JPH11507435A

JPH11507435A - 分析および治療用薬剤

Info

Publication number: JPH11507435A
Application number: JP8536274A
Authority: JP
Inventors: シャンマイラトーマス
Original assignee: ユニヴァーシティオブレイセスター
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 1999-06-29
Anticipated expiration: 2016-02-05
Also published as: DE69608683T2; ES2149448T3; AU4627896A; DE69608683D1; EP0828854A1; CA2222513A1; CA2222513C; GB9510954D0; JP3510267B2; EP0828854B1; AU704928B2; WO1996038588A1; ATE193560T1; US6309825B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンを検出する方法に使用される薬剤であって、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤、および損傷を受けた核酸塩基を検出する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】分析および治療用薬剤本発明は、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンを検出する方法に用いられる薬剤に関し、特に、損傷を受けた(damaged)核酸の検出、該核酸の診断および該核酸の検出法に用いられる薬剤に関する。核酸塩基の損傷、特にＤＮＡの酸化的な塩基損傷は、トキシン（毒素）、癌発生および神経変性障害などの多くの原因により起こり得る。このような損傷を検出することは、医学的な診断、病理研究および職業上の健康管理など医学上の多くの観点から重要である。核酸塩基の損傷を検出するための現在の技術は、酸素遊離ラジカルによって引き起こされるＤＮＡ塩基損傷を感受するマーカーである８−オキソグアニンを検出することによる［Kasai，H．およびNishimura，S.，In：H．Sies，ed.「酸化的ストレス：酸化剤および抗酸化剤（Oxidative Stress：Oxidants and Antioxi dants）London：Academic Press，1991：99-116；Ames，B．N.，1989，Free Rad ．Res．Commun.，7 : 121-128］が、８−オキソグアニンは形成する少なくとも2 0種類の生成物の唯一のものにすぎない。ＤＮＡに対する酸化的損傷に対するマーカーとして８−オキソグアニンを使用することにより、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）を用いて電気化学的に、ＤＮＡ分解物中のデオキシヌクレオシド（８−オキソデオキシグアノシン）として分析される（Floyd，R．A．他、1986，Free Rad．Res．Commun.，1 : 163 -172）。別の方法として、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）法を用いて、８−オキソグアニンを遊離塩基として定量することも行われている（Dizdaroglu，M．1994，Methods Enzymol.，234 ：3-16）が、この手法は高価で且つ技術的な要求が厳しい。これらの２つの手法が比較された（ Halliwell，B．およびDizdaroglu，M.，1992，Free Rad．Res．Commun，16：75- 87）が、得られた結果は一致していない。一般的に、ＧＣ−ＭＳ法によって測定される８−オキソグアニンのレベルは高くなり、新鮮な分離細胞においては、ＧＣ−ＭＳによる値は２から11倍高くなっていることが報告されている。ＤＮＡ中の８−オキソグアニンを測定するにはその他の多くの手段が提示されている。³²Ｐを用いるポストラベル法は文献により確立されている（Lu，L．J． W．他、Chem．Phamaceut．Bull．39：1880-1882 Povey，A．C.他、In :ＤＮＡアダクトを検出するポストラベル法（Postlabelling Methods for Detection of D NA Adducts）。 Lyon，105-114）。この方法は、非常に高感度の検出法を提供する可能性があるが、非常に時間がかかり面倒である。毛細管電気泳動法による８−オキソデオキシグアノシンの測定（Guarnieri，C．他、1994，J．Chromatogr．B．656 ：209- 213）および８−オキソグアニンの測定（Poon，K．W．他、1995，Biochem．Soc ．Trans．23：443s ）も提示されている。現在までのところ、この方法は、ＵＶ吸収測定が本質的に感度を欠いているために感度不足である。本発明に従えば、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８− オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンを検出する方法に使用される薬剤であって、ビオチンと特異的に結合し、且つ、８−オキソグアニン、８− オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシン（それぞれ８−ヒドロキシグアニン、８−ヒドロキシデオキシグアノシン、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシデオキシアデノシンとして知られているその最も一般的な互変異性体）の少なくとも１つに特異的に結合する分子から成ることを特徴とする薬剤が提供される。プリン塩基グアニンは、ビオチン分子と構造的な相関性を殆ど有しない。しかしながら、損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの詳細な結合特性は未だ不明であるが、本発明が見出したところによれば、酸化的ＤＮＡ損傷の損傷生成物である８−オキソグアニンのケト型はビオチンにきわめて構造上類似しており、そして、この酸化された塩基生成物に対してアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体は有意の結合親和性を有するようである。構造的な特徴を考慮すると、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンンはイミダジリドン基を有しているのでアビジンはこれらの化合物と結合することを強く示唆している。「特異的に結合する」とは、薬剤が特定の（単一または複数の）エピトープに対して特異的親和性を有することを意味する。アビジンは少なくともビオチン、８−オキソグアニンおよび８−オキソデオキシグアニンに特異的に結合するので、これらの分子は同一または実質的に同じエピトープを有する。この特異性は、ミモトープ（mimotope）にも特異的なポリペプチドのエピトープに特異的な抗体（Geysen，H．M．他、1987，Journal of Immnological Methods， 102 ：259-27 4）に（構造）類似性である。但し、該ミモトープの配列が該ポリペプチドの配列と相違していることはあり得る。本発明の薬剤は、ビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと実質的に同じ結合特異性を有し得るものである。さらに本発明の薬剤は、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに対して、アビジンまたはストレプトアビジンと実質的に同じ結合特異性を有し得るものである。「同じ結合特異性」とは、薬剤（例えば、フラグメント、アナログ、抗体または抗原結合性フラグメント）が、アビジンまたはストレプトアビジンと実質的に同じ（単一または複数の）エピトープに対して特異的であることを意味する。本発明の薬剤は、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の一つから選ぶことができる。本発明の薬剤は、アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログから構成されてもよい。アビジンおよびストレプトアビジンの特性を調べ変性して該分子の所望のフラグメント、例えば、該分子のうちビオチン結合性部分のみから成るフラグメントを容易に得ることができる。