KR101919403B1 - 재조합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치쿤구니야 바이러스 항원 재조합 단백질을 이용하여 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 감염 여부 진단 키트 및 진단을 위한 정보를 제공하는 것으로, 상기 재조합 단백질을 이용하여 상기 바이러스 감염 여부를 진단하는 경우에는 혈액 내 항체를 효과적으로 검출하여, 상기 바이러스 진단 시 민감도 및 정확도를 높일 수 있다.

Description

재조합 단백질 및 그의 용도{RECOMBINANT PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 재조합 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)는 토가비리데과(family Togaviridae), 알파바이러스속(genus Alphavirus)에 속하는 직경 60 내지 70nm (+)ssRNA 바이러스로 감염된 열대숲모기(Aedes aegypti)나 흰줄숲모기(Aedes albopictus, Tiger mosquito)를 매개로 하여 전파되는 급성열성질환인 치쿤구니야 열병을 일으키는 바이러스로 알려져 있다. 상기 치쿤구니야 바이러스가 감염되는 경우 10~15%는 무증상을 보이지만, 나머지 감염자는 1 ~ 12일의 잠복기를 거쳐 갑작스러운 고열, 간헐적 오한, 두통, 구역질, 구토, 극심한 관절통, 점상출혈발진 및 구진발진 등의 증세를 보이며, 39~40℃에 이르는 고열이 수일 동안 지속되는 것으로 보고되어 있다. 특히, 관절통의 경우 감염자의 30~40%가 수년간 지속되는 만성질환으로 나타날 수 있을 뿐만 아니라, 신생아의 경우 뇌수막염으로까지 이어질 수 있는 질병으로 알려져 있다.
또한, 상기 치쿤구니야는 갑작스런 소모성 질환을 일으킬 수 있는 유행성 잠재력을 가지고 있기 때문에, 개발도상국에서는 잠재적인 위협이 되며, 지속적인 확인으로 인하여 선진국 및 새로 나타나는 풍토성 충돌 지역 내 군사적 배치로 인하여 군인들에게 위협이 상당할 것이다. 상기 치쿤구니야 바이러스 감염은 피고용인이 감염되는 경우 만성적인 무기력한 증상으로 인하여, 유행지역에서 장기 결근으로 이어져 지역 산업이 영향을 받기 때문에 심각한 경제적 타격을 준다는 문제점이 존재한다.
상기 치쿤구니야 바이러스가 감염되어 치쿤구니야 열이 발생되는 경우, 열, 관절통, 발진 등의 증상을 통해 진단할 수 있지만 뎅기열과 증상이 매우 유사하여 그 정확한 진단이 쉽지 않다. 따라서, 상기 바이러스의 감염 여부를 확실히 하는 방법은 현재까지 혈액 검사 또는 뇌척수액 검사를 통해 혈중 바이러스를 확인하는 방법 밖에 없고, 이러한 방법은 4일에서 14일이 소요되어 조기 진단이 어렵다는 단점이 존재한다.
본 발명의 일 목적은 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 재조합 단백질을 이용하여 치쿤구니야 바이러스 감염 여부 진단 키트 및 진단을 위한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다
본 발명자들은 연구 결과, 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 항원 단백질 E2의 아미노산 서열을 기반으로 제조한 재조합 단백질을 이용하여 치쿤구니야 바이러스의 감염 개체의 혈청 내 존재하는 IgG 및 IgM 검출을 통해 상기 바이러스 감염 여부를 매우 효과적으로 진단할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 상기 바이러스 감염, 특히 본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스 감염 진단은 외부로 나타나는 병증만으로 어떠한 바이러스의 감염이 발생하였는지 판단하는 것은 불가능하기 때문에 매우 중요한 방법에 해당한다. 진단방법으로는 생물학적 검정, 혈청학적 진단 및 효소 항체 결합법에 의한 전자현미경 검정 방법 등이 존재한다. 구체적으로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, 바이러스의 항원이 부착되어 있는 기판에 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 혈청을 희석하여 넣어준 뒤, 항원-항체 결합 수준 측정을 통해 바이러스의 감염 여부를 진단하는 것에 해당한다.
