JPH05508919A - スペクトリン又はその崩壊生成物の分析による細胞壊死検出 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 スペクトリン又はその崩壊生成物の 分析による細胞壊死検出 及−五一旦一豊一旦 本発明は細胞病理の検出のためのｉｎ　ｒｊｔｒｔａに関するものであり、より 詳しくは、細胞壊死を判定するために細胞骨格の崩壊生成物をモニターするため の分析に関するものである。

本発明は、ＡＦＯＳＲＣｏｎｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　８６−００９９　（Ｐ、　１ ．　：　Ｌｙｎｃｈ）、ＮＩＢ　Ｇｒａｎｔ　Ｎｏ、　ＮＳ−１８４２７及びＮ ＩＡ　Ｇｒａｎｔ　Ｎｏ、　ＡＧＯＯ５３８の下に、政府の援助下に行われた。

政府は、本発明に対しである種の権利を有する。

細胞の構造的一体性は、部分的には細胞骨格により維持されている。

これは基本的にタンパク質からなる網目状の構造であり、細胞の内側表面に隣接 して置かれている。多くの種類の細胞（部分的にリストアツブすれば、神経細胞 、リンパ球、腎臓、肝臓、心筋及び平滑筋、並びに血小板などがある）の細胞骨 格は、脳のスペクトリン（フォトリンとしても知られている）と同一か、又は密 接に関連したタンパク質を大量に含んでいる。スペクトリンはＦアクチンと結合 し、それらは−緒になって通常は細胞膜の内面に存在し、そこにおいてフィラメ ント状の網目構造を形成する。

脳及び他の多くの組織はカルシウム刺激性タンパク質分解活性を示すことが、か なり長い間知られている。末梢神経の分解についての研究が示したところによれ ば、カルシウム依存性中性プロテアーゼ、カルパインは、除神経又は損傷に続い てのニューロフィラメントの分解において、不可避的に包含されている。脳及び 他の組織において、このプロテアーゼの二つの形態が同定されている。これら二 つの形態は、カルシウムによる活性化についての閾値により区別される。カルパ インＩが必要とするカルシウムは微小モル量であるが、カルパインＩＩは０．１ から０．５ｍＭの間のカルシウム濃度により活性化される。これら二つの形態は 、脳の中に差別的に分布している。カルパインＩＩは主として脳細胞の細胞質画 分中に局在しているが、カルパイン■の最高の活性は、小突起中において見い出 される。カルパインのこれら二つの形態は、これらの点及び他の点において相違 しているが、本明細書においては「カルパイン」という用語は、両方の形態のカ ルパインを含めて、カルシウム依存性中性プロテアーゼを一般的に指して用いる ものとする。

種々の細胞損傷（例えば毒素、酸素欠乏症、その他）及び疾病状態（例えばアル ツハイマー病、パーキンソン病、ＨＩ　Ｖｉ発神経病、筋ジストロフィー）は、 細胞の破壊及び死を生ずる。しかしながら多くの場合、損傷が生じたということ を、破壊作用が不可逆的となるまでの間に測定することは可能ではない。従って 、破壊事象をできるだけ早く、好ましくは病理学的症状の開始期よりも前に検出 するための、信頼できる方法に対するニーズが存在している。そのような方法は また、高い感度と、幅広い範囲の適用性と、施行の容易さを有するのが好ましい 。

発明の概要 簡略に言えば本発明は、被検体、例えば哺乳類における細胞の死又は破壊を検出 するための方法を提供するものであり、スペクトリン崩壊生成物の存在に関して 被検体からの生物学的サンプルを分析し、そのスペクトリン崩壊生成物の量を正 常な被検体におけるスペクトリン崩壊生成物の量と比較し、そこにおいてスペク トリン崩壊生成物のレベルの増大が被検体における細胞の死又は破壊を示すもの である。多くの場合、正常な被検体におけるスペクトリン崩壊生成物の量は実質 的に検出不能である。上記の生物学的サンプルは生物からのどのようなサンプル であってもよいが、特に脳を髄液又は血液成分である。検出される細胞の死又は 破壊は、例えば外傷、虚血、障害、或いは毒素への暴露などの非病理学的細胞損 傷によるもので有り得るし、またはアルツハイマー病、パーキンソン病及び筋ジ ストロフィーなどの神経系の病変を含む痛理に基づくものでもありうる。神経系 における細胞の死又は破壊の検出のための生物学的サンプルは、神経組織又は脳 を髄液を含み得る。

スペクトリン崩壊生成物の存在に関して生物学的サンプルを分析するステップは 、例えばサンプル中のスペクトリン崩壊生成物を検出可能に標識された抗体と接 触させることからなることができる。またこれは、サンプルを電気的勾配に露出 してスペクトリン崩壊生成物がスペクトリンから分離されるような仕方で成分を 分離し、この分離された成分を、検出可能に標識されておりスペクトリン崩壊生 成物に結合する抗体と接触させ、抗体結合の存在を測定するというステップをも 含み得るものであり、そこにおいて抗体結合の存在がスペクトリン崩壊生成物の 存在を示すものとなる。生物学的サンプルを分析するステップはさらに、分離さ れた生成物を、その生成物を視覚化する染料で染色し、染料の結合の存在を判定 するステップからなることもでき、そこにおいて染色の存在がスペクトリン崩壊 生成物の存在を示すものとなる。

本発明の別の実施例においては、哺乳類の如き被検体からのサンプル中における 細胞の死又は病変を検出するための方法が提供され、該方法は、被検体から生物 学的サンプルを入手し、スペクトリン崩壊生成物の存在に関して生物学的サンプ ルを分析し、スペクトリン崩壊生成物の基底レベルを測定し、測定したレベルを 基底レベルと比較することからなり、そこにおいて基底レベルよりも高いレベル が細胞の死又は破壊を示すことｔこなる。この方法多こおける基底レベルは通常 、正常な被検体におけるスペクトリン崩壊生成物の基底レベルであり、多くの場 合にゼロであると仮定することができる。サンプルは被検体からのどのような生 物学的サンプルでもよく、脳を髄液、組織サンプル、或いは血液又は血液の何ら かの成分が含まれる。

さらに別の実施例においては、被検体における細胞の死又は破壊を検出するため の方法であって、被検体から生物学的サンプルを入手し、サンプル中の無傷のス ペクトリン及びスペクトリン崩壊生成物を含むスペクトリンの全量を測定し、ス ペクトリンの全量の基底量を測定し、スペクトリンの全量の測定量をスペクトリ ンの全量の基底量と比較することからなる方法が提供され、そこにおいてスペク トリンの全量が基底量よりも多いことが細胞の死又は破壊を示すことになる。ス ペクトリンの全量は、ＥＬＩＳＡ法又はウェスターン法などの手段を介して、ス ペクトリン全体の免疫反応性として測定することができる。サンプルは被検体か らのどのような生物学的サンプルでもよく、脳を髄液、組織サンプル、或いは血 液又は血液の何らかの成分が含まれる。

本発明の別の側面によれば、生物学的サンプル中における無傷のスペクトリンに 対して該生物学的サンプルをスペクトリン崩壊生成物で濃化する方法が提供され 、該方法は、無傷のスペクトリン分子及びスペクトリン崩壊生成物の溶解度に対 して差別的に作用する条件を変化させることにより、サンプル中において無傷の スペクトリンを沈澱させ、サンプル中においてスペクトリン崩壊生成物を溶液に 残し、沈澱した又は可溶のスペクトリン崩壊生成物を収集することからなる。無 傷のスペクトリン又はスペクトリン崩壊生成物を沈澱させるステップは、生物学 的サンプルの溶液のｐＨ又はイオン強度を変化させることからなることができる 。

本発明のさらなる目的、特徴及びその他の利点については、以下の詳細な説明を 添付図面と共に考察することにより明らかとなろう。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、内側嗅（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）皮質の一側性損傷の２日後の、対偶 （左レーン）及び同側（右レーン）の歯状回の吸着したサンプルにおけるスペク トリン免疫反応性を示す。矢印は、見かけの分子量がそれぞれ約２４０及び２３ ０キロドルトン（ｋＤ）であるスペクトリンのα及びβサブユニットを示し、ま た見かけの分子量がそれぞれ約１５５及び１５０ｋＤである二つの付加的な免疫 反応性ペプチド（ＢＤＰｌ及びＢＤＰ２）を示す。

