KR20220074286A

KR20220074286A - 흰반점증후군 바이러스에 특이적인 재조합 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220074286A
Application number: KR1020200162607A
Authority: KR
Inventors: 김춘섭; 김진숙; 김도형
Original assignee: 주식회사 엔바이로젠; 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-03
Also published as: KR102550527B1

Abstract

본 발명은 전 세계 새우 양식장에서 대량폐사를 유발하는 흰반점증후군 바이러스(White spot syndrome virus, WSSV)에 특이적으로 결합하는 재조합 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

흰반점증후군 바이러스에 특이적인 재조합 항체 및 이의 용도{RECOMBINANT ANTIBODY SPECIFIC FOR WHITE SPOT SYNDROME VIRUS AND USE THEREOF}

흰반점증후군(White spot syndrome)은 새우의 외골격에 흰색 반점이 나타나는 질환으로, 양식산 새우 등의 대량폐사를 초래한다. 1992년대 초 대만에서 양식중인 넙치(Paralichthys olivaceus)가 대량으로 폐사하면서 원인 바이러스가 처음으로 분리된 이후 일본의 조피볼락(Sebastes schlegelii) 및 은어(Plecoglossus altivelis), 중국의 돌가자미(Kareius bicoloratus) 등 아시아 지역에서만 분리되는 바이러스가 2012년도 유럽의 회색숭어(Thymallus thymallus)에서도 검출되는 등 아시아 국가 뿐 아니라 이외의 지역에서도 양식 새우의 흰반점증후군이 꾸준히 발생하고 있어 세계적으로 새우 양식 산업에 심각한 경제적 손실을 입히고 있다. 국내의 경우 1998년도에 넙치로부터 바이러스가 분리되었으며, 참돔과 감성돔에 대하여 병원성을 지니는 것을 확인하였다.

흰반점증후군의 원인 바이러스는 흰반점증후군 바이러스(Whitespot syndrome virus, WSSV)로 니마비리데과(Nimaviridae) 휘스포바이러스속(Whispovirus)에 속하는 외막이 있는 이중가닥의 DNA 바이러스이며, 길이 약 250-400 nm, 넓이 80-150 nm의 막대모양의 형태를 지닌다.

최근 소비자들의 안전한 먹거리에 대한 수요 증가로 인해 전 세계적으로 수산생물의 방역, 예찰 및 모니터링의 중요성이 더욱 커지고 있다. 또한, 국가적인 예찰 및 방역활동 뿐만 아니라, 지역적이고 구역화 된 수산생물의 질병 예찰 및 모니터링 연구결과의 분석은 향후 수산생물질병의 역학조사 및 질병 관리에 필요한 유용한 자료를 제공할 뿐만 아니라 자국 내 특정 질병에 대한 무병(청정)지역을 증명할 수 있는 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 WSSV의 국내 분리주의 서열변이에 대한 지속적인 연구, 및 다른 국가 분리주와의 서열비교 및 지속적인 모니터링도 중요하게 되었다.

한편, WSSV는 감염 새우, 양식장 인근 갑각류 및 패류에서 검출되는 WSSV 특이적 유전자 및 항원을 검출하여 진단할 수 있다. WSSV의 진단은 일반적으로 중합효소 연쇄반응을 이용한 현장혼성화 및 면역학적 항원 진단키트를 이용하며, 특히, WSSV는 배양 가능한 표준 세포주의 부재로 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 진단법을 이용하는 것이 일반적이다.

현재 국제수역사무국(OIE)에서 권장하고 있는 유전자 진단법 및 대만 OIE 표준 실험실에서 개발된 유전자 진단키트가 전세계적으로 WSSV의 진단을 위해 사용되고 있으나, 진단의 민감성 및 특이성이 현저히 떨어져 정확한 진단이 어렵다는 문제가 있다. 또한 일부 음성시료에서도 양성반응이 유발될 수 있어 진단의 신뢰성이 떨어지며, 진단에 있어서의 긴 소요시간 역시 문제점이다.

