CN108387745B - Cd4+t淋巴细胞特征蛋白在鉴定潜伏结核感染和活动性肺结核中的应用 - Google Patents

Cd4+t淋巴细胞特征蛋白在鉴定潜伏结核感染和活动性肺结核中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CD4+T淋巴细胞特征蛋白在鉴定活动性肺结核和潜伏结核感染中的应用。本发明提供了检测integrin beta‑3和/或integrin‑linked kinase表达量的物质在制备区分或鉴定或辅助区分或鉴定活动性肺结核患者和结核潜伏感染者产品中的应用。本发明发现了integrin beta‑3和integrin‑linked kinase蛋白可以区分LTBI患者和初治活动性肺结核患者，这为诊断LTBI患者和初治活动性肺结核患者提供了新的诊断标准。

Description

CD4+T淋巴细胞特征蛋白在鉴定潜伏结核感染和活动性肺结 核中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及CD4+T淋巴细胞特征蛋白在鉴定活动性肺结核和潜伏结核感染中的应用。
背景技术
2015年世界卫生组织在“MTB(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)潜伏感染(1atent TB infection，LTBI)诊治指南”中，将LTBI定义为没有活动性结核病的临床表现，但机体持续存在对MTB抗原刺激的免疫应答的一种状态。据世界卫生组织估计，全球约1/3的人感染结核结核分枝杆菌，其中超过95％表现为结核潜伏性感染，其中5～10％的LTBI感染者最终会发展成为活动性结核，成为主要的传染源。LTBI感染者众多，是目前结核病有效防控的关键与难点所在，因此，准确诊断结核菌潜伏感染，对于结核病的预防具有十分重要的意义。
由于潜伏感染者缺乏特异性症状，而且目前诊断结核潜伏感染还没有统一的标准和方法，因此很难在健康人群中快速检测出结核潜伏感染患者。临床实践中用于LTBI筛查的方法主要有：结核菌素皮肤试验(Mantoux tuberculin skin test,TST)、-干扰素释放试验(Interferon-gamma release assays,IGRA)。TST简单易行，但无法区分MTB感染和卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)接种，在免疫缺陷人群中的敏感性较低。在中国结核病高度流行地区，由于广泛接种BCG，TST会造成假阳性；而在HIV感染患者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下的人群中容易出现假阴性。另外，TST检测还存在费时(48～72小时)、需要受试者回访、皮试操作和结果解释存在主观依赖性等缺点。IGRA检测LTBI的特异性高于TST，且不受BCG接种以及非结核分枝杆菌(nontuberculoaus mycobacteria，NTM)感染的影响。但是，由于目前的IGRA实验只检测IFN-γ一种分子，敏感性低、容易受机体其他因素干扰，而且仅仅只能够检测到结核杆菌的感染，不能够区分活动性结核和潜伏性结核感染。而且，IGRA实验需要抽血获取淋巴细胞、要求专业的操作人员和具备相应条件的实验室、样品必须在采集后8小时内完成等缺点，现阶段仍未能完全取代TST。另外，现阶段研究的样本都非常小，也没有诊断LTBI的金标准。因此，对于IGRA还有待进一步研究。
另外，虽然也有新的标志物如：白细胞介素-2(IL-2)、HSP16.3、干扰素诱导蛋白10(IP-10)及单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)等的出现，但是仍缺乏足够的临床证据。
结核杆菌感染主要引起细胞免疫，T淋巴细胞在受到抗原刺激后产生分化、增殖、合成和分泌一系列细胞因子，产生特异性的细胞免疫。其中，CD4+T淋巴细胞在分泌淋巴因子，激活、趋化巨噬细胞，促进巨噬细胞完全杀灭结核杆菌等方面起到重要的作用。
整合素(integrin)，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质黏附作用的膜表面黏附分子，同时参与细胞的信号转导、生长、分化、凋亡、伸展和移动、炎症、血栓形成、肿瘤转移和创伤愈合等一系列重要生理和病理过程。αIIbβ3是整合素家族中研究最多的分子，是整合素家族中的代表。αIIbβ3是血小板膜表面表达最丰富的整合素分子，它在血小板粘附、聚集、释放等止血功能中发挥着重要的作用。研究发现整合素αⅡbβ3的信号可分为由膜内向膜外的信号和由膜外向膜内的信号，前者由激动剂诱导引起血小板活化，改变整合素αIIbβ3的构像，使整合素αIIbβ3与其配体粘附；后者由配体与整合素αIIbβ3受体连结后而引发产生一系列血小板功能。
整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)，是整合素信号通路中一个重要的调节蛋白，在整合素信号通路的活化过程中发挥了至关重要的调节作用。它是一个由452个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在全身多种组织中高表达，蛋白结构域分析提示，ILK包含一个N端锚蛋白重复结构(ankyrin repeat domain，ARD)和一个C末端与整合素胞质尾部结合的激酶样结构。它通过与整合素亚单位的结合共同介导细胞与细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)，甚至细胞与细胞之间的信号传导，从而影响细胞外信号向下游的传递，调节细胞的生长、增殖、分化、生存、迁移、凋亡、黏附和侵袭。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质的用途。
本发明提供的检测integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质在制备区分或鉴定或辅助区分或鉴定活动性肺结核患者和结核潜伏感染者产品中的应用。
本发明的另一个目的是提供检测integrin alpha-IIb(整合素alpha-IIb)、integrin beta-3(整合素beta-3)和/或integrin-linked kinase(整合素连接激酶)表达量的物质的用途。
本发明提供的检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质在制备检测或辅助检测是否为肺结核患者的产品中的应用；
或本发明提供的检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质在制备检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者的产品中的应用。
上述应用中，所述检测integrin alpha-IIb表达量的物质为下述1)或2)：
1)利用蛋白质质谱检测integrin alpha-IIb表达量所需的试剂和/或仪器；
2)利用Western Blot检测integrin alpha-IIb表达量所需的试剂和/或仪器；
和/或，所述检测integrin beta-3表达量的物质为下述3)或4)：
3)利用蛋白质质谱检测integrin beta-3表达量所需的试剂和/或仪器；
4)利用Western Blot检测integrin beta-3表达量所需的试剂和/或仪器；
