-CoV抗原的实施方案中，β-CoV抗原的亚群用供体荧光团标记，β-CoV抗原的第二亚群用受体荧光团标记。

在均相测定形式中，使体液样品与差异化标记的试剂接触，从而形成测定混合物。液体样品中存在的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)将同时结合两种不同标记的试剂，使供体和受体荧光团非常接近。这些结合事件产生可检测的FRET信号，诊断抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的存在和病毒感染。相反，缺乏FRET信号表明不存在抗β-CoV抗体(例如，SARS CoV-2抗体)和没有β-CoV病毒感染。

这些方法提供了灵活性，并允许检测抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)本身，以及抗体的特定类别和亚类。

因此，在一些实施方案中，所述方法被设计成检测β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)的存在，而不考虑它们的类别或亚类。将患者液体样品如全血、血浆或血清与用供体荧光团和受体荧光团差异化标记的β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)接触。用供体荧光团标记的β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)被认为是第一试剂。用荧光团受体标记的β-CoV抗原(例如SARS CoV-2抗原)被认为是第二试剂。在均相测定形式中，使体液样品与差异化标记的试剂接触。由于抗体通常的多价性质，如果样品中存在抗β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)，它们将被第一和第二试剂结合，使供体和受体荧光团非常接近，导致FRET信号的产生。检测到FRET信号表明在液体样品中存在抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)，并因此诊断出β-CoV感染(例如，SARS-CoV-2感染)。这些实施方案检测抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的存在。它们对于抗β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)属于哪个类别(例如IgG、IgM和/或IgA)或亚类(例如IgA1、IgA2等)没有特异性。

因此，在其他实施方案中，所述方法评估患者液体样品中存在的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的特定类别或亚型。为了实现这种额外水平的特异性，选择试剂使得第一试剂包括β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)，第二试剂包括特异性结合人类抗体的特定类别或亚类的第二(例如，哺乳动物)抗体。第二抗体不必是人类抗体。它可以来源于任何非人类物种，例如山羊或啮齿动物(例如小鼠)，只要它特异性地检测由被测试患者产生的人抗SARS CoV-2抗体。在一些实施方案中，所述第二试剂包括特异性结合人类抗体的特定类别或亚类的纳米抗体。这两种试剂用供体和受体荧光团差异化标记。因此，β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)用供体荧光团标记，第二抗体或纳米抗体用受体荧光团标记，反之亦然。例如，第二抗体可以是标准的抗IgG、抗IgM或抗IgA抗体。由于第二抗体或纳米抗体的亲和力，如果样品中存在的第一、抗SARS-CoV-2抗体包括例如IgG抗体，它们将与抗IgG第二抗体或纳米抗体结合。在均相测定形式中，使体液样品与差异化标记的试剂接触。如果样品中存在特定类别或亚类的β-CoV抗体(例如SARS-CoV-2抗体)，它们将被第一和第二试剂结合，使供体和受体荧光团非常接近，从而产生FRET信号。检测到FRET信号表明液体样品中特定类别或亚类的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的存在，并因此诊断SARS-CoV-2感染。

本发明的另一方面涉及测定试剂本身。在一些实施方案中，试剂对包括用荧光团供体和荧光团受体差异化标记的β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)。

在一些实施方案中，试剂对包括用荧光团供体或荧光团受体标记的β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)作为第一试剂。第二试剂是抗-抗-β-CoV抗体(例如，抗-抗-SARS-CoV-2抗体)或用荧光团供体或荧光团受体标记的纳米抗体，条件是荧光团供体和受体置于不同的试剂上。在一些实施方案中，第二试剂是抗-IgG抗体或抗-IgG纳米抗体。在一些实施方案中，第二试剂是抗-IgM抗体或抗-IgM纳米抗体。在一些实施方案中，第二试剂是抗-IgA抗体或抗-IgA纳米抗体，或其任何亚型，例如抗-IgA1、IgA2。

本发明的另一方面涉及用于检测患者液体样品中的抗β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)的均相、基于TR-FRET的方法的测定试剂盒，其包含：a)第一和第二试剂，其分别包含β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)的第一亚群和β-CoV抗原的第二亚群，其中所述第一和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团差异化标记，其中所述第一和第二试剂可置于相同或不同的容器中；或b)包含β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)的第一试剂和包含结合抗β-CoV抗体的至少一种第二抗体或纳米抗体的第二试剂，其中所述第一和第二试剂用供体荧光团和受体荧光团差异化标记，其中所述至少一种第二抗体或纳米抗体可以结合特定类别或亚型的人类抗体；并且其中用荧光团供体和荧光团受体差异化标记的第一和第二试剂被置于分开的容器中；和c)在用于检测患者液体样品中的抗β-CoV抗体(例如SARS-CoV-2抗体)的均相的、基于TR-FRET的方法中使用所述试剂的印刷说明书。

在所公开的方法、测定试剂和试剂盒的一些实施方案中，所述β-CoV抗原是β-CoV全长刺突蛋白或其抗原部分(例如，全长SARS CoV-2刺突蛋白)。在一些实施方案中，所述刺突蛋白的抗原部分是S1亚基或S2亚基。在一些实施方案中，刺突蛋白的抗原部分是S-受体结合结构域(S-RBD)。在一些实施方案中，β-CoV抗原是β-CoV核衣壳蛋白(“N-蛋白”)或其抗原片段(即，其结合抗β-CoV抗体)。

本发明的方法提供了优于ELISA方法的显著优势。目前的TR-FRET分析可以在ELISA所需的一小部分时间内产生结果，例如在30-45分钟的时间范围内。所述方法不需要复杂的设备；它们可以用多通道移液器和TR兼容的酶标仪进行。由于其相对简单(混合和读取)，它甚至可以在偏远、欠发达的地区轻松实现。它可以扩展到每天数百或数千次测试，每个样品的成本非常低。该测定适用于高通量筛选，如本领域已知的，这意味着可以同时分析相对大量的样品，例如在多孔微量滴定板中，例如在96孔板或384孔板或具有1536或3456孔的板中。

这些优势在特异性和敏感性方面被放大了。如工作实施例中所示，在45个聚合酶链式反应(PCR)阳性和30个PCR阴性样品的测试组上评估该测定，所述测试组先前使用两种不同的ELISA形式进行了分析。一种形式利用S受体结合结构域(S1-RBD)作为标记抗原，另一种形式利用完整的S蛋白作为标记抗原。使用2或4个标准偏差作为截止值(cut-off)，与两种ELISA形式相比，观察到相当或更好的性能。

附图说明

图1是SARS-CoV-2病毒粒子的示意图。

图2是显示用于TR-FRET血清学测定的测定设置的示意图。1.S-RBD以50:50的比例用BODIPY和Tb标记，并与血清混合，这将导致检测S-RBD特异性抗体，但在同种型之间没有区别。2.识别人免疫球蛋白G/免疫球蛋白M/免疫球蛋白A1(IgG/IgM/IgA1)的抗体用Tb标记。S-RBD或S用BODIPY标记，并且都与血清混合用于同种型特异性抗体检测。3.如在2)中，但是交换了标记。常用的ELISA显示在右边作为参考。

图3是显示刺突蛋白的SARS-CoV-2RBD结构域的二聚化以检测SARS-CoV-2特异性IgA1、IgA2、IgM和IgG抗体的线形图。

图4是显示测定1、测定2和测定3的抗体检测的比较的线形图，并证明了测定性能的差异。

图5A-5C是显示测定设置和CR3022验证的示意图和一系列散点图。图5A是显示TR-FRET测定的科学机制的示意图。识别人IgG的抗体用BODIPY标记，SARS-Cov-2刺突蛋白用Tb(铽)标记。两者都与血清混合用于同种型特异性抗体检测。337nm的光脉冲激发Tb-S标记的蛋白质的铽螯合物，并产生490nm的光。在阳性第一抗体存在的情况下，从螯合物发射的能量被转移到BODIPY标记的第二抗体，产生520nm的TR-FRET信号。图5B是TR-FRET分析的流程图。将血清样品稀释到多孔板中，并加入到反应混合物中。通过自动分配器(多点组合试剂分配器)预先添加反应混合物。用Crystal Gryphon机械分配器(Art RobbinsInstruments，LLC)或手动多通道移液器将稀释的血清样品加入到反应混合物中。在TR-FRET兼容的酶标仪(PHERAstar FSX Microplate Reader)上读取平板。图5C是一系列散点图，显示CR3022 IgG/IgM/IgA1滴定到Tb-S蛋白(最终7.5nM)和BODIPY标记的α-hsIgG/IgM/IgA(最终250nM)的预形成混合物中。图5D与图5C相同，但存在1∶150稀释的阴性血清。图5B和图5C中的数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±标准差。

图6A-6D是一系列显示优化血清稀释因子的图表。图6A是显示ELISA IgG测定的灵敏度和特异性的图。将来自一组49份PCR阳性和28份PCR阴性样品(96w_测试组)的血清样品以1:100血清与缓冲液的比例稀释，并在ELISA测定中处理。图6B是显示在1∶100稀释下对相同组群进行TR-FRETαIgG-S测定的灵敏度和特异性的图。图6C是显示使用1∶50、1∶100或1∶150血清稀释的TR-FRETαIgG-S测定与1∶100血清稀释的ELISAαIgG–S测定的相关性的一系列图。图6D是显示用1∶50和1∶150稀释进行的TR-FRETαIgG-S测定的灵敏度和特异性分析的一系列图。图6A-6D中的所有数据都表示为三次重复(n＝3)的平均值±标准差。

图7A-7C是显示TR-FRETαIgG-S测定的灵敏度和特异性的一系列图表。图7A是显示对68个SARS-CoV-2PCR阳性样品(CoV2+)和100个疫情前阴性样品(健康)的组群进行的TR-FRETαIgG-S测定的灵敏度和特异性的图。图7B是显示在相同组群中进行的ELISA IgG的灵敏度和特异性的图。图7C是显示当用相同浓度的血清进行时TR-FRET IgG和ELISA IgG的相关性的图。图7A-7C的数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±标准差。

图8A-8B是显示检测限和定量的一系列图表。图8A是显示TR-FRETαIgG–S测定结果的一系列图表。在1:100稀释的阴性血清存在和不存在的情况下进行CR3022 IgG的滴定。数据表示为三次重复(n＝3)的平均值±标准差。选择用于LoD研究的CR3022的浓度用红色箭头突出显示。图8B是显示TR-FRETαIgG-S测定的检测限的一系列图，通过在存在和不存在1∶100稀释的阴性血清的情况下将CR3022的20个重复(n＝20)与缓冲液对照进行比较而评估的。

图9A-9B是显示图8TR-FRET与其他抗原相容的一系列图。图9A是显示对一组45份PCR阳性和30份PCR阴性样品(96w_测试组)进行的TR-FRETαIgG-N测定的灵敏度和特异性的图。图9B是显示对同一96w_测试组进行的TR-FRETαIgG–S测定与TR-FRETαIgG-N测定的相关性的图。图9A-9B的数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±标准差。