흰반점증후군은 최초 보고된 이래로 현재까지 매년 발생하고 있으며, 발병 후 3-10일 이내 개체의 90% 이상이 감염 및 폐사될 수 있어 새우 양식산업에 큰 경제적 손실을 초래하고 있다. 한번의 감염으로도 수산어가에 큰 피해를 입힐 수 있음에도 불구하고, 감염 시 초기 진단이 어려운 점이 있어 신속하고 용이한 진단을 위한 방안을 개발하려는 노력이 계속되고 있다.

본 발명은 목적은 흰반점증후군 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공하는 것이다.

본 발명은 목적은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄를 포함하는, 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 조성물; 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 이용한 흰반점증후군 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 이를 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기의 구체적인 서술에 의해 본 발명 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명은 흰반점증후군 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다.

본 발명의 재조합 항체는 흰반점증후군 바이러스에 대한 감수성 및 특이성이 높아 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 "항체"는 특정 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는, 면역글로불린 분자를 포함하고 있는 단백질 분자를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체, 전장항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다.

구체적으로 본 발명에서 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체는 하기 서열번호 1로 표시되는 중쇄 및 하기 서열번호 2로 표시되는 경쇄를 포함하는 재조합 항체일 수 있다.

본 발명에서 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "가변영역"은 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미한다.

본 발명에서 재조합 항체는 항체의 친화도, 면역성 등을 개선시키기 위해 모항체의 아미노산 서열 일부를 치환, 부가 및/또는 결실시킨 변이체, 즉, 균등물을 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 변이체는 동일한 항원단백질을 표적으로 하는 것으로 모항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열의 일부가 치환, 부가 또는 결실된 항체일 수 있고, 본 발명의 재조합 항체가 결합하는 항원단백질에 대한 감수성, 특이성 및 결합력이 유지되는 범위라면 항체의 친화도 등을 개선시키기 위해 당업자들에 의해 적절히 조정될 수 있다.

본 발명에서 재조합 항체는 흰반점증후군 바이러스에 존재하는 항원단백질 VP35, VP28, VP19, VP26 및/또는 VP24에 결합하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 VP28에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 또한 본 발명에서 재조합 항체가 특이적으로 결합하는 항원단백질에는 상기 항원단백질의 유사체를 포함한다. 후술할 바와 같이, 본 발명의 재조합 항체는 WSSV에서 발현하는 항원단백질인 VP28에 특이적으로 결합할 수 있어 WSSV에 감염된 새우와 비-감염된 새우를 명확하게 검출해 낼 수 있음을 구체적으로 입증하였으며, 이에 따라 본 발명의 재조합 항체를 포함하는 조성물은 WSSV에 감염여부를 민감도 높게 검출할 수 있다는 점을 확인할 수 있다.

본 발명에서 재조합 항체는 중쇄 및 경쇄의 분자량이 각각 20 내지 30 kDA일 수 있으며, 바람직하게는 분자량이 25 내지 28 kDa일 수 있다.

본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에서 "핵산분자"는 DNA 및 RNA 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자의 구성단위인 뉴클레오티드는 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 분위가 변형된 유사체를 포함한다. 또한 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열과 실질적인 동일성이 있는 서열을 포함한다. 상기 실질적인 동일성은 당업계에서 통상적으로 이용되는 서열분석 방법을 통해 확인했을 때, 최소 80% 이상, 구체적으로 85% 이상, 구체적으로 90% 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세서에서 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등) 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예컨대, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명에서 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 또한, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체를 단백질 L 컬럼 등을 통해 정제할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 상기 항생제 내성 유전자는 예를 들면, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자일 수 있다.

