CN107653313B - Retn和klk1在作为结核病检测标志物中的应用 - Google Patents

Retn和klk1在作为结核病检测标志物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了RETN和KLK1在作为结核病检测标志物中的应用。通过实验证明，RETN基因和KLK1基因在正常组织、结核潜伏感染者(LTBI)和结核病患者(TB)中存在明显的表达差异，结核病患者(TB)组织中RETN基因的表达水平远高于正常组织或者结核潜伏感染者(LTBI)；KLK1基因的表达水平远低于正常组织或者结核潜伏感染者(LTBI)。因此RETN基因和KLK1基因可以作为标志物用于检测或诊断结核病，从而对结核病的发生和进展进行监测。

Description

RETN和KLK1在作为结核病检测标志物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及RETN和KLK1在作为结核病检测标志物中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引发的慢性传染性疾病，严重威胁人类健康。全国第五次结核病流行病学调查显示我国现有超过500万名成人活动性肺结核患者。成人感染结核分枝杆菌后，部分呈现带菌生存状态，并不会发展为结核病，称为潜伏感染者(Latent tuberculosis infection，LTBI)；约5-10％的潜伏感染者会继续发展为活动性结核病。国内各地区流行病学调查结果显示，基于γ-干扰素释放试验(IGRA)得出的结核分枝杆菌感染率大约在20-30％之间，即全国约有3-4亿人为结核分枝杆菌感染者，数目庞大的无临床症状的结核潜伏感染者是活动性结核病的重要来源。此外，由于结核潜伏感染的预防性治疗方案与活动性结核病的抗痨治疗方案显著不同。因此，如何实现结核分枝杆菌潜伏感染者与活动性结核病的早期鉴别诊断至关重要。
常用的结核分枝杆菌感染诊断方法包括传统的结核菌素实验(TST)以及γ-干扰素释放试验(IGRAs)，TST方法容易受到卡介苗接种和非结核分枝杆菌的干扰，结核分枝杆菌感染诊断不够明确，更无法区别潜伏感染和活动性结核病。新近推行的IGRAs方法，虽然能够检测结核分枝杆菌感染，但无法区分结核杆菌潜伏感染和活动性结核病。目前活动性结核病的诊断金标准仍然是经典的痰涂片染色显微镜下查找抗酸杆菌以及结核杆菌培养法，已有近百年的历史。这两种检测方法的敏感性均不高，痰涂片染色法的敏感性约30％，结核杆菌培养法的敏感性约60％。痰涂片染色法虽然可以当天出结果，但不能区分结核杆菌和非结核分枝杆菌，也不能区分活菌还是死菌。结核杆菌培养法的敏感性虽高一些，但耗时较长，即使快速培养也需要1个月的时间才能得到结果。另外，对于临床上大量的肺外结核和涂阴、菌阴的结核患者，金标准检测方法的应用受到限制，加剧了诊断的困难，给及时治疗带来了阻力。近年来虽然陆续出现了一些先进的基于核酸扩增的分子生物学检测技术(如XpertMTB/RIF assay)，但由于受到仪器设备和诊断费用的限制，以及假阳性率偏高等问题，还无法全面推广。因此，现行的结核病诊断方法或辅助诊断手段都无法实现快速有效的鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病，使得临床上面临严重的治疗延误以及过度治疗等问题。基于此，寻找新的结核病特异标志物，鉴别诊断结核潜伏感染和活动性结核病，已经成为结核病临床诊断中一项亟待解决的难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何鉴别结核潜伏感染者和活动性结核病患者。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测如下(1)-(3)中任一种的检测物的物质的新用途：
(1)RETN基因和KLK1基因；
(2)RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
(3)RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
本发明提供了上述检测物在制备用于鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者的产品中的应用。
本发明还提供了上述检测物在鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者中的应用。
上述应用中，所述检测物为检测如下(1)-(3)中任一所述的检测物所需的试剂和/或仪器：
(1)RETN基因和KLK1基因；
(2)RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
(3)RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
为解决上述技术问题，本发明又提供了鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者的系统。
本发明提供的鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者的系统包含用于检测如下(1)-(3)中任一种的检测物：
(1)RETN基因和KLK1基因；
(2)RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
(3)RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
上述系统中，所述检测物为检测如下(1)-(3)中任一所述的检测物所需的试剂和/或仪器：
(1)RETN基因和KLK1基因；
(2)RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
(3)RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
