KR20200004500A

KR20200004500A - 브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200004500A
Application number: KR1020180077398A
Authority: KR
Inventors: 김석
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2020-01-14

Abstract

본 발명은 브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 Ohr 단백질은 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9균과의 교차면역반응성이 없어, 위양성 혈청에 대한 평가가 가능하여, 브루셀라증의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosis of brucellosis comprising recombinant Ohr protein derived from Brucella abortus as effective component and uses thereof}

본 발명은 브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

브루셀라 감염증은 대표적인 인수공통 전염병(인체; 4군 법정전염병, 가축; 2종 법정전염병)의 하나이며 국내는 물론 전 세계적으로 공중보건학적 및 경제학적 심각한 문제를 야기한다고 알려져 있다. 최근 국내에서도 브루셀라 감염증이 인체와 가축에서 폭발적인 증가를 보이고 있어 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.

브루셀라 감염증을 유발하는 브루셀라균은 Brucella abortus(소), B. melitensis(양, 염소), B. canis(개), B. ovis(양), B. suis(돼지) 등이 알려져 있는데, 이들은 모두 인체에 감염하여 심각한 질병을 초래할 수 있고, 국내에서는 브루셀라 어보투스(B. abortus)가 높은 비율을 차지하는 것으로 알려져 있다. 상기 브루셀라균이 인체에 감염될 경우 10% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며, 동물에 감염될 경우 특별한 외부 증상 없이 암컷에서 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 수컷에서 고환염, 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다고 알려져 있다. 상기 브루셀라균은 세포내에서 증식하며 발병을 일으키기 때문에 인체감염의 경우 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 등으로 인하여 치료 방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다. 그러나, 동물에 브루셀라 감염증이 발병된 경우, 특별한 증상 없이 장기간 동안 보균자로 유지하면서, 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하게된다.

브루셀라 감염증에 대한 피해를 최소화하기 위해서는 감염된 사람 또는 동물의 조기 진단, 치료 및 살처분과 같은 대책 마련이 중요한 방법으로 인식되고 있지만, 현재 사용되고 있는 진단법은 낮은 민감도와 다른 질병균과의 교차 반응으로 인하여 브루셀라 감염증을 진단하고 근절하기에 어려움이 있다.

현재 동물 브루셀라 감염의 진단법으로는 혈액 배양을 통한 균의 분리 동정, PCR(polymerase chain reaction), STA(standard agglutination test), 보체결합반응, 우유윤환시험(milk ring test), 로즈벵갈시험(Rose Bengal test), 쿰스 혈구응집반응(Coomb's test), 교류면역전기영동법(counterimmunoelectrophoresis), 간접 용혈반응(indirect hemolysis), AGID(agar gel immunodiffusion), 브루셀린 피부시험(Brucellin skin test) 등 다양한 방법이 제시되고 있으며, 사람 브루셀라 감염의 진단법은 동물과 마찬가지로 혈액 배양을 통한 균의 분리 동정, PCR, STA, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 로즈벵갈시험 등 다양한 방법이 제시되고 있다.

우선 가장 확실한 진단법의 하나인 균의 분리 동정 및 PCR법은 확진하는데 있어 유용한 방법이나, 균의 분리가 쉽지 않고, 시료 중 균체의 수가 적을 경우 PCR 결과 음성으로 판정되어 오진할 수 있는 문제점이 있으며, 장시간 및 고비용이 요구되고, 균체를 다루는 과정에서의 인체 감염 또한 큰 문제로 인식되어지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기위해 제시된 방법이 혈청학적 진단법이다. 현재 국내를 포함하여 전 세계적으로 가장 많이 이용되는 혈청학적 진단법은 SAT이다. SAT 진단법은 PCR 방법보다 간단하고, 안전한 방법으로 인식되고 있으나, 감염초기 환자나 만성감염의 경우 항원과 반응할 수 있는 항체의 양이 적을 경우 음성으로 오진할 수 있는 단점이 있다. 뿐만 아니라 브루셀라 균은 여러 가지 균들과 혈청학적으로 교차반응을 일으켜 SAT법에서 오진을 유발시킨다. 특히, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9균과 대장균(Escherichia coli) O157:H7균의 LPS(lipopolysaccaride)는 브루셀라 어보투스의 LPS와 성상이 유사하여 높은 교차반응을 보이고, 이로 인한 오진의 문제점이 보고되고 있다.