和/或，所述检测integrin-linked kinase表达量的物质为下述5)或6)：
5)利用蛋白质质谱检测integrin-linked kinase表达量所需的试剂和/或仪器；
6)利用Western Blot检测integrin-linked kinase表达量所需的试剂和/或仪器。
上述应用中，所述integrin alpha-IIb的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
和/或，所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
和/或，integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
本发明第3个目的是提供以integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为标志物的区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的物质的用途。
本发明提供了以integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为标志物的区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的物质在制备区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者产品中的应用；
或本发明提供了以integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为标志物的检测或辅助检测是否为肺结核患者的物质在制备检测或辅助检测是否为肺结核患者产品中的应用；
或本发明提供了以integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为标志物的检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者的物质在制备检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者产品中的应用。
上述应用中，所述区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的物质为检测integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质；
或，所述检测或辅助检测是否为肺结核患者的物质为检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质；
或，所述检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者的物质为检测integrinalpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质。
本发明第4个目的是提供integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的标志物的用途。
本发明提供了integrin beta-3和/或integrin-linked kinase作为区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的标志物在区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者中的应用；
或，本发明提供了integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linkedkinase作为检测或辅助检测是否为肺结核患者的标志物在检测或辅助检测是否为肺结核患者中的应用；
或，本发明提供了integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linkedkinase作为检测或辅助检测是否为肺结核患者的标志物在检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者中的应用。
本发明第5个目的是提供区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的物质。
本发明提供的区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的物质，为检测integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质；
或，本发明提供的检测或辅助检测是否为肺结核患者的物质，为检测integrinalpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质；
或，本发明提供的检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者的物质，为检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量的物质。
本发明第6个目的是提供区分或辅助区分活动性肺结核患者和结核潜伏感染者的方法。
本发明提供的方法，包括检测待测样本中integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量，根据integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量确定待测样本是活动性肺结核患者还是结核潜伏感染者；
或，检测或辅助检测是否为肺结核患者的方法，包括检测待测样本中integrinalpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量，根据integrinalpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量确定待测样本是否为肺结核患者；
或，检测或辅助检测是否为结核潜伏感染者的方法，包括检测待测样本中integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量，根据integrin alpha-IIb、integrin beta-3和/或integrin-linked kinase表达量确定待测样本是否为结核潜伏感染者。
上述方法中，所述待测样本为结核分枝杆菌感染者；
和/或，所述integrin alpha-IIb的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
和/或，所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
和/或，integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
本发明的实验证明，本发明发现了integrin alpha-IIb、integrin beta-3和integrin-linked kinase蛋白可用于区分健康人和LTBI患者或者区分健康人和初治活动性肺结核患者，更重要的是integrin beta-3和integrin-linked kinase蛋白可以区分LTBI患者和初治活动性肺结核患者，这为诊断LTBI患者和初治活动性肺结核患者提供了新的诊断标准。
附图说明
图1为BCA蛋白定量法标准曲线。