图10A-10G是一系列图表和示意图。图10A是显示将BODIPY标记的CR3022 IgG抗体滴定到Tb标记的RBD混合物中(终浓度15nM)的图。使用非线性回归拟合模型(GraphPadPrism软件)计算CR3022和RBD(Kd app)的结合亲和力。数据表示为三次重复(n＝3)的平均值±标准差。图10B是显示TR-FRET测定的替代标记策略的示意图。供体荧光团位于抗原上(RBD)，受体荧光团位于检测抗体上(αIgG/M/A)。图10C是显示用于TR-FRET测定的替代标记策略的示意图。供体荧光团位于检测抗体(αIgG/M/A)上，受体荧光团位于抗原(RBD)上。图10D是显示在与图10B相同的测定设置中CR3022 IgG/IgM/IgA1的滴定的一系列图。图10E是显示在与图10C相同的测定设置中CR3022 IgG/IgM/IgA1的滴定的图。图10F是显示在1∶150阴性血清存在下CR3022 IgG/IgM/IgA1的滴定的图，测定设置如图10B所示。图10G是显示在1∶150阴性血清存在下，在与图10C相同的测定设置中，CR3022 IgG/IgM/IgA1的滴定的图。图10C-10F的数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±标准差。

图11A-11C是显示抗原量的优化、抗体量的检测和抗体稀释的检测的一系列图表。图11A是显示将CR3022 IgG滴定到具有不同浓度的Tb-S蛋白的BODIPY-αIgG(终浓度250nM)中的图。图11B是显示将CR3022 IgG滴定到具有不同浓度的BODIPY-αIgG的Tb-S(终浓度7.5nM)中的图。图11C是显示在250nM BODIPY-αIgG和7.5nM Tb-S的最终测定条件下阳性和阴性血清的滴定的图。图11A-11C中的数据是单份的(n＝1)。

图12A-12B是显示Tb-S蛋白标记度优化的一系列图。图12A是显示将CR3022 IgG滴定到具有不同标记度的Tb-S(终浓度7.5nM)的BODIPY-αIgG(终浓度250nM)中的图。图12B是显示将阳性或阴性血清滴定到具有不同标记度的Tb-S(终浓度7.5nM)的BODIPY-αIgG(终浓度250nM)中的图。图12A-12B中的数据是单份的(n＝1)。

图13A-13B是显示测定精度的一系列图表和表格。图13A是显示由三个不同的操作者在不同的日子对一组阳性反应者和阴性对照样品(总共68个)进行的三个独立的TR-FRETαIgG–S测定之间的比较的一系列图。图13B是显示操作者之间计算的平均测定可重复性(CV％)和平均中间精度(在天数和操作者之间计算)的表格，结果对应于图8A中的数据。图13C-13F的数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±标准差。

图14是显示TR-FRET IgG-N测定结果的图。将阳性和阴性血清滴定到具有生物素化的N(终浓度10nM)和Tb-链霉亲和素(终浓度4nM)的BODIPY-αIgG(终浓度250nM)中。图14中的数据是单份的(n＝1)。

图15是S-IgG ELISA反应vs.S-IgG TR-FRET反应的图，显示了TR-FRET和ELISA测定的相关性。

图16是一组比较通过ELISA和TR-FRET测量的从相同受试者获得的血清样品和自收集样品(Neoteryx)的S-IgG反应的图。

图17是从图16的数据集中提取的将S-IgG ELISA和S-IgG TR-FRET与CoV2-组相比较的一组示例性SNR和Z’计算。

图18是在1∶150SARS-CoV2阴性血清(CoV2-)或CoV2+或CoV2-血清样品存在下，将CR3022阳性对照抗体或CR3022滴定到7.5nM Tb-S、250nM AF488-抗-IgG-纳米抗体中的TR-FRET比率对浓度的图，显示在有或没有阴性对照血清的情况下，用AF488-抗IgG-纳米抗体替换BODIPY-抗IgG抗体可成功检测与S蛋白结合的CR3022抗体。此外，该设置能够检测阳性和阴性对照血清。

图19是在1∶150SARS-CoV2阴性血清(CoV2-)或CoV2+或CoV2-血清样品存在下，将CR3022阳性对照抗体或CR3022滴定到7.5nM Tb-抗-IgG-纳米抗体、250nM BODIPY-S中的TR-FRET比率对浓度的图，显示在有或没有阴性对照血清的情况下，用Tb-纳米抗体替换Tb-抗-IgG抗体可成功检测与S蛋白结合的CR3022抗体。此外，该设置能够检测阳性和阴性对照血清。

图20是在1∶150SARS-CoV2阴性血清(CoV2-)，或CoV2+或CoV2-血清样品存在下，将CR3022阳性对照抗体或CR3022滴定到7.5nM Tb-抗IgG-纳米抗体，250nM BODIPY-S中的TR-FRET比率对浓度的图，y轴刻度在0和1之间。

图21是TR-FRET比率对浓度的图，显示Tb-S和AF488-抗IgG纳米抗体、Tb-S和BODIPY-抗IgG抗体以及Tb-抗IgG纳米抗体和BODIPY-S之间的比较，显示在所有情况下用抗IgG纳米抗体代替抗IgG抗体能够成功检测对照CR3022抗体。

图22是TR-FRET比率对浓度的图，显示在1∶150稀释的SARS-CoV2阴性血清存在下，Tb-S和AF488-抗IgG纳米抗体、Tb-S和BODIPY-抗IgG抗体以及Tb-抗IgG纳米抗体和BODIPY-S之间的比较，显示在阴性对照血清存在下，所有方法都能够成功检测CR3022。在存在1∶150稀释的SARS-CoV2阴性血清的情况下，用AF488-抗IgG纳米抗体替换BODIPY-抗IgG抗体将测定信号提高了两倍以上(从0.25到0.6)。

图23是在7.5nM Tb-S，250nM AF488-抗IgG纳米抗体终浓度中滴定SARS-CoV2阳性或阴性血清的TR-FRET比率对浓度的图，显示使用荧光AF488-抗IgG纳米抗体代替荧光标记的抗IgG抗体能够检测和区分SARS-CoV2阳性和阴性血清。

图24是在7.5nM Tb-抗IgG纳米抗体、250nM BODIPY-S终浓度中滴定SARS-CoV2阳性或阴性血清的TR-FRET比率对浓度的图，显示用Tb-抗IgG纳米抗体代替Tb-抗IgG抗体可以检测和区分SARS-CoV2阳性和阴性样品。

图25A–图25I是显示TR-FRET与其他抗原相容的一系列图表。图25A显示了对包括90个疫情前阴性样品和100个SARS-CoV-2阳性样品的MassCPR组进行的TR-FRETαIgG-S蛋白测定的灵敏度和特异性。图25B显示了对MassCPR进行的TR-FRETαIgG-N蛋白分析的灵敏度和特异性。图25C显示了针对MassCPR的TR-FRET测定与ELISA测定中αIgG-S滴度的相关性。注意ELISA测定中的信号“最高限度”和TR-FRET的高动态范围。图25D显示了针对MassCPR的TR-FRET测定与ELISA测定中IgG滴度N蛋白的相关性。图25E显示了100个SARS-CoV-2阳性群组的住院状态。ER–急诊室，IP–住院病人，OP–门诊病人。图25F显示了通过TR-FRET测定测得的IgG滴度，其根据自上次阳性SARS-CoV-2试验以来的天数分层。图25G显示了对MassCPR进行的TR-FRETαIgG-S和TR-FRETαIgG-N测定的相关性，表明了对不同抗原的不同免疫反应。图25H显示了通过对MassCPR的TR-FRET IgG滴度测量的SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白之间的交叉反应性。与图25H一样，图25I显示了交叉反应性，但是是针对SARS-CoV-2和MERS-CoV的S蛋白的。数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±SD。

图26A–图26E是显示Tb-S蛋白和TR-FRETαIgG-N蛋白测定的标记度优化的一系列图表。图26A显示了将阳性和阴性血清滴定到具有生物素化的N(最终20nM)和Tb-SA(最终2nM)的BODIPY-αIgG Ab(最终250nM)中。数据是单份的(n＝1)。图26B显示了使用N蛋白对96w_测试组进行的TR-FRET IgG-N测定的灵敏度和特异性。数据显示为两次重复的(n＝2)。图26C显示了对96w_测试组进行的TR-FRETαIgG-S与TR-FRETαIgG-N测定的相关性。数据表示为两次重复(n＝2)的平均值±SD。图26D显示了对MassCPR进行的ELISAIgG-S测定的灵敏度和特异性(90个疫情前阴性样品和100个SARS-CoV-2阳性)。数据表示为四次重复的平均值±SD(n＝4)。图26E显示了对MassCPR进行的ELISAIgG-N测定的灵敏度和特异性。数据表示为四次重复的平均值±SD(n＝4)。

具体实施方式

试剂

所公开的方法使用两种标记的试剂，其中至少一种是用供体荧光团或受体荧光团标记的β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)。如本文所用，β-CoV抗原指β-CoV病毒颗粒的任何蛋白质或其部分，其能够在感染β-CoV的患者中引发抗体应答。

第一试剂

SARS-CoV/MERS病毒颗粒的示意图如图1所示。如图所示，所谓的刺突蛋白是β-CoV病毒颗粒表面的可见突起，赋予这些病毒其特有的冠状外观。这些同源三聚体蛋白质高度糖基化，每个蛋白质包含两个不同的亚基：S1和S2。刺突蛋白的作用是充当分子钥匙，通过S1受体结合结构域识别并结合人类细胞表面上存在的特定ACE2细胞表面受体(锁)来实现。当S1-RBD与乙酰胆碱酯酶2(ACE2)结合时，刺突蛋白经历了剧烈的结构变化，改变了ACE2的构象，并介导病毒进入宿主细胞。

刺突蛋白突出到外部环境中，并有效地结合细胞表面受体，从而被免疫系统识别。这使得刺突蛋白成为免疫显性冠状病毒抗原，导致其引发强烈的中和抗体反应。(Ju,etal.,Nature 584,115-19(2020))。

因此，在一些实施方案中，本发明的方法和试剂使用β-CoV的全长刺突蛋白或其抗原部分。在一些实施方案中，刺突蛋白的抗原部分是S1亚基或S2亚基。在一些实施方案中，刺突蛋白的抗原部分是S1受体结合结构域(S1-RBD)。

SARS CoV-2病毒的刺突蛋白的示例性氨基酸序列[人类冠状病毒NL63]在NCBI登录号YP_003767，版本YP_003767.1中提供，其通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:1):

1mklflillvl plascfftcn snanlsmlql gvpdnsstiv tgllpthwfc anqstsvysa

61ngffyidvgn hrsafalhtg yydanqyyiy vtneiglnas vtlkickfsr nttfdflsna

121sssfdcivnl lfteqlgapl gitisgetvr lhlynvtrtf yvpaaykltk lsvkcyfnys

181cvfsvvnatv tvnvtthngr vvnytvcddc ngytdnifsv qqdgripngf pfnnwflltn

241gstlvdgvsr lyqplrltcl wpvpglksst gfvyfnatgs dvncngyqhn svvdvmrynl

301nfsansldnl ksgvivfktl qydvlfycsn sssgvldtti pfgpssqpyy cfinstintt

361hvstfvgilp ptvreivvar tgqfyingfk yfdlgfieav nfnvttasat dfwtvafatf

421vdvlvnvsat niqnllycds pfeklqcehl qfglqdgfys anflddnvlp etyvalpiyy

481qhtdinftat asfggscyvc kphqvnisln gntsvcvrts hfsiryiynr vksgspgdss

541whiylksgtc pfsfsklnnf qkfkticfst vevpgscnfp leatwhytsy tivgalyvtw

601segnsitgvp ypvsgirefs nlvlnnctky niydyvgtgi irssnqslag gityvsnsgn

661llgfknvstg nifivtpcnq pdqvavyqqs iigamtavne sryglqnllq lpnfyyvsng

721gnncttavmt ysnfgicadg slipvrprns sdngisaiit anlsipsnwt tsvqveylqi

781tstpivvdca tyvcngnprc knllkqytsa cktiedalrl sahletndvs smltfdsnaf

841slanvtsfgd ynlssvlpqr nirssriagr saledllfsk vvtsglgtvd vdyksctkgl

901siadlacaqy yngimvlpgv adaermamyt gsliggmvlg gltsaaaipf slalqarlny

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1021qgsalnhlts qlrhnfqais nsiqaiydrl dsiqadqqvd rlitgrlaal nafvsqvlnk