국내 브루셀라 감염증의 피해를 최소화하고 국민적 건강증진과 안전한 축산물의 공급을 구축하기 위해서는 국내에서 분리된 브루셀라 어보투스 야외주의 특성 분석 및 항원성을 규명하고, 감염혈청과 반응하는 고민감도의 항원을 선발 활용하여 신속 정확한 진단체계를 확립하여야 한다.

한편, 한국등록특허 제1775369호에는 '브루셀라 어보투스 균주 유래의 Ohr 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1270662호에는 '브루셀라 아보투스의 26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS를 이용한 진단 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 브루셀라의 감염 여부를 진단하는 방법을 개발하고자 브루셀라 어보투스 균주로부터 유래된 재조합 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질을 이용하여 고민감도 혈청진단법(ELISA)을 수행하였다. 그 결과, TAT(Tube agglutination test) 양성 혈청 및 음성 혈청에 대하여 민감도, 특이도 및 정확도가 92.37%, 89.47% 및 90.95%을 보여, 브루셀라 감염증의 여부를 효과적으로 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 어보투스 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 브루셀라 감염 의심 개체의 분리된 생물학적 시료를 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질과 반응시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 반응물에 Ohr 항체에 특이적으로 결합하는, 표지물질이 부착된 2차 항체를 반응시키는 단계; 및 3) 상기 2) 단계 반응물의 Ohr 항체가를 측정하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 기존의 방법과 비교하여 92,37%의 민감도, 89.47%의 특이도 및 90.95%의 정확도를 보여 매우 우수한 진단기법으로 사료되며, 본 발명의 방법은 브루셀라증 진단법의 가장 큰 문제점인 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9균과의 교차면역반응성이 없어, 위양성 혈청에 대한 평가가 가능하여, 브루셀라증에 의한 경제적 손실 및 국민보건 향상에 기여할 것으로 사료된다.

도 1은 재조합 Ohr 단백질의 면역반응 평가 결과이다. 레인 1은 pCold 벡터를 이용한 재조합 Ohr 단백질을 발현시킨 세포 용해물을 로딩한 결과이고, 레인 2는 분리정제한 재조합 Ohr 단백질을 로딩한 결과이며, 레인 3은 분리정제한 재조합 Ohr 단백질을 로딩한 후 브루셀라 감염 확진 소의 혈청과 반응시킨 결과이고, 레인 4는 분리정제한 재조합 Ohr 단백질을 로딩한 후 브루셀라 비감염 소의 혈청과 반응시킨 결과이다. 레인 5는 분리정제한 재조합 Ohr 단백질을 로딩한 후 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. entericolitica) O:9 감염 소의 혈청과 반응시킨 결과이다. M: 크기 마커, 화살표: 재조합 Ohr 단백질(67.6 kDa), 화살표 머리: pCold 벡터 발현 단백질(52 kDa).
도 2는 10 ㎍/㎖의 재조합 Ohr 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 반응 결과이다. TAT 400, 200 및 100: 브루셀라 양성 혈청, Negative: 브루셀라 음성 혈청(비감염).
도 3은 도 2의 결과를 정량화한 것이다. *: p<0.05, **: p<0.01.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 어보투스 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Ohr 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 Ohr 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 유전자는 Ohr 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 Ohr 단백질은 면역원성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "브루셀라 감염증(Brucellosis)"은 다양한 브루셀라 균의 감염에 의하여 발병되는 전염병을 의미하며, 본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 브루셀라 감염증의 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에 있어서, 상기 Ohr 단백질은 브루셀라균 감염 가축 또는 사람의 혈청에만 특이적으로 반응하며, 종래 브루셀라증 진단에서 교차반응성을 야기하는 다른 미생물에는 반응하지 않는 특성이 있다. 상기 교차반응성을 야기하는 다른 미생물의 종류로는, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9, 대장균(Escherichia coli) O157:H7, 에스체리치아 헤르만니(Escherichia hermannii), 야토균(Francisella tularensis), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) serotype Pullorum, Urbana, 콜레라균(Vibrio cholerae), 파스투렐라 헤모리티카(Pasteurella hemolytica), 리조비움 레규미노사륨(Rhizobium leguminosarum), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 필로박테리움 속(Phyllobacterium spp.) 등이 보고되고 있으며, 이들 균주 중 특히 예르시니아 엔테로콜리티카 O:9 균과 대장균 O157:H7 균의 LPS(lipopolysaccaride)는 브루셀라 아보투스의 LPS와 성상이 유사하여 높은 교차반응을 보이고, 이로 인한 오진의 문제점이 보고되고 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 브루셀라 감염증 진단용 키트는, 브루셀라 균의 감염여부를 검출할 수 있는 키트로, 본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 재조합 Ohr 단백질이 항원 단백질로 사용되는 효소면역분석 방식의 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