반면에, 바이러스 개체가 감염되었을 경우 이를 치료하기 위한 요법에 해당하는 백신 프로토콜의 일종인 면역요법은 바람직한 치료요법적 효과를 부여하기 위하여 개인의 면역 반응을 조절하는 것을 지칭한다. 특히, 면역치료제(Immunotherapeutics)는 개체에 투여 되었을 때, 원하지 않는 면역 반응과 연계된 증상을 궁극적으로 감소시키거나 원하는 면역 반응을 증가시켜 감염된 개체에서 발생할 수 있는 증상을 궁극적으로 경감시키는데 충분하도록 개체의 면역계를 조절하는 조성물을 지칭한다. 따라서, 바이러스 감염에 대한 보호를 제공하고 바이러스를 포함하는 병원체 감염의 치료를 위하여, 상기 바이러스의 항원 등을 직접 개체에 투여하는 접종하는 방식으로 이루어진다는 특징이 있어, 진단방법과는 전혀 상이한 프로토콜을 따른다.
본 발명의 일 구현 예에서는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질"이란, 치쿤구니야 바이러스의 외피를 구성을 하는 단백질을 의미한다. 상기 외피 항원 단백질은 E1, E2, E3 및 6K로 구성되어 있으며, 본 발명은 발명의 목적상 외피 항원 단백질 중 외피 돌출 부위에 해당하여 바이러스의 외피 구성에 중추적인 역할을 하는 E2 외피 항원 단백질을 이용한 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 E2 항원 단백질은 서열번호 1로 표시되는 341개의 아미노산 서열로 구성된 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 1로 표시되는 341개의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 치쿤구니야 바이러스 감염의 진단을 위하여 감염이 의심되는 환자의 혈청과 반응시키는 경우, 진단의 민감도 및 정확도를 현저하게 높일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서는 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질의 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합 되어 있을 수 있다. 히스티딘-표지가 결합 되는 경우에는 형질전환에 의해 숙주세포에서 발현이 유도된 이후 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 빠르게 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 단백질의 순도를 높일 수 있다는 장점이 존재한다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
단, 본 발명에서 상기 "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 본 발명에 따른 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy), 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 재조합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 상기 변형 유전자 역시 본 발명의 보호범위 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 절편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 "발현 벡터"란, 숙주세포에 DNA를 도입하여 본 발명의 재조합 단백질을 미생물에서 발현시키기 위한 수단으로서, 상기 발현 벡터의 제작 시에는 상기 재조합 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열 및 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에서 숙주가 효모 (yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2시그널 서열 등이, 숙주가 동물 세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 pET49b 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질과 목적하는 개체의 시료 내 존재하는 항체, 바람직하게는 인간의 IgG 및/또는 IgM의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에서 상기 "키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품을 모아놓은 세트를 의미한다. 구체적으로 상기 키트에는 본 발명에 따른 진단용 조성물뿐만 아니라, 상기 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 분석에 사용되는 본 발명의 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 키트를 이용하는 경우, 목적하는 개체로부터 얻은 시료로부터 상기 재조합 단백질의 항원-항체 복합체 형성 수준을 비교하여, 목적하는 개체에 있어서, 감염 초기 잠복기가 존재하는 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 조기에 진단하여 개별화된 환자에게 적극적인 치료 시행 및 세밀한 관찰요법 여부를 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 키트는 단백질 칩 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 '단백질 칩 키트' 라 한다); 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 'ELISA 키트'라 한다)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “단백질 칩 키트”란, 특정 단백질과 반응할 수 있는 항체 등을 단일 칩 상에 고밀도로 고정화 시킨 키트를 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 특정 단백질은 본 발명에 따른 재조합 단백질 일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질의 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 항체의 결합물을 nCounter 등으로 계수하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "ELISA 키트"란, 효소를 표식자로 하여 항원-항체 반응을 이용한 항원 또는 항체량 측정 방법을 일반적으로 효소면역분석법을 총칭하며, 본 발명의 목적상 상기 ELISA 키트는 본 발명에 따른 재조합 단백질을 포함한다. 