본 발명에서 숙주 세포는 도입된 벡터를 안정적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 것이라면 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포라도 이용할 수 있다. 예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 숙주 세포는 예를 들어, 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 식물 또는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 숙주 세포를 이용한 재조합 항체의 생산방법은 (a) 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포에서 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 재조합 항체의 생산방법에 있어서 형질전환 된 숙주 세포의 배양하는 단계는 당업계에 알려진 적절한 배지 및 배양조건에 따라 이루어질 수 있으며, 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 각 조건을 적절히 조정하여 사용할 수 있다. 또한 상기 재조합 항체의 생산방법은 (c) 상기 숙주 세포에서 발현된 재조합 항체를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 수득한 재조합 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 투석, 크로마토그래피 등 수득된 재조합 항체를 당업계에 알려진 통상의 정제방법을 통해 정제하여 사용할 수 있다.

본 발명은 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 포함하는 흰반점증후군 감염여부 진단용 조성물, 이를 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 여부 또는 특징을 확인하는 것으로, 본 발명에서는 흰반점증후군 바이러스의 감염여부를 확인하는 것일 수 있다.

본 발명의 흰반점증후군 감염여부 진단용 조성물, 이를 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 마이크로어레이는 검체 시료와의 접촉을 통해 항원-항체 복합체를 형성함으로써 효과적으로 흰반점증후군 바이러스 감염여부를 진단할 수 있다.

상기 항원-항체의 복합체 형성 여부는 통상의 면역 검정법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, ELISA, 웨스턴블로팅, 면역형광법, 면역조직화학염색법, 유세포분석법, 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법, 면역확산분석법, 보체 고정 분석법, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 진단용 조성물은 면역학적 분석에 이용되는 공지된 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 예를 들어, 표지물질, 용해제, 세정제일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기 표지물질은 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 물질로, 항원-항체 복합체 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다.

상기 효소는 예를 들어, β글루쿠로니다제, β글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등일 수 있다. 상기 형광물질은 예를 들어, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등일 수 있다. 상기 리간드는 예를 들어, 바이오틴 유도체 등일 수 있으며, 상기 발광물은 예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등일 수 있다. 상기 미소입자는 예를 들어, 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등일 수 있고, 상기 레독스 분자는 예를 들어, 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등일 수 있다. 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등일 수 있다. 다만, 상기 예시에 제한되는 것은 아니며, 면역학적 분석에 통상적으로 사용가능 한 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다.

본 발명에서 진단용 조성물은 진단의 속도 및 편리성을 위해 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체는 예를 들어, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등일 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

본 발명에서 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 "진단용 키트"는 각종 질병, 건강 상태 등 여러 분야에서 각 목적에 맞게 필요한 시약 및 도구 등을 포함하는 생화학 실험 도구를 의미하며, 본 발명에서는 흰반점증후군 감염 여부를 확인하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트는 본 발명의 재조합 항체를 포함하는 것으로, 필요에 따라 웰, 염색제, 검출용의 효소 표지 항체, 세척액, 항체 희석액, 검체 희석액, 효소 기질, 효소 기질액 희석액, 그밖의 시약을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트는 WSSV 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "마이크로어레이(Microarray)"는 질병-단백질 또는 단백질-단백질 관계의 확인하는 것을 목적으로 하여 동시에 수천, 수백 단백질의 발현양상 규명을 위해 사용되는 것으로, 2개의 샘플이 하이브리드 된 후 어레이가 스캔하고 각 샘플의 영상을 분석하여 정량화하여 항체에 특이적으로 결합하는 단백질을 항원-항체 반응을 통해 검출할 수 있다.

본 발명은 흰반점증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 이용한 흰반점증후군 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 항체는 흰반점증후군 바이러스에 대한 감수성 및 특이성이 높으므로 양식장에서 대량폐사를 일으켜 막대한 손해를 입히고 있는 새우의 흰반점증후군을 민감하게 진단할 수 있고 나아가 흰반점증후군의 치료 및 예방에 용이하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 실시예에서 제작된 재조합 항체의 유전자를 E.coli codon으로 최적화하여 pACYCDuet-1 벡터에 클로닝하고, 항체의 중쇄 유전자의 염기서열(NcoI~HindIII)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예에서 제작된 재조합 항체의 유전자를 E.coli codon으로 최적화하여 pACYCDuet-1 벡터에 클로닝하고, 항체의 경쇄 유전자의 염기서열(NdeI~XhoI)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 SDS-PAGE에서 관찰되는 정제된 재조합 항체 단백질을 나타낸 것이다(M: marker (kDa), lane 1~4: washing, lane 5~11: elution).
도 4는 본 발명에서 제작된 재조합 항체의 정상새우 및 WSSV 감염 새우의 아가미 마쇄액에 대한 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다(M: marker (kDa), G+ve: WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액, G-ve: 정상 새우 아가미 마쇄액).

