KR102089268B1

KR102089268B1 - 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 한탄바이러스 검출 방법

Info

Publication number: KR102089268B1
Application number: KR1020190122403A
Authority: KR
Inventors: 류정상; 박은미; 오새진; 임희영; 이예지; 정선희; 이주연; 임아람
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2020-03-16

Abstract

본 발명은 한탄바이러스의 절단된(truncated) 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하는 혈청학적 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.

Description

한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 한탄바이러스 검출 방법{A METHOD FOR DETECTING HANTAAN VIRUS USING HANTAAN VIRUS TRUNCATED NUCLEOCAPSID PROTEIN}

본 발명은 한탄바이러스의 절단된(truncated) 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하는 신증후군출혈열 혈청학적 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.

신증후군출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)은 신부전, 출혈, 혈소판감소증, 쇼크를 특징으로 하는 급성 발열질환으로, 한타바이러스(Hantaviridae) 과의 오르쏘한타바이러스(Orthohantavirus) 속에 속하는 한탄(Hantaan), 서울(Seoul), 도브라바(Dobrava), 푸말라(Puumala) 바이러스 등의 여러 종의 바이러스 감염에 의해 유발된다. 지역마다 분포하는 바이러스의 종에 차이가 있지만, 중국, 러시아 등 동북아시아와 스칸디나비아 반도, 유럽, 북아메리카 등 세계적인 분포를 보이며, 연간 전세계에서 150,000여명의 신증후군출혈열 환자가 발생한다. 오르쏘한타바이러스속 바이러스 속 중 한탄바이러스는 한국, 중국, 러시아 등에 분포하며, 한국에서 발병하는 신증후군출혈열의 약 70%의 원인이 되고 있으며, 이외에 서울바이러스가 발병 원인이 되기도 한다.

한국에서 발생하는 신증후군출혈열 환자의 수는 매년 약 400명 내외로, 바이러스가 감염된 설치류의 타액, 소변, 분변 등을 통해 전파되는 질병 특성상, 야외 활동이 빈번할수록 감염에 노출될 가능성이 크며, 생활환경의 영향이 크다. 그러나, 최근 약 10년 동안의 국내 발생 현황에 따르면 생활환경의 개선과 백신접종에도 불구하고 환자 및 사망자가 꾸준히 발생하고 있어 체계적인 감시를 위한 진단법의 개발이 필요하다.

기존에 사용되고 있는 IgG 간접면역형광항체법(IFA) 진단은 민감도가 낮으며, 결과 판독이 실험자의 검경으로 이루어져 객관성이 결여되는 점이 있고, 비특이 반응에 의한 위양성이 많고, 민감도도 낮으며, 쯔쯔가무시증, 중증열성혈소판감소증 등과 같은 유사 질병과 교차 반응이 일어날 가능성이 있다. 특히 쯔쯔가무시증은 신증후군출혈열, 렙토스피라증과 함께 우리나라의 3대 가을철 발열성질환의 하나이며, 매년 수천명의 환자가 발생하기 때문에 신증후군출혈열 진단시 감별진단이 매우 중요하다. 상용화되어 있는 IgG ELISA의 경우, 민감도가 높으며, 객관적 수치를 통한 판단이 가능하나, 역시 위양성, 위음성 구별에 문제가 있으며, 교차반응 판별이 불가하다. 따라서 새로운 진단 방법이 필요하지만, 진단제제 관련 연구 및 생산이 경제성 등의 이유로 이루어지지 않고 있어 계속해서 간접면역형광항체법을 통한 진단이 이루어지고 있는 실정이다.

한국특허 공개번호 제10-2002-0083196호에는 한탄바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 이용한 신증후군출혈열의 진단키트에 관한 내용이 개시되고 있으나, 상기 문헌에서 제공한 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 ELISA는 기존의 항원을 이용한 ELISA보다 혈청 역가가 낮고, 특히 쯔쯔가무시 등 질병에 대한 교차반응성에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다. 따라서 여전히 민감도, 특이도 및 교차반응성 등이 개선된 진단 방법에 대한 요구가 존재한다. 이에 따라, 신증후군출혈열 진단 능력을 향상시키기 위한 지속적인 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하였다.