１ｍ１Ｂは、以下の条件の下に培養された脳の精製スペクトリンを示す。レーン １は添加物なし。レーン２は１ｍＭの（ａＣＩ２と１．８μｇ／ｍｌのカルパイ ンＩで１０分間。レーン３は１ｍＭのＣａＣｌ、と３μｇ／ｍｌのカルパイン■ で３０分間。レーン４は損傷の２日後の歯状回タンパク質のホモジネート１０μ ｇ０レーン５は１ｍＭのＣａＣ１，と、１３μｇ／ｍｌのカルパインと、１．　 ２５　μｇ／ｍ　ｌのカルモジュリンで３分間。レーン６は１ｍＭのＣａＣ１， と、１３μｇ　／　ｍＩのカルパインと、１．２５μｇ／ｍｌのカルモジュリン で３０分間である。

図２は、走査型反射式濃度測定により測定されたＢＤＰＩ（黒丸）及びＢＤＰ２ 　（白丸）レベルが、全スペクトリン免疫反応性に対するパーセンテージとして 表す。

図３は、対照マウス及びＢｒ１ｎｄｌｅｄマウスの脳の領域におけるＢＤＰのレ ベルであり、銅での治療による効果を示している。

図４は、トリメチルスズを投与されているラットの海馬の歯状回及びＣＡＬ領に おけるＢＤＰのレベルを示している。

図５は、虚血の後のアレチネズミからの海馬の歯状回及びＣＡ１＠におけるＢＤ Ｐのレベルを示している。

図６は、ＥＬＩＳＡ法による種々のレベルのスペクトリンについての、４０５ｎ ｍにおける吸光度を示す標準的な曲線である。

図７は、対照動物の左（切側から尾側、１−４）及び右（５−８）の海馬、及び カイネート（ｋａｉｎａｔｅ）を注入した動物からの左（９−１２）及び右（１ ３−１６）の海馬であり、上側のパネルはウェスターン法による分析を示し、下 側のパネルはＥＬ　Ｉ　ＳＡ法による分析を示す。

図８は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により測定した、グループ１（破裂していない動脈瘤 ）の二人の患者及びグループ２（破裂した動脈瘤）の四人の患者からのＣＳＦサ ンプルのスペクトリン免疫反応性を示す。

図９は、ＡＮＥＵ　（未破裂の動脈瘤患者（ｎ＝２））　、ＳＡＨ（蜘網膜下出 血患者（ｎ＝１２））　、ＡＤ　（アルツハイマー病患者（ｎ＝３））　、５Ｔ ＲＯＫＥ　（卒中患者（ｎ＝１））、ＩＶＨ（脈管内出血患者（ｎ＝３））及び ＰＩＣＫ’Ｓ（ピック病（ｎ＝１））に関してＥＬＩＳＡ法により測定された、 Ｃ８Ｆサンプルのスペクトリン免疫反応性を示す。

好ましい実施例の詳細な説明 本発明は、細胞の死及び破壊の早期検出のための、感受性が高く効率的な方法に 関するものである。本発明の方法は、スペクトリン又はスペクトリンの崩壊生成 物の分析を通して、細胞の死及び／又は破壊を検出する。

カルパインの活性化は、スペクトリンを含めて多くのタンパク質のタンパク質分 解を導く。従ってカルパインは、死んだ細胞及び病変細胞におけるスペクトリン から、スペクトリン崩壊生成物（ＢＤＰ）の産生を行うものと考えられる。よっ てＢＤＰの検出は、カルパインの活性化のインジケータとして有利に利用できる ものと考えられる。

スペクトリンのＢＤＰは、非常に安定なポリペプチドである。ＢＤＰは細胞骨格 からの遊離後、最長で２力月又はそれ以上に至るまで、ｉｎ　ｖｉｖｏで検出可 能である。従ってこの安定性の期間の間、ＢＤＰは細胞の死又は破壊のインジケ ータとして、依然として有利に利用できるものである。

カルパインの活性化は、細胞の死の初期の事象であるという証拠がある。このこ とは、細胞の死の後期の段階においてのみ活性化されると考えられている他の公 知のプロテアーゼとは対照をなすものである。

カルパインの活性化は、細胞の死に伴う病理学的徴候の発現よりも前に生ずるこ とが多いと考えられている。従ってＢＤＰの検出は、細胞の早期の検出、可能性 としては病理学的徴候の発現以前の検出のための方法として、有利に利用するこ とができると考えられる。

本発明は、スペクトリンのＢＤＰの存在を測定するためのイムノアッセイによっ て細胞病理を検出するための方法を、効果的に提供するものである。二つの主要 なりＤＰＳＢＤＰＩ及びＢＤＰ２が知られている。本発明の一つの側面において は、スペクトリン含有細胞のサンプルからの成分は、ＢＤＰとスペクトリンとが 分離されるように、例えば電場をかけることによって物理的に分離される。この 分離された成分は次いで、クーマシーブルーのような染料で染色することによっ て視覚化することができる。或いはまたその時に、ＢＤＰと反応性のある抗体を 分離されたサンプルと接触させて、ＢＤＰを含有しているサンプルの部分に対す る抗体の結合を測定することができる。次いで、ＢＤＰの測定量を、正常な患者 からの同様のサンプル中におけるＢＤＰの基底レベルと比較する。ＢＤＰレベル の増大は、細胞の死又は破壊を示すことになる。多くの場合、基底レベルという のは本明細書で記述している方法の検出閾値よりも低いレベルである。従ってそ のような場合、何らかの免疫反応性を検出したならば、それは細胞の死又は破壊 を示すものとなる。

本発明は、無傷のスペクトリンそれ自体の存在又はスペクトリンの免疫反応性を 測定するために細胞病理を検出するための追加的な方法を提供する。本発明のこ の側面にょる一実施例においては、組織抽出物、脳を髄液（Ｃ３Ｆ）又は血清と いった生物学的サンプルにおけるスペクトリンの免疫反応性に関してのニンザイ ムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が提供される。この方法の 一つの特有な用途は、蜘！！５膜下出血、アルツハイマー病、ＨＩＶ誘発神経症 、及び／又は卒中といった神経変性状態の指標として、ＣＳＦ中のスペクトリン 又はスペクトリン免疫反応性を検出することである。

精製したスペクトリンのサンプルを種々の長さの時間にわたってカルパインに暴 露し、こうして処理したいくつものサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけることに よって、サンプルからＢＤＰを識別した。脳のスペクトリンは、ここで参照する ことによりその内容を本明細書に取り込むディビス及びベネットの方法Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８ニア７５７−７７６６（１９８３）により、９０ ％より大きな純度へと精製した。カルパインはラットの赤血球細胞質ゾルから、 ここで参照することによりその内容を本明細書に取り込むシュバートらの方法發 ｙ咀駐１：２０’２４　（１９８７）に従って、同様の純度レベルまで精製した 。

７５μｇ／ｍｌの濃度のスペクトリンを、１００μＭのＣａＣｌ２．３μｇ／ｍ ｌのカルパインＩ、２０ｍＭのトリス−ＣＩ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノー ル及び１５０ｍＭのＮａＣｌと共に、ｐＨ７゜５において３０℃で培養した。１ ０分後及び３０分後の時点で、部分標本を採った。これらの部分標本を、３ｘＳ ＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液（１５０ｍＭのトリス−ＰＯ，，６％のＳＤＳ、３０％の グリセロール、３．７５ｍＭのＥＤＴＡ、３％のβ−メルカプトエタノール、ｐ Ｈ６゜８）の３分の１容積に添加した。これらのサンプルを９０℃の水浴で３− １０分間加熱し、３から１０％の勾配のゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲ ルはクーマシーブルーで染色し、また７％の酢酸で脱色した。以上の方法は、こ こで参照することによりその内容を本明細書に取り込むシュバートらの鉦正狙肛 １：２０−２４　（１９８７）に記載されている。大体１５０キロドルトン（ｋ Ｄ）及び１５５ｋＤの二つのペプチドバンド（まとめてｒｌ　５０　ｋＤバンド 」という）のペプチド量が、カルパインに対する暴露時間と共に増大することが 見い出された。これに対応して、それぞれ２４０ｋＤ及び２３０ｋＤであるスペ クトリンのα及びβサブユニットを表している二つのペプチドノくン白こおける ペプチド量は、カルパインに対する暴露時間と共に減少した。二つの１５０ｋＤ バンドのペプチドを、ＢＤＰｌ及びＢＤＰ２と名付けた。

従って実施例■は、スペクトリンがカルパインＩの存在下にＢＤＰを産生ずると いうことを示している。実施例Ｉはまた、クーマシーブルーのような染料に暴露 した際にポリペプチドバンドが裸眼に見えるようにするのに必要なだけの比較的 高いレベルを有しているサンプルにおいて、スペクトリン又はＢＤＰを検出する ために、５ＤＳ−ＰＡＧＥ後の染色を用いることができることをも示している。