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다.

실시예. 재조합 항체의 제조

(1) 재조합 항체 유전자 합성

WSSV에 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자 서열을 유전자 합성 장비(Dongshenglong Second Generation ETC 811 New Type of Polymerase Chain Reactor, BioBasic, China)를 이용하여 합성하였다.

재조합 항체의 중쇄 서열 내에는 NcoI 및 HindIII 제한효소 서열을 추가하여 합성하였고, 경쇄 서열 내에는 NdeI와 XhoI 제한효소 서열을 추가하여 유전자를 합성하여 pACYCDeut-1 벡터 클로닝에 활용하였다.

(2) 재조합 항체 유전자의 pACYCDuet-1 벡터에 서브 클로닝

상기 합성한 재조합 항체 유전자를 pACYCDuet-1 벡터에 서브 클로닝하기 위해 먼저 pACYCDeut-1 벡터 및 중쇄 유전자를 각각 NcoI와 HindIII 제한효소를 이용하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 자른 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 37℃에서 한 시간동안 반응시켜 중쇄 유전자를 벡터에 클로닝 하고, 아가로스겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동 후 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 정제하였다(QIAquick gel extraction kit (Qiagen, USA)).

이후 중쇄 유전자가 삽입된 pACYCDeut-1 벡터와 경쇄 유전자를 각각 NdeI와 XhoI 제한효소를 이용하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 자른 후, T4 리가아제를 이용하여 경쇄 유전자를 중쇄 유전자가 삽입되어 있는 pACYCDeut-1 벡터에 클로닝 하였다. pACYCDeut-1 벡터에 클로닝이 완료된 중쇄 및 경쇄 유전자의 염기서열 분석 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.

(3) 재조합 항체의 발현

재조합 항체 발현에는 E. coli BL21(DE3)을 사용하였다. 재조합 항체 유전자를 포함하는 pACYCDeut-1 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 주입하였다. 재조합 항체 유전자가 삽입된 pACYCDuet-1 벡터를 지닌 대장균은 클로람페니콜 항생제에 저항성을 갖게 된다. 대장균을 클로람페니콜(34 mg/ml)을 함유한 멸균된 Luria-Bertani (LB) 한천배지 위에 분주한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 LB 한천배지 위에 있는 E. coli 콜로니를 하나 선택하여 멸균된 LB 100 ml 플라스크에 클로람페니콜(34 mg/ml) 100 μl 넣은 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 대장균 10 ml을 클로람페니콜(34 mg/ml) 1ml을 함유한 멸균된 TB 배지(TB 1000 ml + 10 mM MgSO₄ + 4 ml glycerol)에 넣고 37℃에서 배양하였다. OD_600nm 값이 0.6에 도달할 때까지 배양한 후, 온도를 25℃까지 낮추고 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 최종농도가 1 mM 되도록 첨가한 후, 25℃에서 18시간 동안 재조합 항체를 발현시켰다. 재조합 항체가 발현된 대장균은 원심분리기를 통해 침전시킨 후 재조합 항체 정제 시까지 -80℃에서 보관하였다.

(4) 재조합 단백질의 정제

1L 배양액으로부터 배양한 대장균을 30 ml 1XPBS 버퍼에 균일하게 푼 후, 2mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 10 mM EDTA 그리고 inhibitor cocktail 1 tablet을 첨가하고, 초음파 파쇄기(SONOPULS Ultrasonic homogeniser, BANDELIN)를 이용하여 ice bath에서 30분 동안(pulse on 2초, pulse off 6초) 세포막을 파괴하였다. 상기 세포막이 파괴된 대장균은 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000 g에서 20분간 원심분리하고, 침전물은 버리고 상층액만 취한 후 2 ml protein L 레진을 사용하여 재조합 항체를 정제하였다.