효소면역분석법은 고체지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스타아제(alkaline phosphatse)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC(fluorescen isothiocyanate), RITC(rhodanun B isothiocyanate) 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), 테트라메틸 벤지딘(tetramethylbenzidine, TMB)가 사용될 수 있다.

본 발명은 또한,

1) 브루셀라 감염 의심 개체의 분리된 생물학적 시료를 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질과 반응시키는 단계;

2) 상기 1) 단계의 반응물에 Ohr 항체에 특이적으로 결합하는, 표지물질이 부착된 2차 항체를 반응시키는 단계; 및

3) 상기 2) 단계 반응물의 Ohr 항체가를 측정하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 1) 단계의 생물학적 시료는 브루셀라 감염이 의심되는 가축 또는 사람으로부터 분리된 혈청, 혈액, 혈장, 척수액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 브루셀라 균에 대한 면역글로불린(immunoglobulin)을 함유하고 있는 생물학적 시료를 모두 포함한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 2) 단계의 표지물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로, 그 종류는 이에 한정하지 않으나, 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등의 효소; 플루오레세인, Eu³ ⁺, Eu³ ⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등의 형광물질; 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등의 발광물질; 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등의 미소입자; 또는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 등의 방사성 동위원소일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 3) 단계의 Ohr 항체가의 측정은 항원-항체 복합체를 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 공시균주

본 발명에서 사용된 브루셀라 어보투스(B. abortus) 544 균주는 농림축산검역검사본부에서 분양받아 공시하였으며, 재조합 단백질 발현을 위해 대장균 DH5α (Invitrogen)를 이용하였다. 브루셀라균은 Brucella 액체배지(BD, USA)에 배양하였으며 대장균은 LB 액체배지(BD, USA)에서 37℃에서 하루동안 진탕배양하였다. 고형배지의 경우 같은 종류의 액체배지에 1.5%(w/v) 한천(Takara, Japan)을 첨가하였으며, 필요에 따라 암피실린(100 ㎍/㎖)을 첨가하였다.

2. Ohr 재조합 단백질 발현 컨스트럭트 제조

브루셀라균의 총 게노믹 DNA는 하루동안 배양된 브루셀라균 5 ㎖을 원심분리하고 세포 펫렛으로 모아, bacteria genomic DNA purification 키트(Intron, Korea)를 이용하여 정제하였다. 브루셀라 어보투스 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 재조합 항원 제작을 위하여, Ohr을 암호화하는 유전자를 찾아, 프라이머를 제작한 후 PCR을 이용하여 Ohr 유전자를 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 정방향 프라이머; 5'-AATTCGAATTCATGCCAATTCTTTACACG-3'(밑줄 EcoRI 자리, 서열번호 3)와 역방향 프라이머; 5'-AGGCAAGCTTTCAGGCTACGCTCAGGCG-3'(밑줄 HindⅢ 자리, 서열번호 4)를 이용하였다. 증폭된 Ohr 유전자는 pCold 벡터(Takara, Japan)에 삽입한 후 유전자 발현을 위해 대장균 DH5α균주에 형질전환하였으며, Ohr 유전자가 삽입된 플라스미드는 염기서열을 분석을 통해 Ohr 유전자를 확인하였다.

3. 재조합 Ohr 단백질의 정제

상기 형질전환된 대장균 DH5α균주를 암피실린(100 ㎍/㎖)이 포함된 LB 액체배지 1L에 IPTG(Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)를 최종농도 0.2 mM로 첨가하여, 37℃에서 4시간 동안 진탕배양하였다. 그 후, 배양된 균주는 5,000 rpm, 20분간 원심분리를 수행한 후 상층액을 제거하여 회수하였다. 그 후, 세균 펠렛은 25 ㎖의 컬럼 버퍼(20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, and 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 10% Glycerol, pH 7.4)를 이용하여 현탁시킨 후, -70℃에서 동결과 해동과정을 3회 수행한 후, 초음파기(Bandelin electronic, Germany)를 이용하여 분쇄한 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수거하고, 말토즈 레진 컬럼(Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 재조합 단백질을 정제하였다.