한국특허 공개번호 제10-2002-0083196호

신증후군출혈열에 대한 기존의 혈청학적 진단법은 객관성의 결여, 위양성, 또는 교차반응의 한계를 나타내고 있으므로 이를 극복할 수 있는 효과적인 진단의 필요성이 있다.

따라서 본 발명은 신증후군출혈열의 효과적인 진단을 위하여 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 단편을 이용한 한탄바이러스 검출 방법 및 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편을 포함하는 단백질을 검출용 항원으로 이용하여 민감도 및 특이도가 높고, 교차반응률이 낮은 Indirect ELISA 진단 방법 및 진단 키트를 제공하고자 한다.

본 발명은 한탄바이러스 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편, 즉, 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 한탄바이러스의 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 한탄바이러스 검출용 키트에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편, 즉, 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 한탄바이러스 검출용 키트를 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 1 내지 117번 위치의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것이거나, 또는 상기 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 또는 검출용 키트는 한탄바이러스를 면역분석 방법에 따라 검출하여 한탄바이러스에 의한 감염 여부를 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은, 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 효소결합면역측정법(ELISA), 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피(immunochromatography) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 검출 방법 또는 검출 키트는 효소결합면역측정법(ELISA), 보다 바람직하게는, 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)을 이용할 수 있다. 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)에 관한 구체적 실시태양에서, 본 발명의 절단형 단백질이 코팅된 플레이트의 각 웰에 검체의 혈청, 예를 들어, 신증후군출혈열 의심환자로부터 채취된 혈청을 반응시킨 후 세척하여 상기 절단형 단백질인 검출용 항원에 결합하지 않은 요소들을 제거한 후, 검출 표지와 접합한 2차 항체를 반응시킨 다음 세척하여, 검출용 항원인 절단형 단백질, 검체의 혈청 내 한탄바이러스 항체, 및 검출 표지와 접합한 2차 항체가 특이적으로 결합한 복합체를 얻은 후, 반응 기질을 각 웰에 처리하여 발색 반응을 측정하는 것을 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)을 이용한 본 발명의 검출 방법은

(a) 상기 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 검출용 항원으로 하고, 검사대상시료를 고체상 지지체에 고정된 상기 검출용 항원과 반응시키는 단계;

(b) 한탄바이러스 항체에 특이적으로 결합하고 검출 표지와 접합된 2차 항체를, 상기 검사대상시료에 포함된 한탄바이러스 항체와 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 검사대상시료에 포함된 한탄바이러스 항체에 결합한 상기 2차 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계

를 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)을 위한 본 발명의 검출용 키트는 (a) 상기 절단형 뉴클레오캡시드 단백질; 및 (b) 한탄바이러스 항체에 특이적으로 결합하고 검출 표지와 접합된 2차 항체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 검사대상시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 채취되거나 분리된 것, 예를 들어, 혈액 또는 혈액 구성성분(blood constituent), 체액(bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 검출 표지의 구체적인 예로는 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 페록시다제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출 표지는 호스래디쉬 페록시다제(Horseradish peroxidase, HRP)이다.

본 발명의 검출 방법 또는 검출용 키트는 한탄바이러스의 감염으로 발생하는 질병 또는 질환, 바람직하게는 신증후군출혈열의 진단에 사용되는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 검출 방법 또는 검출용 키트는 쯔쯔가무시증, 중증열성혈소판감소증 등과 같은 유사 질병과 교차반응률이 낮다. 특히 본 발명의 검출 방법 또는 검출용 키트는, 한탄바이러스 전장 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 한탄바이러스를 검출하는 방법과 비교하여, 쯔쯔가무시증에 대한 교차반응률이 낮은 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한탄바이러스 검출용 키트에는 검체의 혈청을 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 재조합 항원 단백질 및 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스 항체의 존재유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.

상기 검출용 키트가 ELISA 용으로 개발되는 경우에는 플레이트 (또는 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질로 표면 코팅된 플레이트), 완충용액, 상기 검출 표지와 접합한 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

상기 발색 기질은 발색 효소로서 알칼리 포스파타아제를 이용하는 경우 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), BCIP/니트로 블루테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트, 또는 ECF 기질 등일 수 있고, 발색 효소로서 호스래디쉬 퍼옥시다제를 이용하는 경우 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), o-페닐렌디아민(OPD), 4-CN(4-chloro-1-naphthol), 또는 알파-나프톨피로닌 등일 수 있고, 발색 효소로서 글루코스 옥시다아제를 이용하는 경우 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등일 수 있다.

