CN107447042B - 用于诊断活动性结核类疾病的分子标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于诊断活动性结核类疾病的分子标志物及其应用。本发明证实了miR‑16、B12、CD272可作为诊断活动性结核类疾病的分子标志物,并且三者组合诊断能够提高结核病的诊断准确率(>90%),远远优于单一标志物诊断,适用于活动性结核类疾病筛查、诊断和药效评价。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,更具体地,涉及用于诊断活动性肺结核的分子标志物及其应用。
背景技术
据估计,全球有1/3的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB),约5%~10%感染人群最终会发展为结核病(Tuberculosis,TB),我国是全球22个TB高负担国家之一。2014年WHO全球TB控制报告,全球每年新发TB患者约900万,其中死亡约150万,而我国每年新发TB患者超过100万,结核病疫情呈现出高感染率、高患病率、高耐药率、区域患病率差异大、乡村疫情高于城镇、中老年患病多、无症状肺结核患者比例大等特点。目前,临床针对活动性结核病诊疗的困点与难点仍旧是诊断与筛查,诊断发现时往往已经错过了最佳的防治时机。为此,寻找新的活动性结核病标志物、开发新型的诊断方法,尤其是早诊断已成为当下控制活动性肺结核类疾病的重点发展方向。
传统的肺结核筛选诊断方法,主要依据胸部影像学表现和痰结核菌检查,结合临床表现及其它相关检查综合分析后做出判断,主要的诊断方法主要包括放射学、病原学和免疫学诊断等几个方面。这些方法在结核的实验诊断中发挥了重要作用并取得了有目共睹的成就,但也存在一些不足,例如检出率低、检测时间长、诊断效率不高或者需配套特殊昂贵的仪器设备等。
针对这些问题,近年来各种肺结核诊断标记物及方法被不断的提出。例如,各种结合分枝杆菌分泌的特异性蛋白标志物,如CD1c、Rv1984c、IP10、Eotaxin等;针对免疫性系统相关的特异性细胞因子I-309、MIG、IL-8、白介素等血浆检测;针对血清或全血样本肺结核分枝杆菌的特异性核酸标志物检测,包括lncRNA-MIR3945HG、mRNA、micRNA;针对结核分枝杆菌分泌到尿液甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖,开发的尿液检测等。近来,为了进一步提高结合分枝杆菌的检测灵敏度与检测率,各种组合式的检测方法也逐渐被报道。例如,冯晓燕等人发明了一种包括Rv3871,Rv3876和Rv3879三种抗原的活动性肺结核诊断方法,对痰涂片阳性/痰培养阳性、痰涂片阴性/痰培养阳性以及痰涂片阴性/痰培养阴性结核患者均具有高灵敏度与特异性;通过采用活动性肺结核病的特异血清miRNAs组合(hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101),在血清miRNAs水平上对活动性肺结核病检测,灵敏度为90.2%。目前,在活动性肺结核诊断方法大部分新型诊断方法都是单一层面检测,如利用特异性蛋白标志物诊断或者核酸标志物诊断。考虑到个体的差异性、TB发病机制的复杂性,单一层面的诊断筛选对检测特异性不具备大规模筛选的优势。
近年来,已证实miRNA在宿主-致病原的免疫网络中发挥重要作用。有学者研究发现miRNA在TB的潜伏感染和活动性感染中扮演着一个重要的控制管理角色,更有研究发现miR-155,miR-29a,miR-361-5p,miR-889,miR-125b,miR-576-3p,miR-147,miR-30c,miR-146a和miR-93等miRNA在MTB感染者中存在一定的表达差异,miR-16是miR-15家族成员,定位于人染色体13q14,此前并未证实miR-16与结核病之间的关系。CD272又称B和T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA),属于免疫共抑制分子,在T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC细胞以及NK细胞中均表达。目前,大量研究均证实CD272参与不同感染性疾病的发生和发展,其与结核病的功能研究则报道较少。人TNF-α诱导蛋白1(B12)又名TNFAIP1和hBACURD2,是第一个被鉴定出的TNF-α诱导产生的蛋白,属于hBACURD家族和PDIP1家族成员。B12基因是高度保守的单拷贝基因,定位于人染色体17q22-q23。B12是E3泛素化连接酶CRLs家族Cul3的底物识别配体,主要通过介导真核生物蛋白泛素化降解发挥调控作用。目前尚无B12与结核病相关的研究报道。
综上,开发新的结核病相关分子标志物,对于结核病的早期筛查诊断非常有意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于诊断活动性结核类疾病的分子标志物及其应用。
本发明所采取的技术方案是:
用于诊断活动性结核类疾病的分子标志物,所述分子标志物为miR-16、B12、CD272中的一种或多种。