또한, 상기 ELISA 키트는 상기 재조합 단백질에 결합된 목적하는 개체 내의 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 항체와 결합(link)되어 있는 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질과 목적하는 개체의 시료 내 존재하는 항체와의 복합체 형성 수준을 측정하여 치쿤구니야 바이러스 감염을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료 내에서 본 발명에 따른 재조합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 상기 재조합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "목적하는 개체"란, 치쿤구니야 바이러스 감염의 여부가 확실하지 않은 개체로, 감염 가능성이 높은 개체를 의미한다. 또한, 상기 개체에서 분리된 시료란, 감염 가능성이 높은 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 객담과 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 바람직하게는 인간의 혈청 내에 포함되어 있는 IgG 및 IgM 항체 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에 있어서 상기 항원-항체 복합체 형성 수준의 측정은 정상 대조군, 즉 치쿤구니야 바이러스가 감염되지 않은 개체에서의 본 발명에 따른 재조합 유전자를 항원으로 하는 항원-항체 복합체 형성 수준과, 치쿤구니야 바이러스가 감염된 것으로 의심되는 환자, 즉 목적하는 개체의 항원-항체 복합체 형성 수준을 비교할 수 있고, 상기 복합체 형성 수준의 차이를 판단하여, 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원-항체 복합체 형성 수준이 치쿤구니야 바이러스가 감염되지 않은 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체가 치쿤구니야 바이러스가 감염되었을 것으로 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "항원-항체 복합체"란, 본 발명에 따른 재조합 단백질과 목적하는 개체 내 존재하는 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 수준은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "항원-항체 복합체 형성 수준 측정"이란, 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 진단하기 위하여 본 발명에 따른 상기 재조합 유전자와 결합하는 목적하는 시료 내 존재하는 항체의 존재 정도를 확인하는 과정으로, 본 발명에 따른 재조합 유전자를 이용하여 목적하는 시료 내의 항체의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 "검출 라벨은 효소"는, 예를 들면 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 검출 라벨로서 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 형광물로서 이용 가능한 것에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2 +, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질 E2를 이용한 재조합 단백질을 이용하여 상기 바이러스 감염 여부를 진단하는 경우에는 혈액 내 항체를 효과적으로 검출하여, 상기 바이러스 진단 시 민감도 및 정확도를 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질의 발현을 위한 플라스미드 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질의 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질을 이용한 정상 및 치쿤구니야 바이러스 감염 환자 혈청 내 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[ 실시예 1] 치쿤구니야 외피 항원 단백질 발현 플라스미드 제작
치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 검출을 위하여 정확성 및 감수성을 현저하게 높일 수 있는 아미노산 서열인 치쿤구니야 바이러스의 외피 단백질 항원 E2의 일부분에 해당하는 341 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 제작하였다.
상기 재조합 단백질을 제작하기 위하여, 하기 PCR 반응을 실시하였다. 첫 번째 증폭 반응은 치쿤구니야 게노믹 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1의 1번 및 2번의 프라이머로 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 70초의 합성 조건에서 실시하는 변성-어닐링-합성 사이클을 25회 반복하여 반응물을 얻었다. 상기 PCR 반응물인 E2 재조합 단백질 유전자는 pET49b(Addgene) 벡터에 삽입하여 단백질 발현 플라스미드(plasmid)를 제작하였다. 상기 단백질 발현 플라스미드는 DNA 서열분석(sequencing, macrogen)을 통해 검증한 결과, 서열번호 2와 같음을 확인하였다. 상기 제작된 플라스미드의 모식도는 도 1과 같다.