상기 protein L 레진을 사용한 재조합 항체의 정제 방법은 구체적으로 다음과 같다. 재조합 항체가 포함된 용액을 1XPBS로 세척한 protein L 레진 2 ml과 혼합하고, ice bath에서 20분간 반응시켜 재조합 항체와 protein L 레진을 결합시킨 후, 다시 1XPBS 용액 20 ml로 레진을 세척하고, 100 mM glycin-HCl (pH 2.7) 버퍼로 용출시키고 곧바로 1M tris pH 9.0 버퍼로 중화시킨 후, 3 kDa 투석 맴브레인을 이용하여 4℃에서 1XPBS 용액으로 투석하여 최종적으로 재조합 단백질을 획득하였다.

상기 정제된 재조합 항체의 SDS-PAGE 결과(M, Marker; lane 1~4 washing; lane 5~11 elution)는 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 재조합 항체의 중쇄 및 경쇄는 약 20 내지 30 kDa의 분자량을 가지는 것을 알 수 있다.

실험예. 항원에 대한 재조합 항체의 인식 능력 확인

재조합 항체의 항원 인식 능력을 확인하기 위하여 정제된 WSSV의 VP28 재조합 단백질을 사용하여 웨스턴 면역블로팅(western immunoblot) 분석을 실시하였다.

구체적으로, WSSV에 감염된 새우 및 비-감염 새우의 아가미 조직을 마쇄하고 전기영동 한 후, 겔에 있는 단백질을 transblot 장치(ATTO, Japan)를 이용하여 144 ㎃에서 1시간 동안 나이트로셀룰로스 멤브레인 필터(advantec, Japan)에 블로팅 하였다. 블로팅 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시키고, buffer 1 (0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, pH 7.5)로 15분간 세정하였다.

이후 1차 항체로서 실시예의 재조합 항체를 2% skim milk로 10배 희석하여 1시간 반응시키고 위와 동일한 방법으로 세정하였다. 2차 항체로는 알칼리인산분해효소(alkaline phosphatase, AP)가 표식되어 있는 goat polyclonal anti-mouse IgG antibody (novus, USA)를 2% skim milk로 5,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후 5회 세정하고 발색제[100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂용액(pH 9.5) 20㎖, NBT (75 ㎎/㎖ 4-nitrotetrazolium blue chloride) 90 ㎕, BCIP (50 ㎎/㎖ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt/dimethyl-formamide) 70㎕]로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액(1mM EDTA, 10mM Tris-HCl)을 첨가하였다.

재조합 항체의 WSSV 내의 단백질 인식 부위를 나타낸 웨스턴 블로팅 결과는 도 4에 나타내었다(M: marker (kDa), G+ve: WSSV 감염새우의 아가미 조직, G-ve: 정상새우의 아가미 조직). SDS-PAGE는 실시예에서와 동일한 방법이 사용되었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 WSSV에 특이적으로 결합하는 재조합 항체는 WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액에서 25 kDa에서 반응하였고, 정상새우의 아가미 마쇄액에서는 반응하지 않았다. 이는 본 발명의 재조합 항체가 WSSV에 감염된 새우를 특이적으로 인식할 수 있음을 나타내며, 본 발명의 재조합 항체가 포함된 조성물이 WSSV의 감염여부를 확인하기 위한 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