1081ytevrgsrrl aqqkinecvk sqsnrygfcg ngthifsivn sapdgllflh tvllptdykn

1141vkawsgicvd giygyvlrqp nlvlysdngv frvtsrvmfq prlpvlsdfv qiyncnvtfv

1201nisrvelhtv ipdyvdvnkt lqefaqnlpk yvkpnfdltp fnltylnlss elkqleakta

1261slfqttvelq glidqinsty vdlkllnrfe nyikwpwwvw liisvvfvvl lsllvfccls

1321tgccgccncl tssmrgccdc gstklpyyef ekvhvq

S1亚基位于氨基酸残基17至680之间。S2亚基位于残基727至1195之间。S1-RBD位于S蛋白的残基331至524。

在UniProtKB-P0DTC2提供的另一个示例性SARS-CoV-2刺突蛋白氨基酸序列通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:2):

S1-RBD位于残基318至541。

在本测定方法的实践中可能是有用试剂的其他SARS-CoV-2刺突蛋白是本领域已知的(例如，可从NCBI病毒数据库获得，登录号QMT50797、QMT51409、QMT51505、QMT51865、QMT52129、QMT52237、QMT52249、QMT52393、QMT52561、QMT52741、QMT52765、QMT53017、QMT53041、QMT53053、QMT53065、QMT53089、QMT53101、QMT53149、QMT53173、QMT53197、QMT53221、QMT53233、QMT53245、QMT55880、QMT57260、QMT57332、QMT57572、QMT57584、QMT57608、QMT57644、QMT57656、QMT57692、QMT94108、QMT94756、QMT94780、QMT95200、QMT95308、QMT95356、QMT95368、QMT95452、QMT95488、QMT95560)，5个来自亚洲(QLL26046、QLI49781、QLF98260、QKY60061和QKV26077)。SARS CoV刺突蛋白和它们各自的受体结合结构域也是可商购的。

据报道，近三分之一的刺突蛋白序列与突变有关。因此，突变形式的刺突蛋白(及其抗原性的、ACE2结合片段)可用本测定方法实践中的试剂。根据分布位置将在人类SARS-CoV-2刺突蛋白中观察到的突变位点和突变类型在Guruprasad,Lalitha.“Human SARSCoV-2spike protein mutations.”Proteins vol.89,5(2021):569-576.doi:10.1002/prot.26042的表3中列出。Guruprasad发现了具有1至16个突变的刺突蛋白。参考SEQ IDNO:2，在残基D614、L5、L54、P1263、P681、K417、S477、T859、S221、V483、E484、N501和A845中的任何一个或多个处具有突变的刺突蛋白可用作试剂。因此，用作试剂的刺突蛋白可以具有一个或多个突变，包括S1-RBD中的一个或多个突变。作为代表性实例，在一些实施方案中，具有突变D614G(参考SEQ ID NO:2)的刺突蛋白可用作试剂。在一些实施方案中，具有突变N501Y突变(参考SEQ ID NO:2)的刺突蛋白可用作试剂。在一些实施方案中，具有突变K417N、E484K、N501Y(参考SEQ ID NO:2)的刺突蛋白可用作试剂。在一些实施方案中，具有RBD突变K417T、E484K和N501Y(参考SEQ ID NO:2)的刺突蛋白可用作试剂。在一些实施方案中，在18、69-70、80、144、215、246、417、484、601、570、614、681、701、716、982和/或1118氨基酸位置(参考SEQ ID NO:2)具有突变的刺突蛋白可用作试剂。

在UniProtKB-P59594提供的另一个示例性SARS-CoV-2刺突蛋白氨基酸序列通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:3):

/>

S1-RBD位于残基318至510。

在一些实施方案中，在49、77、78、118、139、144、147、193、227、239、244、261、311、344、360、426、437、472、480、487、501、577、605、607、608、609、613、665、701、743、754、804、860-861、894、999、1001、1132、1148和/或1163氨基酸位置具有突变的刺突蛋白(参考SEQID NO:3)可以用作试剂。

在SARS-CoV-2全长刺突蛋白的情况下，也可以使用S1-RBD片段的突变版本。已经报道了S1-RBD中的四十四(44)个不同的突变位点；突变位于位置337、344、345、348、354、357、367、368、379、382、384、393、395、403、407、408、411、413、441、453、457、458、468、471、476、477、479、483、484、485、486、491、493、494、498、500、501、506、507、508、518、519、520和522(所有都参考SEQ ID NO:2)。参见上述Guruprasad。在一些实施方案中，S1-RBD片段在位置344(例如，A344S)、477(例如，S477N)、483(例如，V483A)和501(例如，N501Y)中的任一位置处具有突变。在一些实施方案中，S1-RBD片段具有以下突变中的任一种:S477N、V483A、A344S和N501Y/T。在一些实施方案中，S1-RBD片段具有以下突变中的任一种:K417N/T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，S1-RBD片段在位置Y453(例如，Y453F)、G476(例如，G476S)、F486(例如，F486L)和T500(例如，T500I)中的任一位置处具有突变。

在一些实施方案中，第一试剂包括结合抗β-CoV抗体的全长MERS-CoV刺突蛋白或其片段。在UniProtKB-R9uQ53提供的示例性SARS-CoV-1刺突蛋白氨基酸序列通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:4):

/>

S1-RBD位于残基358至558。

在一些实施方案中，第一试剂可包括结合抗β-CoV抗体的β-CoV的核衣壳蛋白(下文称为“N蛋白”或β-CoV N蛋白)，或其抗原部分。如图1所示，核衣壳蛋白(N-蛋白)是一种结构蛋白，它与冠状病毒RNA基因组结合，从而在封闭的核酸周围形成一个壳(或衣壳)。N蛋白还1)在病毒装配期间与病毒膜蛋白相互作用，2)协助RNA合成和折叠，3)在病毒出芽中起作用，以及4)影响宿主细胞反应，包括细胞周期和翻译。N蛋白或其抗原部分也可用于制备本发明中使用的标记试剂。

SARS CoV-2N蛋白的示例性核酸序列在NCBI登录号DQ_243962，版本DQ_243962.1中提供，其通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:5):

1atggctacag tcaaatgggc tgatgcatct gaaccacaac gtggtcgtca gggtagaata

61ccttattctc tttatagccc tttgcttgtt gatagtgaac aaccttggaa ggtgatacct

121cgtaatttgg tacccatcaa caagaaagac aaaaataagc ttataggcta ttggaatgtt

181caaaaacgtt tcagaactag aaagggcaaa cgggtggatt tgtcacccaa gttacatttt

241tattatcttg gcacaggacc ccataaagct gcaaaattta gagagcgtgt tgaaggtgtt

301gtctgggttg ctgttgatgg tgctaaaact gaacctacag gttacggtgt taggcgcaag

361aattcagaac cagagatacc acacttcaat caaaagctcc caaatggtgt tactgttgtt

421gaagaacctg actcccgtgc tccttcccgt tctcagtcaa ggtctcagag tcgcggtcgt

481ggtgaatcca aatctcaatc tcggaatcct tcaagtgaca gaaaccataa cagtcaggat

541gacatcatga aggcagtcgc tgcggctctt aaatctttag gttttgacaa gcctcaggaa

601aaagacaaaa agtcagcgaa aacgggtact cctaagcctt ctcgtaatca gagtccttct

661tcttttcaat ctgctgccaa gattcttgct cgttctcaga gttctgaaac aaaagaacaa

721aagcatgaaa tgcaaaagcc acggtggaaa agacagccta acgatgatgt gacatctaat

781gtcacacaat gttttggccc cagagacctt gaccacaact ttggaagtgc aggtgttgtg

841gccaatggtg ttaaagctaa aggctatcca caatttgctg agcttgtgcc gtctacagct

901gctatgcttt ttgatagtca cattgtttcc aaagagtcag gcaacactgt ggtcttgact

961ttcaccacca gagtgactgt gcccaaagac catccacact tgggtaagtt tcttgaggaa

1021ttaaatgcat tcactagaga aatgcaacaa cagcctcttc ttaaccctag tgcactagaa

1081ttcaacccat cccaaacttc acctgcaact gttgaaccag tgcgtgatga agtttctatt

1141gaaactgaca taattgatga agtcaactaa

另一个示例性的SARS CoV-2N蛋白具有在NCBI保藏号AB_B90505，版本AB_B90505.1中提供的氨基酸序列，其通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:6):

1matvkwadas epqrgrqgri pyslyspllv dseqpwkvip rnlvpinkkd knkligywnv

61qkrfrtrkgk rvdlspklhf yylgtgphka akfrervegv vwvavdgakt eptgygvrrk

121nsepeiphfn qklpngvtvv eepdsrapsr sqsrsqsrgr gesksqsrnp ssdrnhnsqd

181dimkavaaal kslgfdkpqe kdkksaktgt pkpsrnqsps sfqsaakila rsqssetkeq

241khemqkprwk rqpnddvtsn vtqcfgprdl dhnfgsagvv angvkakgyp qfaelvpsta

301amlfdshivs kesgntvvlt fttrvtvpkd hphlgkflee lnaftremqq qpllnpsale

361fnpsqtspat vepvrdevsi etdiidevn

另一种SARS CoV-2N蛋白具有Djukic,et al.,Virology 557:15-22(2021)中描述的氨基酸序列，该文献通过引用并入本文，并复制如下(SEQ ID NO:7):

在一些实施方案中，第一试剂包括结合抗β-CoV抗体的全长N蛋白的片段。代表性片段包括SED ID NO:7的氨基酸残基58-419，复制如下(SEQ ID NO:8):

如图1所示，可用于制备适用于本发明的试剂的其它β-CoV抗原或其部分包括包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和血凝素-酯酶二聚体蛋白(HE)。E蛋白在病毒中少量存在。其被认为是一种跨膜蛋白并具有离子通道活性。这种蛋白质促进病毒的装配和释放，并具有其他功能，如离子通道活性。据信它对病毒复制不是必需的，但对发病机理是必需的。M蛋白是最丰富的结构蛋白。其不含信号序列，在病毒颗粒中作为二聚体存在。它可能有两种不同的构象，以使其能够促进膜弯曲以及结合核衣壳。HE蛋白存在于β冠状病毒的一个亚群中。这种蛋白质结合表面糖蛋白上的唾液酸。该蛋白的活性被认为能增强S蛋白介导的细胞进入和病毒通过粘膜的传播。

用于制备在本发明中使用的标记试剂的β-CoV抗原(例如，重组形式的)是可商购的，例如，来自Native Antigen公司(SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S1)、绵羊Fc-标签(HEK293)和SARS-CoV-2刺突蛋白糖蛋白(S2)、绵羊Fc-标签(HEK293)，Sino Biological(例如、SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突蛋白S1(D614G)-His重组蛋白、HPLC验证的、SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突蛋白RBD-His(K458R)重组蛋白)、AcrobioSystem(全长N蛋白，Cat.NUN-C81Q6)和Millipore-Sigma(例如，重组SARS CoV-2N蛋白片段(CAT.AXX841))。