実施例Ｉの方法はさらに、ＢＤＰ及び無傷のスペクトリンに対応するノくンドを 容易に識別することのできる比較的純粋なサンプルによく適合している。

適切な高いレベル及び純度のスペクトリン及び／又はＢＤＰを有しているサンプ ルは、例えばホモジナイズされた神経組織から精製後に得られる。上記のディビ ス及びベネットの文献を参照のこと。

ポリペプチドの複合混合物においてさえもスペクトリン又はＢＤＰを検出すると いうより感度の高い方法は、分離されたサンプルをスペクトリンスはＢＤＰに対 する反応性を有する抗体に暴露することによって、好ましく得ることができる。

この目的に適した一つの分析法は、ウェスターン法として知られるに至っている 。

ＢＤＰはさらなる分解に対しては見かけ上の安定性を示すが、このことは、スペ クトリンに対して差し向けられた抗体が、組織、液体その他の生物学的サンプル においてＢＤＰを認識することができることを示唆している。ＢＤＰ及び無傷の スペクトリンは両方とも、スペクトリンに対して差し向けられた抗体により認識 され得る。従って抗スペクトリン抗体は、ウェスターン法において用いられた場 合には、無傷のスペクトリン及びＢＤＰの両者を検出することになる。以下の実 施例は、無傷のスペクトリン及びＢＤＰの両者の存在を検出するために、実施例 Ｉから得られたゲル及び抗スペクトリン抗体を用いたウェスターン法分析を示し ている。

実施例ＩＩ スペクトリン及びＢＤＰのウェスターン法分析脳のスペクトリンに対する抗体を 、周知の手順を用いてウサギで育成した（例えばここで参照することによりその 内容を本明細書に取り込むＦｌｕｒｎ、　Ｂ、Ａ、Ｌ、及びＣｈａｎｔｌｅｒ、 　Ｓ、Ｍ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　１０：１０４−１３５　（１９８８）を 参照のこと）。この抗脳スペクトリン抗体を、脳スペクトリンセファロースアフ ィニティークロマトグラフィーにより、血清から精製した。簡単に言えば、脳ス ペクトリンに対する抗体は血清から、δ−アミノヘキサン酸で活性化したセファ ロース４Ｂ（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社）に固定化した脳ス ペクトリンに対する吸着によって分離した。特異的に結合した抗体を次いで、ｐ Ｈ２，８，０，２Ｍのグリシン中で溶出させた。親和性により精製したこれらの 抗体を次いでｐＨ７，４へと平衡させ、使用まで凍結した。これらの抗体は、Ｂ ＤＰｌ及びＢＤＰ２、並びに無傷のスペクトリンに対して反応性であることが判 明している。従ってスペクトリンをカル／ぐインに暴露した際に現れた１５０ｋ Ｄバンドは、スペクトリンと交差反応性のポリペプチドからなっている。

精製した脳スペクトリンを、実施例工記載の如くにして培養した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥの後、高分子量タンパク質の写し取りについて製造業者が推奨 するところに従い、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔｔｅｒ　（カリフォルニア州１ルンチ モンド、バイオ−ラド社）を用いて、このタンパク質をニトロセルロース膜へと 電気泳動的に写し取った。このニトロセルロース膜を抗スペクトリン抗体で培養 し、結合した抗体は、製造業者の指示するところに従い、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏ ｔ分析キット（やはりバイオ−ラド社から市販されている）を用いて検出した。

簡単に言えば、アルカリホスファターゼに接合された抗ウサギＩｇＧ（カリフォ ルニア州すッチモンド、バイオ−ラド社）が、製造業者の推奨するところに従い 、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラ ゾリウム基質検出系において用いられた。親和性を用いて精製された抗スペクト リン抗体は１／７５０へと希釈され（容量５０ｍ１中）、−次抗体段階の際のプ ロットと共に一晩培養した。バンドの免疫反応性は、図ＩＢのレーン１−３に示 されている。レーン１は、カルパインへの暴露なしのスペクトリンを示している 。レーン２は、１ｍＭのＣａｃ１２と１．８μｇ／ｍｌのカルパインＩで１０分 間処理した後のスペクトリンを示している。レーン３は、１ｍＭのＣａＣ１，と ３μｇ／ｍ１のカルパインＩで３０分間処理した後のスペクトリンを示している 。カルパインの存在下において、スペクトリンの分解がＢＤＰ、主としてＢＤＰ ｌ及びＢＤＰ２を産生することが看取され得る。

実施例ＩＩ及び他の同様な実験における発見は、本発明者らを次の知見へと導い た。即ち、神経支配除去又は損傷に続いてのカルパイン活性の増大は、損傷を受 けた組織におけるＢＤＰのかなりのレベルでの生成をもたらすということである 。

上記の知見に従い、本発明の一つの側面によれば、被検体哺乳類からサンプルを 抽出し、スペクトリンＢＤＰの存在に関してサンプルを分析するステップからな る、細胞病理を検出するための方法が提供される。より大きな感度を得るために 、分析ステップはスペクトリン又はスペクトリンの安定な崩壊生成物を認識する 抗体を用いたイムノアッセイを包含することができる。

本発明のこの側面においては、ＢＤＰの量が測定され、この量がＢＤＰの基底レ ベルと比較される。ＢＤＰの何らかの増大は、細胞の死又は分解を指示するもの となる。通常、基底レベルというのは健康な細胞からのＢＤＰレベルである。こ の基底レベルは、健康な被検体哺乳類の対応するサンプルから取り出すことがで きる。或いはまた、基底レベルは同じ被検体から、傷害に先立つ時点におけるサ ンプルから得ることができる。従って、単一の被検体からある時間にわたって一 連のサンプルを取り出してＢＤＰの存在に関して分析を行い、それによって被検 体における細胞の死又は分解の経路の指標を好都合に提供することができる。健 康な被検体から取り出したサンプルの多くにおいては、ＢＤＰのレベルはここに 記載する分析法の検出閾値よりも低い。従って、検出したＢＤＰ量を比較対照す べき基底レベルは、多くの場合ゼロである。よって多くのサンプルにおいて、何 らかのＢＤＰを検出したとすれば、それは細胞の死又は分解を示すものとなる。

以下の実施例は、ヒトのＣＳＦについての基底レベルの確立を例示するものであ る。

実施例ＩＩＩ ヒトＣ５ＦにおけるＢＤＰ基底レベルの確立Ｃ８Ｆサンプルは、健康なヒトの被 検者から得た。全てのＣＳＦサンプルは、限外濾過によって濃縮した。完全なゲ ル中における無傷のスペクトリン及びＢＤＰに対応するバンドを識別するために 、二つの標識サンプルも入手した。最初の標識サンプルは実施例Ｉのレーン１に おけるようなカルパインへの暴露をしない精製スペクトリンのサンプルであり、 無傷のスペクトリンの位置を示している。他方の標識サンプルは、実施例■のレ ーン３におけるようなカルパイン暴露後の精製スペクトリンのサンプルであり、 ＢＤＰの位置を示している。サンプル及び標識サンプルのタンパク質濃度は、こ こでの参照によりその内容を本明細書に取り込むブラッドフォードの方法Ａｎａ １．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

７２：２４ｇ−２５４（１９７６）により測定した。各々のサンプル及び標識サ ンプルの１０ｇｇを３−１０％の勾配のゲル上で、ブロモフェノール染料のマー カーがゲルの先端に達するまで、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ た。次いでこれによるタンパク質を高分子量タンパク質について製造業者が指示 するところに従い、写し吸い取り（ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）装置（カリフォルニア 州すッチモンド、バイオ−ラド社）を用いて、ニトロセルロース膜へと写し取っ た。抗体を実施例ＩＩにおける如く生成し、ニトロセルロース膜上でスペクトリ ン免疫反応性を検圧するために用いた。標識サンプルによりめた無傷のスペクト リンの位置に対応する位置において、各々のＣＳＦサンプルについてスペクトリ ン免疫反応性が見い出された。しかしながら、標識サンプルによりめたＢＤＰの 位置に対応する位置においては、ＣＳＦサンプルについて検出可能なスペクトリ ン免疫反応性は見い出せなかった。従って、このヒトの被検者のＣＳＦについて のＢＤＰの基底レベルはゼロであると決定される。