アナログ（アビジンまたはストレプトアビジン分子自身のアナログまたは該分子のフラグメントのアナログ）を調製することもできる。例えば、ビオチン分子または損傷を受けたＤＮＡに対する結合特異性ないしは結合親和性が変化したようなアナログを調製してもよい。「アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログ」とは、アビジンまたはストレプトアビジン分子のフラグメントまたはアナログであって、ビオチンに対して、および、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに対して特異的に結合するものを意味する。本発明者は、驚くべきことに、アビジン、ストレプトマイシンおよび抗ビオチン抗体が、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの検出、したがって、損傷を受けた核酸、特に損傷を受けたＤＮＡの検出に使用し得ることを見出した。アビジンは、卵白中にある天然に存在する因子であり、ビオチンビタミンに対して顕著な親和性（Ka＝10¹⁵Ｍ^-1）を有し（Bayer，E．A．およびIchek，M.，19 90，Methods in Enzymol.，184 ：49-67）、そして、ストレプトマイセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）由来の細菌性アナログであるストレプトアビジンも実質的に同じ結合親和性と特異性を有する。ビオチン分子（Green，N．M.，1972，Adv．Protein Chem.，29：85-131）は疎水性が大きく、そして、ウレイド基およびイミダジリドン環から成る。その分子全体がアビジン結合部位と相互作用して、アビジンは２面対称を有する安定な四量体を形成し、４ケのビオチン結合部位を含むように配置されて２つのクラスターとなると考えられている。ビオチン分子の小フラグメントから成るアナログである広範囲の化合物がアビジンと結合し得るが、10mMのレベルでは類似の化合物が有意に結合しないこと（Green，1972,上述の文献）から、ビオチンに対するアビジンの結合性には比較的高い特異性が存するものと考えられる。アビジンは、主として検出や増幅における二次的手段として研究および実用技術の両方において汎用されている。イムノアッセイにおいてはビオチンを検出するのに多用され、この場合には、一次抗体は直接ビオチンが結合されるか、またはビオチン化二次抗体を介して結合される。また、塩基のような標的分子をビオチン化により化学的に修飾して可視化する場合にも使用されている。アビジンは、ビオチン以外の生体分子を直接検出するのに現在のところ使用されてはいない。本発明の試薬は、別の手段として、抗体またはその抗原結合性フラグメントから構成することもできる。本発明における抗体とは、全抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、一般的にはいずれの免疫グロブリンクラスに属するものであってもよい。すなわち、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体である。抗体またはそのフラグメントは、動物性のものであってもよく、例えば哺乳動物由来のものであり、例えば、マウス、ラットまたはヒト由来のものである。本発明における抗体は天然の抗体またはそのフラグメントであってもよいが、所望に応じて、組換え抗体、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて製造された抗体または抗体フラグメントであってもよい。使用し得る特別の抗体または抗体フラグメントとしては、（１）抗原結合性部位の少なくとも一部が別異の抗体由来であるようなもの、例えば、１つの抗体の超可変または相補性決定領域が第２の別の抗体の可変フレームワーク領域内に融合（グラフト）されているような抗体（例えば、ヨーロッパ特許明細書第239400 号に記載されているようなもの）；（２）非Fv配列が他の別異の抗体由来の非Fv 配列によって置換されているような組換え抗体またはフラグメント（例えば、ヨーロッパ特許明細書第171469、173494および194276号に記載されているようなもの）；または（３）実質的に自然の免疫グロブリンの構造を保有する組換え抗体またはフラグメントであるが、ヒンジ部が該自然免疫グロブリンに見出されるのとは異なる数のシステイン残基を有し、且つ、該組換え抗体またはフラグメントの表面ポケットの１つまたはそれ以上のシステイン残基が該自然免疫グロブリンに存在する他のアミノ酸残基に置換されているもの（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ88／00730 およびＰＣＴ／ＧＢ88／00729 に記載されているようなもの）が含まれる。本発明における抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ポリクローナル抗体由来のものでもよく、または、モノクローナル抗体由来のものでもよい。該抗体またはフラグメントは多数のエピトープに特異的なものでもよく、または、１つのエピトープに特異的なものでもよい。抗原結合性の抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′ もしくはＦａｂフラグメントのような、全抗体をタンパク質分解することによって得られるフラグメント、またはＦｖフラグメントのような組換えＤＮＡ技術によって得られるフラグメント（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／00747 に記載されているようなもの）が挙げられる。本発明に従う抗体は、周知の免疫学的手法を用い、アビジンまたはストレプトアビジンが特異的であるような（単数または複数の）エピトープ（またはそのミモトープ）を抗原として使用して、ビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと実質的に同じ結合特異性を有するような抗体またはその抗原結合性フラグメントを生成することにより調製することができる。すなわち、例えば、エピトープまたはアジュバンに結合したエピトープまたはエピトープを有するペプチドを適当な宿主に注入して、血清を集め、適当な精製および／または濃縮を行う（例えば、アフィニティ媒体として固定化ストレス蛋白を用いるアフィニティクロマトグラフィによる）ことにより所望のポリクローナル抗体を得ることができる。別の方法として、例えば、Kohler他による方法（1976，Eur．J．Immunol. ，6 ：511）を用いて細菌タンパク質を注入した宿主から脾臓細胞またはリンパ球を回収して不死化させ、得られる細胞を分離するとモノクローナル抗体を産生する単一の遺伝的細胞系を得ることができる。抗体フラグメントは、慣用的手法、例えばペプシンまたはパパインを用いる酵素分解により製造することができる。本発明に従う組換え抗体を製造することが所望される場合には、例えば、ヨーロッパ特許明細書第171469、173494、194276および239400号に記載されているような方法を用いて製造することができる。本発明に従う抗体は、慣用的手法を用いて検出性ラベルで標識化されてもよく、本発明はそのような標識化抗体または抗体複合体（コンジュゲート）を包含するものである。本発明における抗体の例として、シグマ(S1gma)社から供給されているモノクローナル抗体ＢＮ−３４（Ｆ4024）がある。実験によれば本発明の薬剤は損傷の受けた核酸塩基に特異的に結合することができることが示されている（後述の「実験」の項参照）。本発明の薬剤は損傷を受けた核酸塩基に結合し得る。本発明の薬剤は酸化的塩基損傷核酸に結合し得る。本発明の薬剤は損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合し得る。本発明の薬剤は損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合し得る。核酸塩基は、遊離の塩基の形態を成しているか、または、他の分子、例えば、糖−リン酸骨格に結合されてＤＮＡまたはＲＮＡを形成しているものである。酸化的に塩基が損傷を受けた核酸は、例えば、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシンである。本発明の薬剤は、一本鎖の核酸分子の損傷塩基に結合し得る。本発明の薬剤は、二本鎖の核酸分子の損傷塩基に結合し得る。本発明の薬剤は損傷を受けた核のＤＮＡ塩基に結合し得る。