CN111172269B - 一种检测calm2基因表达水平的试剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测CALM2基因表达水平的试剂在菌阴性肺结核诊断中的应用。本发明设计得到人CALM2基因的荧光定量PCR扩增引物F：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG；R：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC。实现了通过提取人外周血白细胞的RNA，实时检测CALM2基因表达水平的技术效果，用于区分健康人与菌阴肺结核患者，灵敏度和特异性都可达到80％以上，从而更加有针对性的采取肺结核治疗和隔离措施。

Description

一种检测CALM2基因表达水平的试剂的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测CALM2基因表达水平的试剂在菌阴性肺结核诊断中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的重大传染病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但由于结核感染率高，耐药问题严重，目前结核病仍然是感染性疾病中的头号杀手。全球每年约200万人死于结核病，防控形势十分严峻。及早诊断活动性结核患者既是提高治疗效果的关键，也是有效控制结核病传播的关键。痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性肺结核的金标准，但灵敏度低，痰菌呈现阴性的肺结核患者占总的结核病人的60％～70％。菌阴肺结核的存在，加大了对结核诊断方法的要求。尽管当前已出现了多种基于免疫学、分子生物学、酶学等学科的诊断新技术，但即使多种诊断技术相结合，菌阴肺结核的诊断仍然较低，早期诊断率更低，并且由于结核发病和艾滋病等其他疾病合并症，最近几年反而有下降趋势，特别是菌阴肺结核的诊断仍属重大难点。因此，寻找新诊断靶点、开创新诊断方法已成为当务之急！
近几年众多科技人员一直在努力研究人外周血细胞分子的表达与结核病发病关系，寻找能够诊断菌阴肺结核病的分子标志物。CALM2分子是细胞内钙传导器蛋白，当细胞内Ca2+浓度增加时，CALM2可结合多达4个Ca2+，改变构象，调节细胞功能，如激活或抑制大量的酶、离子通道和受体。
发明内容
本研究发现，相对于健康人，在菌阴结核病患者外周血中CALM2基因的表达显著下降，因此CALM2基因的表达水平可以用来作为菌阴肺结核的新靶点分子，用于区分非结核感染与菌阴结核感染，从而更加有针对性的采取肺结核治疗和隔离措施。
本发明所采取的技术方案是：
检测CALM2基因表达水平的试剂在制备菌阴性肺结核诊断试剂盒中的应用。
上述检测CALM2基因表达水平的试剂含有CALM2 mRNA扩增引物序列组和/或核酸探针。
作为上述试剂的进一步改进，CALM2 mRNA扩增引物序列如下：
CALM2 mRNA扩增正向引物序列为：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG(SEQ ID NO.1)；CALM2 mRNA扩增反向引物序列为：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC(SEQ ID NO.2)。
作为上述试剂的进一步改进，探针为Taqman探针和/或Beacon探针。
一种同时定性/定量检测CALM2基因表达水平的方法，包括如下步骤：
1)从样品中提取RNA，加入反转录引物进行反转录，得到cDNA；
2)以cDNA为模板，使用引物进行PCR扩增反应，扩增反应的同时加入探针，对扩增产物进行分析，判断CALM2 mRNA的荧光定量反应值，即可；
其中，扩增引物为上述CALM2 mRNA扩增引物序列；
探针为上述Taqman探针和/或Beacon探针；
所述方法不用于疾病的诊断和治疗。
作为上述方法的进一步改进，PCR扩增反应体系如下：
Sybrgreen PCR 10×Buffer：5μL；
引物：F/R各1μL；
10倍稀释的cDNA：3μL；
ddH2O：补足至10μL。
作为上述方法的进一步改进，PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40cycles。
作为上述方法的进一步改进，PCR扩增反应体系中含有PCR添加剂。
作为上述方法的进一步改进，PCR添加剂为浓度<1％的DMSO或浓度<10％的甲酰胺。
本发明的有益效果是：CALM2基因的表达水平是一种新型菌阴结核分子标志物，本发明的CALM2 mRNA扩增引物序列及其检测CALM2基因表达水平的试剂等可以有效的反转录目标mRNA，有助于反映不同受试者CALM2基因的基线表达水平，更好地区分菌阴结核阳性样本和阴性样本，更容易判断出检测结果，得到的结果更为准确。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测健康志愿者与菌阴肺结核患者PBMC中CALM2的表达；
图2为ROC曲线分析。
具体实施方式
1、引物设计
设计人CALM2基因(NCBI Reference Sequence:NM_001743)的荧光定量PCR扩增引物：
F：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG(SEQ ID NO.1)；
R：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC(SEQ ID NO.2)。