ここに説明した方法は、種々の組織及び液体中におけるＢＤＰを測定するのに用 いることができる。なぜならスペクトリンは種々の組織において見い出されるか らである。例えばスペクトリンのＢＤＰは、血小板（フォックスら、ヒ６９：５ ３７−５４５　（１９８７））及び腸内刷子縁細胞（グレンニイら、ハ酪７９： ４００２−４００５　（１９ｇ２））において観察されている。ラットから取っ た以下の組織はここに記載の方法を用いて本発明者ら及びその他の者により調べ られて、スペクトリン及びＢＤＰを示すことが見い出された。即ち下顎腺、刷子 縁、精巣、胸腺、骨格筋、心筋、肺、肝臓、牌臓、副腎、腎臓及び脳である。さ らに、ヒト、アレチネズミ及びマウスはスペクトリン及びＢＤＰを含有すること が本発明者ら及びその他の者により確かめられたが、これはスペクトリン及びＢ ＤＰが全ての哺乳類に共通のものであることを示唆している。

哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）における損傷は、ダメージを受けたニューロンの 分解及びダメージを受けていない神経細胞エレメントの成長応答の両方の結果を 生ずる。これらの過程の根底をなす機構を調べるための十分に確立された犯例は 、内側嗅皮質を損傷し、歯状回においてその軸索入力の大多数が奪われた、十分 に明確にされている樹枝状領域の生成をもたらすことを含んでいる。神経細胞除 去の解剖学的帰結は、樹枝状萎縮、神経膠肥大及び萎縮、並びにダメージを受け ていない軸素における成長応答を含む。

そこで、ラットの内側嗅皮質の損傷後に歯状回において、十分に明確にされてい る樹枝状領域を検出するという本発明の好ましい方法の能力を示すために、実施 例ＩＶからＶＩＩＩを提示するものであり、それによって予想した組織における 細胞の死又は分解の検出について示す。

実施例ｒｖ 定位的に設けた内側嗅皮質の一側性電解損傷をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄｅｖｌｅｙラ ットにおいて行った。ラットは０．２，０．４，１，２，４，７．１４及び２７ 日の術後生存期間の後に殺した。

断頭によりラットを殺した直後に、０．３２Ｍのスクロース、１０ｍＭのトリス 、２ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　１　ｍＭのエチレングリコールビス（β−アミノ −エチルエステル）　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ） 、１００μＭのロイペプチン、１　ｔｔ　ｇ／ｍ　ＩのＮ−トシル−し−フェニ ルアラニンクロロメチルケトン（Ｔ　Ｐ　ＣＫ）からなるｐＨ７，４の氷冷した 均質化！ｌ衝液中において、脳を手早く解剖した。

各々の海馬は分断遊離させて解剖月メスで切断し、歯状回を分離した。

槽（ａｌｖｅａｒ）表面上に載置された海馬について、海鳥裂に沿って長手方向 に一つ切断を行って鉤状回を分離し、また別の長手方向切断により、Ｃａ２領の 殆どを除去した。次いでＣＡＬに対して、海馬裂と平行に第三の切断を行い、Ｃ ＡＬの大部分を除去した。残りの組織（１０−２０−２Ｏは歯状回サンプルとし て利用され、実施例Ｖにおける如く組織サンプルとして用いられた。歯状回の対 偶及び同側サンプルを得た。

対偶歯状回組織サンプルおよび同側歯状同組織サンプルの各々を、５００μｌの 解剖緩衝液中でホモジナイズした。各々の部分標本を、３ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサ ンプル緩衝ｉ’ｔ！（１５０ｍＭのトリス−ＰＯ４，６％のＳＤＳ、３０％のグ リセロール、３．７５ｍＭのＥＤＴＡ、３％のβ−メルカプトエタノール、ｐＨ ６，８からなる）の３分の１容積に添加し、９０℃の水浴で３分間加熱した。各 々のホモジネートのタンパク質濃度は、前述したブラッドフォードの方法により 測定した。

次いで、各々のホモジネートサンプルにおけるタンパク質の濃度をサンプル緩衝 液を追加して０．３３ｍｇ／ｍｌに調節した。

実施例ＶＩ サンプルタンパク質の分離及び膜への写し取り実施例Ｖの各々のサンプルからの １０μｇのタンパク質を３−１０％の勾配のゲル上で、ブロモフェノール染料の マーカーがゲルの先端に達するまで、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に かけた。次いでタンパク質を高分子量タンパク質について製造業者が指示すると ころに従い、写し吸い取り装置（カリフォルニア州すッチモンド、バイオ−ラド 社）を用いて、ニトロセルロース膜へと写し取った。

実施例ＶＩＩ 抗スペクトリン抗体の調製 抗体は、以下の方法により生成した。各々のウサギについて、はぼ２００μｇの 精製した脳のスペクトリンを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから削り取り（電 気泳動分離の後に）、フロイントの完全アジュバントと乳濁した。多数回の皮下 注射を行い、フロイントの不完全アジュバントを用いて２から４週間後にこの手 順を繰り返した。さらに２週間後に、はぼ１００μｇのスペクトリンを含有して いる乳濁液の皮下注射を行った。この処置を約１カ月後に繰り返した。この一連 の注射の１０日後に、各々のウサギから約２０ｍ１の血液を抜き出し、この血液 を４℃で一晩凝固させた後に血漿を集めた。

脳スペクトリンに対する抗体は次いで、実施例ＩＩに記載したようにして、δ− アミノヘキサン酸で活性化したセファロース４Ｂに固定化した脳スペクトリンに 対する吸着によって親和性を用いて精製した。

親和性により精製したこれらの抗体を次いでｐＨ７，４へと平衡させ、使用まで 凍結した。

実施例ＶＩの膜上でのスペクトリンの免疫反応性の量を測定するために、ウェス ターン法の一部としてこの膜を実施例ＶＩＩの抗体に暴露した。

ブロッキング、−次及び二次抗体培養並びに色の発現のための手順は、実施例Ｉ Ｉに記載の如くであった。免疫反応種の定量は、ソフトレーザー走査濃度計（カ リフォルニア州フユラートン、バイオメト・インスツルメンツ社、モデル＃５Ｌ Ｒ５０４−ＸＬ）を用いて行った。積分器（カリフォルニア州すニーベイル、バ リアン社、モデル４２７０）により、各々のバンドにおける反応生成物の量を合 計し、それをそのサンプルにおける合計のパーセンテージとして表した。

−側性内側嗅損傷の２日後の、対何（レーン１）及び同側（レーン２）歯状回に おいて存在する抗スペクトリン反応性種を図ＩＡに示す。

同側歯状回のホモジネートは、ＢＤＰ　ｌ及びＢＤＰ２と命名した二つのペプチ ドの、見かけの分子量がそれぞれ約１５５，０００及び１５ｏ、ｏｏｏドルトン という顕著な増大を示した。

実施例ＩＶからＶＩＩＩの手順を繰り返し、実施例ＩＶにおける動物の損傷から 殺生までの間に経過する時間の長さが様々になるよ彊こした。−側性内側嗅皮質 損傷の後のＢＤＰＩ及びＢＤＰ２における経時変イヒ（ま、図２に示されている 。施術されていない動物からのサンプルにおし１では、ＢＤＰは通常は検出限界 を下回る。同側サンプル〔こおけるＢＤＰの顕著な上昇は、損傷後４時間という 早さにおいて明白になってし）る。

この増大は損傷後２日後に最大となり、そこにおいてＢＤＰは免疫反応性の合計 の２５％を占めている。損傷の後２週間、及び４週間後（こおいてさえも、ＢＤ Ｐの皿は依然として顕著に増大してＬ）る。対偶歯状回は２週間及び４週間後に おいては検出可能なりＤＰを示さず、平均ＢＤＰ２レベルは合計のスペクトリン 免疫反応性の０．１％未満である。同側領では、施術されていない動物と比較し た場合に、損傷後の最初の週の間にＢＤＰの量の僅かな増大が観察された。

以上の結果は、歯状回に対する主入力の除去の後には、骨格細胞タンパク質脳ス ペクトリンの急激で長期にわたる分解の増大力（続くと０うことを示している。

損傷の後には、歯状回の樹枝状領域における細胞質カルシウムレベルに異常が生 ずることが知られている。例えばここで参照することによりその内容を本明細書 に取り込む）くウド１ノーら、は、これらの組織におけるＢＤＰのレベルの上昇 は、そのようなカルシウムの異常レベルによるそれらの組織でのカルノ々インの 活性イヒの結果であると考える。実施例ＶＩＩＩの結果は従って、ラットの内側 嗅皮質の損傷の後に、歯状回の、十分に明確化されている樹枝状領域を検出する という本発明の能力を確認するものである。