图2为Western验证CD4+T淋巴细胞特征蛋白结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、区分活动性肺结核和潜伏结核感染的CD4+T淋巴细胞特征蛋白的发现及应用
下面实验用仪器是液相色谱-电喷雾电离串联质谱(Q-Exactive ThermoFinnigan)，电泳仪(Bio-rad,美国)，MultiSkans酶标仪(Thermo,美国)。
一、CD4+T淋巴细胞的收集
收集已经临床诊断LTBI患者、已经临床诊断初治活动性肺结核患者(防止药物对机体产生影响)和健康对照血液样本，各9例。所有的血液样本均在清晨空腹状态下抽取，采用一次性真空抗凝管，采集外周血5.0ml。
2小时内用淋巴细胞分离液(Lymphoprep，Stemcell)提取外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)细胞，然后分离出CD4+T淋巴细胞(CD4+TCell Isolation Kit,Miltenyi)，用流式细胞仪检测提取的CD4+T淋巴细胞纯度达94.71％。
二、质谱检测CD4+T淋巴细胞特征蛋白
1、蛋白质提取
1)-20℃冰箱预冷研钵，从-80℃冰箱取出冻存的CD4+T淋巴细胞样品。
2)将其转入预冷的无热源的离心管里，加入0.3ml的蛋白裂解液中一起充分振荡，保证最大限度的分散和破碎细胞，直到溶液透明均一。
3)加入0.1ml的蛋白裂解液中一起振荡，直至看不到明显的悬浮物为止，转入预冷的1.5ml管。
4)检测每管研磨物的体积是否一致，未发现有研磨物过少的现象。
5)超声破碎设置为每次2秒，间隔10秒，共5次，整个操作在冰上进行。
6)超声破碎物在冰上放置20分钟，4℃10,000g离心30分钟，取上清转入新管，得到源于9例LTBI患者的CD4+T淋巴细胞蛋白、源于9例初治活动性肺结核患者的CD4+T淋巴细胞蛋白和源于9例健康对照的CD4+T淋巴细胞蛋白，在-80℃冰箱保存。
蛋白裂解液配方：8.0M脲100mM Tris-HCl pH 8.0 10mM DTT 1X蛋白酶抑制剂(Roche)。
2、蛋白定量
将上述1提取的源于9例LTBI患者的CD4+T淋巴细胞蛋白、源于9例初治活动性肺结核患者的CD4+T淋巴细胞蛋白和源于9例健康对照的CD4+T淋巴细胞蛋白分别作为待测蛋白进行如下定量检测：
1)最终的蛋白总量分别为0μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg和25μg，对同一个蛋白浓度标准曲线的检测点设为两个。
2)根据计算配置蛋白溶液，加入计算好体积的BCA，总体积为25μl。同时准备好被检样本1ul，与25ul水混合。
3)按50：1混匀BCA试剂的A液和B液生成工作液，每管加入200μl，混匀。加入检测酶标板。
4)在37℃保温30分钟，然后室温放置5分钟。肉眼观察是否存在紫色的梯度。如果梯度不明显，终止下一步检测。
5)用酶标仪(BioTek公司)检测，检测波长设定在562nm。
6)根据检测结果，生成标准曲线，如果相关性R<0.90，标准曲线不能用于计算，重新进行实验。
7)根据标准曲线(图1，线性公式：Y＝0.05422X+0.14396，R2＝0.9984)推导出检测蛋白的总量，并计算相应浓度。
注意：
1.蛋白样品检测前的准备，保证样品充分溶解，无悬浮物和混浊，静置无沉淀，所使用的缓冲质和BCA试剂兼容。
2.根据样本起始材料量，将待测蛋白总量调整在检测区间之内。
结果如表1所示，其中，样品编号1-3是9例正常的3个样本混合结果，样品编号4-6是9例潜伏结核感染的3个样本混合结果，样品编号7-9是9例活动性肺结核的3个样本混合结果。
表1为BCA蛋白定量法测得样品浓度及总量分布表
Figure BDA0001586719280000061
Figure BDA0001586719280000071
3、胰蛋白酶解样本
(1)将上述2定量后的蛋白质取200μg蛋白溶液置于离心管中，用8M尿素溶液将体系定至125μl；
(2)加入现配的5μl 1M DTT溶液至体系中，混匀后，37℃孵育1h；
(3)加入现配的20μl 1M IAA溶液至体系中，混匀后，避光，室温(25℃)反应1h；
(4)吸取所有样品加入到10kD超滤管中，12000rpm(不超过14000g)离心20min，弃掉收集管底部溶液；
(5)加入100μl尿素溶液(8M)至超滤管中，12000rpm离心10min，重复2次。
(6)在超滤管中加入胰蛋白酶(100U/μg)2-4μg(与蛋白质量比1:50-100)，体积50μl，37℃反应过夜20h；次日，12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心，收集管底部沉淀，得到酶解产物。
4、液相分级以及蛋白质质谱检测
取上述3得到的酶解产物，按照定量结果取10μg进行LCMSMS分析。采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为含有2％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：2ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)，B液为含有84％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：84ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)。色谱柱Thermo EASY column SC200150μm×100mm(RP-C18)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样到Thermo EASY column SC001traps 150μm×20mm(RP-C18)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到45％(体积百分比含量，下同)；100min-108min，B液线性梯度从45％到100％；108min-120min，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在M/Z 200时分辨率为70000，MS2在M/Z 200时分辨率为17500。
5、质谱鉴定
先利用Trans-Proteomic Pipeline软件提取一级质谱定量信息(采用软件默认参数)，利用ProfileAnalysis2.0软件进行定量(采用软件默认参数)。然后利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合，具体如下：
以Peptide FDR≤0.05对数据进行筛选过滤。导入Maxquant软件(属于ProteinScape2.1软件的一部分)进行Label-free分析。主要参数如下：
Main search ppm：6Missed cleavage：2
MS/MS tolerance ppm：20De-Isotopic：TRUE
enzyme：Trypsin database：ipi.human.3.87.fasta
Fixed modification：Carbamidomethyl(C)
Variable modification：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)
Decoy database pattern：reverse