번호 프라이머 서열
1 5' G GGA TCCG AGC ACC AAG GAC AAC TTC AAT GTC T 3'
2 5' C GTCGAC TTA CGG CCA ATA CTT GTA CGG CTC 3'
[ 실시예 2] 치쿤구니야 재조합 단백질 생산
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 유전자 발현 플라스미드를 통해 치쿤구니야 외피 단백질 E2의 재조합 단백질을 생산하였다.
상기 재조합 유전자 발현 플라스미드를 화학적으로 처리한 BL21 (DE3 E.coli) 대장균에 형질전환(transformation) 방법에 의해 삽입(insert)하고, 카나마이신(kanamycin) 항생제가 포함되어 있는 LB 아가(agar) (Becton, Dickinson and Company) 플레이트에 상기 형질전환된 대장균을 배양하였다. 상기 배양하는 과정을 통하여, 항생제 내성이 있는 플라스미드 벡터가 포함되어 있는 단일 대장균 콜로니를 1mM의 카나마이신이 있는 액체 배지(LPS)에 넣고, 37℃의 항온 진탕 배양기에서 배양하였다. 상기 배양액의 OD600값이 ~0.7이 되면, 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필울-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 1 mM을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 재조합 단백질의 발현이 유도된 대장균은 4,000 rpm에서 20분 원심분리하여 수득하고, 상기 대장균 세포의 용해(cell lysis)는 소니케이터(sonicator)를 이용하였다. 상기 세포 용해액은 원심분리를 통해 다른 세포 이물질을 제거한 뒤, Ni-NTA 한천 비드(Qiagen)와 4℃에서 2시간 결합시켰다. 그 후, 10 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 비특이적인 결합을 한 다른 단백질들을 제거하고, 50 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린을 이용하여 최종적으로 비특이적 결합의 단백질을 제거하였다. 비드에 결합 되어 있던 재조합 단백질은 250 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린을 이용한 경쟁적인 저해 방법으로 Ni-NTA 한천 비드에서 용리시켜 수득하였다. 상기 수득된 재조합 단백질(추출, elution)은 SDS-PAGE를 통하여 사이즈 및 순도를 확인하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 상기 과정을 통하여 제조된 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 E2 재조합 단백질이 약 38 KDa에서 관찰되는 것으로 보아, 재조합 단백질의 제작 및 발현이 제대로 된 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 치쿤구니야 외피 항원 E2 재조합 단백질을 이용한 진단 효과 검증
상기 실시예 2에서 제조한 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 치쿤구니야 바이러스 감염 여부 확인을 위한 진단 효과를 ELISA 방법에 의해 검증하였다.
상기 ELISA는 코팅용액(Na2CO3 0.159g, NaHCO3 0.293g, 100ml 당, pH9.6)에 상기 실시예 2에서 제조한 재조합 단백질 및 대조군에 해당하는 상업적으로 판매되는 426 아미노산 서열을 갖는 치쿤구니야 항원 단백질을 3.0㎍/ml의 농도로 희석하여 최종 부피 100㎕를 96웰 플레이트의 각각 웰(well)에 넣어 준 후, 4℃에서 하루동안 흡착 과정을 거쳤다. 항원의 흡착이 완료된 상기 플레이트는 PBS를 이용하여 4회 세척 과정을 거친 뒤, 비특이적 결합을 배제하기 위하여 정상 염소 혈청이 5% 포함되어 있는 PBS를 각각의 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
치쿤구니야 감염 환자 혈청 및 치쿤구니야가 감염되지 않은 정상 대조군의 혈청을 부피비 1:300의 비율에 해당하도록 완충액으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBS로 4회 세척 과정을 거친 후 발색을 위한 효소가 결합 되어 있는 horse radish peroxidase-conjugated Goat anti-Human IgG 및 IgM 항체와 반응 후 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤에 암실에서 기질 완충용액(3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) 및 과산화수소수)을 첨가하여 발색 시키고, 2N 황산을 가하여 발색 반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 3의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
도 3의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2에서 제작한 재조합 단백질(ChiK E2341)과 치쿤구니야 감염 환자의 IgG 및 IgM 항체와 반응은 대조군인 업체에서 제조한 대조군(chiKE2426) 보다 민감도 및 특이도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었고, 특히 감염 초기에 검출되는 IgM항체를 매우 민감하게 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 본 발명에 따른 재조합 단백질을 치쿤구니야 바이러스 감염 여부 진단을 위한 항원으로 사용하는 경우 단순히 치쿤구니야 항원 단백질인 E2(chiKE2426)를 사용한 것에 비하여 민감성 및 특이성에 현저한 상승 효과가 있는 것을 알 수 있다.