実施例ＩＸからＸＩは、実施例■からＶＩＩＩにおいて用いられた方法が、細胞 の死又は分解を検出するについて幅広い有用性を有していることを示すために提 示されたものである。これらの実施例は、本発明の方法を介して、種々の原因に よる、また種々の細胞組織における細胞の死又は分解の検出を示している。これ らの実施例はそのようなものとして本発明を例示するものであり、限定を行うも のではない。ここに記載の手順、例えば実施例ＶからＶＩＩＩのそれは、使用さ れ得る典型的な手法ではあるが、当業者に知られている別の代替法を代替的に採 用することも可能である。

生後１２日の子マウスの海馬、皮質及び線条からのサンプルを、実施例Ｖ−ＶＩ ＩＩにおける歯状回サンプルについて記述したようにして処理した。実験グルー プは、対照マウス、Ｂｒ１ｎｄｌｅｄマウス、及び補足的に銅を投与されている Ｂｒ１ｎｄｌｅｄマウスである。この投与は、そうしない場合に早死するのを防 止するだめの処置である。Ｂｒ１ｎｄｌｅｄマウスは、銅が欠乏しており、処置 されない場合には自然退化を生ずるということで特徴付けられる。図３により看 取され得るように、スペクトリンのＢＤＰは屑理条件下において上昇し、この上 昇は銅の補足により阻止された。

実施例Ｘ 工業的毒素トリメチルスズ（Ｔ　Ｍ　Ｔ　）に暴露した後のＢＤＰの分析 ３匹のラットに１０　ｍ　ｇ　ＴＭＴ／　ｋ　ｇ体重を腹腔内（ｉ、ｐ、　）注 射した。４匹目のラットには生理的食塩水のみを腹腔内注射して、対照として利 用した。処置後３，７及び１４日後に、３匹の試験ラットの海馬の歯状口及びＣ ＡＬ領を除去し、実施例Ｖ−ＶＩＩにおいて記載したようにしてＢＤＰに関して 分析した。図４に示す如（、歯状口及びＣＡＬ領の両者において、ＢＤＰの大量 の増大が記録された。脳のこれらの領域は、ＴＭＴ毒素に最も冒され易い領域と して識別されている（ここで参照することによりその内容を本明細書に取り込む バラビンら、Ｎｅｕｒｏｓａ　２６：３３７−３６１　（１９８８）参照）。

実施例ＸＩ 虚血後のＢＤＰの分析 ８匹のモンゴル産アレチネズミの二つのグループの各々において、皮質に対する 主血流を阻止するために頚動脈を１０分間クランプした。

アレチネズミの二つの対照グループもまた分析した。対照アレチネズミの一つの グループと、試験アレチネズミ一つのグループから、虚血の４時間後に海馬のＣ ＡＬ領と小脳のサンプルを取り出した。また、対照及び試験アレチネズミの第二 のグループから、虚血の２４時間後にサンプルを取り出した。図５に示すように 、試験アレチネズミは対照動物と比較して、ＣＡＬ領におけるＢＤＰの増大を示 した。小脳への血液供給は阻害されず、この構造はそのような増大を何も示して いない。ＢＤＰレベルの分析は、実施例Ｖ−ＶＩＩＩに示された如くである。

かくして以上の実施例は、本発明の方法が、種々のサンプルにおける種々の原因 による細胞の死又は分解を検出するために好都合に使用することができることを 示すものである。

本発明はさらに、サンプルをＢＤＰ及び無傷のスペクトリンへと分離する必要な しに、細胞病理を検出するための追加的な方法を好都合に提供するものである。

この追加的な方法は、由来とは無関係にスペクトリン自体の存在又はスペクトリ ンの免疫反応性をめるために、イムノアッセイの手段によるものである。従って 本発明のこの実施例では、スペクトリン及びＢＤＰに対する免疫反応性を含めて 、全スペクトリン免疫反応性を測定することができる。本発明のこの側面による 一実施例においては、生物学的サンプル、例えば組織抽出物、脳を髄液（ＣＳ　 Ｆ）或いは血清におけるスペクトリンの免疫反応性に関するエンザイムリンクド イムノソルベントアッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）が提供される。

好ましい実施例の競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析のための準備においては、スペクトリ ンサンプルがポリスチレンマイクロリットルプレートに固定化される。本発明者 らは、在来の活性化されたポリスチレンプレートからスペクトリンが固定化の後 に脱着し、その結果、結合された抗体の量と測定すべきサンプル中のスペクトリ ンの量の間に、予期せぬベル形の関係が生ずることを見い出した。この予期しな い結果についてはいかなる特定の説明にも拘束されることを欲するものではない が、脱着されたスペクトリンは、サンプル中に存在する付帯的なタンパク質の存 在下に、依然として固定化されているスペクトリンとポリマーを形成するものと 考えられる。このスペクトリンポリマーは、抗スペクトリン抗体の結合に対して より利用しやすいものと考えられる。加えて、サンプル中のスペクトリンは、ス ペクトリンのさらなる重合化を介してプレートに結合するものと考えられる。

結合抗体の量とサンプル中におけるスペクトリンとの間におけるこの予期しない 関係を防止するために、ポリスチレンプレートに対するスペクトリンの固定化の 前に、プレートをグルタルアルデヒドで処理することが可能である。グルタルア ルデヒドは、プレートのポリスチレン及びスペクトリン分子の両者に対して、共 有結合を形成する。塩度及びｐＨを含めて、スペクトリンの重合化に対して好ま しくない条件を有する緩衝液を使用することもまた、この予期しない結果を防ぐ ことが見い出されている。イオン濃度が高いことはスペクトリンポリマーの形成 を禁止することが見い出されているが、しかしそのような濃度はまた免疫反応性 をも阻害する。ＥＧＴＡ、スクロース及び界面活性剤などの他の種々の添加剤を 添加することもまた、この予期せぬ結果を防ぐことが見い出されている。従って 本発明の好ましい方法においては、生理的塩類溶液中にＥＧＴＡ、スクロース及 び界面活性剤を含んでいる７、０より僅かに大きなｐＨの緩衝液が用いられる。

ＮａＢｒ又はＫｌにょうなカオトロピック塩もまた、ポリマーの形成を禁止する ために用いることができる。

未知のサンプルを試験する場合には、各々のウェルに対してサンプルと共に、限 定量の抗スペクトリン抗体が添加される。サンプル中のスペクトリンは、抗体に 関して、プレートに固定化されたスペクトリンと競合する。従ってサンプル中の スペクトリンが多いほど、プレートに固定化されたスペクトリンに結合する抗体 は少なくなる。よってプレート上のスペクトリンに対する抗体の結合量は、サン プル中のスペクトリンの量に関する指標をもたらすことになる。抗体の量は、標 準的なＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の手順におけるようにして比色反応により測定すること もできるし、また例えばラジオイムノアッセイを介してなど、何らかの公知の仕 方により検出することができる。

ディビス及びベネットの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５８ニア７５ ７−７７６６、１９８３）により、ラットの脳からスペクトリン試料を調製した 。スペクトリンに対する抗体は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによるスペクトリン調製に従 って調製しくシュバートら、シｙ塁刈１：２０−３４．１９８７参照）、スペク トリンを含有しているゲル領域を削り取り、このゲルをホモジナイズし、確立さ れた手法に従って（例えばバーン及びチャントラ−１Ｍｅｔｈｏｄｓ匡肛赳Ｌ７ ０：１０４−１３５．１９８０参照）このホモジナイズされたゲルでウサギを免 疫した。

固定化されたスペクトリンを有するマイクロタイタープレートは、最初に、ｐＨ ＝５．０のＯ，ＬＭ燐酸ナトリウム中０．２％のグルタルアルデヒドで室温下に ４時間、マイクロタイタープレート（未変性のポリスチレン、例えば”Ｃｏｒｎ ｉｎｇ　Ｅａｓｙ−Ｗａｓｈ”という商品名で市販されているもの）を処理する ことにより調製した。グルタルアルデヒドを除去した後、ｐＨ＝８．０の０．１ Ｍ燐酸ナトリウム中のスペクトリン（１０μｇ／ｍｌ）溶液１００μｌを各々の ウェルに加え、プレートを室温でさらに４時間培養した。プレートをｐＨ＝８． ０の０．　１Ｍ燐酸ナトリウム中０．１Ｍのりシンで洗浄し、このりシン溶液１ ００μｍを各々のウェルに添加した。次いでプレートを室温で４時間にわたって 培養した。リシンは未反応のグルタルアルデヒドの結合部位と反応するように機 能し、プレートに対するスペクトリンのさらなる結合を防止する。