第二试剂

如上所述，第二试剂可以是第一试剂的差异化标记的版本。

在其他实施方案中，第二试剂是结合可能存在于患者样品中的抗β-CoV抗体的第二抗体。第二抗体的选择及其来源并不重要，只要该抗体能够特异性结合患者样品中可能存在的人类抗β-CoV抗体。抗体可以是另一物种的，例如山羊或啮齿动物(例如小鼠)。第二抗体的代表性实例包括山羊抗人IgG、抗人IgM和抗人IgA抗体，以及山羊抗人IgA1、抗人IgA2抗体，可从许多商业来源获得，例如从Bethyl Laboratories，Inc.(抗IgG:A80-104A；抗IgM:A80-100A；抗IgA:A80-102A)。标记的抗体也可以通过商业途径获得。

在其他实施方案中，第二试剂包括结合可能存在于患者样品中的抗β-CoV抗体的纳米抗体。纳米抗体是一类来源于骆驼科动物的抗原结合蛋白，其结合亲和力和特异性与经典抗体相当，尽管仅包含单个15kDa的可变结构域。参见Mitchell,et al.,Proteins 86(7):697-706(2018)。纳米抗体也被称为单结构域抗体，由骆驼科抗体可变区的重链组成，并且是VHH(VHH)的形式。由于sdAbs可以针对传统抗体无法达到的独特表位靶位产生，因此它们通过增强的分子和组织穿透性，以高亲和力和特异性提供了精确结构分析的能力。在一些实施方案中，纳米抗体是抗人IgG纳米抗体(例如，AF488-抗IgG纳米抗体，可从Chromotek公司购买，为Alpaca抗人IgG)。/>

TR-FRET和供体和受体荧光团

TR-FRET是时间分辨荧光(TRF)和FRET的结合。TRF通过延迟读取荧光信号来减少背景荧光，例如延迟大约50-200微秒。在该延迟(即门控期)之后，测量样品中持续时间更长的荧光。使用TR-FRET，例如由于样品中的干扰物质引起的干扰背景荧光不会被共同检测到。仅测量由能量转移产生或抑制的荧光。TR-FRET系统产生的荧光通过合适的测量装置来确定。这种时间分辨检测系统使用例如脉冲激光二极管、发光二极管(LED)或脉冲染料激光器作为激发光源。在适当的时间延迟之后，即在干扰背景信号已经衰减之后，进行测量。现有技术中描述了用于确定时间分辨FRET信号的装置和方法。

TR-FRET要求目的信号必须对应于具有长荧光寿命的化合物。选择合适的TR-FRET供体和受体对的标准包括以下一项或多项:(1)FRET能量供体的发射光谱应与FRET能量受体的激发光谱重叠；(2)FRET配偶体(即FRET能量供体和FRET能量受体)的发射光谱应该显示不重叠的荧光；(3)FRET量子产率(即，从FRET供体转移到FRET受体的能量)应该尽可能高(例如，FRET在1-20nm，例如5-10nm的测量距离上，应该具有约1-100％，例如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％和99％的效率；(4)FRET信号(即荧光)必须能够与样品产生的荧光(例如自发荧光)相区别；和(5)FRET供体和FRET受体应该具有允许检测FRET信号的半衰期(例如，TR-FRET可以发光，并且可以在10-9秒至10-3秒的时间范围内发生)。

用于基于TR-FRET的测定的供体/受体荧光团对是本领域已知的。参见例如JosephR.Lakowicz(Principles of fluorescence spectroscopy，第2版，Kluwer academic/plenum publishers，NY(1999))。

供体荧光团有利地发射长寿命荧光，通常在>0.1毫秒(ms)的量级，优选在0.5和6ms之间。以这种方式，通过脉冲光源(如闪光灯)激发供体荧光团，随后延迟，然后进行FRET信号测量(本领域称为计数窗口)，使得短寿命荧光在测量之前消退。这一特性使测定能够以时间分辨的方式进行，从而降低背景(信噪比)，进而提高灵敏度和准确度。

供体荧光团类型的代表性实例包括镧系金属及其复合物，包括螯合物和穴合物。示例性的镧系元素包括铽(Tb)、铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、镱(Yb)、铒(Er)以及它们各自的3+配合物。这种复合物包括穴合物和螯合物，其代表性实例描述于例如美国专利申请公开2015/0198602A1中，该文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，供体荧光团是铽或铕，或者它们的穴合物或螯合物，其实例在‘602专利公开中有所描述。这些供体荧光团是可商购的，例如来自Cisbio。例如，Eu3+具有毫秒级的荧光寿命。

受体荧光团的代表性例子包括别藻蓝蛋白(商品名XL 665)；发光有机分子，例如罗丹明、花青染料(例如Cy5)、方酸菁(squaraines)、香豆素、proflavins、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物(以商品名“BODIPY”市售)、以商品名“Atto”已知的荧光团、以商品名“DY”已知的荧光团、以商品名“Alexa”已知的化合物和硝基苯并噁二唑。

“Alexa”化合物是可商购的，例如来自Invitrogen；“Atto”化合物可从Atto-tec商购获得；“DY”化合物可从Dyomics商购获得；“Cy”化合物可从Amersham Biosciences商购获得。

表1列出了TR-FRET/HTRF¹的供体/受体对的代表性实例，而表2列出了已知FRET荧光团的激发和发射(nm)。

表1

¹改编自Invitrogen.com(FRET；Alexa染料)和Cysbio(TR-FRET)；²Ro是FRET效率为50％时的距离。在美国专利申请公开20180356411A1中描述了可用于实施本发明的各种供体和受体荧光团的激发和发射。

表2

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参见美国专利申请公开20180356411A1。

在本发明的一些实施方案中，供体荧光团是铽(Tb)或铕，或它们的穴合物或螯合物，荧光团受体是有机硼荧光染料，例如硼-二吡咯亚甲基(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚)(以商品名BODIPY^TM商购),6-氨基-9-(5-((氨基甲基)氨基甲酰基)-2-羧基苯基)-3-亚胺基-3H-呫吨-4,5-二磺酸钠(以商品名Alexa488^TM商购)和2-[5-[3,3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺丙基)吲哚-1-鎓-2-基]五-2,4-二烯亚基]-3-甲基-3-[5-氧代-5-(6-膦酰氧基己基氨基)戊基]-1-(3-磺丙基)吲哚-5-磺酸(以商品名Alexa647^TM商购)。

在一些实施方案中，荧光团供体/受体对是Tb和BODIPY。在一些实施方案中，荧光团供体/受体对分别是Eu和ALEXA647。

用供体和受体荧光团标记试剂

本领域教导了如何根据各种技术和偶联剂将蛋白质实体与供体和受体荧光团结合。参见例如‘602专利公开。可商购获得的试剂盒也可用于此目的。例如，可从Cisbio和Perkin Elmer商购的试剂盒允许用铽穴合物标记肽、蛋白质和寡核苷酸，所述铽穴合物包括N-羟基琥珀酰亚胺活化的铽-三联吡啶(TBP)。

用荧光体供体和受体对试剂进行了差异化标记。在本发明的TR-FRET测定中，确定任何给定的荧光体供体和受体对的各自的摩尔浓度以增强FRET信号并促进其检测。因此，摩尔浓度可以变化，取决于任何给定的荧光团供体和受体对，以及携带它们的试剂的蛋白质部分。确定与任何给定的β-CoV抗原(例如，SARS CoV-2抗原)和部分第二试剂(例如，第二抗体或纳米抗体)一起使用的标记的相对摩尔浓度，以便优化FRET信号并最小化背景噪声，这在本领域的技术水平范围内。工作实施例说明了使用本领域已知的技术优化这些摩尔浓度。

在一些实施方案中，例如，在约1.75nM至约30nM范围内(相对于15μL的TR-FRET测定体积)的供体荧光团如铽或铕(例如，作为SARS CoV-2抗原的标记)的浓度可能是有用的。该范围之外的浓度，更低或更高，也可能是有用的。在一些实施方案中，供体荧光团如Tb或Eu的浓度为约7.5nM，而在其它实施方案中，所述浓度为约15nM。

在一些实施方案中，约50nM-1μM(相对于15μL的TR-FRET测定体积)的受体荧光团，例如BODIPY(例如，当与Tb一起用作荧光团供体时)的浓度可能是有用的。该范围之外的浓度，更低或更高，也可能是有用的。在一些实施方案中，BODIY的浓度为约250nM(相对于15μL的TR-FRET测定体积)。

荧光团供体和受体相对于彼此的最佳摩尔浓度可能取决于标记度(DoL)。如本领域已知的，DoL是与蛋白质分子(在这种情况下是SARS-CoV-2抗原性蛋白质或其抗原性片段和抗体)偶联的标记(在这种情况下是荧光团供体和受体)的平均数。在摩尔浓度的情况下，DoL可以变化。确定与任何给定的SARS CoV-2抗原和第二抗体一起使用的标记的相对DoL，以便优化FRET信号和最小化背景噪声，在本领域技术人员的能力范围内。在本方法中，DoL(例如，相对于Tb)通常在约1.0至约3.8的范围内。在一些实施方案中，DoL在大约1.8至大约3.8的范围内。在一些实施方案中，DoL约为1.8。此范围之外的DoL值(更低或更高)也可能有用。然而，对于Tb，DoL约为8(或更高)可能是不利的，因为FRET信号太强而不实用。工作实例说明了使用本领域已知的技术对Tb的DoL进行优化。Tb-抗-IgG-纳米抗体的DoL约为1。如工作实例中所示，DoL可以根据标准技术来确定。

患者和患者样品

本方法需要测试从个体获得的体液样品。样品可以包括全血或其成分(例如血清和血浆)、唾液和眼泪。在一些实施方案中，体液样品是血清或血浆。在一些实施方案中，体液样品是干燥的全血。本发明的实践不限于任何个体亚群。样品可以从任何个体(患者)获得，而不仅仅是表现出感染症状的个体。希望、被认为有需要、被要求进行β-CoV检测(如SARS-CoV-2)和/或无症状的个体可以接受检测。

测定方法的实施

本发明方法的共同点是需要通过诱导可通过TR-FRET信号检测的邻近事件来检测抗β-CoV抗体(例如，SARS CoV-2抗体)。标准试剂和溶液的选择和优化、试剂的浓度和仪器(例如荧光计、微孔板、激发装置、供体和受体荧光团，以及用于抗体检测的基于TR-FRET的均相测定形式中涉及的信号和其他参数的测量)在本领域技术人员的能力范围内。参见，例如，Saraheimo S,Hepojoki J,Nurmi V,Lahtinen A,I,Vaheri A,et al.(2013)Time-Resolved FRET-Based Approach for Antibody Detection–A New SerodiagnosticConcept.PLoS ONE 8(5):e62739；doi.org/10.1371/journal.pone.0062739(以及其中引用的参考文献)。