본 발명의 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 검출 항원으로 이용하는 검출 방법 또는 검출용 키트는 검사대상시료, 예를 들어, 목적 혈청 내 한탄바이러스 항체 유무를 효과적으로 확인할 수 있다.

특히, 본 발명의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 검출 항원으로 이용하여 Indirect ELISA를 실시하는 경우, 한탄바이러스 IgG 및 IgM의 민감도 및 특이도가 높아 우수한 진단 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 상기 Indirect ELISA는 유사 질병, 특히, 쯔쯔가무시병에 대한 교차반응성이 낮아 신증후군출혈열의 정확한 혈청학적 진단에 사용될 수 있다.

도 1은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 이의 절단형의 모식도를 나타낸다.
도 2 및 3은 유전자를 pET28a 벡터에 클로닝하여 재조합 후 E. Coli 균주에서 발현하여 정제한 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 다양한 농도에서 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질과 항체의 반응성을 확인하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 Indirect ELISA의 조건을 최적화하기 위해 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질의 농도에 따른 항체와의 반응 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명의 Indirect ELISA의 과정 및 최적 조건을 나타낸 모식도이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

Indirect ELISA의 검출용 항원 제조

본 발명의 Indirect ELISA의 검출용 항원으로서 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열번호 1의 위치 1 내지 117의 아미노산(서열번호 2)을 포함하는 절단형 뉴클레오캡시드 단백질(NP)을 제조하였다(도 1).

구체적으로, 상기 절단형 NP을 제조하기 위하여 이를 코딩하는 유전자를 pET28a 백터에 클로닝하고 이를 발현시킨 후 (E.Coli, 15.3 KDa), Ni-NTA chormatography로 정제하였다(도 2 및 3).

이하의 실시예에서 상기 절단형 NP의 검출 효능을 비교하기 위해, 한탄바이러스 전장 NP를 포함하는 시판중인 제품(Hantaan virus Nucleocapsid protein-His Taq, Sino biologiclal Inc.)을 대조군으로 사용하였다.

[실시예 2]

Indirect ELISA 최적화 조건 확인

절단형 NP(항원) 코팅 농도, 혈청 희석 농도, 및 HRP-접합된 항-인간 IgM/IgG의 희석 농도를 각각 변화시켜 Indirect ELISA 분석을 수행하여 최적화 조건을 확인하여, 그 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다. 구체적으로, 절단형 NP(항원) 2 μg/ml을 4℃에서 코팅하고, 1:200으로 희석된 혈청을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응 및 세척한 후, HRP로 표지된 2차 항체를 1:10k(IgG), 1:20k(IgM)로 희석시켜 실온에서 45분간 반응시키는 것을 최적화 조건으로 설정하였다(도 6). 이하에서 수행한 본 발명의 Indirect ELISA의 검증 및 적용 실험은 상기 조건에 따라 수행하였다.

[실시예 3]

민감도 및 특이도 분석

(1) 양성 검체 및 음성 검체의 분류

IFA법을 통해 총 116개의 검체의 한탄바이러스 혈청 역가를 확인하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 혈청 역가 1:512를 기준으로 하여 그 이상의 혈청 역가를 가진 검체를 양성으로 판정하였다. 혈청 역가 1:32 미만인 검체를 음성으로 판정하였다.

	실험에 사용된 검체 수
IgG IFA의 혈청 역가	2014년	2015년	2016년	Total
<1:32	10	7	6	23
1:32	5	3	8	16
1:64	6	7	7	20
1:128	3	8	10	21
1:256	4	3	5	12
1:512	3	0	3	6
1:1024	0	0	2	2
1:2048	0	0	2	2
>1:4096	8	2	4	14
Total	39	30	47	116

* 양성기준: IFA IgG 양성 혈청 역가 1:512 이상

(2) Cutoff Q 값 설정

위 (1)에서 음성으로 판정된 검체를 이용하여, cutoff Q 값을 설정하였다.

구체적으로, 음성 검체를 대상으로 절단형 NP 및 전장 NP를 이용하여 Indirect ELISA를 수행하였다. 대조군으로는 상용화된 PROGEN사의 ELISA를 사용하였다. 본 발명의 Indirect ELISA의 결과(Q) 값은 하기 계산식으로 도출하였다.