本発明の薬剤は損傷を受けたミトコンドリアＤＮＡに結合し得る。ミトコンドリアＤＮＡは限られた修復能しか有しないことが示されており、核のＤＮＡよりもかなり酸化的損傷を受け易い（Richter，C．他、1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：6465-6 467）。本発明の薬剤は、損傷を受けた核酸塩基、特にＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための診断法に用いられることができる。そのような方法は標準的な試験法から構成され、標的に対する薬剤の結合が検出され分析されることにより、損傷を受けた核酸塩基の存否が判定される。例えば、薬剤（例えばアビジン）を固体の支持体（担体）に結合させ、次に被験者由来のサンプルと接触させて、該サンプルからの損傷核酸塩基を効果的に精製する。適当な時間経過後、サンプルを取り除き、支持体に結合した薬剤を調べて損傷核酸塩基の存在を知る。このような試験法は、以下のような工程を含み得るものである：ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと薬剤を反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；およびｃ）サンプルと薬剤の結合反応の検出結果を、損傷ＤＮＡの存在および量と相関させる工程。さらに、本発明の薬剤は、混合物（例えば、反応混合物）から８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシンを単に精製するのに用いることもできる。このような精製は、例えば、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシンを製造するのに使用され得る。本発明の薬剤は、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法において使用され得る。本発明に従えば、さらに、核酸塩基損傷を検出する方法であって、ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤と反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合を検出する工程；およびｃ）サンプルと薬剤の結合反応の検出結果を、損傷核酸塩基の存在および量と相関させる工程を含む方法が提供される。前記分子は、酸化的塩基損傷核酸に結合し得るものである。該分子は損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合し得るものである。該分子は損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合し得るものである。前記分子は、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合し得る。前記分子は、二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合し得る。損傷核酸塩基は、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基である場合がある。また、損傷核酸塩基は、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基である場合もある。本発明の方法は、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法となり得る。サンプルの試験を行うに際しては、ビオチンにより該サンプルが汚染されていないようにすることができる。本発明に従う診断試験は医学的な診断、病理研究および職業上の健康管理などに適用することができ、さらに、体液やバイオプシー標本のスクリーニングに使用できる。また、遺伝子毒性を有する可能性のある化合物について毒理学的スクリーニングを行うのに適用できる。図面を参照する以下の説明から本発明がさらに明らかになるであろう。図面は、損傷ＤＮＡを検出する１つの態様を例示のために示したにすぎない。各図の説明は以下のとおりである。図１は、ＵＶＡ処理した細胞に結合しているアビジンを示す。室温下に10分間ＵＶＡを照射したＩＭＲ３２細胞の核にアビジン−FITCS（フルオレセインイソチオシアネート）が結合した。細胞は照射直後に固定化し透過性化した。アビジン−FITCS により抗体の結合（図示していない）を可視化した。一次抗体の非存在下に、照射細胞の核物質にアビジンが結合した（Ｂ）。対照には結合が認められなかった（Ａ）。図２は、ビオチンおよび８−オキソグアニンの最適化構造を示す。デスクトップ分子モデル(Desktop Molecular Modelling)プログラムを用いて、グアニンの最も一般的な互変異性体、８−ヒドロキシグアニンおよび８−オキソデオキシグアノシンの６,８−ジケト互変異性体、ならびにビオチンの最適化構造を求めたものである。図３は、毛細管電気泳動法により測定したビオチンおよび８−オキソグアニンに対するアビジンの結合特性を示す。ビオチン（Ａ）または８−オキソグアニン（Ｂ）（いずれも濃度は100 μＭ）にアビジンを濃度を変化させながら添加し、毛細管電気泳動法により非結合ビオチンまたは８−オキソグアニンの量（パーセント）を測定し、ビオチンまたは８−オキソグアニンに対するアビジンの結合比を１：４と仮定した理論上の残存量に対してプロットしたものである。図４は、酸化的変性を受けたＤＮＡに対するアビジンの特異性を示す。一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの双方をメチレンブルーで処理して、酸化的変性による塩基損傷を引き起こした。ELISA（酵素結合イムノソルベント分析）プレート（Ａ）（ｎ＝８）、または４％(w/v)のパラホルムアルデヒドを用いて固定化したMultiScreen（ＲＴＭ）ろ過プレート（Ｂ）（ｎ＝８）に、メチレンブルーまたは非変性ＤＮＡ（100 μg/ml）を結合させ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合化(conju gated)アビジンの結合レベルを分光光度計を用いて測定した。正常なＤＮＡに関して、＊は95％レベルで有意であるもの、＊＊は99％レベルで有意なものを示す。幾つかの競争物質について、パラホルムアルデヒドで固定化されメチレンブルーで処理された二本鎖ＤＮＡへのアビジンの結合に対する阻害能を調べた（Ｃ）。ｎ＝８（但し、８−オキソデオキシグアノシンおよび８−オキソグアニンについてはｎ＝４）。図５は、８−オキソデオキシグアノシンおよびその非変性デオキシヌクレオシドアナログに対するアビジンの結合特性を示す。８−オキソデオキシグアノシンおよびデオキシグアノシンに対するFITCS-複合化アビジンの結合性（Ａ）を、固定化細胞の基質に結合したいろいろな濃度の塩基への結合レベルによって評価した。結合の最大値と最小値の違い（パーセント）としてデータを表している（Ａ）。８−ＯＨｄＧ（８−オキソデオキシグアノシン）またはｄＧ（デオキシグアノシン）のいずれかに対するアビジンの結合性の最大値と最小値との間には統計学的な差は認められなかった。FITCS が複合した抗ビオチンモノクローナル抗体の８−オキソデオキシグアノシンおよびデオキシグアノシンに対する結合性（Ｂ）をアビジンの結合性と比較して、固定化細胞の基質に結合したいろいろな濃度の塩基への結合レベルで示した。アビジン−FITCS に関して観測された結合性の最大値（パーセント）としてデータを表している。数値はｎ＝８における平均値 ±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。示しているデータは代表的な実験におけるものである。図６は、過酸化水素で処理したＩＭＲ細胞に対するアビジンの結合特性を示す。ＨＢＳＳ（Hanks の緩衝塩溶液）に溶かした濃度の異なる過酸化水素溶液に１時間接触させた後、ＩＭＲ３２神経芽細胞腫培養物に新鮮な完全培地を添加し24 時間培養した後、FITCS-複合化アビジンを用いてアビジンの結合レベルを評価した（Ａ）。ＭＴＴ（３−(4,5)−ジメチル−チアゾール−２−イル−2,5 −ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析を用いて、細胞毒性を評価した。数値はｎ＝８における平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。ANOVA（分散分析）法およびScheffe 多重レンジ試験法を用いる対照を含む群から95％の信頼度で有意に差があるものを＊で示す。