Lable free quantification(LFQ)：TRUE
LFQ min ratio count：2
Match between runs：2min
Peptide FDR：0.05
Protein FDR：0.05
筛选出3个fold change(比值)＞1.5或者<0.6的差异蛋白，从而获得区分患者蛋白特征谱。其中，比值＞1.5的蛋白为表达上调的蛋白，比值<0.6的蛋白为表达下调的蛋白，比值为A患者的相应蛋白的平均表达量与B患者的对应蛋白的平均表达量的比值。
最终所得区分A患者和B患者蛋白特征谱中含有表达差异的4种蛋白质，A患者和B患者比较存在差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质。
结果如表2所示，
表2为3组患者中存在差异的蛋白质
Figure BDA0001586719280000091
可以看出，LTBI组和健康对照组相比较，在LTBI组及活动性肺结核组中表达差异的蛋白质为上调的蛋白质：integrin alpha-IIb(整合素alpha-IIb，序列1)、integrinbeta-3(整合素beta-3，序列2)、integrin-linked kinase(整合素连接激酶，序列3)；其中，integrin beta-3和integrin-linked kinase这两种蛋白质亦能有效区分LTBI患者和活动性肺结核患者，在活动性肺结核患者中表达量更高(P<0.0001)。
阀值计算公式：LTBI组相对表达量/健康组相对表达量
区分健康和LTBI的阈值，若待测样本中integrin alpha-IIb相对表达量大于2.59、integrin beta-3相对表达量大于3.70，和/或integrin-linked kinase相对表达量大于1.58(满足至少一种即可)，则待测样本为LTBI，若不符合上述条件，则待测样本为健康；
阀值计算公式：肺结核组相对表达量/健康组相对表达量
区分健康和肺结核患者的阈值(包括活动性和LTBI)，若待测样本中integrinalpha-IIb相对表达量大于3.04、integrin beta-3相对表达量大于5.50，和/或integrin-linked kinase相对表达量大于2.42(满足至少一种即可)，则待测样本为肺结核患者，若不符合上述条件，则待测样本为健康；
阀值计算公式：肺结核组相对表达量/LTBI组相对表达量
区分LTBI和活动性肺结核患者的阈值，若待测样本中integrin beta-3相对表达量大于1.49和/或integrin-linked kinase相对表达量大于1.54(满足至少一种即可)，则待测样本为LTBI患者，若不符合上述条件，则待测样本为活动性肺结核患者。
三、Western验证CD4+T淋巴细胞特征蛋白
1、试剂及耗材
Figure BDA0001586719280000092
Figure BDA0001586719280000101
Figure BDA0001586719280000111
2、细胞蛋白抽提
预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂)。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1×107向上述一收集的各组的CD4+T淋巴细胞加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，得到蛋白。
BCA法蛋白定量，结果源于9例LTBI患者的CD4+T淋巴细胞蛋白、源于9例初治活动性肺结核患者的CD4+T淋巴细胞蛋白和源于9例健康对照的CD4+T淋巴细胞蛋白的量分别为表1。
3、目的蛋白WB检测
根据目的蛋白的分子量，配制12％和8％的分离胶，浓缩胶浓度为5％。待检测蛋白样品上样量：10ug/孔。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。湿转法，转膜条件：300mA恒流，0.45um孔径NC膜，转膜时间2h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭：将膜完全浸没3％BSA-TBST中室温轻摇30min。一抗孵育：用3％BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10min，放4℃过夜。
表4为所用一抗名称
编号 一抗名称 稀释比例 稀释后体积
1 Mrp8 1:2000 4ml
2 COX5B 1:1000 4ml
3 BCS1L 1:1000 4ml
4 CD7 1:2000 4ml
第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。二抗孵育：用5％脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP，1:10000室温轻摇40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。ECL加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。
胶片扫描后结果如下：
内参蛋白WB正式实验
Stripping Buffer洗膜，37℃洗膜30min(如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10K以上，可以不用stripping buffer洗膜这一步)。
洗膜：去离子水洗膜3次。
洗膜：TBST洗膜3次，每次3min
将膜完全浸没5％脱脂奶粉-TBST中室温轻摇30min。
孵育内参：加GAPDH鼠单抗，用5％脱脂奶粉-TBST稀释抗体，1：20000稀释，室温孵育40min。
洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。
二抗孵育：用5％脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1:10000，室温轻摇40min。
洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。
ECL加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。
相对表达量＝目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值
结果如图2所示，可以看出，integrin alpha-IIb、integrin beta-3、integrin-linked kinase的相对表达量可以区分LTBI组和健康对照组；integrin beta-3和integrin-linked kinase的相对表达量可以区分LTBI患者和活动性肺结核患者。
序列表
<110>首都医科大学附属北京胸科医院
<120>CD4+T淋巴细胞特征蛋白在鉴定潜伏结核感染和活动性肺结核中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1039
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 1
Met Ala Arg Ala Leu Cys Pro Leu Gln Ala Leu Trp Leu Leu Glu Trp
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Leu Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro Ala Trp Ala Leu