未知のものについてのスペクトリン免疫反応性を測定するために、各々のウェル 内のりシン溶液を捨て、未知のサンプルを各々のウェル内に置いた。次いで２０ ｍＭのトリス、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ１０．５％ウシ血清アルブ ミン、０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０．２ｍＭのＥＧＴＡ、０．２％窒化ナトリウム 、ｐＨ＝７．２　（ｒ分析緩衝液」）により、容量を５０μＩに調節した。これ に対して、分析緩衝液中で１：５０，０００に希釈した抗スペクトリン抗血清を ５０μｍ添加した。プレートを混合し、４℃で一晩培養した。次いで１０ｍＭの トリス、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２　（ｒ洗浄緩衝液」）中でプレートを ４回洗浄し、分析緩衝液を用いて製造業者の推奨するところの濃度に希釈した１ ００μｌのビオチン化したヤギ抗ウサギ抗血清（ベクター・ラボラトリーズから 入手可能）を添加し、プレートを揺動プラットホーム上で室温で４時間培養した 。このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、分析緩衝液中において製造業者の指 示に従って調製した１　００　Ｉｔ　ｌのＡＢＣ（アルカリホスファターゼ）試 薬（やはりベクター・ラボラトリーズから入手可能）を添加した。プレートを室 温で揺動プラットホーム上で２時間培養し、洗浄緩衝液で６回洗浄した。製造業 者の指示に従って作成したアルカリホスファターゼ基質溶液（バイオ−ラド社か ら入手可能）を１００μｌ添加し、室温で３０分から４時間にわたって培養する ことにより、色が発現した。

この未知サンプルの測定と並行して、最初に既知の濃度のスペクトリンを含有し ているウェルのスペクトリン免疫反応性の測定をも行った。

これらの標準濃度を含有しているウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をプレート リーダーを用いて読み取り、このデータから図６に示す標準曲線を得た。

未知サンプルを含有しているウェルの４０５　ｎｍにおける吸光度もまた読み取 り、未知のウェルの標準曲線に対する吸光度を比較することにより、スペクトリ ンの濃度をめた。スペクトリンの免疫反応性の濃度は、実施例ＶＩＩＩのウェス ターン法による分析に従う同じサンプルについての測定と良好に相関していた。

以下の実施例は、神経変性したラットにおけるウェスターン法とＥＬ　Ｉ　ＳＡ 法の間の相関を例証する。

成体のラットに、海鳥内における神経変性を生ずる化合物として知られているカ イネート（ｋａｉｎａｔｅ）を７５　ｎ　ｇ、脳内脳室注射を行った。

ラットの別の組には、同容積の塩類溶液の注射を行った。これらのラットは４日 間かけて回復させた。次いで海馬を除去し、吻側から尾側にかけて４つの部分に 分割した。各々の部分を実施例ＩＩにおける如きウェスターン法を用いて、また 実施例ＸＩＩにおける如きＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。結果を図７に示す。

図７は、対照動物の左（吻側から尾側、１−４）及び右（５−８）の海馬、及び カイネートを注入した動物からの左（９−，１２）及び右（１３−１６）の海馬 を示す。上側のパネルはウェスターン法による分析を示し、下側のパネルはＥＬ 　Ｉ　ＳＡ法による分析を示す。ＥＬＩＳＡ法により測定した免疫反応性の全量 の増大が、ウェスターン法により測定したＢＤＰにおける増大と良好に相関して いることを看取するこδができる。

本発明のＥＬＩＳＡ法の一つの特別な適用例は、蜘網膜下出血、卒中、多発性梗 塞性痴呆症、ＨＩＶ誘発神経病及びアルツハイマー病といった神経変性状態の指 標として、脳を髄液（ＣＳＦ）中におけるスペクトリン又はスペクトリン免疫反 応性を検出することである。

限外濾過により濃縮された正常なＣＳＦ中におけるスペクトリンの微量を検出す ることも可能ではあるが、正常な濃縮されていないＣ８Ｆ中においては、本発明 のＥＬＩＳＡ法分析を用いることによっては事実上回のスペクトリン免疫反応性 も検出されない。従って、未濃縮のＣ３Ｆにおけるスペクトリン又はスペクトリ ンＢＤＰの何れかの検出は、神経系内における細胞の死又は分解を示すことにな る。スペクトリンは脳室を裏打ちしている皮膚同種（ｉｓｏｄｅｒｍａｌ）細胞 中に存在しており、特にＣＳＦと血液の間にある特定の細胞中に存在しているが 、そのような細胞の数は神経細胞に比べて非常に少ない。ニューロンの支持細胞 である神経膠細胞の死又は分解もまた、ＣＳＦに対するスペクトリン又はＢＤＰ に寄与することができる。しかしながら、神経膠細胞の死又は分解の後、それら の細胞が支持していた神経細胞の死又は分解が、そのすぐ後に続く。従って、Ｃ ＳＦにおいて見い出されるスペクトリン免疫反応性の殆ど大部分は、神経細胞の 崩壊を示すものとなる。

ヒトの脳を髄液は、直接に、あるいは凍結乾燥又は遠心限外濾過（”Ｃｅｎｔｒ ｉｃｏｎ−１０’又は”Ａｍ１ｃｏｎ″という商品名で販売されている機材を用 いて）を使用して濃縮した後に分析することができる。以下の実施例は、スペク トリンの免疫反応性の存在に関してヒトのＣＳＦを分析するための本発明の典型 的な一方法を例証するものである。

破裂していない動脈瘤（グループ１）を有すると診断された二人の患者と、動脈 瘤が破裂し蜘網膜下出血を生じている四人の患者（グループ２）からの脳を髄液 サンプルを得た。各々のサンプルの２ｍｌを凍結乾燥し、１００μ！の水中に再 懸濁し、得られた溶液の１０μｍを実施例ＸＩＩのＥＬＩＳＡ法を用いてスペク トリンの免疫反応性に関して分析した。結果を図８に示す。蜘網膜下出血を生じ ているグループからのＣＳＦサンプルは全てスペクトリン免疫反応性を示したが 、未破裂の動脈瘤グループは検出可能なスペクトリン免疫反応性を示さなかった 。

従って実施例ＸＩＶから、ＣＳＦ中における検出可能量のスペクトリン免疫反応 性の存在が、神経組織における細胞の死又は変性を示していることが看取され得 る。

概括すれば、以上の実施例は明らかに、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける神経変性が、Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡ法により測定した如く、スペクトリンの全免疫反応性を劇的に増大 させることを示している。神経変性を検出するについてのＥＬｒＳＡ法分ＳＡ法 範な適用性を例証するために、以下の実施例を行ＣＳＦ中におけるスペクトリン 免疫反応性レベル神経変性に随伴することが知られている種々の状態に苦しんで いる何人もの異なる患者から取ったＣ８Ｆについて、実施例ＸＩＩのＥＬＩＳＡ 法を用いてスペクトリンの全免疫反応性を測定した。結果を図９に示す。”ＡＮ ＥＵ”と標識した図９の最初のカラムは、実施例ＸＩＶのグループｌにおけるよ うに、脳動脈瘤が検出されその動脈瘤が破裂する前に外科的に治療された二人の 患者についての結果を示す。従って、これらの患者については顕著な神経変性は 予想されない。図９において看取され得るように、これらの患者から取ったＣＳ Ｆ中においてはスペクトリン免疫反応性は見い出されなかった。このデータは、 本発明のＥＬＩＳＡ法分析を用いた場合に神経変性のない哺乳類のＣＳＦ中には スペクトリン免疫反応性が検出されないことを確認するものである。

”ＳＡＷ’と標識されている図９の次のカラムは、Ｃ５Ｆドレーンが設置された 蜘網膜下出血のある１２人の患者のＣ５Ｆにおけるスペクトリン免疫反応性の測 定値を示す。１２人の患者の全てからのＣ３Ｆがスペクトリン免疫反応性を示し ており、神経変性が生じたことを示している。

ＡＤ”と標識されている図９の第三のカラムは、３人のアルツノ１イマ一病患者 からのＣ３Ｆにおけるスペクトリン免疫反応性を示している。

３人の患者は全て、それらのＣ８Ｆ中においてスペクトリン免疫反応性を示して おり、神経変性が生じたことを指示している。

図９の４番目のカラムは、−人の卒中（ｓｔｒｏｋｅ）患者からのＣ３Ｆにおけ るスペクトリン免疫反応性を示している。この患者のスペクトリン免疫反応性は 非常に高いことが看取され得るものであり、かなりの神経変性が生じたことを示 している。

”ＩＶＨ”と標識された図９の５番目のカラムは、脳室内出血を起こしている３ 人の未熟児からのスペクトリン免疫反応性を示している。結果は、これらの患者 ３人のうち２人までがＣＳＦ中におけるスペクトリン免疫反応性を示すことを示 し、神経変性が起きていることを表している。