示しているデータは代表的な実験におけるものである。図７は、過酸化水素で処理したＩＭＲ３２細胞内でアビジンが結合した核の所在位置を示す。過酸化水素（100μＭ）を含むＨＢＳＳ（Ａ）または含まないＨＢＳＳ（Ｂ）に１時間ＩＭＲ３２細胞を接触させた直後のアビジン位置を細胞の顕微鏡写真(×200)に示すものである。アビジンの結合に対するビオチンの阻害能（Ｃ）、８−オキソデオキシグアノシンの阻害能（Ｄ）およびグアニンの阻害能（Ｅ）（濃度はいずれも100 μＭ）についても調べた。図８は、ＵＶＡ照射したＩＭＲ３２細胞に対するアビジンの結合特性を示す。分化したＩＭＲ細胞にＵＶＡを照射（最大0.2mJ cm^-2）し、照射直後または照射から24時間後のアビジン−FITCSの結合性を調べた（Ａ）。照射24時間後についてはアビジンの細胞結合性に対するα−トコフェロールを用いる予備培養の効果について調べた（Ｂ）。ＭＴＴ分析により、照射24時間後の細胞の生存率を調べた（Ｃ）。数値はｎ＝８における平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。ANOVA（分散分析）法およびScheffe 多重レンジ試験法を用いる対照を含む群から95％の信頼度で有意に差があるものを＊で示す。示しているデータは代表的な実験におけるものである。図９は、運動神経ニューロン症(ＭＮＤ：motor neurone disease)患者由来の運動皮質切片に対するアビジンの結合性を示すものである。運動皮質の凍結切片（12μＭ）を固定化し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中２％w/v）、次に氷冷メタノールを用いて透過性化した。Ａ：65才男性の対照用；Ｂ：69才女性のＭＮＤ患者；Ｃ：75才女性のＭＮＤ患者；Ｄ：74才女性の対照用。アビジン−FITCSはＭＮＤの皮質切片に直接結合することが認められた。実験（実施例）材料ＩＭＲ３２神経芽細胞腫細胞（継代数66）は、ＥＣＡＣＣ（European Collect ion of Animal Cell Cultures）(在Porton Down，Salisbury)から入手した。アビジン−FITCS 複合体は、シグマ(Sigma)社（Ａ2050）から、抗ビオチン−F ITCS 複合体ヒツジモノクローナル抗体（クローン番号BN-34）(Ｆ4024)として入手したものである。ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（コンジュゲート）はBiotrin 社(在Dubilin，Eire)から入手した。ＵＶＡランプ(366nm)は、Knight Optical Technologies 社からOptical Radio meterとして入手したものである。セントリコン(Centricon)ミクロ濃縮装置はアミコン（Amicon）社（在Stoneho use（英国））製である。ＤＮＡ塩基：８−オキソデオキシグアノシンは、Udenfriendシステム（Kasai およびNishimura，1984，Mutation Research，12：2137-2145）に従って実験室で合成し、エレクトロスプレー質量スペクトル法によりその純度を確認した。分子モデルデスクトップ(Desktop)分子モデル(Oxford University Press，1994)プログラムを利用して、酸化された塩基とビオチンの３次元モデルを作製した。該プログラムにより構造の最小化を行った。毛細管電気泳動法による結合分析８−オキソグアニン（シグマ社製）およびビオチン（シグマ社製）の両方に対するアビジンの結合性を毛細管電気泳動法を用いて検討した（Poon他、1995、前述の文献）。ベックマン(Bechman)社製Ｐ／ＡＣＥ2200（英国High Wycombe在）を用い付属のSystem GOld（ＲＴＭ）ソフトウェアで制御しながら電気泳動を実施した。分析は全て、全長57cmで内径75μｍの未処理溶融シリカ毛細管を用いて行った。ビオチンおよび８−オキソグアニンの分析は自由帯域毛細管電気泳動法によって行った。８−オキソグアニン溶液（最終濃度100 μＭ）またはビオチン溶液（最終濃度100 μＭ）にアビジンを添加して、84％から０％の間の理論上の結合比が得られるようにした。得られた溶液をCentricon ミクロ濃縮装置に通し（ビオチン溶液および８−オキソグアニン溶液のそれぞれに対して、C Con30 および C Con10 をそれぞれ適用）、濃縮物を４℃において2000rpmで20分間遠心分離に供した。次いで、氷の上に配置した後、ＣＥにより分析した。電気泳動液として、0.45μｍのフィルターに通した10mMのテトラホウ酸ナトリウム(ｐＨ9.3)を用いた。正圧（0.5psi）でサンプルに25℃において５秒間負荷をかけた。操作時間は30kVの電圧下に10分間とし、リンス時間は0.17分（約10.2 秒）とした。200nm における吸光度により検出を行い、既知の標準物質と比較した。ピーク高さから各化合物の濃度を推定した。酸化されたＤＮＡの調製メチレンブルーでＤＮＡを処理することにより、残留するデオキシグアノシンが酸化されて８−オキソデオキシグアノシンとなる。氷の上に配置され上向きにしたペトリ皿ふた内の0.5cm の水により白色光源（光源とＤＮＡの距離は３cm）から遮蔽されたペトリ皿に入れたメチレンブルー（最終濃度20μg/ml、0.1 Ｍの tris中、ｐＨ8.5）の存在下にＤＮＡ（0.5mg/mlの水溶液）をインキュベートした。３時間照射を行い、その間に固形状の塩化ナトリウムを添加して最終濃度が１Ｍとなるようにし、エタノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを取り出し脱イオン水に溶解させた。該ＤＮＡを再沈殿させ、２回洗浄して残存するメチレンブルーを除去した。酵素を結合させたアビジンの結合性分析アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（アビジン−ＨＲＰ）（シグマ社製）のメチレンブルー処理ＤＮＡに対する結合性を未処理ＤＮＡに対する結合性と比較した。ＤＮＡをメチレンブルーで処理すると、８−オキソデオキシグアノシンのような酸化された塩基生成物が得られる。ＤＮＡに対するアビジンの結合特異性を明確にするため競争実験を実施した。損傷ＤＮＡおよび未損傷ＤＮＡはＥＬＩＳＡプレートに結合する。当初の実験においては、ＰＢＳ（50μｌ／ウェル）中50μg/mlの濃度で、未損傷およびメチレンブルー処理した二本鎖および一本鎖ＤＮＡをＥＬＩＳＡプレート（Nunc製、ImmunoプレートMaxisorp（ＲＴＭ））に結合させた。しかしながら、各種の処理後に残存するＤＮＡの量を定量するのは困難であるので、本実験においてはMillipore Multiscreen（ＲＴＭ）ろ過プレートを用いた。かくして、96ウェルを備えるMultiscreen-HVプレートのウェル（100μｌ／ウェル）に、未損傷およびメチレンブルーで処理した二本鎖および一本鎖のＤＮＡ（水中100mg/ml）を添加した。これらのプレートのウェルの基板は、0.45mMで疎水性のタンパク質結合性が低いDurapore（ＲＴＭ）膜である。これらの実験においては、４％(w/v)のパラホルムアルデヒドのＰＢＳ(ｐＨ7.4)溶液（100μｌ／ウェル）を用いて室温下で５分間ＤＮＡを固定化した。固定化後、真空マニホルドを用い水相をろ過除去した。1.0 ％(w/v)ゼラチンのＰＢＳ溶液中で５分間ＤＮＡをインキュベートすることにより非特異的結合部位をブロックした。次いで真空ろ過によりブロック溶液を取り除き、ＰＢＳで３回ウェルを洗浄した。アビジン−ＨＲＰをウェルに添加し（ＰＢＳ中500 倍稀釈、50μｌ／ウェル）、37℃において加湿器内で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、50μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン（0.05Ｍのリン酸−クエン酸中0.5mg/ml、ｐＨ5.0 ；Ｈ ₂ Ｏ₂を置換するため0.03％(w/v)の過ホウ酸ナトリウムを含有）を基質として、結合したペルオキシダーゼ標識化アビジンの検出を行った。室温下に20分間、２ＭのＨ₂ＳＯ₄ （25μｌ／ウェル）を用いて反応を停止させ、492nm における生成物の分光測を行った。競争実験として、アビジン−ＨＲＰを稀釈して(１：500)競争物質と考えられる物質の溶液を作製し、ＤＮＡ調製液に直接添加した。競争物質は使用直前に直接添加した。競争物質は使用直前にＰＢＳ中で調製し、ｐＨを7.4 に修正した。