20 25 30
Asn Leu Asp Pro Val Gln Leu Thr Phe Tyr Ala Gly Pro Asn Gly Ser
35 40 45
Gln Phe Gly Phe Ser Leu Asp Phe His Lys Asp Ser His Gly Arg Val
50 55 60
Ala Ile Val Val Gly Ala Pro Arg Thr Leu Gly Pro Ser Gln Glu Glu
65 70 75 80
Thr Gly Gly Val Phe Leu Cys Pro Trp Arg Ala Glu Gly Gly Gln Cys
85 90 95
Pro Ser Leu Leu Phe Asp Leu Arg Asp Glu Thr Arg Asn Val Gly Ser
100 105 110
Gln Thr Leu Gln Thr Phe Lys Ala Arg Gln Gly Leu Gly Ala Ser Val
115 120 125
Val Ser Trp Ser Asp Val Ile Val Ala Cys Ala Pro Trp Gln His Trp
130 135 140
Asn Val Leu Glu Lys Thr Glu Glu Ala Glu Lys Thr Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Cys Phe Leu Ala Gln Pro Glu Ser Gly Arg Arg Ala Glu Tyr Ser Pro
165 170 175
Cys Arg Gly Asn Thr Leu Ser Arg Ile Tyr Val Glu Asn Asp Phe Ser
180 185 190
Trp Asp Lys Arg Tyr Cys Glu Ala Gly Phe Ser Ser Val Val Thr Gln
195 200 205
Ala Gly Glu Leu Val Leu Gly Ala Pro Gly Gly Tyr Tyr Phe Leu Gly
210 215 220
Leu Leu Ala Gln Ala Pro Val Ala Asp Ile Phe Ser Ser Tyr Arg Pro
225 230 235 240
Gly Ile Leu Leu Trp His Val Ser Ser Gln Ser Leu Ser Phe Asp Ser
245 250 255
Ser Asn Pro Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Tyr Ser Val Ala Val
260 265 270
Gly Glu Phe Asp Gly Asp Leu Asn Thr Thr Glu Tyr Val Val Gly Ala
275 280 285
Pro Thr Trp Ser Trp Thr Leu Gly Ala Val Glu Ile Leu Asp Ser Tyr
290 295 300
Tyr Gln Arg Leu His Arg Leu Arg Gly Glu Gln Met Ala Ser Tyr Phe
305 310 315 320
Gly His Ser Val Ala Val Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp
325 330 335
Leu Leu Val Gly Ala Pro Leu Tyr Met Glu Ser Arg Ala Asp Arg Lys
340 345 350
Leu Ala Glu Val Gly Arg Val Tyr Leu Phe Leu Gln Pro Arg Gly Pro
355 360 365
His Ala Leu Gly Ala Pro Ser Leu Leu Leu Thr Gly Thr Gln Leu Tyr
370 375 380
Gly Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Arg Asp
385 390 395 400
Gly Tyr Asn Asp Ile Ala Val Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Pro Ser Gly
405 410 415
Arg Gly Gln Val Leu Val Phe Leu Gly Gln Ser Glu Gly Leu Arg Ser
420 425 430
Arg Pro Ser Gln Val Leu Asp Ser Pro Phe Pro Thr Gly Ser Ala Phe
435 440 445
Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Val Asp Ile Asp Asp Asn Gly Tyr Pro
450 455 460
Asp Leu Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Asn Gln Val Ala Val Tyr Arg
465 470 475 480
Ala Gln Pro Val Val Lys Ala Ser Val Gln Leu Leu Val Gln Asp Ser
485 490 495
Leu Asn Pro Ala Val Lys Ser Cys Val Leu Pro Gln Thr Lys Thr Pro
500 505 510
Val Ser Cys Phe Asn Ile Gln Met Cys Val Gly Ala Thr Gly His Asn
515 520 525
Ile Pro Gln Lys Leu Ser Leu Asn Ala Glu Leu Gln Leu Asp Arg Gln
530 535 540
Lys Pro Arg Gln Gly Arg Arg Val Leu Leu Leu Gly Ser Gln Gln Ala
545 550 555 560
Gly Thr Thr Leu Asn Leu Asp Leu Gly Gly Lys His Ser Pro Ile Cys
565 570 575
His Thr Thr Met Ala Phe Leu Arg Asp Glu Ala Asp Phe Arg Asp Lys
580 585 590
Leu Ser Pro Ile Val Leu Ser Leu Asn Val Ser Leu Pro Pro Thr Glu
595 600 605
Ala Gly Met Ala Pro Ala Val Val Leu His Gly Asp Thr His Val Gln
610 615 620
Glu Gln Thr Arg Ile Val Leu Asp Cys Gly Glu Asp Asp Val Cys Val
625 630 635 640
Pro Gln Leu Gln Leu Thr Ala Ser Val Thr Gly Ser Pro Leu Leu Val
645 650 655
Gly Ala Asp Asn Val Leu Glu Leu Gln Met Asp Ala Ala Asn Glu Gly
660 665 670
Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Ala Val His Leu Pro Gln Gly Ala
675 680 685
His Tyr Met Arg Ala Leu Ser Asn Val Glu Gly Phe Glu Arg Leu Ile
690 695 700
Cys Asn Gln Lys Lys Glu Asn Glu Thr Arg Val Val Leu Cys Glu Leu
705 710 715 720
Gly Asn Pro Met Lys Lys Asn Ala Gln Ile Gly Ile Ala Met Leu Val
725 730 735
Ser Val Gly Asn Leu Glu Glu Ala Gly Glu Ser Val Ser Phe Gln Leu
740 745 750
Gln Ile Arg Ser Lys Asn Ser Gln Asn Pro Asn Ser Lys Ile Val Leu
755 760 765
Leu Asp Val Pro Val Arg Ala Glu Ala Gln Val Glu Leu Arg Gly Asn
770 775 780
Ser Phe Pro Ala Ser Leu Val Val Ala Ala Glu Glu Gly Glu Arg Glu
785 790 795 800
Gln Asn Ser Leu Asp Ser Trp Gly Pro Lys Val Glu His Thr Tyr Glu
805 810 815
Leu His Asn Asn Gly Pro Gly Thr Val Asn Gly Leu His Leu Ser Ile
820 825 830
His Leu Pro Gly Gln Ser Gln Pro Ser Asp Leu Leu Tyr Ile Leu Asp
835 840 845
Ile Gln Pro Gln Gly Gly Leu Gln Cys Phe Pro Gln Pro Pro Val Asn
850 855 860
Pro Leu Lys Val Asp Trp Gly Leu Pro Ile Pro Ser Pro Ser Pro Ile
865 870 875 880
His Pro Ala His His Lys Arg Asp Arg Arg Gln Ile Phe Leu Pro Glu
885 890 895
Pro Glu Gln Pro Ser Arg Leu Gln Asp Pro Val Leu Val Ser Cys Asp
900 905 910
Ser Ala Pro Cys Thr Val Val Gln Cys Asp Leu Gln Glu Met Ala Arg
915 920 925
Gly Gln Arg Ala Met Val Thr Val Leu Ala Phe Leu Trp Leu Pro Ser
930 935 940
Leu Tyr Gln Arg Pro Leu Asp Gln Phe Val Leu Gln Ser His Ala Trp
945 950 955 960
Phe Asn Val Ser Ser Leu Pro Tyr Ala Val Pro Pro Leu Ser Leu Pro
965 970 975
Arg Gly Glu Ala Gln Val Trp Thr Gln Leu Leu Arg Ala Leu Glu Glu
980 985 990
Arg Ala Ile Pro Ile Trp Trp Val Leu Val Gly Val Leu Gly Gly Leu
995 1000 1005
Leu Leu Leu Thr Ile Leu Val Leu Ala Met Trp Lys Val Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Lys Arg Asn Arg Pro Pro Leu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Gly
1025 1030 1035
Glu
<210> 2
<211> 788
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 2
Met Arg Ala Arg Pro Arg Pro Arg Pro Leu Trp Ala Thr Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Pro Asn Ile Cys Thr
20 25 30
Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys Leu Ala Val Ser Pro Met
35 40 45
Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg Cys
50 55 60
Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile
65 70 75 80
Glu Phe Pro Val Ser Glu Ala Arg Val Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser
85 90 95
Asp Lys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gln Val Thr Gln Val Ser Pro Gln
100 105 110
Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp Ser Lys Asn Phe Ser Ile
115 120 125
Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile Tyr Tyr Leu Met
130 135 140
Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Trp Ser Ile Gln Asn Leu
145 150 155 160
Gly Thr Lys Leu Ala Thr Gln Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Leu Arg
165 170 175
Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Val Ser Pro Tyr Met Tyr
180 185 190
Ile Ser Pro Pro Glu Ala Leu Glu Asn Pro Cys Tyr Asp Met Lys Thr
195 200 205
Thr Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His Val Leu Thr Leu Thr Asp
210 215 220
Gln Val Thr Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys Lys Gln Ser Val Ser Arg
225 230 235 240
Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gln Ala Thr
245 250 255
Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn Asp Ala Ser His Leu Leu
260 265 270
Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile Ala Leu Asp Gly Arg Leu
275 280 285
Ala Gly Ile Val Gln Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Val Gly Ser Asp
290 295 300
Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp Tyr Pro Ser Leu Gly Leu
305 310 315 320
Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala Val
325 330 335
Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Tyr Gln Asn Tyr Ser Glu Leu Ile Pro
340 345 350
Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln
355 360 365
Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu
370 375 380
Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Phe Asn Ala Thr Cys
385 390 395 400
Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys Ser Cys Met Gly Leu Lys
405 410 415
Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys
420 425 430
Pro Gln Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys
435 440 445
Asp Ser Leu Ile Val Gln Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln
450 455 460
Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser His Arg Cys Asn Asn Gly Asn Gly Thr
465 470 475 480
Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro Gly Trp Leu Gly Ser Gln
485 490 495
Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln Asp Glu Cys
500 505 510
Ser Pro Arg Glu Gly Gln Pro Val Cys Ser Gln Arg Gly Glu Cys Leu
515 520 525
Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ile Thr Gly
530 535 540
Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys Val Arg Tyr Lys Gly Glu
545 550 555 560
Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Ser Cys Gly Asp Cys Leu Cys Asp
565 570 575
Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys Thr Thr Arg Thr Asp Thr
580 585 590
Cys Met Ser Ser Asn Gly Leu Leu Cys Ser Gly Arg Gly Lys Cys Glu
595 600 605
Cys Gly Ser Cys Val Cys Ile Gln Pro Gly Ser Tyr Gly Asp Thr Cys
610 615 620
Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys Thr Phe Lys Lys Glu Cys
625 630 635 640
Val Glu Cys Lys Lys Phe Asp Arg Gly Ala Leu His Asp Glu Asn Thr
645 650 655
Cys Asn Arg Tyr Cys Arg Asp Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Lys
660 665 670
Asp Thr Gly Lys Asp Ala Val Asn Cys Thr Tyr Lys Asn Glu Asp Asp
675 680 685
Cys Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Lys Ser Ile
690 695 700
Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly Pro Asp Ile Leu
705 710 715 720
Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala
725 730 735
Ala Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr Ile His Asp Arg Lys Glu
740 745 750
Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala
755 760 765
Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr
770 775 780
Tyr Arg Gly Thr
785
<210> 3
<211> 452
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 3
Met Asp Asp Ile Phe Thr Gln Cys Arg Glu Gly Asn Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Arg Leu Trp Leu Asp Asn Thr Glu Asn Asp Leu Asn Gln Gly Asp Asp
20 25 30
His Gly Phe Ser Pro Leu His Trp Ala Cys Arg Glu Gly Arg Ser Ala
35 40 45
Val Val Glu Met Leu Ile Met Arg Gly Ala Arg Ile Asn Val Met Asn
50 55 60
Arg Gly Asp Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Arg
65 70 75 80