図９の最後のカラムは一人のピック病患者のスペクトリン免疫反応性を示してい る。その結果はこの患者におけるスペクトリン免疫反応性が高レベルであること を示し、この疾病に伴う神経変性を示している。ビック病は、臨床的にはアルツ ハイマー病と区別するのが非常に困難なものである。現在ではビック病は、検死 に際してのみ、アルツハイマー病と容易に区別可能であるに過ぎない。ここでの データからは、ピック病の患者はアルツハイマー病の患者の誰よりも高いレベル のスペクトリン免疫反応性を有することが看取できる。従って本発明の方法は、 ピック病患者のＣＳＦ中において見い出される一般的に高いレベルのスペクトリ ン免疫反応性により、これら二つの病気を区別するための診断ツールを提供する ものと考えられる。

かくして上記の実施例から、Ｃ３Ｆ中におけるスペクトリン免疫反応性の測定が 、幅広い各様の原因による神経変性についての有用な指標であることを看取する ことが可能である。

以上の実施例の全てにおいて検出されたスペクトリン免疫反応性は、勿論、多数 の具なる抗原エピトープに基づくものである。スペクトリンのＢＤＰへのタンパ ク質加水分解の後に、無傷のスペクトリンにおいては存在しない付加的又は潜在 的なエピトープが露出されるものと考えられる。従ってＢＤＰに対して育成され た多クローン性抗体を用いてＥＬＩＳＡ法分析を行う場合には、ＢＤＰは無傷の スペクトリンよりも強い信号をもたらすことができる。そのような分析にお０て ζよ、潜在エピトープを露出するような仕方でスペクトリンを処理することによ ってもまた、無傷のスペクトリンよりも強い信号をもたらすことができる。

実施例ＩＩからＸＩのウェスターン法分析において用いた抗スペクト１ノン抗体 は、実施例ＩＩに記載の親和性精製法を用いて親和的に精製した。

無傷のスペクトリンについて行ったこの親和精製ステップは、存在するスペクト リンに対する、また無傷のスペクトリンに露出されるエピトープに対する抗体の 精製という結果をもたらす。しかしながら、生血溝はスペクトリンに対して反応 する少なくとも二つの他の種類の抗体を含んでいた。その種類の一つは、無傷の 四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒｅｓ）においては露出されていないが分裂したスペク トリンにおいては露出されているスペクトリンのエピトープに対する抗体である 。抗体の別の種類は、スペクトリン−５ＤＳ錯体に特異な抗体である。この種類 の抗体が予測されるのは、実施例ＩＩにおいて抗体を産生じているウサギを免疫 化するのに用いたスペクトリンが５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製され、その結果と してこれらの５ＤＳ−スペクトリン錯体の形成が行われるからである。生の、親 和精製されていない、変性されたラットのスペクトリンに対して育成された抗ス ペクトリン抗体が無傷のスペクトリンの場合よりも変性されたスペクトリンにつ いてより効率的に反応するということを例証するために、そしてまたそれにより 、潜在的なエピトープが存在すること及び潜在エピトープに対する抗体を用いて 変性されたスペクトリンから生のスペクトリンを区別することができるというこ とを例証するために、以下の実施例を行った。

実施例ＸＶＩ 性スペクトリン及び化スペクトリンの免疫反応性実施例ＸＩＩにおけるようにし て、スペクトリンをポリスチレンプレート上に固定化した。各々のウェルは４つ のうち一つの変性処理剤でもって室温において１時間培養し、次いで洗浄緩衝液 （５０ｍＭ）リス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）中で６回洗浄した。こ の４つの変性処理剤とは、対照（洗浄緩衝液）、１％ＳＤＳ、１Ｍの酢酸及びＩ ＭのＫＩである。各々の処理について４つのウェルを分析した。プレート上にお けるスペクトリンの免疫反応性の量は、分析緩衝液中で１：１０，０００に希釈 した免疫したウサギからの生血溝（１００μｌ／ウエル）でプレートを一晩４℃ で培養し、洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄し、実施例ＸＩＩにおけるようにし てベクターのＡＢＣ−ＡＰキットを用いて結合した抗体を検出することによって 測定した。結果対　照　０．９９７±０．１１５ １％ＳＤ５　２．５４０±０．２８１ １Ｍ　酢酸　１．１１０土０．０８７ ギからの生血溝が、生の対照処理のスペクトリンよりも効率的シこ変性スペクト リンを認識することを看取することができる。意外なことではなしに、ＳＤＳで 処理したスペクトリンはこの血清と最も強く反応する。従ってこれらの結果から 明らかなことは、変性スペクト１ノンが無傷のスペクトリン分子においては存在 してし−なし）潜在的なエピトープを露出しているということである。ＴＣＡ、 有機溶媒、エタノール及びグアニジンといった他の変性処理剤も、免疫反応性各 二つ（Ｓで同様の増大を生ずるものと予想される。

また、無傷のスペクトリンがＢＤＰへと開裂することも、隠されたエピトープを 露出するものと考えられる。溶液中でのスペクトリンの開裂が隠れたエピトープ を露出し、これらのエピトープ番二対する抗体を用いて無傷のスペクトリンを開 裂したスペクトリンから区別することができることを例証するために、以下の実 施例を行った。

ラットの脳を１０ｍＭのＨＥＰＥＳｌｌｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭ（７）ＤＴＴ、 ｐＨ＝７．２中においてホモジナイズした。ホモジネートを１２、ＯＯＯＸｇに おいて１０分間遠心分離し、上溝を２つの分画に分割した。カルパインを活性化 するため、分画２に対してＣａＣ１，を添加した。画分２におけるＣａ−の最終 的な濃度は５０ｍＭであった。

画分１にはＣａＣｌ□を添加しなかった。両方の画分を３７℃において３０分間 培養した。サンプルの免疫反応性はこの培養期間の前及び後の両方において、実 施例ＸＩＩのＥＬＩＳＡ法分析を用いて測定した。二番目のサンプルにおいて、 ＢＤＰの形成へとつながる多大のタンパク質加水分解が生じたことが、実施例Ｉ Ｉにおける如きウェスターン法分析により確認された。他のサンプルにおいては タンパク質加水分解は検出されなかった。何れのサンプルにおいても、沈澱は観 察されなかった。ＥＬＩ　ＳＡ測測定結果を表２に示す。

１　（−Ｃａ”）　０．　３１６±０．０１４　０．３８１±０．０２３２　（ ＋Ｃａ”）　ｏ、３３４±０．０３３０．４５１±０．０２２疫反応性が平均０ ．３８１から平均０．４５１へと、１８％の増分をもって増大したことを看取す ることができる。いかなる場合にも、画分ｌの免疫反応性は画分２の免疫反応性 を越えることはなかった。従って上記の実施例は、／’／７　ｖｉ’ｔｒｏにお けるスペクトリンのＢＤＰへの開裂が、５ＤＳ−スペクトリン錯体で免疫された ウサギの生血溝に対する免疫反応性を増大させることを示している。

ウェスターン法分析をＥＬＩＳＡ法分析と比較している図７に戻ると、スペクト リンの免疫反応性の量は、ラットの海鳥のＢＤＰの増大が見い出される区域にお いて最も劇的に増大していることを看取することができる。従って図７のデータ は、ｉｎ　ｖｔｔｒｏのみならず１ｊｙｊｔｔｏにおけるＢＤＰへの開裂によっ ても免疫反応性が増大されることを確認している。

無傷のスペクトリンにおける隠されたエピトープの利用可能性は、無傷のスペク トリンとは全く異なり、ＢＤＰを特異的に検出するＥＬＩＳＡ法分析又は他のイ ムノアッセイを提示する。そのような分析法は、技術的に公知の方法を用いて、 例えば親和精製又は隠されたエピトープに対する単クローン性抗体の産生を通じ て得られる、これらの隠されたエピトープのみに対する抗体を用いることができ る。実施例ＩＩにおける如く無傷のスペクトリンに存在し且つ露出されているエ ピトープに対する種類の抗体の親和精製は、隠されたエピトープに対する抗体を 含んでいるスペクトリン−セファロースに結合しない画分をもたらすものと予想 される。