上述应用或系统中，所述检测上述检测物所需的试剂和/或仪器可为任何能够实现对上述检测物进行定量检测的试剂和/或仪器，如定量PCR检测所述RETN基因或KLK1基因表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用基因芯片检测所述RETN基因或KLK1基因表达水平所需的试剂和/或仪器。
上述应用或系统中，所述物质或系统还包含数据处理装置；所述数据处理装置内设具有如下(a1)和(a2)所示的功能的模块：
(a1)分别检测待测者组织样本中RETN基因和KLK1基因的相对表达量，得到KLK1相对表达量和RETN相对表达量；然后根据如下公式计算待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量：
联合表达量＝e2.077×KLK1相对表达量+0.741×RETN相对表达量-4.874/(1+e2.077 ×KLK1相对表达量+0.741×RETN相对表达量-4.874)；
(a2)根据所述联合表达量按照如下方法确定待测者为活动性结核病患者还是结核潜伏感染者：若待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量≥0.6411，则待测者为或候选为活动性结核病患者；若待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量＜0.6411，则待测者为或候选为结核潜伏感染者。
上述相对表达量采用2-△△Ct方法计算，计算公式如下：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT待测者-ΔCT对照者)＝2-[(CT待测者目的基因-CT待测者内参基因)-(CT对照者目的基因-CT对照者内参基因)]。其中，对照者为正常人；所述目的基因为RETN基因或KLK1基因，所述内参基因为GAPDH基因。
为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物的新用途。
本发明提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者的产品中的应用。
本发明还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者中的应用。
本发明还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在制备用于检测或诊断结核病的产品中的应用。
本发明还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在检测或诊断结核病中的应用。
本发明还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在制备用于监测结核病发生和/或发展的产品中的应用。
本发明还提供了RETN基因和/或KLK1基因作为标志物在监测结核病发生和/或发展中的应用。
在本发明中，所述产品可为试剂盒。
通过实验证明，RETN基因和KLK1基因在正常组织、结核潜伏感染者和活动性结核病患者中存在明显的表达差异，并且95.1％的结核潜伏感染者中的RETN基因和KLK1基因的联合表达量均小于0.6411，而73.0％的活动性结核病患者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量均大于等于0.6411。因此RETN基因和KLK1基因可以作为标志物用于鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者，从而对结核病的发生和进展进行监测。
附图说明
图1为经结核特异抗原ESAT-6和CFP-10体外刺激的结核病(TB)、结核潜伏感染(LTBI)、健康人(HC)的外周血单个核细胞内差异表达基因谱(P<0.05，Fold change>2)。
图2为17个差异基因进行qPCR验证。
图3为126例样本中验证结果。
图4为ROC曲线分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、结核病检测标志物的筛选
一、差异表达基因的筛选
1、供试者
4例经临床确诊的活动性结核病患者(TB)、4例经临床确诊的结核潜伏感染者(LTBI)和4例正常人(HC)。供试者均为自愿参与。
2、芯片筛选差异表达基因
使用Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray(4×44K)(上海伯豪生物芯片有限公司)对供试者外周血单个核细胞进行基因芯片分析，分析的具体步骤参照芯片使用说明书，经P<0.05，Fold change>2标准筛选获得差异基因表达谱。
按照组间差异倍数FD>10且在TB和LTBI、TB和HC中趋势一致，在TB与LTBI组间共筛选得到13个差异表达基因，在TB与HC组间共筛选得到11个差异表达基因。TB与LTBI组间的13个差异表达基因和TB与HC组间的11个差异表达基因共存在7个为重叠基因，最终筛选得到如下17个差异表达基因：RETN、KLK1、CXCL5、HP、LCN2、S100A2、F3、CNKSR3、CA12、ABCA1、PID1、LTF、LRRC38、MT1JP、CD177、CXCL3和INSM1。
二、qPCR验证
1、12例样本
分别提取步骤一中12例供试者组织样本中的RNA，反转录获得cDNA。以12例供试者的cDNA为模板，采用qPCR检测供试者中步骤一中筛选获得的17个差异表达基因的组间相对表达量。组间相对表达量采用2-△△Ct方法计算，计算公式如下：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT实验组-ΔCT对照组)＝2-[(CT实验组目的基因-CT实验组内参基因)-(CT对照组目的基因-CT对照组内参基因)]，目的基因为表1中17个基因，内参基因为GAPDH基因。引物序列如表1。