概括地说，本发明提供了一种均相的、基于TR-FRET的方法，用于检测患者体液样品中的β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)。通过本方法检测的β-CoV抗体在本文中被称为第一抗体。为了测试来自患者的体液样品，本发明的方法使用两种试剂，每种试剂与抗SARSCoV-2抗体结合。至少一种试剂是TR-FRET标记的β-CoV抗原(例如，SARS CoV-2抗原)，如本文所用，其是指能够在感染β-CoV如SARS-CoV-2的患者中引发抗体反应的任何β-CoV蛋白或其部分。在一些实施方案中，第二试剂是相同的β-CoV抗原，但是具有互补的TR-FRET标记。在一些实施方案中，第二试剂是结合第一抗体的TR-FRET标记的第二抗体。在一些实施方案中，第二试剂是结合第一抗体的TR-FRET标记的纳米抗体。试剂用供体荧光团和受体荧光团进行不同的标记。使体液样品与两种不同标记的试剂在均相测定形式中接触。由于抗体通常的多价性质，液体样品中存在的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)将结合差异化标记的试剂。如果样品中存在抗β-CoV抗体(例如SARS-CoV-2抗体)，它们将被第一和第二试剂结合，使供体和受体荧光团非常接近。这些结合事件产生可检测的FRET信号，用于诊断抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)和β-CoV病毒感染。相反，缺乏FRET信号表明不存在抗β-CoV抗体(例如，抗SARS CoV-2抗体)和没有β-CoV病毒感染。

在一些实施方案中，所述方法被设计成检测抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的存在，而不考虑它们的类别或亚型。代表性的基于TR-FRET的均相测定形式示意性地显示在图2中(测定1)。将患者液体样品如血浆或血清与用供体荧光团和受体荧光团差异化标记的SARS-CoV-2抗原接触。因此，在这些实施方案中，用供体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原被认为是第一试剂。用受体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原被认为是第二试剂。在均相测定形式中，使体液样品与不同标记的试剂接触。由于通常抗体的多价性质，如果样品中存在SARS-CoV-2抗体，它们将与第一和第二试剂结合，使供体和受体荧光团在SARS-CoV-2抗体的Fab区非常接近，导致FRET信号的产生。如图2所示(测定1)，抗体的一个Fab臂将与用供体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原结合，抗体的另一个Fab臂将与用受体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原结合。检测到FRET信号表明液体样品中存在抗SARS-CoV-2抗体，从而诊断出SARS-CoV-2感染。

这些实施方案检测抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的存在。它们对于抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)属于哪一类别(例如IgG、IgM和/或IgA)或亚型(例如IgA1、IgA2等)没有特异性。本方法提供了检测这些种类的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的额外水平的特异性。

因此，在其他实施方案中，所述方法针对患者体液样品中存在的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的特定类别或亚型。两种代表性的基于TR-FRET的均相测定形式示意性地显示在图2中，测定2和3。为了获得这种额外水平的特异性，选择试剂，使得第一试剂是SARS-CoV-2抗原，第二试剂是能够结合第一抗SARS-CoV-2抗体的第二抗体。这两种试剂分别用供体和受体荧光团标记。因此，当SARS-CoV-2抗原用供体荧光团标记时，第二抗体用受体荧光团标记(测定3)，反之亦然(测定2)。为了检测不同种类的抗SARS-CoV-2抗体，第二抗体不必是人类抗体。它可以来源于任何非人类物种，例如山羊或啮齿动物(例如，小鼠)，只要它特异性地检测被测试患者产生的任何种类的人抗SARS CoV-2抗体。在一些实施方案中，第二抗体可以是标准的人抗IgG、抗IgM或抗IgA抗体。相同的原理适用于检测不同亚型的抗SARS-CoV-2抗体。第二抗体不必是人类抗体，只要它能够结合并检测由受试患者产生的人抗SARS CoV-2抗体的任何亚型。因此，第二抗体可以是标准的人抗IgA1或抗IgA2抗体。

在均相测定形式中，使体液样品与不同标记的试剂接触。如果样品中存在特定类别或亚型的SARS-CoV-2抗体，它们将被第一和第二试剂结合，使供体和受体荧光团非常接近，从而产生FRET信号。如图2所示(测定2)，抗体的Fab臂将与用受体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原结合，并且由于用供体荧光团标记的第二抗体的亲和力，它将与第一抗体的Fc区结合。如图2所示(测定3)，抗体的Fab臂将与用供体荧光团标记的SARS-CoV-2抗原结合，抗体的Fc区将与用受体荧光团标记的第二抗体结合。检测到FRET信号表明在液体样品中存在特定类别或亚型的抗SARS-CoV-2抗体，并因此诊断出SARS-CoV-2感染。

这些不同的实施方案分别使用铽和BODIPY作为供体和受体荧光团进行了说明。如本文所公开的，该方法可以用其他FRET供体/受体荧光团对实施，所述荧光团对能够基于手性距离产生可检测的FRET信号。这种FRET供体/受体对包括Eu和ALEXA647。表1列出了TR-FRET/HTRF的供体/受体对的代表性实例，而表2列出了已知FRET荧光团的激发和发射(nm)。

为了获得同种型特异性检测，可以将供体或受体荧光团移至第二抗体(图2所示的试验2和试验3)或纳米抗体，所述第二抗体或纳米抗体将与患者样品中存在的抗原特异性IgG/IgM/IgA结合。当抗原结合到第一抗体，并且第二抗体或纳米抗体识别第一抗体时，供体和受体荧光团非常接近，导致阳性TR-FRET信号(图3和图4)。

只要从任何一对FRET供体/受体对产生的FRET信号与所有其他FRET供体/受体对基本上不重叠，就可以用多对(2对或更多对)标记的试剂进行所述测定方法。

FRET信号的类型及其测量/检测

“FRET信号”是指代表荧光供体化合物和受体化合物之间FRET的任何可测量的信号。因此，FRET信号可以是荧光供体化合物或受体化合物的发光强度或发光寿命的变化。多种发光和光检测仪器中的任何一种都可以用于引发FRET(例如，激发供体荧光团或激发能够激发供体荧光团的试剂)和/或检测所产生的发射。由供体和受体荧光团产生的光发射，即FRET信号，可以通过视觉、摄影、辐射测量、分光光度或任何其他方便的方法，如使用荧光计来检测或测量。例如，见上文Saraheimo。

抗体或配体与靶抗原的结合可以定性确定，即通过FRET信号的存在或不存在；没有任何FRET信号表明没有结合。通常，“FRET信号的缺失”由某个阈值来定义，即在扣除任何背景信号之后。背景信号通常通过用除待测抗体或配体之外的所有试剂进行FRET测定来确定。

标记试剂与目标抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的结合可以定性或定量测定。定性测定简单地检测FRET信号的存在与否。没有任何FRET信号表明没有结合。通常，“FRET信号的缺失”由某个阈值来定义，即在扣除任何背景信号之后。背景信号通常通过用除标记试剂之外的所有测定试剂进行FRET测定来确定。对于定量测定，结合的水平或强度可以通过测试产生最大有效浓度(EC₅₀)的一半的不同浓度的标记试剂来测定。EC₅₀是指在特定的暴露时间后，与抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的结合处于基线和最大值的中间的标记试剂的浓度。可以生成EC₅₀剂量反应曲线。

所公开的试剂可以方便地包装在测定试剂盒中，以便于实施用于检测患者液体样品中的抗β-CoV抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗体)的均相的、基于TR-FRET的方法。

本发明的另一方面涉及一种用于检测患者体液样品中抗β-CoV抗体(例如，SARS-CoV-2抗体)的均相的、基于TR-FRET方法的测定试剂盒。广义而言，试剂盒可包括置于相同或不同容器中的第一和第二试剂，以及用于实施所述测定方法的印刷说明书。

在一些实施方案中，第一和第二试剂分别包括β-CoV抗原的第一亚群(例如，SARS-CoV-2抗原)和β-CoV抗原的第二亚群，其中第一和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记，其中第一和第二试剂可置于相同或不同的容器中。第一试剂可以包括供体荧光团，在这种情况下，第二试剂可以包括受体荧光团，反之亦然。

在其他实施方案中，第一试剂可包括β-CoV抗原(例如，SARS-CoV-2抗原)，第二试剂可包括结合抗β-CoV抗体的至少一种第二抗体或纳米抗体。至少一种第二抗体或纳米抗体可以结合特定类别或亚型的人类抗体。第一和第二试剂分别用供体荧光团和受体荧光团标记。用荧光团供体和荧光团受体差异化标记的第一和第二试剂可以放置在分开的容器中。

印刷说明书描述了在检测患者体液样品中抗β-CoV抗体(如SARS-CoV-2抗体)的均相、基于TR-FRET的方法中，试剂以及任何必要仪器的使用。

实施图2所示的实施方案(测定1)需要使用第一和第二试剂，所述试剂包括用供体荧光团和受体荧光团差异化标记的β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)的第一和第二亚群。为此，它们可以被放置在同一个容器中。

实施图2所示的实施方案(测定2和3)需要使用差异化标记的第一和第二试剂，其中第一试剂包括β-CoV抗原(例如SARS-CoV-2抗原)，第二试剂包括结合抗β-CoV抗体的至少一种第二抗体或纳米抗体。因此，在单独的容器中提供它们，对于可以用试剂盒的组分进行的测定形式的类型提供了更大的灵活性。例如，用供体荧光团和受体荧光团差异化标记的第二抗体或纳米抗体的亚群不用于同一测定。因此，在第一容器中提供用供体荧光团标记的至少一种第二抗体或纳米抗体的第一亚群，并且在第二容器中提供用受体荧光团标记的至少一种第二抗体或纳米抗体的第二亚群，提供了在其整个范围内实施所公开的方法所需的最少试剂。在这点上，试剂盒可以进一步包括第二、第三等标记的第二抗体。

根据测试的结果，可能需要进行治疗。因此，在一些实施方案中，可以用预防剂(疫苗)或抗β-CoV治疗剂(例如，抗SARS-CoV-2治疗剂)治疗受试患者。例如，如果结果为阴性(无抗β-CoV抗体)，可能会开出疫苗(预防性)处方。如果结果是阳性的，病人有症状，可能需要进行治疗。如果结果呈阳性且患者无症状(这可能意味着近期感染，但发病期已消退，或者患者处于发病期，但只是没有表现出典型症状)，则可能需要疫苗或治疗。

实施例

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整公开和描述，而不是为了限制发明人认为是他们的发明的范围。

实施例1：材料和方法

抗原生产

SARS-CoV-2的全长刺突蛋白(通过去除弗林蛋白酶(furin)位点稳定的S蛋白融合蛋白，在TunaCHO中表达)购自Lake Pharma(目录号46328)和SARS-CoV-2的全长N蛋白(构建体1-419)购自AcrobioSystem(目录号NUN-C81Q6)。RBD蛋白购自LakePharma(目录号46438)。SARS-CoV的全长刺突蛋白(目录号40634-V08B)和MERS-CoV的全长刺突蛋白(目录号40069-V08B)购自Sino Biological。

CR3022抗体的构建和蛋白纯化

根据制造商的方案(Thermo Fischer Scientific，A14525)，使用1∶1或2∶1的重链与轻链转染比率，在Expi293T细胞中表达CR3022 IgG、IgM、IgA1抗体。在46500相对离心力(rcf)(Ti45，Beckman Coulter)下离心15分钟来使细胞悬浮液澄清。将澄清的介质用0.45μm过滤器过滤，然后加入到用结合缓冲液(PBS，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH为7.4)预平衡的结合柱中，并使用蛋白G(GE，GE17-0405-01)用于IgG，使用蛋白L(GE，GE17-5478-15)用于IgM或肽M(InvivoGen，gel-pdm-5)。用20-50倍柱体积(CV)的结合缓冲液洗涤珠子。用6-15CV的0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱缓冲液从珠子上洗脱蛋白质，并立即用10∶1比例的1M Tris-HCl pH 8.0淬灭。将含蛋白质的级分汇集并在的液氮中快速冷冻，浓度为0.1–1.5mg/mL。将抗体储存在-80℃下，直到进一步使用。使用Bradford测定法估算浓度。