<110> EnBioGene Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> RECOMBINANT ANTIBODY SPECIFIC FOR WHITE SPOT SYNDROME VIRUS AND USE THEREOF <130> CDP20200886 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of recombinant antibody <400> 1 Met Gly Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ala Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45 Phe Thr Phe Ile Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 85 90 95 Ser Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Cys His Trp Asp Arg Gly Asp 115 120 125 Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Ser Ala Ala 145 150 155 160 Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser 195 200 205 Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr 210 215 220 Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile 225 230 235 240 Val Pro Arg Asp Cys Gly Ser Cys Lys Pro Cys Ile His His His His 245 250 255 His His <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of recombinant antibody <400> 2 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 20 25 30 Ser Thr Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 165 170 175 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 195 200 205 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 210 215 220 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of recombinant antibody <400> 3 atgggcaaga aaaccgcaat cgcgatcgcg gttgctctgg cgggtttcgc gaccgttgct 60 caagctgaag ttcagctggc tgaaagcggc ggcggcctgg ttcagccgaa aggtagcctg 120 aaattatctt gtgctgcatc tggtttcacc ttcatcaact actacatggc gtgggttcgt 180 caggcgccgg gtaaaggcct ggaatgggtg gcgaccatct ccaccggtgg tggtaacacc 240 tactaccgtg atagcgttaa aggccgtttc accatcagcc gtgatgatag ccagagcatg 300 ctgtacctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaagataccg cgatgtacta ctgcgcgcgt 360 cactgccact gggatcgtgg tgatttcttc gattactggg gccagggcac caccctgacc 420 gttagcagcg cgaaaaccac cccgccgagc gtttacccgc tggcgccggt tagcgcggcg 480 cagaccaaca gcatggtgac cctgggctgc ctggtgaaag gttacttccc ggaaccggtt 540 accgttacct ggaacagcgg ctccctgtcc tctggtgttc acaccttccc ggcggttctg 600 cagtctgatc tgtacaccct gagcagcagc gttaccgttc cgagcagcac ctggccgagc 660 gaaaccgtta cctgcaacgt tgcgcacccg gctagtagca ctaaagtgga taaaaagata 720 gtgccgcgtg actgcggtag ctgtaaaccg tgcatccatc accatcacca ccactaa 777 <210> 4 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of recombinant antibody <400> 4 atgaagaaaa ccgccatcgc gatcgcggtt gcgctggcgg gcttcgcgac cgtcgcgcag 60 gcgcagatcg ttctgaccca gagcccggcg atcatgagca cctctccggg cgaaaaagtt 120 accatgacct gcaaagcgtc caaatctatc agcaaatacc tggcgtggta tcagcagaaa 180 ccgggtagct ccccgcgtct gctgatctac agcggtagca ccctgcagag cggcgttccg 240 gttcgtttct ccggtagcgg ctctggcacc tcttactctc tgaccatcag ccgtatggaa 300 gcggaagatg cggcgaccta ctactgccag cagcacaacg aatacccgct gaccttcggc 360 agcggcacca aactggaaat caaacgtgcg gatgcggcgc cgaccgtttc tatcttcccg 420 ccgagcagcg aacagctgac cagcggtggc gcgagcgttg tttgcttcct gaacaacttc 480 tacccgaaag atattaacgt taaatggaaa atcgatggca gcgaacgtca gaacggtgtt 540 ctgaactctt ggaccgacca ggatagcaaa gatagcacct actctatgtc ctctaccctg 600 accctgacca aagatgaata cgaacgtcac aacagctaca cctgcgaagc gacccacaaa 660 acctctacca gcccgatcgt taaatctttc aaccgtaacg aatgctaa 708

Claims

서열번호 1로 표시되는 중쇄 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄를 포함하는, 흰반점증후군 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)에 특이적으로 결합하는 재조합 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 흰반점증후군 바이러스의 항원단백질 VP28에 특이적으로 결합하는 것인 재조합 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 중쇄 및 경쇄의 분자량이 각각 20 내지 30 kDa인 재조합 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 항체를 코딩하는 핵산분자.
제4항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
제5항의 벡터로 형질전환된 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항의 재조합 항체를 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 조성물.
제7항의 진단용 조성물을 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 키트.
제7항의 진단용 조성물을 포함하는 흰반점증후군 바이러스 감염여부 진단용 마이크로어레이.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항의 재조합 항체를 이용한 흰반점증후군 바이러스 감염여부를 진단하는 방법.