表1、17个待测基因和内参基因(GAPDH)引物序列
基因 正向引物(5'to3') 反向引物(5'to3')
CXCL5 TTGGCCCCTTTCACAGAGTAGA GAACTGTGCTAAAAACCCGACA
CYP3A5 TGGACAGAGCCTGAGGAGTT GTTTCTGGGTCCAGTTCCAA
HP AGCCTGGAAGAGGGCAAAGT CCCATCAGCTTCAAACCACAT
LCN2 GGGCCTCCCTGAAAACCA TGCACTCAGCCGTCGATACA
S100A2 GGTAGCCATTGCGCTGAAG AGGACATTGCTGGGTAAAAAGC
CD177 CAGACCACCGTTCTATACGCAAT CCCACGATACGCAGATGCT
F3 AAGGTGACTGGGAATTGTTACTG GATACGTTGTTGTAAGCCACTGA
CXCL3 TAAATGACAGGGTGGGGAAC CCCTTACCCTAACAGTGATCCA
LRRC38 TGGGATTAGTGCCCTCATGAA GCTGCATCCTCAAGCATTGA
ABCA1 TTTTTGTGCTCTTTGTTCATCATTG CCAGTGCAAAAATAGATCCCATT
CA12 GCCCACACGCTCCTAACTCT CCTGGGCCTTGTTTTTGCTA
CNKSR3 TTGCATTTTGACCTGTTCAGTGT CCATGAGGCTTTCCAAGATATTTC
CYP3A7 GGCTTCTCTGCTTCTCATAGGACTA TTATGTTATCAGAGCTCAGGAGGAGTT
INSM1 CTGTTGTCTGGGATTGTTTTGTG ACGTGAAACACTGAGGCAGTTACT
KLK1 CACCCCCAATAAGCCTTCTG TCCGCTATGGTGTCCTCGAT
MT1JP GCAAAGGGACGTCGGAGAA TCCAGGTTGTGCAGGTTGTTC
PID1 GTGTCCGTATCTGCGTTTGTGT CATGCTTATTCTACATGCCTGAAAA
RETN TCACCGGCTGCACTTGT CTGGCAGTGACATGTGGTCT
LTF TCACTGCCCCCAGCTCTTC TAAGCAGATGGATGGGCAATC
GAPDH TGACTTCAACAGCGACACCCA CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
结果如表2、表3和图2所示。从表和图中可以看出：17个差异表达基因在qPCR与芯片中的表达趋势一致率为100％(17/17)，其中6个基因RETN、KLK1、CXCL5、HP、PID1和CXCL3保持组间差异(P<0.05)。
表2、TB与LTBI、TB与HC组间差异基因的芯片分析结
Figure BDA0001405115750000051
Figure BDA0001405115750000061
表3、TB与LTBI、TB与HC组间差异基因的qPCR分析结果
编号 基因 TB/LTBI 调控模式 P-value TB/HC 调控模式 P-value
1 RETN 17.79 上调 0.087 15.04 上调 0.048
2 KLK1 0.14 下调 0.001 0.07 下调 0.036
3 CXCL5 31.07 上调 0.031 6.35 上调 0.023
4 HP 4.99 上调 0.038 2.88 上调 0.071
5 LCN2 9.53 上调 0.085 4.99 上调 0.107
6 S100A2 5.33 上调 0.101 3.68 上调 0.079
7 F3 8.61 上调 0.186 19.98 上调 0.163
8 CNKSR3 2.72 上调 0.333 6.68 上调 0.218
9 CA12 4.83 上调 0.135 3.79 上调 0.155
10 ABCA1 22.96 上调 0.148 4.16 上调 0.185
11 PID1 9.61 上调 0.003 1.72 上调 0.114
12 LTF 3.99 上调 0.296 1.95 上调 0.465
13 LRRC38 2.51 上调 0.372 3.20 上调 0.233
14 MT1JP 8.39 上调 0.235 9.94 上调 0.201
15 CD177 1.74 上调 0.235 3.31 上调 0.063
16 CXCL3 7.61 上调 0.036 4.85 上调 0.022
17 INSM1 4.26 上调 0.050 2.58 上调 0.085
2、126例样本
(1)供试者
37例经临床确诊的活动性结核病患者、41例经临床确诊的结核潜伏感染者和48例正常人。供试者均为自愿参与。
(2)qPCR
分别提取步骤(1)中126例供试者组织样本中的RNA，反转录获得cDNA。以126例供试者的cDNA为模板，采用qPCR检测步骤1中的6个差异表达基因RETN、KLK1、CXCL5、HP、PID1和CXCL3的表达情况。
结果表明：6个差异表达基因中的基因RETN和KLK1在TB组与LTBI组间，TB组与HC组间均存在组间显著差异。与LTBI组和HC组相比，TB组的RETN基因相对表达量均显著高于LTBI组和HC组；与LTBI组和HC组相比，TB组的KLK1基因相对表达量均显著低于LTBI组和HC组。
上述实验结果表明：RETN和KLK1可作为结核病诊断标志物，其表达水平与结核病密切相关。
(3)计算结核病患者(TB)和结核潜伏感染者(LTBI)的联合表达量
根据37例结核病患者(TB)和41例结核潜伏感染者(LTBI)的RETN和KLK1的相对表达量(相对于正常人组)分别计算每个样本的联合表达量。其中，与正常人组相比，KLK1的相对表达量记作KLK1相对表达量；与正常人组相比，RETN的相对表达量记作RETN相对表达量。联合表达量计算公式如下：联合表达量＝e2.077×KLK1相对表达量+0.741×RETN相对表达量-4.874/(1+e2.077 ×KLK1相对表达量+0.741×RETN相对表达量-4.874)。