● Q = (한탄바이러스 NP로 코팅된 웰의 평균 OD 값 - 버퍼 만으로 코팅된 웰의 평균 OD 값) / 대조군(Reference control)의 평균 OD 값

얻어진 Q 값을 사용하여 cutoff Q 값을 다음과 같이 계산하였다.

● Cutoff Q 값 = 음성 검체의 Q값의 평균 + 표준편차Х3

이로부터 얻어진 각 실험군의 Cutoff Q값은 다음과 같다.

Indirect ELISA	전장 NP	절단형 NP
IgG	1.1	1.14
IgM	2.0	1.63

(3) Indirect ELISA의 민감도 및 특이도 평가

전장 및 절단형 NP를 이용하여 Indirect ELISA를 수행하였고, 대조군으로서 상용화된 PROGEN사의 ELISA를 사용하였다. 본 발명의 Indirect ELISA의 결과(Q) 값은 위 (2)와 같이 계산하였다. 얻어진 Q 값이 표 2에 나타낸 Cutoff Q 값 이상인 검체는 양성으로, 그 미만인 경우는 음성으로 평가하였다. 민감도 및 특이도는 다음과 같이 계산하였다.

● 민감도 = Indirect ELISA에서의 양성 검체수 / 대조군(PROGEN test)에서의 양성 검체수

● 특이도 = Indirect ELISA에서의 음성 검체수 / 대조군(PROGEN test)에서의 음성 검체수

IgG를 이용한 Indirect ELISA의 결과를 표 3 및 4에 나타내었다.

IgG		전장 NP
IgG		양성	음성	Total	민감도	특이도
대조군	양성	21	3	24	87.50% (21/24)	83.70% (77/92)
	음성	15	77	92
	Total	36	80	116

IgG		절단형 NP
IgG		양성	음성	Total	민감도	특이도
대조군	양성	24	0	24	100.00% (24/24)	91.30% (84/92)
	음성	8	84	92
	Total	32	84	116

표 3에 나타낸 바와 같이, 전장 NP를 이용한 경우, 민감도가 87.5%, 특이도가 83.7%로 나타났다. 절단형 NP를 이용한 경우에는 표 4에 나타낸 바와 같이 민감도가 100%, 특이도가 91.3%로 나타났다.

이로부터 절단형 NP를 사용한 Indirect IgG ELISA의 민감도 및 특이도가 전장 NP를 사용한 경우보다 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

IgM을 이용한 Indirect ELISA의 결과를 표 5 및 6에 나타내었다.

IgM		전장 NP
IgM		양성	음성	Total	민감도	특이도
대조군	양성	12	2	14	85.71% (12/14)	98.04% (100/102)
	음성	2	100	102
	Total	14	102	116

IgM		절단형 NP
IgM		양성	음성	Total	민감도	특이도
대조군	양성	12	2	14	85.71% (12/14)	99.02% (101/102)
	음성	1	101	102
	Total	13	103	116

표 5에 나타낸 바와 같이, 전장 NP를 이용한 경우, 민감도가 85.71%, 특이도가 98.04%로 나타났다. 절단형 NP를 이용한 경우에는 표 6에 나타낸 바와 같이 민감도가 85.71%, 특이도가 99.02%로 나타났다.

이로부터 본 발명의 절단형 NP를 사용한 Indirect IgM ELISA의 민감도 및 특이도가 전장 NP를 사용한 경우와 유사하거나 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4]

민감도 및 특이도 분석 - 최적의 cutoff Q값 설정

실제 진단에 적용할 수 있는 보다 최적화된 cutoff Q 값을 설정하기 위해 Indirect ELISA에서 IgG 및 IgM의 여러가지 cutoff Q 값에 대한 민감도 및 특이도를 분석하였다. PROGEN사의 ELISA의 경우 IgG의 Q값의 cutoff를 Q=1.5, IgM의 Q값의 cutoff를 Q=2로 설정하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로서, 전장 및 절단형 NP를 코팅하여 수행한 Indirect IgG ELISA로부터 얻어진 결과를, PROGEN test (대조군)로부터 얻어진 결과와 대비하여, 민감도 및 특이도 값을 계산하였다.

IgG을 이용한 Indirect ELISA의 결과를 표 7에 나타내었다.