2、试验操作
1)分离菌阴结核患者与健康人对照外周血，通过红细胞裂解液破除红细胞。
采用淋巴细胞分离液分离健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)；采用密度梯度离心法分离纯化PBMC，具体操作如下：
①在15mL刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；
②取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18～20℃，1800～2000rpm/min水平离心20～30min；
③离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；
④用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI 1640液，18～20℃，1500rpm/min离心10min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；
⑤细胞计数及细胞活力检测：PBMC细胞悬液与1/10体积的0.4％台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以104即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率[活细胞率％＝(活细胞数/总细胞数)×100％]。
2)提取RNA，实时荧光定量PCR检测CALM2的表达。
采用TRIzol法，裂解PBMC并提取RNA。实时荧光定量PCR检测CALM2的表达，扩增反应体系及条件为：
Sybrgreen PCR 10×Buffer：5μL；
引物：F/R各1μL；
10倍稀释的cDNA：3μL；
ddH2O：补足至10μL。
预加热温度：95℃，时间：5min；
变性温度：95℃，时间：10s；
退火、延伸温度：60℃，时间：30s；
循环次数：40次。
3、结果分析
1)分离200例以上菌阴肺结核患者与健康志愿者的PBMC，裂解并提取RNA。实时荧光定量PCR检测CALM2的表达，采用t-检验检测差异性。
结果如图1所示，相对于健康人，在菌阴结核病患者外周血中CALM2的表达显著下降(P<0.001)，因此CALM2 mRNA表达可以用来作为菌阴肺结核的新靶点分子，用于区分非结核感染与菌阴结核感染。
2)CALM2作为菌阴肺结核诊断新靶点的可行性分析
采用ROC曲线判断靶标可行性，结果表明，CALM2有望成为菌阴肺结核诊断的有效靶标(图2和表1)。
表1.ROC曲线分析结果
Cutoff 灵敏度 特异性 约登指数
…… …… …… ……
<-0.8750 0.7816 0.8943 7.40
<-0.8650 0.7931 0.8943 7.50
<-0.8550 0.8046 0.8943 7.61
<-0.8450 0.8046 0.8862 7.07
<-0.8350 0.8161 0.8862 7.17
…… …… …… ……
本发明前期结果研究发现，与健康人相比，CALM2分子在菌阴肺结核患者PBMC中表达呈现极显著下调趋势(P<0.001)。为了了解CALM2在PBMC的表达变化是否可以用于区分健康人与菌阴肺结核患者，我们使用ROC曲线分析CALM2在PBMC中的表达变化是否用于结核病的诊断。根据CALM2在健康人以及菌阴肺结核患者PBMC中的相对表达量，采用统计分析软件，建立横坐标为1-特异性、纵坐标为灵敏度的ROC曲线。结果显示，ROC曲线下面积AUC(A)＝0.9466，说明CALM2用于菌阴肺结核患者诊断具有较高的准确性(图2)。ROC曲线中A值意义说明：在A>0.5的情况下，A越接近于1，说明诊断效果越好。A在0.5～0.7时有较低准确性，在0.7～0.9时有一定准确性，在0.9以上时有较高准确性。
对累积频数分布表(表1)进行分析发现，当CALM2的转录水平Cut-off值(域值)取-0.8550时，约登指数最大，此时检测灵敏度可以达到80.46％，而特异性达到89.43％。将CALM2用于菌阴肺结核的诊断是可行的，对于提高菌阴肺结核的诊断率具有重要意义。
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<110> 南方医科大学
<120> 一种检测CALM2基因表达水平的试剂的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtgctgcag aacttcgcca tg 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaggtcttc actttgctgt catc 24

Claims (2)

1.检测 CALM2 基因表达水平的试剂在制备菌阴性肺结核诊断试剂盒中的应用，所述检测CALM2 基因表达水平的试剂的检测样本为外周血，所述检测 CALM2 基因表达水平的试剂为CALM2 mRNA 扩增引物组和核酸探针，所述CALM2 mRNA 扩增引物序列如下：
CALM2-F：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG；
CALM2-R：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，探针为 Taqman 探针和/或 Beacon 探针。
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