结果表明：37例活动性结核病患者中，有27例(73.0％)的联合表达量均≥0.6411；而41例结核潜伏感染者中，有39例(95.1％)的联合表达量均＜0.6411。
因此，可基于RETN和KLK1基因通过如下方法鉴别待测者为活动性结核病患者还是结核潜伏感染者：
(a1)检测待测者组织样本中RETN基因和KLK1基因的相对表达量，并根据RETN基因和KLK1基因的相对表达量计算联合表达量；
(a2)根据联合表达量按照如下方法确定待测者为结核病患者(TB)和结核潜伏感染者(LTBI)：若待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量≥0.6411，则待测者为或候选为结核病患者；若待测者组织样本中RETN基因和KLK1基因的联合表达量＜0.6411，则待测者为或候选为结核潜伏感染者。
三、ROC曲线分析
对疾病组和对照组测定结果进行ROC曲线分析，通过确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性(代表真阳性率)为纵坐标，1-特异性(代表假阳性率)为横坐标作图绘成ROC曲线。ROC曲线下的面积值在0.5和1.0之间。在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC为0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC＜0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。ROC曲线分析的具体步骤如下：
1、定义列变量并输入数据
(1)诊断分类值或检测结果(test)：多个诊断试验则定义test1，test2，...；
(2)金标准类别(gro上调)：1＝病例组，0＝对照组；
(3)分类频数(freq)，需要进一步执行第二步。
2、说明频数变量
路径：Data\Weight Case，选项：Weight case by，填表：Freqency Variable(freq)。
3、ROC分析
路径：Grahps\Roc Curve，填表：Test Variable(test)，State Variable(gro上调)，Value of state variable，选项包括：(display)ROC Curve，with diagonalreference line(机会线)，standard error and confidence interval(面积的标准误，及其可信区间)，Coordinate points of the ROC curve(ROC曲线的坐标点)，options：testdirection(如果检测值小划归为阳性，则需要选)，cofidence level(％)：需要除95％以外的可信度，可在此定义。如果是连续型测量资料，则不需要第1步的(3)及第2步。
ROC曲线分析结果如表4和图4所示。从结果可见：无论TB组与LTBI组还是TB组与HC组，RETN和KLK1基因的AUC均大于0.7。说明本发明的诊断方法准确可靠。
表4、ROC曲线分析结果
基因 AUC(95％CI) 敏感性(95％CI) 特异性(95％CI)
TB与LTBI
RETN 0.780(0.680–0.881) 70.3(53.0–84.1) 70.7(54.5–83.9)
KLK1 0.808(0.715–0.901) 75.7(58.8–88.2) 68.3(51.9–81.9)
RETN-KLK1Combination 0.912(0.851–0.974) 73.0(55.9–86.2) 95.1(83.5–99.4)
TB与HC
RETN 0.851(0.773–0.929) 94.3(80.8–99.3) 56.2(41.2–70.5)
KLK1 0.859(0.783–0.935) 82.9(66.4–93.4) 70.8(55.9–83.0)
RETN-KLK1Combination 0.947(0.904–0.990) 88.6(73.3–96.8) 89.6(77.3–96.5)

Claims (3)

1.检测如下（1）-（3）中任一种的物质在制备用于鉴别活动性结核病患者和结核潜伏感染者的产品中的应用：
（1）RETN基因和KLK1基因；
（2）RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
（3）RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质包括检测如下（1）-（3）中任一种所需的试剂和/或仪器：
（1）RETN基因和KLK1基因；
（2）RETN基因和KLK1基因编码的mRNA；
（3）RETN基因和KLK1基因编码的蛋白。
3.根据权利要求1-2中任一所述的应用，其特征在于：所述物质还包含数据处理装置；所述数据处理装置内设具有如下（a1）和（a2）所示的功能的模块：
（a1）分别检测待测者组织样本中RETN基因和KLK1基因的相对表达量，得到KLK1相对表达量和RETN相对表达量；然后根据如下公式计算待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量：
联合表达量=e2.077×KLK1相对表达量 + 0.741×RETN相对表达量-4.874/（1+ e2.077 ×KLK1相对表达量 + 0.741×RETN相对表达量 - 4.874）；
（a2）根据所述联合表达量按照如下方法确定待测者为活动性结核病患者还是结核潜伏感染者：若待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量≥0.6411，则待测者为或候选为活动性结核病患者；若待测者的RETN基因和KLK1基因的联合表达量＜0.6411，则待测者为或候选为结核潜伏感染者。
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