細胞培養ＩＭＲ３２（継代数66）細胞系は、ＥＣＡＣＣ（英国Porton Down，Salisbury 在）から入手した。該細胞の維持は95％空気、５％ＣＯ₂から成る加湿雰囲気化に37℃において行った。10％(v/v)のＨＩＦＣＳ（熱不活化ウシ胎児血清）および１％(v/v)の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むα−最少必須培地内でＩＭＲ細胞系を恒常的に維持した。いずれの場合でも抗生物質は用いなかった。ストック培養物は対数増殖期に準集密的に維持した。15回以内で培養物を継代させた後、凍結ストックに復帰させた。少量の新鮮培地内で振動させることによりＩＭＲ細胞を分離してハーベストおよび継代接種に供した。ゲージ19のニードルにより軽く粉砕することにより新鮮培地に細胞を再懸濁した。ストックを維持するために、約２×１０⁶細胞／75cm²フラスコの割合で細胞を再び接種した。全ての実験の前に培養物は化学的に分化させた。蛍光定量法およびＭＴＴ（３ −(4,5)−ジメチル−チアゾール−２−イル−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）代謝測定によりＤＮＡ損傷を定量するために、96−ウェルのプレートで細胞を培養した。５′−ブロモデオキシウリジン（１×10^-5M）を含む200 μｌの培地（５％(v/v)のＨＩＦＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−ＭＥＭ）を有するウェル当たり２×１０⁵ヶの細胞の割合で96−ウェルのプレートにＩＭＲ３２細胞を接種し、時間を変えて分化を行わせた（Thomas，S．M．およびAnderton，B．H. ，1991，Toxic．In Vitro，5 ：173-180）。蛍光による細胞化学分析のためには、５′−ブロモデオキシウリジン（１×10^-5Ｍ）を含む300 μｌの培地（５％(v /v)のＨＩＦＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−ＭＥＭ）を有するウェル当たり２×10⁵ヶの細胞の割合で、８−チャンバーのプラスチック製LabTe k（ＲＴＭ）スライドに細胞を接種した。８−オキソデオキシグアニンの蛍光結合分析（ＦＢＡ）ＩＭＲ３２の培養物を前述したように96−ウェルプレートで増殖させ分化させた。未処理の培養物を前述のように固定化し透過性化して基質とした。この基質に８−オキソデオキシグアノシンが結合してＦＡＡｓが行われ得るようになる。種々の濃度の正常塩基または酸化塩基をこれらのプレート状で１時間培養した（ 100 μｌ／ウェル）。次いで該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、アビジン−複合化ＦＩＴＣＳ（ＰＢＳ中で200 倍稀釈、１時間）またはFITCS-複合化抗ビオチンモノクローナル抗体（ＰＢＳ中で80倍稀釈、１時間）を用いて結合した塩基を可視化した。励起波長485nm および発光波長535nm とし、蛍光プレートリーダー（英国 Denly，Billingshurst）を用いて結合のレベルを定量した。過酸化水素処理分化処理後、培地を注意深く吸引し、各ウェル（200 μｌ）に予め加温したHa nks緩衝液（ＨＢＳＳ）を添加した。この際、該緩衝液は、各種濃度の新たに調製した過酸化水素を含むものと含まないものを用いた。過酸化水素を用いて１時間培養物をインキュベートした後、ＨＢＳＳを新鮮な培地（５％(v/v)のＨＩＦＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−ＭＥＭ）と交換し、標準的な培養条件下に24時間回復させた後、ＭＴＴ分析により細胞死を評価し、蛍光分析によりアビジンの結合性を評価した。ＵＶＡ露光分化細胞をＵＶＡ照射に供した。この照射は、脂質相抗酸化剤α−トコフェロールによる予備培養を行ったものと行わないものについて行った。各実験においてラジオメーターによりＵＶＡ照射レベルをモニターした。照射24時間前に現存の培地に、抗酸化剤を最終濃度が200 μＭとなるように添加した（原料は使用直前にメタノール中で調製した）。対照用の培養物は等量のビヒクル（エタノール）が添加されたものである。照射前に培地を取り除き細胞をＨＢＳＳで洗浄した。室温下に上方から細胞に照射を行った。対照にも照射した。細胞の固定化は前述したように行った。ＭＴＴ分析ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴの還元（Mosmann．T .，1983，Immunol．Methods 65（1-2）：55-63）は標準的な比色法による細胞毒性分析法である。各測定時点の１時間前に20μｌのＭＴＴ(ＰＢＳ中５mg/ml)を各ウェルに添加し細胞培養物を37℃で１時間インキュベートした。培地を注意深く吸引し、各ウェルに100 μｌのイソプロパノールを添加して生存細胞内に沈着したホルマザン生成物を溶解させた。プレートを５分間攪拌した後走査式マルチウェル分光光度計で550nmにおける吸光度を読みとり、該ホルマザン生成物が完全に溶解していることを確認した。アビジン結合性の蛍光測定ＰＢＳで細胞を洗浄した後、2％(w/v)のパラホルムアルデヒド（ｐＨ7.4 のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中）を15分間添加することにより細胞を予め固定化した。加温したＰＢＳ中で細胞を洗浄した。培養物を固定化し氷冷したメタノールで15分間透過性化し、ＰＢＳ中で再水和した後、10％(w/v)の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するＰＢＳを用いてブロッキングした。0.2％(w/v)ＮＧＳを含有するＰＢＳを用いてブロッキング液を洗い去った。アビジン−複合化フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣＳ）（ＰＢＳ中200 倍稀釈、１時間）、または FITCS-複合化抗ビオチンモノクローナル抗体（ＰＢＳ中80倍稀釈、１時間）を用いてＤＮＡ損傷を可視化することにより、蛍光顕微鏡観測または蛍光プレートリーダー(英国Denley，Billingshurst)による定量分析に供した。アビジン結合性の阻害変性ＤＮＡおよびビオチンについて、過酸化水素処理した細胞に対するアビジンの結合性の阻害能を調べた。ビオチン、グアニンおよび８−オキソデオキシグアノシンの100 μＭ溶液をＰＢＳ(ｐＨ7.4)を用いて使用直前に調製した。このように競争物質と考えられるものにアビジン−ＦＩＴＣＳ（シグマ社製）を添加し(１：100)、暗中で室温下に１時間予備的にインキュベートした。対照として競争物質を含まないＰＢＳも同時に処理した。得られた溶液をミクロ遠心機で５分間（室温）10,000g で遠心分離し、上清を結合性実験に用いた。該溶液を用いて固定化細胞を暗中で室温下に１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄した後、Vectorshield（ＲＴＭ）（英国PeterboroughのVector Labor atories 製）（グリセロール系の抗漂白マウントである）を用いてスライドにカバースリップを取り付けた。病理学的検討用組織片発光している凍結組織片を室温下に15分かけて解凍した後、氷上で0.5 ％のグルタルアルデヒドを含む４％(w/v)のパラホルムアルデヒド(リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ7.4)を添加することにより固定化し、ＰＢＳおよび食塩で洗浄した。得られたサンプルをアルコールで脱水した後、0.3 ％の過酸化水素を含むメタノール中で15 分間インキュベートすることにより内生ペルオキシダーゼをブロックした。サンプルを再水和し、ＰＢＳ中で洗った。アビジン−複合化フルオロセインイソチアネート(ＦＩＴＣＳ)（ＰＢＳ中200 倍稀釈）を１時間接触させることによりアビジンの結合を可視化した。組織片を充分に洗った後、Vectorshield（ＲＴＭ）（英国PeterboroughのVector Laboratories 製）（グリセロール系の抗漂白マウントである）を用いて組織片にカバースリップを取り付けた後、顕微鏡観察を行った。統計学的解析データの解析にはStatgraphics V.5.0プログラム（米国マサチューセッツ州ＳＴＳＣInc.製）を用いた。解析の前に確率プロットによりデータの正規分布または非母数分布を調べた。分散分析法（ＡＮＯＶＡ）および95％信頼度におけるSc heffe 多重レンジテスト法を用いて正規分布データへの影響を調べた。