生物素化的SARS-CoV-2N蛋白的构建和蛋白纯化

在昆虫细胞中克隆并表达了全长N蛋白，其具有N端Strep-Avi-Tev融合标签。通过超声处理裂解细胞(在50mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、0.1％ Triton X-100、1mM PMSF和1片完全蛋白酶抑制剂混合物中，Roche Applied Science)，通过高速离心使裂解物澄清，并使上清液通过StrepTactin-XT HC亲和树脂(IBA)。使用生物素洗脱目标蛋白，并进行Poros50HQ离子交换层析。使用26/60Superdex S200柱(GE Healthcare)在50mM HEPES pH7.4、200mM NaCl和2mM TCEP中使用尺寸排阻色谱法完成纯化。在BirA酶、10mM MgCl₂、2mM生物素、20mM ATP存在下，将纯化的带有avi标签的N蛋白生物素化。生物素化通过质谱得到证实。将含蛋白质的级分汇集并在液氮中进行快速冷冻，N蛋白的浓度为1.6mg/mL。将蛋白质储存在-80℃下，直到进一步使用。使用Bradford测定法估算浓度。

血清样品

本研究中使用的血清/血浆样品通过拉贡临床服务研究所(Ragon InstituteClinical Services)(96w_测试组)、布莱根妇女医院(Brigham and Women Hospital)(BWH组)和达纳-法伯肺癌中心(Dana-Farber Lung Cancer Center)(96w_测试组中的疫情前阴性对照)获得。所有样品都是在受试者签署知情同意书后收集的，或者是根据经批准的马萨诸塞州总医院(Massachusetts General Hospital)(MGH)机构协议作为废弃样品收集的。BWH组包括先前确诊SARS-CoV-2RNA+且隔离2周后两次重复RNA阴性测试的康复者(CoV2+)和一组低风险的社区成员(健康)样本。如果受试者的SARS-CoV-2RNA测试呈阳性，则被纳入其中。样本在60℃下热灭活1小时。

用NCP311-Tb或Bodipy进行蛋白质标记

根据制造商的方案，使用PD-10脱盐柱(Sigma，GE17-0851-01)将缓冲液中浓度为0.25mg/mL的抗IgG抗体(2.5mL；Bethyl，A80-104A)、抗IgM抗体(2.5mL；Bethyl，A80-100A)、RBD蛋白(2.5mL；莱克制药，46438)或SARS-CoV(目录号40634-V08B)和MERS-CoV(目录号40069-V08B)，或缓冲液中浓度为1mg/mL的抗IgG纳米抗体(Chromotek，购买srbAF488-1-100作为AF488标记的样品，以及srbGCys2-1-500用于使用NCP311-Tb进行标记)，或S蛋白(2.5mL；Lake Pharma，46328)以0.5mL每级分洗脱交换到pH 8.5的100mM碳酸钠缓冲液、0.05％吐温-20去污剂中。将含有蛋白质的级分汇集，浓度为0.5-1mg/mL，并加入适当体积的NCP311-Tb(1mM，在二甲基乙酰胺(DMAc)中)或BODIPY-NHS(10mM，在DMSO中)，以获得约4-5倍NCP311-Tb(参见PCT专利公开号WO 2020/086629，通过引用并入本文)或3倍抗IgG纳米抗体的摩尔比，纳米体的最终标记度为1或6倍BODIPY对抗体。BODIPY-NHS可从许多商业来源购得，例如Thermo Fisher(D2184)和Abcam(ab146451)。用于本发明的NCP311-Tb的替代物是可商购的，例如来自Thermo Fisher(Lanthascreen铽NHS；PV3578)，来自CisBio(铽穴合物；62TBSPEA)和Perkin Elmer(DELFIATRF试剂；AD0009)。

NCP311-Tb的结构

将反应混合物短暂涡旋，并在室温下静置1小时。为了纯化标记的缀合物，使用PD-10脱盐柱并按照制造商的协议使用0.5毫升洗脱级分，将标记反应缓冲液交换为50mM磷酸钠缓冲液pH7.4，137mM氯化钠，0.05％TWEEN-20去污剂。将含有蛋白质的级分汇集并在液氮中快速冷冻，浓度为0.4-0.6mg/mL，并储存在-80℃。

蛋白质缀合物的校正的A₂₈₀值(A_280，corr)是借助Nanodrop(0.1cm路径长度)通过测量A₂₈₀和A₃₄₀，使用公式1来确定的：

A_280，corr＝A₂₈₀-(A₃₄₀×cf) (1)

其中cf是Tb复合物对A₂₈₀贡献的校正因子，等于0.157。

使用等式2确定蛋白质缀合物的浓度c_ab(M)：

其中ε是A₂₈₀处的抗体消光系数，对于标准IgG类别等于210,000M^-1cm^-1，对于抗IgG纳米抗体等于24,075M^-1cm^-1，对于RBD等于80,200M^-1cm^-1，对于S蛋白等于240,000M^-1cm^-1，而b是以cm为单位的路径长度(0.1cm)。使用等式3确定与蛋白质共价结合的Tb复合物c_Tb(M)的浓度：

其中，ε是A₃₄₀处的复消光系数，等于22,000M^-1cm^-1，b是以cm为单位的路径长度(0.1cm)。使用等式4计算标记度(DOL)：

受体结合结构域的TR-FRET测定

将CR3022 IgG/IgM/IgA1抗体的滴定或测试的人血清样品的稀释物加入到测定混合物中，在含有PBS、0.05％吐温-20(Sigma Aldrich P9416)的缓冲液中具有15nM Tb标记的RBD和250nM BODIPY标记的抗IgG/IgM/IgA的最终浓度。血清样品在含有50mM Tris pH8.0、140mM NaCl、0.05％吐温-20和1％ BSA的缓冲液(Cell Signaling Technology9998S)中稀释。TR-FRET测定在384孔板(Corning，4514)中以15μL最终测定体积进行。在进行TR-FRET测量之前，将反应在室温(RT)下孵育1小时。在337nm处激发铽荧光后，记录490nm(铽)和520nm(BODIPY)的发射，在130μs内延迟70μs以减少背景荧光，并使用PHERAstar FS酶标仪(BMG Labtech)对每个数据点的反应进行>20或>100秒的循环。通过计算520/490nm比值提取每个数据点的TR-FRET信号。

SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV的刺突蛋白的TR-FRET测定

将CR3022 IgG/IgM/IgA1抗体的滴定或测试的人血清样品的稀释物加入到测定混合物中，所述测定混合物在含有PBS、0.05％吐温-20(Sigma Aldrich P9416)的缓冲液中具有最终浓度为7.5nM Tb-标记的SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV的S蛋白和250nMBODIPY-标记的抗-IgG/抗-IgM/抗-IgA或AF488-抗-IgG-纳米抗体。在另一种设置中，以7.5nM Tb抗IgG纳米抗体、250nM BODIPY-S的最终浓度进行滴定。血清样品在含有50mMTris pH 8.0、140mM NaCl、0.05％ Tween-20和1％ BSA(细胞信号技术9998S)的缓冲液中稀释。TR-FRET测定在384孔微孔板(Corning，4514)中以15μL最终测定体积进行。在进行TR-FRET测量之前，将反应在室温下孵育1小时。在337nm处激发铽荧光后，记录490nm(铽)和520nm(BODIPY/AF488)的发射，在130μs内延迟70μs以减少背景荧光，并使用PHERAstar FS酶标仪(BMG Labtech)对每个数据点的反应进行>20或>100秒的循环。通过计算520/490nm比值提取每个数据点的TR-FRET信号。

核衣壳蛋白的TR-FRET测定

将测试的人血清样品稀释物加入到测定混合物中，所述测定混合物在含有PBS、0.05％ Tween-20(Sigma Aldrich P9416)的缓冲液中具有最终浓度为20nM的生物素化的N蛋白、24nM的链霉亲和素-Tb和250nM的BODIPY标记的抗IgG。血清样品在含有50mM Tris pH8.0、140mM NaCl、0.05％吐温-20和1％BSA(细胞信号技术9998S)的缓冲液中稀释。TR-FRET分析在384孔板(Corning，4514)中以15μL最终测定体积进行。将生物素化的N蛋白和链霉亲和素-Tb预混合并在室温下孵育10分钟。在进行TR-FRET测量之前，将反应在室温下孵育1小时。在337nm激发铽荧光后，记录490nm(铽)和520nm(BODIPY)处的发射，在130μs内延迟70μs以减少背景荧光，并使用PHERAstar Fs酶标仪(BMG Labtech)对每个数据点的反应进行>20或>100秒的循环。通过计算520/490nm比值提取每个数据点的TR-FRET信号。

刺突蛋白的ELISA测定

ELISA测定在384孔板(Thermo Fisher#464718)中进行，该板在室温下用50μL/孔的500ng/mLSARS-CoV-2S蛋白的包被缓冲液(每100mL Milli-Q H₂O 1粒碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液胶囊(Sigma#C3041100CAP))包被30分钟。然后使用Tecan自动洗板机，用100μL/孔的洗涤缓冲液(0.05％吐温-20，400mM NaCl，50mM Tris pH 8.0，在Milli-Q H₂O中)洗涤板3次。通过加入100μL/孔的封闭缓冲液(1％ BSA，140mM NaCl，50mM Tris pH 8.0，在Milli-QH2O中)在室温下封闭板30分钟。然后如上所述洗涤平板。在添加到孔中之前，将样品稀释至50μL体积(在稀释缓冲液中；1％ BSA、0.05％ Tween-20、140mM NaCl、50mM Tris(pH8.0)在Milli-Q H₂O中)，并在37℃下孵育30分钟。然后如上所述将板洗涤5次。在添加到孔中之前，将检测抗体溶液稀释至50μL/孔的体积(HRP-抗人IgG Bethyl Laboratory#A80-104P)，并在室温下孵育30分钟。然后如上所述将平板洗涤5次。然后将TMB过氧化物酶底物(40微升/孔；Thermo Fisher#34029)加入孔中，并在室温下孵育3分钟(IgG)。通过向每个孔中加入40μL/孔的终止溶液(在Milli-Q H₂O中的1M H₂SO₄)来终止反应。在450nm和570nm处用Pherastar FSX酶标仪读取OD。通过从450nm信号中减去570nm背景来计算分析中使用的最终数据。

N蛋白的ELISA测定

ELISA测定在384孔板(Thermo Fisher#464718)中进行，该板在室温下用50μL/孔的500ng/mLSARS-CoV-2N蛋白的包被缓冲液(每100mL Milli-Q H₂O 1粒碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液胶囊(Sigma#C3041100CAP))包被30分钟。然后使用Tecan自动洗板机，用100μL/孔的洗涤缓冲液(0.05％吐温-20，400mM NaCl，50mM Tris pH 8.0，在Milli-Q H₂O中)洗涤板3次。通过加入100μL/孔的封闭缓冲液(1％ BSA，140mM NaCl，50mM Tris pH 8.0，在Milli-QH2O中)在室温下封闭板30分钟。然后如上所述洗涤平板。在添加到孔中之前，将样品稀释至50μL体积(在稀释缓冲液中；1％ BSA、0.05％ Tween-20、140mM NaCl、50mM Tris(pH8.0)在Milli-Q H₂O中)，并在37℃下孵育30分钟。然后如上所述将板洗涤5次。在添加到孔中之前，将检测抗体溶液稀释至50μL/孔的体积(HRP-抗人IgG Bethyl Laboratory#A80-104P),并在室温下孵育30分钟。然后如上所述将平板洗涤5次。然后将TMB过氧化物酶底物(40微升/孔；Thermo Fisher#34029)加入孔中，并在室温下孵育3分钟(IgG)。通过向每个孔中加入40μL/孔的终止溶液(在Milli-QH₂O中的1M H₂SO₄)来终止反应。在450nm和570nm处用Pherastar FSX酶标仪读取OD。通过从450nm信号中减去570nm背景来计算分析中使用的最终数据。