IgG	민감도				특이도
Cutoff	전장 NP		절단형 NP		전장 NP		절단형 NP
Q≥1	87.50%	(21/24)	100.00%	(24/24)	80.43%	(74/92)	86.96%	(80/92)
Q≥1.25	83.33%	(20/24)	100.00%	(24/24)	86.96%	(80/92)	92.39%	(85/92)
Q≥1.5	79.17%	(19/24)	87.50%	(21/24)	93.48%	(86/92)	95.65%	(88/92)
Q≥2	75.00%	(18/24)	75.00%	(18/24)	98.91%	(91/92)	100.00%	(92/92)

표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 절단형 NP를 사용한 Indirect IgG ELISA의 민감도 및 특이도가 전장 NP를 사용한 경우보다 더 우수하였다. 특히 절단형 NP를 사용한 indirect IgG ELISA의 최적의 cutoff 값은 민감도가 가장 좋으며 특이도의 손해가 가장 작은 값인 Q=1.25(1.25~1.5)로 설정하였다.

IgG와 동일한 방법으로, IgM에 대한 Indirect ELISA를 실시한 결과, Q=2.0(1.5~2.0)에서 절단형 NP의 민감도는 전장 NP의 민감도와 거의 동일하였고(약 85.71%), 특이도는 절단형 NP의 경우 99.02%로서 전장 NP의 98.04%에 비해 더 우수하였다. 따라서 Indirect IgM ELISA의 최적의 cutoff 값은 Q=2.0(1.5~2.0)으로 설정하는 것이 적절한 것으로 확인되었다.

[실시예 5]

양성 반응 검출능 분석

본 발명의 절단형 NP을 이용한 Indirect IgG ELISA의 혈청 역가별 양성 반응 검체수를 Q≥1, Q≥1.25, Q≥1.5, Q≥2의 각 cutoff별로 분석하였다. 그 결과를 IFA 시험에 의한 양성 검체수와 비교하였다(표 8).

IgG	IFA 양성 검체수	절단형 NP
IgG		Q≥1	Q≥1.25	Q≥1.5	Q≥2
혈청 역가		양성 검체수	양성 검체수	양성 검체수	양성 검체수
1:1024	2	2	2	2	1
1:2048	2	2	2	2	2
>1:4096	13	12	12	12	11

표 8에 나타낸 바와 같이, 혈청 역가가 1:1024 이상인 경우 IFA 시험에 의해 양성에 해당하는 검체 대부분이 Indirect IgG ELISA에 의해서도 양성으로 나타났다.

이로부터 본 발명의 절단형 NP는 높은 역가에서도 우수한 검출능을 나타냄을 확인하였다.

[실시예 6]

쯔쯔가무시증 교차반응 확인

전장 NP 등을 항원으로 사용하는 것 보다 절단형 NP를 사용할 경우 쯔쯔가무시증과의 교차반응이 개선될 것으로 예상되어, 이를 확인하고자 본 실험을 수행하였다.

구체적으로, 절단형 NP을 이용한 본 발명의 Indirect IgG ELISA이 다른 발열성 질환에 혈청학적 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하였다. 검체로는 국내 대표적인 발열성 질환인 쯔쯔가무시증 양성 검체를 이용하였다. 50개의 검체를 절단형 NP를 이용한 본 발명의 Indirect IgG/IgM ELISA 및 PROGEN사의 상용화된 IgG/IgM ELISA(대조군)에 각각 적용하여 비교 분석하였다. 본 발명의 Indirect ELISA에서는 cutoff를 각각 Q≥1, Q≥1.14, Q≥1.25, Q≥1.5, Q≥2일 때를 기준으로 하여 교차반응이 나타내는 양성 검체수를 확인하였다. 그 결과를 표 9 및 10에 나타내었다.

IgG (총 검체수 : 50)		양성검체수	양성 반응률
절단형 NP	Q≥1	4	8.00%
	Q≥1.14	3	6.00%
	Q≥1.25	3	6.00%
	Q≥1.5	2	4.00%
	Q≥2	2	4.00%
대조군	Q≥1.5	16	32.00%

IgM (총 검체수 : 50)		양성검체수	양성 반응률
절단형 NP	Q≥1	5	10.00%
	Q≥1.25	4	8.00%
	Q≥1.5	3	6.00%
	Q≥1.63	3	6.00%
	Q≥2	3	6.00%
대조군	Q≥1.5	18	36.00%

위 결과로부터 본 발명의 절단형을 이용한 Indirect IgG/IgM ELISA는 모두 상용화된 PROGEN사의 ELISA과 비교하여 쯔쯔가무시증에 대해 매우 낮은 양성 반응률을 나타내었다. 이로부터 본 발명의 Indirect IgG/IgM ELISA는 상용화된 ELISA에 비하여 교차반응을 거의 나타내지 않는 것을 확인하였다.