4. SDS-PAGE 및 면역블롯팅( immunoblotting)

정제된 재조합 Ohr 단백질을 Laemmli 샘플버퍼에 넣고 100℃에서 10분간 가열처리한 후 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였고, 그 후 Immobilon-P membranes(Milipore, USA)을 이용하여 트랜스퍼하였다. 그 후, 멤브레인은 1%(w/v) BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 블록킹을 수행하였고, 농림축산검역검사본부에서 분양받은 브루셀라 어보투스 비감염 마우스 혈청과, 감염 마우스 혈청을 상기 멤브레인과 반응시키고, 결과를 X-ray film(Fuji, Japan)에 현상하여 Ohr 재조합 단백질의 면역원성을 확인하였다.

5. 간접 ELISA

ELISA에 사용된 혈청은 2006~2014년도에 채집된 국내 한우혈청을 이용하였다. 사용된 혈청은 시험관응집반응(tube agglutination test, 이하 TAT)을 통하여 브루셀라 감염여부를 측정하였고, TAT 양성시료 118개, TAT 음성시료 114개, 총 232개를 실험에 사용하였다. ELISA 측정을 위해 사용된 플레이트(Maxibinding, SPL Life Sciences)에 phosphate coating 버퍼(0.1 M, pH 9.6)에 혼합한 rOhr 단백질(10 ㎍/㎖) 50 ㎕를 넣고, 4℃에서 24시간 코팅시킨 후, 200 ㎕의 0.5%(v/v) PBS-T를 이용하여 3회 세척하고 200 ㎕의 블록킹 버퍼(5%(w/v) skim milk in PBS-T)를 이용하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트는 반응이 끝난 후에 200㎕의 0.5%(v/v) PBS-T를 이용하여 3회 세척한 후, 각각의 한우혈청을 블록킹 버퍼에 1:200으로 희석하여 웰에 넣어주고 4℃에서 24시간 반응시켰다. 그 후, 각 웰을 0.05% PBS-T를 이용하여 4회 세척하였고, 100 ㎕의 HRP-conjugate protein G를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 0.05% PBS-T를 이용하여 5회 세척하였고, 100 ㎕의 O-phenylenediamine(OPD)을 첨가하여 15분동안 상온에서 반응시킨 후, 50 ㎕의 3M 염산 및 3M 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고, ELISA reader(BioTek, Korea)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 컷오프 값(cut off value)은 브루셀라 음성 혈청값의 평균에 두배를 곱한 값으로 설정하였다.

6. 통계

각 실험을 통해 나온 결과는 평균값±표준편차로 표기하였으며, One-way ANOVA program을 이용하여 분석하였다.

실시예 1. Ohr 재조합 단백질의 발현 및 면역원성 규명

브루셀라 어보투스균 유래의 Ohr 재조합 단백은 SDS-PAGE를 통하여 약 67.6 kDa (pMAL 단백질은 52 kDa)으로 확인되었으며(도 1), 정제과정을 거쳐 분리된 Ohr 재조합 단백질의 면역원성을 규명하기 위하여, 브루셀라 감염 마우스 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 수행 결과 SDS-PAGE에서 발현된 재조합 단백과 동일한 크기에서 특이적인 밴드가 확인되어, 재조합 단백질의 면역원성이 확인되었다(도 1).

실시예 2. Ohr 재조합 단백질을 이용한 ELISA

정제된 Ohr 재조합 단백질을 이용하여 양성혈청(TAT 400, 200 및 100)과 음성혈청을 이용하여 ELISA를 수행해 본 결과, TAT 양성혈청은 본 발명의 Ohr 재조합 단백질과 높은 반응성을 보인 반면(cut off value 보다 높은 반응을 보임), TAT 음성혈청은 Ohr 재조합 단백질과 낮은 반응성을 보여, 본 발명의 Ohr 재조합 단백질이 진단적 가치가 있는 것으로 확인되었다(도 2). 또한 TAT 양성혈청과 음성혈청을 이용하여 ELISA 흡광도를 측정해본 결과, 음성혈청은 평균 0.1 이하의 흡광도를 나타내었고, TAT 100, TAT 200 및 TAT 400 혈청은 컷오프 값의 흡광도(0.168)에 비해 각각 1.7배, 2.28배, 2.45배 높은 흡광도를 보였으며, TAT 값에 비례하여 흡광도가 높게 나타나는 것을 알 수 있었다(도 3).