Asp Ile Val Gln Lys Leu Leu Gln Tyr Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val
85 90 95
Asn Glu His Gly Asn Val Pro Leu His Tyr Ala Cys Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Asp Gln Val Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn Gly Ala Leu Val Ser Ile
115 120 125
Cys Asn Lys Tyr Gly Glu Met Pro Val Asp Lys Ala Lys Ala Pro Leu
130 135 140
Arg Glu Leu Leu Arg Glu Arg Ala Glu Lys Met Gly Gln Asn Leu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Pro Tyr Lys Asp Thr Phe Trp Lys Gly Thr Thr Arg Thr Arg
165 170 175
Pro Arg Asn Gly Thr Leu Asn Lys His Ser Gly Ile Asp Phe Lys Gln
180 185 190
Leu Asn Phe Leu Thr Lys Leu Asn Glu Asn His Ser Gly Glu Leu Trp
195 200 205
Lys Gly Arg Trp Gln Gly Asn Asp Ile Val Val Lys Val Leu Lys Val
210 215 220
Arg Asp Trp Ser Thr Arg Lys Ser Arg Asp Phe Asn Glu Glu Cys Pro
225 230 235 240
Arg Leu Arg Ile Phe Ser His Pro Asn Val Leu Pro Val Leu Gly Ala
245 250 255
Cys Gln Ser Pro Pro Ala Pro His Pro Thr Leu Ile Thr His Trp Met
260 265 270
Pro Tyr Gly Ser Leu Tyr Asn Val Leu His Glu Gly Thr Asn Phe Val
275 280 285
Val Asp Gln Ser Gln Ala Val Lys Phe Ala Leu Asp Met Ala Arg Gly
290 295 300
Met Ala Phe Leu His Thr Leu Glu Pro Leu Ile Pro Arg His Ala Leu
305 310 315 320
Asn Ser Arg Ser Val Met Ile Asp Glu Asp Met Thr Ala Arg Ile Ser
325 330 335
Met Ala Asp Val Lys Phe Ser Phe Gln Cys Pro Gly Arg Met Tyr Ala
340 345 350
Pro Ala Trp Val Ala Pro Glu Ala Leu Gln Lys Lys Pro Glu Asp Thr
355 360 365
Asn Arg Arg Ser Ala Asp Met Trp Ser Phe Ala Val Leu Leu Trp Glu
370 375 380
Leu Val Thr Arg Glu Val Pro Phe Ala Asp Leu Ser Asn Met Glu Ile
385 390 395 400
Gly Met Lys Val Ala Leu Glu Gly Leu Arg Pro Thr Ile Pro Pro Gly
405 410 415
Ile Ser Pro His Val Cys Lys Leu Met Lys Ile Cys Met Asn Glu Asp
420 425 430
Pro Ala Lys Arg Pro Lys Phe Asp Met Ile Val Pro Ile Leu Glu Lys
435 440 445
Met Gln Asp Lys
450

Claims (5)

1.检测integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备区分或鉴定初治活动性肺结核患者和结核潜伏感染者产品中的应用；
所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
2.检测integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备辅助区分或鉴定初治活动性肺结核患者和结核潜伏感染者产品中的应用；
所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
3.检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备检测谁为初治活动性肺结核患者的产品中的应用；
或检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备检测谁为结核潜伏感染者的产品中的应用；
所述integrin alpha-IIb的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
4.检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备辅助检测谁为初治活动性肺结核患者的产品中的应用；
或检测integrin alpha-IIb、integrin beta-3和integrin-linked kinase表达量的物质在制备辅助检测谁为结核潜伏感染者的产品中的应用；
所述integrin alpha-IIb的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin beta-3的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量；
所述integrin-linked kinase的表达量为CD4+T淋巴细胞中表达量。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述检测integrin alpha-IIb表达量的物质为下述1)或2)：
1)利用蛋白质质谱检测integrin alpha-IIb表达量所需的试剂和/或仪器；
2)利用Western Blot检测integrin alpha-IIb表达量所需的试剂和/或仪器；
和/或，所述检测integrin beta-3表达量的物质为下述3)或4)：
3)利用蛋白质质谱检测integrin beta-3表达量所需的试剂和/或仪器；
4)利用Western Blot检测integrin beta-3表达量所需的试剂和/或仪器；
和/或，所述检测integrin-linked kinase表达量的物质为下述5)或6)：
5)利用蛋白质质谱检测integrin-linked kinase表达量所需的试剂和/或仪器；
6)利用Western Blot检测integrin-linked kinase表达量所需的试剂和/或仪器。
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