２つのサンプルの比較には95％信頼度におけるスチューデント式テストを採用した。結果当初に見出されたことは、驚くべきことに、ＵＶＡで処理された細胞において抗体が全く存在しない場合にアビジン−複合体がＤＮＡに結合したということである。ＵＶＡ処理された核にアビジン−ＦＩＴＣＳが結合することが見出されたが（図１のＢ）、対照の照射細胞の核には結合は認められなかった。酸化的に変性されたＤＮＡ塩基と天然のリガンドであるビオチンの構造的類似性を検討した結果、非変性塩基グアニンとビオチンの間には殆ど類似性は存しないが、８−オキソグアニンおよび８−オキソグアノシンの両者の6,8 −ジケト互変異性体の最適化構造（Aida，M.およびNishimura，S.，1987，Mutation Resear ch，192 ：83-89）はビオチンと構造的類似性を有する（図２）。８−オキソグアニンの6,8 −ジケト互変異性体および８−オキソデオキシグアノシンの6,8 − ジケト互変異性体はいずれも、ビオチンと共通するイミダジリドン基を有している。但し、デオキシリボース基は、８−オキソデオキシグアノシンのイミダジリドンのＮ³に結合している。ビオチンの２つの環は融合してシス体となっており、また、吉草酸側鎖はイミダジリドン環に関してシスである（Green，N．M.，19 72，Adv．Protein Chem.，29：85-131 ）。８−オキソグアニンおよび８−オキソデオキシグアノシンのいずれも類似のアルキル基を有してはいないが、８−オキソデオキシグアノシンの糖基は２つの環構造に対して類似の位置関係にあり、また、リボース分子内の２つの酸素基は吉草酸のカルボキシル基の２つの酸素に対して類似の位置関係にある（図２）。アビジンに対するビオチンの結合度を示すために毛細管電気泳動法を用いて、各種の濃度のアビジンでインキュベーションした後のビオチンの消失を観測した（図３）。結合比としてアビジン１ヶに対して４ヶのビオチン分子が結合すると仮定した場合、非結合ビオチンの回収は予測される理論値に非常に近いものであった。同様の手法を適用して、８−オキソグアニンに対するアビジンの結合能を検討した。アビジンで予備的にインキュベートすると、８−オキソグアニンの検出レベルは、ビオチンで見られたように見かけ上１：４の比率で減少した（図３）。メチレンブルーでＤＮＡを処理すると酸化的塩基損傷が得られ、特に８−オキソデオキシグアノシンが生成する。ＥＬＩＳＡ式の分析を適用して、メチレンブルーで損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの親和性を検討した。メチレンブルー処理した一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対するアビジンの結合レベルは、正常なＤＮＡに対して見られるよりも大きいものであった（図４のＡ）。正常な一本鎖ＤＮＡおよびメチレンブルー処理された一本鎖ＤＮＡの両方に対する結合のレベルは、二本鎖ＤＮＡに対するものよりもかなり大きいものであった。パラホルムアルデヒド（４％(w/v)）を用いてＤＮＡを固定化すると二本鎖ＤＮＡに対するアビジンの結合レベルは増大し、その結果、正常な一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対する結合レベルには有意な差が存在しなくなった（図４のＢ）。メチレンブルー処理されたＤＮＡに対するアビジンの結合性を正常ＤＮＡに対する結合性と比較するときわめて有意な差が認められた。メチレンブルー処理されたＤＮＡに対するアビジンの結合レベルは正常ＤＮＡに対するものよりもかなり大きいものであったが、非処理ＤＮＡに対しても結合は存在する。しかしながら、市販のＤＮＡは多くの処理を受けており、また、ここで用いたような実験の範囲内においてもＤＮＡは酸化的損傷から保護されていない。市販のウシ胸腺中の８−オキソグアニンのレベルをＨＰＬＣで測定した（示さず）ところ、そのレベルは0.4nmol/mgＤＮＡまたは3.2mol/10⁵mol グアニンであった。競争実験によれば、８−オキソデオキシグアノシンと共にインキュベートすると、メチレンブルーで処理された二本鎖ＤＮＡに対するアビジンの結合阻害が大きくなった（図４のＣ）。グアニンおよびグアノシンにも結合阻害能があったが、アビジンの濃度(約10^-8Ｍ)に対して阻害剤の濃度は高い（約1000倍）ものであった。ビオチンおよびモノクローナル抗体のアビジンに対する結合性を調べるために、各種の濃度の８−オキソデオキシグアノシンまたはデオキシグアノシンを固定化細胞質材料の基質に結合させた。アビジン結合は８−オキソデオキシグアノシンが10^-5Ｍのときに最大となり、その後は濃度（結合）はほぼ一定のレベルに維持された（図５のＡ）。これとは対照的に、デオキシグアノシンに対する結合性は濃度の上昇とともに増大し、デオキシグアノシンが10^-6Ｍで最大となった（図５のＢ）。これらの実験において０％値および100％値は統計学的には異ならない。抗ビオチンモノクローナル抗体は、アビジンと同程度の特異性を有しないようであり、８−オキソデオキシグアノシンおよびデオキシグアノシンの両方に対する結合性の最大値は10^-9Ｍのときであったが、損傷ＤＮＡを未損傷ＤＮＡと識別することは可能であった（図５のＣおよびＤ）。同じ実験でデオキシヌクレオシドの濃度を同じにした場合、抗体の結合レベルはアビジンの結合レベルよりかなり低いものであった。ＩＢＲ培養物（24時間にわたって分化したもの）を過酸化水素に１時間接触させることにより、過酸化水素濃度に関してアビジン−ＦＩＴＣＳの結合性がかなり有意に増大する（ＡＮＯＶＡによるｐ＝0.0026）。過酸化水素10nMの場合（図６のＡ）、アビジンの結合レベルは、対照を含有する群よりも統計学的な相違が見られた。対照の培養物に関して認められた蛍光の固有レベルは、顕微鏡分析で認められるように、アビジン−ＦＩＴＣＳの固有の結合のレベルが低いことに因るものであり、細胞質材料の自己蛍光に因るものである。結合のレベルは過酸化水素が100nM のときに一定状態になった。これに対して、当初の接触から24時間後の明白な細胞死は、過酸化水素の濃度が100 μＭ以上になったときにのみ認められた（図６のＢ）。アビジン−ＦＩＴＣＳの結合は主として培養物の核に存在し（図７のＢ）、一方、過酸化水素で処理されない細胞には核への結合は認められなかった（図７のＡ）。アビジン−ＦＩＴＣＳ結合がビオチンによる予備インキュベーションによって妨げられるか否かということを明らかにするために阻害性の検討を行い、結合が特異的なものであり、ビオチン結合部位が関与していること、さらに、競争物質として８−オキソデオキシグアノシンも関与していることを確認した（図７のＡ〜Ｅ）。最初の例として、過酸化水素と接触させた細胞とのインキュベーションの前に、該アビジン複合体を各種の競争物質と予備的にインキュベートした。予測したように、10μＭビオチンとの予備的インキュベーションにより過酸化処理細胞への結合が妨げられた（図７のＣ）。８−オキソデオキシグアノシンも結合を妨げたが（図７のＤ）、グアニンは結合を妨げなかった（全て100 μＭにおいて）（図７のＥ）。これらの事実は、核へのＤＮＡへの結合にビオチン結合部位が関与していることを示唆している。処理細胞に競争物質とアビジン−複合体を同時に添加した競争実験も同様の結合阻害パターンを示した。遊離ラジカル発生系により障害を受けている培養細胞中におけるＤＮＡに対するアビジン−複合体の結合性は酸化が介在する現象に依存することを更に明らかにするため、抗酸化剤による該結合の妨害能を調べた。分化したＩＭＲ３２細胞にＵＶＡ照射してＤＮＡ損傷を引き起こした。ＵＶＡ照射直後に該細胞にアビジンが結合することは明らかであり(ＡＮＯＶＡによるｐ＝0.008)、64mJ cm^-2およびこれより強い照射を行った細胞に対する結合性は、対照含有群と統計学的異なっていた。24時間後の照射においては結合レベルはかなり大きく（ＡＮＯＶＡによるｐ＝0.0005）、また、16mJ cm^-2しか照射しなかった細胞においてはその効果は対照と有意に異なっていた(図８のＡ)。α−トコフェロール（200 μＭ）を用いる予備インキュベーションは、短時間の照射ではアビジン結合性を減少させたが、長時間照射後は結合性を減少させるのに効果的ではなかった。多重レンジＡＮＯＶＡ法によると、α−トコフェロールは検討した照射時間の全範囲にわたってアビジンの結合性を有意に減少させた( ｐ＝0.003)。照射後の培養物の生存率をＭＴＴで評価することにより、アビジンの結合が細胞の即死と関係していないことを明らかにした（図８のＣ）。生存率に統計学的に有意な変化はなかった。