统计

使用Prism 8.0.2和R v3.6.1；packages ggplot2进行统计计算。相关图包括使用R v3.6.1geom_smooth函数以广义线性模型计算(glm方法)的置信区间进行几何平滑。如果值超过平均值(健康)+3标准差(健康)阈值，则ELISA IgG或TR-FRET IgG中的样品被分类为阳性。

实施例2：检测SARS-CoV-2抗体的TR-FRET测定的开发

开发了基于TR-FRET检测的均相血清学测定，用于检测人血浆/血清中的SARS-CoV-2抗体(图5A)。该测定允许简单的混合和读取方案，可轻松实现可扩展的自动化(图5B)。该测定基于对三元复合物的检测，该复合物包含供体荧光团标记的抗原和受体荧光团标记的检测抗体，识别由血清免疫球蛋白启动(图5A)。供体(铽)和受体(BODIPY)荧光团的接近导致阳性FRET信号，该信号以520nm(受体)/490nm(供体)比率读出，并允许以免疫球蛋白同种型特异性方式准确定量血清抗体。

为了实现灵敏的检测，背景信号的最小化和特定信号的同时优化是至关重要的，尤其是因为均相测定形式缺乏任何信号放大。首先，建立了TR-FRET测定形式可以检测免疫球蛋白变体IgG、IgM和IgA1与SARS-CoV-2抗原的结合(图5C)。重组表达SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，并用铽-NHS或BODIPY-NHS检测抗体(抗-IgG、抗-IgM、抗-IgA1)标记，这些抗体是商业获得的，也用铽-NHS或BODIPY-NHS标记。SARS-1IgG抗体CR3022被重组表达并与SARS-CoV-2的RBD(Kd为9.1±0.66nM，图10A)以及含有CR3022可变区的IgM和IgA1发生交叉反应(Tian et al.,2020Emerg.Microbes Infect.,9:382-385)。

通过添加标记的RBD和标记的检测抗体的混合物来改变供体和受体荧光团的位置(在RBD或检测抗体上)，进行CR3022(IgG、IgM、IgA1)的滴定(图10B，10C)。虽然所有组合都导致功能性读数(图10D、10E)，但当在血清或血浆样品中进行时，检测抗体信号在整个免疫球蛋白库中被稀释，这导致信号损失(图10F、10G)。为了优化，抗原用铽标记，检测抗体用BODIPY标记，得到IgG/IgM/IgA1的定量结合曲线(图5C)。由于前带效应，结合曲线呈现特征性的钟形(Ha等人，2016Cell Rep.，16:2047)，这可以通过数学模型准确地解释(Douglass等人，2013J Am Chem Soc，135:6092-6099)。

接下来，确定了CR3022可以类似地在人血清中检测到(图5D)。虽然信号急剧减少，但低背景水平允许精确定量。在测定条件的优化过程中，用全长SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)代替RBD显著降低了背景，特别是在存在血清的情况下。这可能是由于1)全S蛋白的三聚体性质导致亲合力效应，和2)RBD暴露的表面在全长的S蛋白中被屏蔽，其导致非特异性的相互作用。

使用刺突蛋白继续进一步验证，随后优化抗原和检测抗体的浓度(图11A、11B)。使用优化的浓度，证实恢复期血清导致TR-FRET信号的剂量依赖性反应(图11C)。

实施例3：均相的TR-FRET测定可以检测患者血清中的IgG

在优化测定条件后，测试了从康复患者(CoV2+)和疫情前阴性对照血清(健康)中获得的血清中抗体的检测。组装一组49个PCR测试阳性和28个PCR测试阴性的血清样品(下文称为96w_测试组)。使用刺突蛋白进行ELISA作为参照(图6A)。对96w_测试组以1∶100的初始血清稀释度进行TR-FRET测定，以匹配精确的ELISA浓度(图6B)。当以基于远离健康对照平均值的3个标准偏差的截止值进行测量时，TR-FRET实现了94.87％的灵敏度和100％的特异性，这与实现100％的灵敏度和96.55％的特异性的ELISA相当。观察到TR-FRET和ELISA测定之间的强相关性(图11C)。虽然TR-FRET和ELISA对CoV2+和CoV2-的区分相当，但与TR-FRET相比，尤其是对于低反应者，ELISA具有明显更强的信号。这很可能是由于与TR-FRET的平衡结合相比ELISA是一种信号放大测定，并且ELISA被TR-FRET的低背景噪声所抵消。用96w_测试组使用1:150、1:100和1:50的稀释因子再次进行测定。观察到增加血清浓度提高了性能而不损害背景噪声(图6C，6D)。当与ELISA比较时，所有浓度对Cov2+和阴性血清具有等同或更好的区分(图6)。由于TR-FRET测定利用了铽对抗原的共价标记，因此对标记度(DOL)进行了优化，以确保不会发生表位掩蔽(图12A-12B)。相当于约3.8的DOL在最佳信号下没有提供可检测的表位掩蔽。所有其它的实验都使用约等于3.8的DOL。

实施例4：TR-FRET测定可以准确地检测血清转化

TR-FRET测定用于检测更大样品组中的血清转化，该样品组包含68份SARS-CoV-2PCR阳性样品(CoV2+)和100份疫情前阴性样品(健康)(以下称为BWH组)。这些样品也使用已建立的ELISA测定法进行分析。与之前的观察一致，健康对照的标准偏差非常低，并且当使用基于健康对照的3个标准偏差的截止值时，以100％特异性和100％灵敏度实现了CoV2+和健康样品之间的准确区分(图7A)。为了直接比较，对相同的样品组进行已建立的ELISA测定(图7B)，其给出了可比较的结果。TR-FRET和ELISA测定之间的单个样品的反应具有很好的相关性(图7C)。

实施例5：TR-FRET测定的分析检测限(LoD)

为了评估TR-FRET测定的检测限(LoD)，在存在和不存在阴性对照血清的情况下，以1∶150血清对缓冲液稀释度进行对照抗体CR3022 IgG的滴定(图8A)。前带效应在较高浓度的抗体下清晰可见，并且在血清存在下信号强度降低。选择信号高于平均值+3标准差的CR3022抗体的最低浓度，以建立LoD。在存在和不存在血清的情况下，将20个重复与空白对照的20个重复进行比较(图8B)。基于此，在没有血清的情况下，TR-FRET测定的LoD被确定为1.22ng/mL，在有血清的情况下为39ng/mL，这与ELISA测定的32ng/mL 21LoD相当。

实施例6：评估TF-FRET测定的测定内和测定间精度

去除清洗步骤并减少样品处理步骤的总数将产生高的再现性和可重复性。为了评估TR-FRET测定的测定内和测定间精度，选择了一组阳性反应者和阴性对照样品(总共68个)。由三名操作者在三个不同的日期进行分析(图13A-13B)。操作者之间的相关性高于99.6％，其中平均重复性为4.31％，不同日期和操作者之间的总体精度为5.72％，这完全在所需范围内。

实施例7：TR-FRET测定可以快速扩展到其他SARS-CoV-2抗原

在建立刺突蛋白的血清学试验后，评估TR-FRET设置是否与其他抗原相容。刺突蛋白是SARS-CoV-2血清学测定中最广泛研究的抗原之一，但还存在其他高度免疫原性的SARS-CoV-2蛋白(Dutta et al.,2020J Virol.,94)，例如在病毒颗粒内部结合病毒RNA的高度丰富的核衣壳蛋白(N蛋白)(Lu et al.,2020Lancet,395:565-574；Narayanan etal.,2003J Virol,77:2922-2927)。

建立了N蛋白TR-FRET IgG检测测定(此后命名为N TR-FRET)。使用相同的TR-FRET设置，其中供体荧光团在抗原上，受体荧光团在IgG抗体上。商购获得生物素化的N蛋白，并用铽-链霉亲和素缀合物标记。将康复者CoV2+血清滴定至生物素化N蛋白、Tb-链霉亲和素和BODIPY-IgG，以验证该测定。观察到剂量反应，在较低稀释度(1∶50)下存在强信号，这与我们的刺突蛋白TR-FRET测定一致(图14)。

对96w_测试组进行N TR-FRET，得到97.56％的灵敏度和96.55％的特异性(图9A)。有趣的是，N TR-FRET的TR-FRET信号强度超过了S TR-FRET测定的信号强度(图9B)。比较96w_测试组的刺突蛋白TR-FRET和N TR-FRET读数，得出Pearson相关系数为0.47。这表明这两种测定是高度正交的，并且当组合时可能提供关于血清学状态的额外信息(图9B)。

实施例8：使用干燥全血样品的TR-FRET测定

使用干燥的全血样品(N＝175)证明了TR-FRET IgG-S测定的稳健性。在TR-FRET结果中观察到血清和全血样品类型(Neoteryx)背景信号的低可变性，这是TR-FRET测定的一个标志，但在ELISA测量中却不是这样，在ELISA测量中，全血样品的背景可变性显著增加(图15-图17)。这些结果导致ELISA测定中信噪比和Z’的降低，而TR-FRET测定的性能没有改变(图17)。

实施例9：TR-FRET测定可以快速扩展到其他抗原

已经建立了S蛋白的血清学试验，可以确定TR-FRET设置是否与其他抗原相容。S蛋白或S-RBD是SARS-CoV-2血清学试验中最广泛使用的抗原，但也存在其他高度免疫原性的SARS-CoV-2蛋白，如大量的核衣壳蛋白(N蛋白)，它与病毒颗粒内的病毒RNA结合。利用与之前相同的TR-FRET设置，建立了N蛋白TR-FRET IgG检测测定(此后命名为N TR-FRET)，其中供体荧光团在抗原上，受体荧光团在αIgG抗体上。将N蛋白从昆虫细胞中表达，生物素化并使用铽-链霉亲和素(Tb-SA)缀合物标记抗原。为了验证测定设置，将康复者CoV2+血清滴定到生物素化的N蛋白、Tb-SA和BODIPY-αIgG。观察到在1:150的稀释度下存在强信号的剂量反应，与S蛋白TR-FRET一致(图26A)。接下来，对96w_测试组进行N TR-FRET，其得到80.0％的灵敏度和96.6％的特异性(图26B)。