상기 결과를 이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> YEONSEI, YEONSEI <120> RECOMBINANT PROTEIN AND USE THEREOF <130> DPB163725 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Chikungunya virus <400> 1 Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val 20 25 30 Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile 35 40 45 Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp 50 55 60 Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg 65 70 75 80 Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr 85 90 95 Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr 100 105 110 Val Gly Phe Thr Asp Gly Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro 115 120 125 Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg 130 135 140 Pro Gln His Gly Arg Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro 165 170 175 Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val 180 185 190 Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser Ser Glu 195 200 205 Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln 210 215 220 Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro 225 230 235 240 Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Ser Gly Asp Arg Lys Gly Lys Val His 245 250 255 Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg 260 265 270 Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr 275 280 285 Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro 290 295 300 Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg Leu Thr 305 310 315 320 Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr 325 330 335 Lys Tyr Trp Pro Gln 340 <210> 2 <211> 1030 <212> DNA <213> Chikungunya virus <400> 2 ggatccgagc accaaggaca acttcaatgt ctataaagcc acaagaccgt acctagctca 60 ctgtcccgac tgtggagaag ggcactcgtg ccatagtccc gtagcgctag aacgcatcag 120 aaacgaagcg acagacggga cgttgaaaat ccaggtttcc ttgcaaatcg gaataaagac 180 ggatgatagc catgattgga ccaagctgcg ttatatggac aatcacatgc cagcagacgc 240 agagcgggcc gggctatttg taagaacgtc agcaccgtgc acgattactg gaacaatggg 300 acacttcatt ctggcccgat gtccgaaagg agaaactctg acggtggggt tcactgatgg 360 tagaaagatc agtcactcat gtacgcaccc atttcaccac gaccctcctg tgataggccg 420 ggaaaaattc cattcccgac cgcagcacgg tagggaacta ccttgcagca cgtacgcgca 480 gagcaccgct gcaactgccg aggagataga ggtacatatg cccccagaca ccccagatcg 540 cacattaatg tcacaacagt ccggcaatgt aaagatcaca gtcaatagtc agacggtgcg 600 gtacaagtgc aattgtggtg actcaagtga aggattaacc actacagata aagtgattaa 660 taactgcaag gttgatcaat gccatgccgc ggtcaccaat cacaaaaaat ggcagtataa 720 ttcccctctg gtcccgcgca atgctgaatc cggggaccgg aaaggaaaag ttcacattcc 780 atttcctctg gcaaatgtga catgcagggt gcctaaagca agaaacccca ccgtgacgta 840 cggaaaaaac caagtcatca tgttgctgta tcctgaccac ccaacgctcc tgtcctacag 900 gaatatggga gaagaaccaa actatcaaga agagtgggtg acgcataaga aggagatcag 960 gttaaccgtg ccgactgaag ggctcgaggt cacgtggggt aacaatgagc cgtacaagta 1020 ttggccgcag 1030

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 E2 단백질로 구성되고, 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합되어 있는 재조합 단백질을 유효성분으로 구성되는, 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료 내에서 서열번호 1로 표시되는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 E2 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 서열번호 1로 표시되는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 E2 단백질과의 항원-항체 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 항원-항체 복합체 형성 수준 측정 방법은 방사상면역분석, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석 방법을 통해 측정되는 것인, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 시료는 혈청 내 IgG 및 IgM 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군 시료의 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 치쿤구니야 바이러스가 감염된 것으로 평가하는, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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