<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION <120> A METHOD FOR DETECTING HANTAAN VIRUS ANTIBODIES USING HANTAAN VIRUS TRUNCATED NUCLEOCAPSID PROTEIN <130> KCD19P-0004-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HANTAAN VIRUS FULL-LENGTH NUCLEOCAPSID PROTEIN <400> 1 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Ser Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 Phe Val Val Pro Ile Leu Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 Gly Arg Gln Thr Thr Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Phe Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Leu Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu 180 185 190 Ile Thr Pro Gly Arg Tyr Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala 195 200 205 Gln Ile Lys Ala Arg Gln Met Ile Ser Pro Val Met Ser Val Ile Gly 210 215 220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ile Glu Gln Trp Leu 225 230 235 240 Ile Glu Pro Cys Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ala Ala Val Ser Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Arg Gln Val Ala 260 265 270 Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu Ser Lys Ala Ile Arg Gln His Ala 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ser Glu 340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ile Val Leu Phe 370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu Ile Asp Val 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HANTAAN VIRUS TRUNCATED NUCLEOCAPSID PROTEIN <400> 2 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala 115 <210> 3 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HANTAAN VIRUS TRUNCATED NUCLEOCAPSID PROTEIN <400> 3 atggcaacta tggaggaatt acagagggaa atcaatgccc atgagggtca attagtgata 60 gccaggcaga aggtgaggga tgcagaaaaa cagtatgaaa aggatccaga tgagttgaac 120 aagagaacat taactgaccg agagggcgtt gcagtatcta tccaggcaaa aattgatgag 180 ttaaaaaggc aactggcaga taggattgca actgggaaaa accttgggaa ggaacaagat 240 ccaacagggg tggagcctgg agaccatctg aaagagaggt caatgctcag ttatggtaat 300 gtgctggatt taaaccattt ggatattgat gaacctacag gacagacagc a 351

Claims

서열번호 2를 갖는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 효소결합면역측정법(ELISA)을 통해 한탄바이러스의 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 효소결합면역측정법은 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)인 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제3항에 있어서,
(a) 상기 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 검출용 항원으로 하고, 검사대상시료를 고체상 지지체에 고정된 상기 검출용 항원과 반응시키는 단계;
(b) 한탄바이러스 항체에 특이적으로 결합하고 검출 표지와 접합된 2차 항체를, 상기 검사대상시료에 포함된 한탄바이러스 항체와 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 검사대상시료에 포함된 한탄바이러스 항체에 결합한 상기 2차 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제4항에 있어서, 상기 2차 항체는 검출 표지로서 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase,　HRP)와 접합된 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서, 신증후군출혈열의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서, 한탄바이러스 전장 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 한탄바이러스를 검출하는 방법과 비교하여, 쯔쯔가무시증에 대한 교차반응률이 낮은 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스의 검출 방법.
서열번호 2를 갖는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소결합면역측정법(ELISA)에 사용하기 위한 한탄바이러스 검출용 키트.
제8항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스 검출용 키트.
제8항에 있어서, 상기 효소결합면역측정법은 간접 효소결합면역측정법(Indirect ELISA)인 것을 특징으로 하는, 한탄바이러스 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 절단형 뉴클레오캡시드 단백질; 및
한탄바이러스 항체에 특이적으로 결합하고 검출 표지와 접합된 2차 항체
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 한탄 바이러스 검출용 키트.
제11항에 있어서, 상기 2차 항체는 검출 표지로서 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase,　HRP)와 접합된 것을 특징으로 하는, 한탄 바이러스 검출용 키트.
제8항에 있어서, 신증후군출혈열의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, 한탄 바이러스 검출용 키트.
제8항에 있어서, 한탄바이러스 전장 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 한탄바이러스를 검출하는 방법과 비교하여, 쯔쯔가무시증에 대한 교차반응률이 낮은 것을 특징으로 하는, 한탄 바이러스 검출용 키트.