본 결과를 토대로 Ohr 재조합 단백질을 이용한 고민감도 혈청진단법(ELISA)를 수행한 결과, TAT 양성혈청(118개) 및 음성혈청(114개)에 대하여, 민감도, 특이도 및 정확도는 92.37%, 89.47% 및 90.95%를 나타내었다.

표준 TAT와 비교한 재조합 Ohr 항원을 이용한 ELISA 법의 분석능 평가 결과

		TAT 양성 (n=118)	TAT 음성 (n=114)
ELISA	양성	109	12
ELISA	음성	9	102

민감도 : (109/118) x 100 = 92.37%, 특이도 : (102/114) x 100 = 89.47%, 정확도 : (211/232) x 100 = 90.95

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for diagnosis of brucellosis comprising recombinant Ohr protein derived from Brucella abortus as effective component and uses thereof <130> PN18143 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 423 <212> DNA <213> Brucella abortus <400> 1 atgccaattc tttacacgac ccagtccacg gcaaccggtg gccgcacggg cagcgccaag 60 accgccgatg ggcgcctcag cgtcgttctc gacacgccga aggaacttgg cgggcagggc 120 ggtgaaggca ccaatcccga acagcttttt gcttccggct atgctgcctg ctttctcggg 180 gcgctgaaat tcgcggcggc gaaagaaaag atttcgatcc ccgctgaaag caccgtgacc 240 gcgacagttg gcatcggccc gcgcgaggat ggcaccggtt tcggccttga cgtggcgctg 300 tcaattgctc ttcctggcat cgacaaggca aaggcggagg agctggtgca ggccgcccac 360 atcgtttgcc cctattcgca cgcgacgcgg ggcaatctcg acgttcgcct gagcgtagcc 420 tga 423 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 2 Met Pro Ile Leu Tyr Thr Thr Gln Ser Thr Ala Thr Gly Gly Arg Thr 1 5 10 15 Gly Ser Ala Lys Thr Ala Asp Gly Arg Leu Ser Val Val Leu Asp Thr 20 25 30 Pro Lys Glu Leu Gly Gly Gln Gly Gly Glu Gly Thr Asn Pro Glu Gln 35 40 45 Leu Phe Ala Ser Gly Tyr Ala Ala Cys Phe Leu Gly Ala Leu Lys Phe 50 55 60 Ala Ala Ala Lys Glu Lys Ile Ser Ile Pro Ala Glu Ser Thr Val Thr 65 70 75 80 Ala Thr Val Gly Ile Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Gly Phe Gly Leu 85 90 95 Asp Val Ala Leu Ser Ile Ala Leu Pro Gly Ile Asp Lys Ala Lys Ala 100 105 110 Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala His Ile Val Cys Pro Tyr Ser His Ala 115 120 125 Thr Arg Gly Asn Leu Asp Val Arg Leu Ser Val Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aattcgaatt catgccaatt ctttacacg 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aggcaagctt tcaggctacg ctcaggcg 28

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 어보투스 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 브루셀라 감염증 진단용 조성물.
제1항의 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 키트.
제2항에 있어서, 상기 키트는 브루셀라 어보투스 유래 Ohr 단백질을 항원으로 하는 효소면역분석키트인 것을 특징으로 하는 키트.
1) 브루셀라 감염 의심 개체의 생물학적 시료를 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 브루셀라 유래 Ohr(organic hydroperoxide resistance) 단백질과 반응시키는 단계;
2) 상기 1) 단계의 반응물에 Ohr 항체에 특이적으로 결합하는, 표지물질이 부착된 2차 항체를 반응시키는 단계; 및
3) 상기 2) 단계 반응물의 Ohr 항체가를 측정하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 2) 단계의 표지물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 것을 특징으로 하는 브루셀라 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.