ＭＴＴ代謝の上昇が認められなかったが、これはα−トコフェロールによる予備インキュベーションで防止された。神経変性障害で死亡した患者由来の死後の神経組織片に対するアビジン−ＦＩＴＣＳの結合性を年齢を合わせた対照と比較した（図９のＡ〜Ｄ）。該対照にもある程度の結合は認められたが（ＡおよびＤ）、結合のレベルはＭＮＤ患者由来のものの方がはるかに高かった。同様の方法を用いて他の身体組織の検討も容易に行うことができる。ヒトの病理組織を用いることにより、この手法がインビトロ系のみならず、組織にも適用できることが明らかである。考察以上のようにアビジン、ストレプトアビジン、およびビオチン特異的抗体は損傷を受けたＤＮＡに特異的に結合するが、従来の技術はこの点について教示していない(例えば、Wood，G．S．およびWamke，R.，1981，J．Histochem．Cytochem .，29：1196-1204参照)。純粋に化学的な系における結合性の検討により、非結合化合物の減少を調べるには最小限の予備的インキュベーションが必要であったことから、アビジンに対する８−オキソグアニンの結合は極めて速いことが示唆された。結合比は、アビジンに対する理論比４：１に匹敵するものであり、各アビジン分子に４ヶの結合部位が存在することと一致しており、また、アビジンの結合部位は８−オキソグアニンの結合に関与していることを示唆している。遊離ラジカルによって損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの結合性は、複合体(コンジュゲート)にも検出の終点法にも依存しない。阻害実験は、さらに、ＤＮＡに対するアビジンの結合が特異的であり、そして、ビオチンはアビジンの結合を阻害することからアビジンのビオチン結合部位に依存することも示唆している。さらに、８−オキソデオキシグアノシンも結合をブロックし得るものであり、したがって、このことは、該化合物もビオチン結合部位に結合することを示唆している。グアニンおよびグアノシンもアビジンの結合を阻害するが、高濃度の場合のみである。かくして、これらのデータは、当該結合がアビジンの結合部位によって仲介されるものであることを強く示唆している。また、８−オキソデオキシグアノシンの検出系としてアビジンの感度についても検討した。該基質に８ −オキソデオキシグアノシンが100 ％結合すると仮定すると、酸化されたＤＮＡに対するアビジンの理論的（したがって控えめに見積もった）感度は、10⁴分子の８−オキソデオキシグアノシンを検出し得ることを示唆している。アビジンにより認識されるＤＮＡの構造は、α−トコフェロールで予めインキュベートされたＵＶＡ照射細胞に対するアビジンの結合が減少することから、酸化性の遊離ラジカル機構により生じるものと考えられる。細胞に対するアビジンの結合性は、ＵＶＡ照射または過酸化水素を用いるインキュベーション［これらはいずれも酸化的ＤＮＡ損傷（８−オキソデオキシグアノシンの生成を含む）を起こすための確立された手段である］が介在する障害作用に依存して上昇する。他の細胞系（他の神経芽腫細胞腫および３Ｔ３繊維芽細胞を含む）を用いて、遊離ラジカルが関与した損傷細胞に対するアビジンの結合性についても検討した。アビジン−複合体は、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソグアニンおよびビオチンに対して類似の親和性を有するようである。アビジンを用いて、インビトロの培養実験由来の固定化細胞材料および固定化病理学的組織片の両方におけるＤＮＡに対する損傷を明らかにした。この手法は、広範囲の用途に適用し得る。ＤＮＡは現在広く研究されているが、採用されている方法は高価で且つ時間のかかるものである。８−オキソデオキシグアノシンは、広範な酸化的ＤＮＡ損傷生成物の１つに過ぎないが(Dizdaroglu，M.，1994．Methods Enzymol.，234 ：3-16)、酸化的ＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして許容されることが示唆された。病理学的標本における８−オキソデオキシグアノシンを直接同定することができ、同定の前に抽出や精製を必須条件としないことは魅力的で満足できるバイオマーカーとなる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年４月９日【補正内容】請求の範囲１．８−オキソグアニン、８−オキソグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシグアノシンを検出する方法において、ビオチンに特異的に結合する分子を含むことを特徴とする薬剤の使用。２．該分子がビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと実質的に同じ結合特異性を有することを特徴とする請求項１に従う薬剤の使用。３．該分子が、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の任意の１つから選ばれることを特徴とする請求項１に従う薬剤の使用。４．アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログを含むことを特徴とする請求項１または２に従う薬剤の使用。５．該分子が抗体またはその抗原結合性フラグメントから成ることを特徴とする請求項１または２に従う薬剤の使用。６．モノクローナル抗体から成ることを特徴とする請求項５に従う薬剤の使用。７．モノクローナル抗体が、シグマ(Sigma)社から供給されるＢＮ−３４（Ｆ4 024）であることを特徴とする請求項６に従う薬剤の使用。８．前記分子が、損傷を受けた核酸塩基に結合することを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに従う薬剤の使用。９．前記分子が、酸化的に塩基が損傷を受けた核酸に結合することを特徴とする請求項８に従う薬剤の使用。 10．前記分子が、前記損傷ＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８または９のいずれに従う薬剤の使用。 11．前記分子が、前記損傷ＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項10のいずれかに従う薬剤の使用。 12．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項11のいずれかに従う薬剤の使用。 13．前記分子が、二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項12のいずれかに従う薬剤の使用。 14．請求項８〜請求項13のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用され、該損傷核酸塩基が損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする薬剤の使用。 15．請求項８〜請求項14のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用され、該損傷核酸塩基が損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを特徴とする薬剤の使用。 16．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用されることを特徴とする請求項10〜請求項15のいずかに従う薬剤の使用。 17．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用される薬剤の使用であって、ａ）該薬剤をＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；およびｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡの存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする請求項16に従う薬剤の使用。 18．８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシンを精製する方法に使用されることを特徴とする請求項１〜請求項17のいずれかに従う薬剤の使用。 19．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法に使用されることを特徴とする請求項１〜請求項18のいずれかに従う薬剤の使用。 20．