为了进一步评估已建立的IgG S和N TR-FRET测定的性能，使用了来自MassCPR协会的更大样品组，其中包括100个SARS-CoV-2RT-PCR阳性样品(CoV2+)，以及来自Dana-Faber Cancer Institute Bio Bank的90个疫情前对照(健康，CoV2-)，此后命名为MassCPR组。使用建立的平均值(健康)+3SD(健康)截止值，建立的TR-FRET测定性能对于S抗原分别具有97.1％的灵敏度和97.8％的特异性，对于N抗原分别具有95.2％的灵敏度和98.9％的特异性(图25A和图25B)。使用ELISA的类似结果得到对S抗原95.2％的灵敏度和97.8％的特异性以及对N抗原94.3％的灵敏度和98.9％的特异性(图26D和图26E)。在S和N测定中，TR-FRET显示出比ELISA更高的灵敏度(S TR-FRET为97.1％，S ELISA为95.2％，N TR-FRET为95.2％，N ELISA为94.3％)，具有相同的特异性。如之前使用MGB组所见，对于ELISA读数注意到了信号的“最高限度”而TR-FRET测定具有增加的动态范围(图25C和图25D)。MassCPR样品组的临床入院状态表明19名患者被送入急诊室(ER)，76名住院患者(IP)和5名门诊患者(OP)。没有观察到各组之间IgG S抗体滴度的显著差异(图25E)。记录了自上次SARS-CoV-2测试阳性以来的天数，在14-30天期间，IgG水平变化无显著趋势(图25F)，这与以前报道的纵向研究一致，其中S IgG水平在感染后14天稳定。比较MassCPR和96w_测试组的S和N TR-FRET读数得到96w_测试组的Pearson相关系数为0.37(图26C)和MassCPR的Pearson相关系数为0.22(图25G)，表明这两种分析是部分正交的，并且当组合时可能提供关于血清学状态的额外信息，这与在其他研究中发现的结果一致(图25G和图26C)。刺突蛋白在SARS-CoV-2和SARS-CoV之间具有高度的序列相似性，与MERS-CoV也有较小程度的序列相似性，这可导致抗体反应中的交叉反应性。以类似于SARS-CoV-2S TR-FR测定的方式，建立了用于SARS-CoV和MERS-CoV的基于S的IgG检测测定并使用MassCPR样品组进行了测试。如预期的，观察到SARS-CoV-2和SARS-CoV之间的交叉反应性(图25H)，但是与MERS-CoV的交叉反应性非常有限(图25I)。这再次与使用这些抗原的以前的观察结果一致，并证明了TR-FRET测定与ELISA和其他形式的测定相似，交叉反应性或敏感性很大程度上取决于抗原的选择。在测试的CoV2+样品中，约有6％的样品被鉴定出具有高滴度的针对MERS-CoV S的IgG抗体。

所有专利出版物和非专利出版物都表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。

所有这些出版物均以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出以引用的方式并入。

尽管本文已经参照特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，这些实施方案仅仅是本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对说明性实施方案进行许多修改，并且可以设计出其他配置。

序列表

<110> 丹娜-法伯癌症研究公司

通用医疗公司

Fischer, Eric

Nowak, Radoslaw

Yue, Hong

Overwigan, Daan

Mazitschek, Ralph

Payne, Connor

<120> 用于检测血清学样品中的抗体的基于TR-FRET的分析

<130> 52095-707001WO

<140> 尚未指定

<141> 2021-08-16

<150> US 63/066,632

<151> 2020-08-17

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1356

<212> PRT

<213> 人类冠状病毒

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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130 135 140

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<213> 人类冠状病毒

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Lys His Glu Met Gln Lys Pro Arg Trp Lys Arg Gln Pro Asn Asp Asp

245 250 255

Val Thr Ser Asn Val Thr Gln Cys Phe Gly Pro Arg Asp Leu Asp His

260 265 270

Asn Phe Gly Ser Ala Gly Val Val Ala Asn Gly Val Lys Ala Lys Gly

275 280 285

Tyr Pro Gln Phe Ala Glu Leu Val Pro Ser Thr Ala Ala Met Leu Phe

290 295 300

Asp Ser His Ile Val Ser Lys Glu Ser Gly Asn Thr Val Val Leu Thr

305 310 315 320

Phe Thr Thr Arg Val Thr Val Pro Lys Asp His Pro His Leu Gly Lys

325 330 335

Phe Leu Glu Glu Leu Asn Ala Phe Thr Arg Glu Met Gln Gln Gln Pro

340 345 350

Leu Leu Asn Pro Ser Ala Leu Glu Phe Asn Pro Ser Gln Thr Ser Pro

355 360 365

Ala Thr Val Glu Pro Val Arg Asp Glu Val Ser Ile Glu Thr Asp Ile

370 375 380

Ile Asp Glu Val Asn

385

<210> 7

<211> 419

<212> PRT

<213> 人类冠状病毒

<400> 7

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 8

<211> 362

<212> PRT

<213> 人类冠状病毒

<400> 8

Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro

1 5 10 15

Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg

20 25 30

Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser

35 40 45

Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu

50 55 60

Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg

115 120 125

Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser

130 135 140

Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala

145 150 155 160

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys

165 170 175

Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys

180 185 190

Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr

195 200 205

Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln

210 215 220

Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp

225 230 235 240

Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala

245 250 255

Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

260 265 270

Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln

340 345 350

Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

355 360

Claims (45)

1.一种用于检测患者液体样品中的抗β冠状病毒(β-CoV)抗体的均相的、基于TR-FRET的方法，其包括从患者获得体液样品；将所述体液样品与第一试剂和第二试剂接触，从而形成测定混合物，其中所述第一试剂和第二试剂中的每一种都结合β-CoV抗体(第一抗体)，其中所述第一试剂包含β-CoV抗原的第一亚群，所述第二试剂包含β-CoV抗原的第二亚群，其中所述β-CoV抗原的第一亚群和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记，或者其中所述第一试剂包含β-CoV抗原，所述第二试剂包含结合所述第一抗体的第二抗体或纳米抗体，并且其中所述第一试剂和第二试剂用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记；以及检测FRET信号，其中检测到FRET信号表明所述体液样品中存在包括β-CoV抗体的第一亚群的第一试剂，并且可诊断为β-CoV感染。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品包括全血、血清或血浆。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光团是镧系金属或其复合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述镧系金属是铽(Tb)或铕(Eu)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中供体荧光团是铽或铕的螯合物或穴合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述供体荧光团是铽。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受体荧光团选自由如下组成的组：有机硼荧光染料、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青、方酸菁、香豆素、脯氨酸、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、6-氨基-9-(5-((氨基甲基)氨基甲酰基)-2-羧基苯基)-3-亚胺基-3H-呫吨-4,5-二磺酸钠、2-[5-[3,3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺丙基)吲哚-1-鎓-2-基]五-2，4-亚二烯基]-3-甲基-3-[5-氧代-5-(6-膦酰氧基己基氨基)戊基]-1-(3-磺丙基)吲哚-5-磺酸(ALEXA647)和硝基苯并噁二唑。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述受体荧光团是有机硼染料。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述有机硼染料是硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述β-CoV抗原包括β-CoV刺突蛋白或其抗原性片段。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述刺突蛋白包含刺突蛋白亚基1(S1)、刺突蛋白亚基2(S2)或受体结合结构域(S1-RBD)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-CoV抗原包括β-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)或其抗原片段。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含β-CoV抗原的第一亚群，所述第二试剂包含β-CoV抗原的第二亚群，其中所述β-CoV抗原的所述第一和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含所述β-CoV抗原，且所述第二试剂包含结合所述第一抗体的第二抗体或纳米抗体，且其中所述第一试剂和所述第二试剂用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含供体荧光团，所述第二试剂包含受体荧光团。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含受体荧光团，所述第二试剂包含供体荧光团。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二试剂结合特定类别的人类抗体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二试剂包括抗IgG抗体或抗IgG纳米抗体。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二试剂包括抗IgM抗体或抗IgM纳米抗体。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二试剂包括抗IgA抗体或抗IgA纳米抗体。

21.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二试剂包括结合特定亚型的人类抗体的抗体或纳米抗体。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述供体荧光团是浓度为约1.75nM至约30nM的铽，所述受体荧光团是浓度为约50nM至约1μM的BODIPY，所述浓度相对于15μL的测定混合物的体积。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述Tb的浓度为约7.5nM。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述Tb的浓度为约15nM。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述BODIPY的浓度为约250nM。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光团是浓度为约1.75nM至约30nM的铽，所述受体荧光团是浓度为约50nM至约1μM的BODIPY，所述第一和第二试剂中的至少一种是全长刺突蛋白，所述浓度为相对于15μL的测定混合物的体积。

27.根据权利要求26所述的方法，其中BODIPY的浓度为约250nM。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光团是Eu，且所述受体是ALEXA647。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其检测抗急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS CoV-1)抗体。

30.根据权利要求1到28中任一项所述的方法，其检测抗急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS CoV-2)SARS CoV-2抗体。

31.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其检测抗中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)抗体。

32.一种用于检测患者液体样品中抗β-CoV抗体的均相的、基于TR-FRET的方法的测定试剂盒，其包括:

a)分别包含β-CoV抗原的第一亚群和β-CoV抗原的第二亚群的第一和第二试剂，其中所述第一和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记，其中所述第一和第二试剂可以置于相同或不同的容器中；或者

b)包含β-CoV抗原的第一试剂和包含结合所述抗β-CoV抗体的至少一种第二抗体或纳米抗体的第二试剂，其中所述第一和第二试剂用供体荧光团和受体荧光团差异化标记；和

c)在用于检测患者液体样品中的抗β-CoV抗体的均相的、基于TR-FRET的方法中使用所述试剂的印刷说明书。

33.根据权利要求32所述的测定试剂盒，其中所述供体荧光团是镧系金属或其复合物。

34.根据权利要求33所述的测定试剂盒，其中所述镧系金属是铽或铕。

35.根据权利要求32所述的测定试剂盒，其中所述供体荧光团是铽或铕的螯合物或穴合物。

36.根据权利要求34所述的测定试剂盒，其中所述供体荧光团是铽。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的测定试剂盒，其中所述受体荧光团选自由如下组成的组：有机硼荧光染料、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青、方酸菁、香豆素、脯氨酸、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、6-氨基-9-(5-((氨基甲基)氨基甲酰基)-2-羧基苯基)-3-亚胺基-3H-呫吨-4,5-二磺酸钠和硝基苯并噁二唑，以及2-[5-[3，3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺丙基)吲哚-1-鎓-2-基]五-2,4-亚二烯基]-3-甲基-3-[5-氧代-5-(6-膦酰氧基己基氨基)戊基]-1-(3-磺丙基)吲哚-5-磺酸(ALEXA647)。

38.根据权利要求37所述的测定试剂盒，其中所述受体荧光团是有机硼染料。

39.根据权利要求38所述的测定试剂盒，其中所述有机硼染料是硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)。

40.根据权利要求32-39中任一项所述的测定试剂盒，其中所述β-CoV抗原包括β-CoV-2刺突蛋白或其抗原性部分。

41.根据权利要求40所述的测定试剂盒，其中所述刺突蛋白包含刺突蛋白亚基1(S1)、刺突蛋白亚基2(S2)或受体结合结构域(S1-RBD)。

42.根据权利要求32-41中任一项所述的测定试剂盒，其中用供体荧光团标记的β-CoV抗原和用受体荧光团标记的β-CoV抗原置于相同的容器中。

43.根据权利要求32-42中任一项所述的测定试剂盒，其中用供体荧光团标记的β-CoV抗原和用受体荧光团标记的β-CoV抗原置于不同的容器中。

44.根据权利要求32-43中任一项所述的测定试剂盒，其包含第一组第一和第二试剂，所述第一和第二试剂分别包含β-CoV抗原的第一亚群和β-CoV抗原的第二亚群，其中所述第一和第二亚群用供体荧光团和受体荧光团进行差异化标记，其中所述第一和第二试剂可置于相同或不同的容器中，和第一另外的容器，其中设置有不同的第二试剂，所述不同的第二试剂包含结合所述抗β-CoV抗体并被所述供体荧光团标记的至少一种第二抗体或纳米抗体。

45.根据权利要求44所述的测定试剂盒，其进一步包括第二另外的容器，其中设置有第二试剂，所述第二试剂包含结合所述抗β-CoV抗体并被所述受体荧光团标记的所述至少一种第二抗体或所述纳米抗体。