隠されたエピトープに対する抗体源を用いることにより、スペクトリンの免疫反 応性の全量及びＢＤＰ免疫反応性の量の測定を別個に行い得ることが予想される 。

或いはまた、無傷のスペクトリン分子の溶解度に影響する溶液の条件を変化させ ることにより、ウェスターン法により視覚化されたＢＤＰｌ及びＢＤＰ２ポリペ プチド及び他のスペクトリンフラグメントを含めて、ＢＤＰから無傷のスペクト リンを分離することが可能であると考えられる。ｐＨ，イオン強度或いは他のそ のような因子を変化させることにより、ＢＤＰを可溶化させる一方で無傷のスペ クトリン分子を沈澱させることが可能であると考えられる。スペクトリン免疫反 応性を有するサンプルを、界面活性剤、酸性又は塩基性ｐＨ（好ましくは８．５ より大きいか又は５．５より小さい）を生ずる試薬、カオトロピック試薬及び誘 電率の低い有機溶媒からなる群から選択された試薬で処理することにより、ＢＤ Ｐの一部又は全部を沈澱させることなしに無傷のスペクトリンを沈澱させるのに 必要な、変化された溶解条件が得られるものと考えられる。沈澱した無傷のスペ クトリン分子を除去することにより、存在するＢＤＰの量の測定を行うことがで きる。商業的な有用性のためには、ＢＤＰの少なくとも１０倍の濃縮が好ましく 、１００倍程度がより好ましい。

本発明は現在のところ好ましい実施例を参照して記載してきたが、本発明の思想 から逸脱することなしに種々の改変を行い得ることが理解されねばならない。従 って本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

スペクトリン崩壊（％） ％ＢＤＰ　（１＋２） ω 全スペクトリンＢＤＰ　（％） スペクトリン崩壊（％） 吸光度４０５ｎｍ スペクトリン免疫反応性 ｎｇ／ｕｇ　タンパク質 ！−−−孜−−−豊 本発明は、細胞骨格成分であるスペクトリンの安定な崩壊生成物、ＢＤＰ又はＢ ＤＰｌ及びＢＤＰ２と命名されるものの存在を測定するためのイムノアッセイを 介して、細胞病理を検出するための方法を提供する。本発明の一つの側面におい ては、スペクトリン含有細胞のサンプルからの成分は、ＢＤＰ及びスペクトリン が分離されるような仕方で例えば電場にかけることによって物理的に分離される 。ＢＤＰと反応性の抗体が次いでこの分離されたサンプルに接触され、サンプル において何らかのＢＤＰを含有している部分に対するそれらの結合が測定される 。本発明の別の側面においては、分析、例えばＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析が行われて、 細胞の死又は分解の指標として、スペクトリンの全免疫反応性が検出される。

補正書の写しく翻訳文）８！出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４９１０ ２・発明の名称 スペクトリン又はその崩壊生成物の分析１こよる細胞壊死検出３、特許出願人 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニツイーンティ・オブ・カリフォルニア ４、代理人 補正クレーム ５、サンプルが脳を髄液又は組織サンプルである、請求項３の方法。

６、測定ステップが、サンプル中に存在する無傷のスペクトリンからスペクトリ ン崩壊生成物を物理的に分離することなしに遂行される、請求項１の方法。

国際調査報告 −釦−−−紬一一、ｋＰＣＴハＪＳ　９１１０４９１０１＠−一＆−１ｃｊｌＩ ａａｍ＆　ｐｃ丁／ＵＳ　９１１０４９１０国際調査報告 にＴＡＩＳ　９１１０４９１０ Ｓ＾　４９５２９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．被検体における細胞の死又は分解を検出するための方法であって、 被検体から生物学的サンプルを取り出し、サンプル中における無傷のスペクトリ ン及びスペクトリン崩壊生成物を含むスペクトリンの全量を測定し、スペクトリ ンの全量の基底量を測定し、スペクトリンの全量の測定量をスペクトリンの全量 の基底量と比較し、 サンプル中におけるスペクトリン全量の数量が基底量よりも大きいことが、サン プルを取り出した組織又はサンプルと流体連絡している組織における細胞の死又 は分解を指示することからなる方法。 ２．スペクトリンの全量及びスペクトリンの全量の基底量を測定するステップが 、スペクトリンの全免疫反応性を測定することにより行われる、請求項１の方法 。 ３．スペクトリンの全量の基底量が正常な被検体からの生物学的サンプルにおけ るスペクトリン全量の数量である、請求項１の方法。 ４．正常な被検体からの生物学的サンプルにおけるスペクトリン全量の数量が、 スペクトリンの全量を測定するステップにおいて用いられる方法により測定され た場合には実質的に検出不能なスペクトリン量である、請求項３の方法。 ５，サンプルが脳脊髄液である、請求項３の方法。 ６．サンプルが組織サンプルである、請求項１の方法。 ７．サンプルが神経組織ホモジネートサンプルである、請求項６の方法。 ８．サンプルが血液又は血液成分である、請求項１の方法。 ９．被検体が哺乳類である、請求項１５の方法。 １０．スペクトリンの全量及びスペクトリン全量の基底量を測定するステップが ＥＬＩＳＡ分析により行われる、請求項１の方法。 １１．スペクトリンの全量及びスペクトリン全量の基底量を測定するステップが 、 サンプルを電気泳動にかけた後に得られるゲルを染色し、無傷のスペクトリン又 はスペクトリン崩壊生成物に結合した染料の量を測定することからなる、請求項 １の方法。 １２．細胞の死又は分解が、蜘網膜下出血、卒中、多発性梗塞性痴呆症、ヒト免 疫不全性ウイルス誘発神経症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロ フィー、脈管内出血及びピック病からなる群から選択された状態に起因する、請 求項１の方法。 １３．スペクトリンの全量及びスペクトリン全量の基底量を測定するステップが ウェスターン法により行われる、請求項２の方法。 １４．スペクトリンの潜在性エピトープに特異な抗体を調製する方法であって、 スペクトリンが実質的に変性するようにスペクトリンを処理し、処理したスペク トリンで哺乳類を免疫し、前記哺乳類から血清を得ることからなる方法。 １５．スペクトリンを処理する前記ステップが、界面活性剤、酸性又は塩基性ｐ Ｈを生ずる試薬、カオトロピック試薬及び誘電率の低い有機溶媒からなる群から 選択された試薬で処理することからなる、請求項１４の方法。 １６．哺乳類におけるスペクトリン崩壊の存在を評価するための方法であって、 前記哺乳類から生物学的サンプルを取り出し、前記サンプルをスペクトリンの潜 在性エピトープに特異な抗体に暴露し、 前記サンプルに結合した抗体の量を測定することからなる方法。 １７．被検体における細胞の死又は分解を検出するための方法であって、 被検体から生物学的サンプルを取り出し、スペクトリンの潜在性エピトープに特 異な抗体にサンプルを暴露し、サンプルに待合した抗体の量を測定することによ り、スペクトリン崩壊生成物の存在に関してサンプルを分析し、スペクトリン崩 壊生成物の基底レベルを測定し、分析ステップにおいて測定したスペクトリン崩 壊生成物の量をスペクトリン崩壊生成物の基底量に対して比較し、サンプル中に おけるスペクトリン崩壊生成物のレベルが基底レベルよりも大きいことにより、 サンプルを取り出した組織又はサンプルと流体連絡している組織における細胞の 死又は分解を指示することからなる方法。 １８．生物学的サンプルを生物学的サンプル中における無傷のスペクトリンに対 してのスペクトリン崩壊生成物に関して濃縮する方法であって、前記サンプル中 における無傷のスペクトリンを沈澱させ、無傷のスペクトリン分子及びスペクト リン崩壊生成物の溶解度に差別的に影響する条件を変化させることにより前記サ ンプル中においてスペクトリン崩壊生成物を溶液中に残し、沈澱した無傷のスペ クトリンを除去することからなる方法。 １９．無傷のスペクトリンを沈澱させるステップが、生物学的サンプル溶液のｐ Ｈ又はイオン強度を変化させることからなる、請求項１８の方法。 ２０．無傷のスペクトリンを沈澱させる前記ステップが、最初の生物学的サンプ ルの少なくとも１０倍の濃縮を生ずる、請求項１９の方法。 ２１．被検体における細胞の死又は分解を検出するための方法であって、 被検体から生物学的サンプルを取り出し、無傷のスペクトリン分子及びスペクト リン崩壊生成物の溶解度に対して差別的に影響する条件を変化させることにより 、無傷のスペクトリンをサンプル中において沈澱させ、スペクトリン崩壊生成物 をサンプル中の溶液中に残し、 沈澱した無傷のスペクトリンを除去し、それにより得られた溶液を崩壊生成物の 存在に関して分析し、スペクトリン崩壊生成物の基底レベルを測定し、分析ステ ップにおいて測定されたスペクトリン崩壊生成物の量をスペクトリン崩壊生成物 の基底量に対して比較し、サンプル中におけるスペクトリン崩壊生成物のレベル が基底レベルよりも大きいことにより、サンプルを取り出した組織又はサンプル と流体連絡している組織における細胞の死又は分解を指示することからなる方法 。