核酸塩基の損傷を検出する方法であって、ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８− オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤と反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；およびｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けた核酸塩基の存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする方法。 21．前記分子が酸化的に損傷を受けた核酸塩基と結合することを特徴とする請求項20に従う検出方法。 22．前記分子が、前記損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項20または21に従う検出方法。 23．前記分子が、前記損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項22のいずれかに従う検出方法。 24．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項23のいずれかに従う検出方法。 25．前記分子が二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項24のいずれかに従う検出方法。 26．損傷核酸塩基が、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする請求項20〜請求項25のいずれかに従う検出方法。 27．損傷核酸塩基が、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを特徴とする請求項20〜請求項26のいずれかに従う検出方法。 28．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法であることを特徴とする請求項20〜請求項27のいずれかに従う検出方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．８−オキソグアニン、８−オキソグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシグアノシンを検出する方法に使用され、ビオチンに特異的に結合し、且つ、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１に特異的に結合する分子を含むことを特徴とする薬剤。２．該分子がビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと同じ結合特異性を有することを特徴とする請求項１に従う薬剤。３．該分子が、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の任意の１つから選ばれることを特徴とする請求項１に従う薬剤。４．アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログを含むことを特徴とする請求項１または２に従う薬剤。５．該分子が抗体またはその抗原結合性フラグメントから成ることを特徴とする請求項１または２に従う薬剤。６．モノクローナル抗体から成ることを特徴とする請求項５に従う薬剤。７．モノクローナル抗体が、シグマ(Sigma)社から供給されるＢＮ−３４（Ｆ4 024）であることを特徴とする請求項６に従う薬剤。８．前記分子が、損傷を受けた核酸塩基に結合することを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに従う薬剤。９．前記分子が、酸化的に塩基が損傷を受けた核酸に結合することを特徴とする請求項８に従う薬剤。 10．前記分子が、前記損傷ＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８または９のいずれに従う薬剤。 11．前記分子が、前記損傷ＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項10のいずれかに従う薬剤。 12．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項11のいずれかに従う薬剤。 13．前記分子が、二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項８〜請求項12のいずれかに従う薬剤。 14．請求項８〜請求項13のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用される薬剤であって、該損傷核酸塩基が損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする薬剤。 15．請求項８〜請求項14のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用される薬剤であって、該損傷核酸塩基が損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを特徴とする薬剤。 16．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用されることを特徴とする請求項10〜請求項15のいずかに従う薬剤。 17．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用される薬剤であって、ａ）該薬剤をＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；およびｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡの存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする請求項16に従う薬剤。 18．８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシンを精製する方法に使用されることを特徴とする請求項１〜請求項17のいずれかに従う薬剤。 19．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法に使用されることを特徴とする請求項１〜請求項18のいずれかに従う薬剤。 20．核酸塩基の損傷を検出する方法であって、ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８− オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤と反応させる工程；ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；およびｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けた核酸塩基の存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする方法。 21．前記分子が酸化的に損傷を受けた核酸塩基と結合することを特徴とする請求項20に従う検出方法。 22．前記分子が、前記損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項20または21に従う検出方法。 23．前記分子が、前記損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項22のいずれかに従う検出方法。 24．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項23のいずれかに従う検出方法。 25．前記分子が二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする請求項20〜請求項24のいずれかに従う検出方法。 26．損傷核酸塩基が、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする請求項20〜請求項25のいずれかに従う検出方法。 27．損傷核酸塩基が、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを特徴とする請求項20〜請求項26のいずれかに従う検出方法。 28．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法であることを特徴とする請求項20〜請求項27のいずれかに従う検出方法。