作为上述分子标志物的优选,所述分子标志物由miR-16、B12 mRNA、CD272 mRNA构成。
作为上述分子标志物的优选,所述分子标志物miR-16的相对表达量≥1.3,B12mRNA的相对表达量≥0.5,CD272 mRNA的相对表达量≤20。
作为上述分子标志物的优选,所述相对表达量是在外周血单个核细胞中的相对表达量。
作为上述分子标志物的优选,结核类疾病选自肺结核、肾结核、骨结核。
上述用于诊断活动性结核类疾病的分子标志物在制备活动性结核类疾病筛查试剂盒、诊断试剂盒、药效评价试剂盒中的应用。
作为上述应用的优选,结核类疾病选自肺结核、肾结核、骨结核。
本发明的有益效果是:
本发明证实了miR-16、B12、CD272可作为诊断活动性结核类疾病的分子标志物,并且三者组合诊断能够提高结核病的诊断准确率(>90%),远远优于单一标志物诊断,适用于活动性结核类疾病筛查、诊断和药效评价。
附图说明
图1:miR-16、B12 mRNA和CD272 mRNA在活动性肺结核患者和健康志愿者PBMC中的表达量,图中,A为miR-16在PBMC中的相对表达量,B为B12 mRNA在PBMC中的相对表达量,C为CD272 mRNA在PBMC中的相对表达量;其中,TB为活动性肺结核患者,HV为健康志愿者。
图2:miR-16、B12 mRNA和CD272 mRNA在活动性肺结核患者分类中的表达情况,图中,A为miR-16在PBMC中的相对表达量,B为B12 mRNA在PBMC中的相对表达量,C为CD272mRNA在PBMC中的相对表达量;其中,SS+为痰涂阳性患者,SS-为痰涂阴性患者。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
本发明未注明具体条件的实验方法,按照常规条件操作或按照制造厂商所建议的条件。实施例中为注明具体来源的试剂均为常规市售产品。本发明的临床样本信息均由东莞市第六人民医院提供。
本发明采用SPSS 18.0统计软件和GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析,各组实验至少独立重复三次。计量资料采用均值±SEM表示,各分析结果均采用双侧检验P值,检验水准a=0.05。成组数据检验采用t检验或卡方检验,相关性分析采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1、miR-16、B12 mRNA和CD272 mRNA在活动性肺结核患者和健康志愿者PBMC中的表达
经过《WS 288-2008肺结核诊断标准》确诊的活动性肺结核患者47例,其中痰涂阳性15例、痰涂阴性32例,健康志愿者(HV)52例,满足无肺结核临床症状及胸部影像学检查无明显异常,性别和年龄与肺结核患者组无明显差异。
1、PBMC分离
采集TB患者和HV健康者的外周静脉血,加入与血液样本体积相同的淋巴细胞分离液;1200rpm,室温水平离心20min;小心吸取第二层白色淋巴细胞层于另一无菌离心管中,用10mL无菌PBS缓冲液重悬清洗3次,室温、1200rpm离心10min,弃上清;用离心管内残存PBS缓冲液(约200μl)悬浮细胞得外周血单个核细胞(PBMC)悬液备用。
2、RNA提取
取100μL的PBMC悬液,加入Trizol裂解细胞10min,取1mL裂解液加入200μL三氯甲烷,剧烈晃动混匀数秒,室温静置5~10min,分层后12000rpm,4℃离心15min,小心吸取最上层水相溶液,转移至新无酶1.5mL EP管;加入等量异丙醇并吹打混匀,室温静置10min,12000rpm,4℃离心10min,弃去上清液得RNA沉淀;加入1mL75%乙醇,重悬,7500rpm,4℃离心5min,弃上清液,重复两次;自然干燥RNA沉淀3~5min,加入DEPC水溶解得RNA溶液;调整RNA溶液浓度至500~1000ng/μL。
3、Real-time PCR检测miR-16、B12 mRNA和CD272 mRNA
miR-16的检测:采用TaKaRa公司MiR-XTM miRNA First-Strand Synthesis andSYBR qRT-PCR User Manual试剂盒进行逆转录,获得cDNA模版,采用SYBR Premix EX TaqTM(Tli RNaseH Pluse)试剂盒进行Real-time PCR,体系中Forward miR-16 Primer的核苷酸序列为:5’-CTAGCAGCACG TAAATATTGG-3’(SEQ ID NO:1),以通用miRNA内参U6计算相对表达量;
B12 mRNA和CD272 mRNA的检测:采用TaKaRa公司Prime ScriptTM reagent Kit试剂盒进行逆转录,获得cDNA模版,采用SYBR Premix EX TaqTM(Tli RNaseH Pluse)试剂盒进行Real-time PCR,Universe Primer换成Reverse Preimer,B12、CD272及内参GAPDH的引物对序列如下,以内参GAPDH计算相对表达量:
B12-F:5′-TTACCTCCGAGATGACACCATCAC-3′(SEQ ID NO:2);
B 12-R:5′-TCCTCATCTTCACTGGGGGAA-3′(SEQ ID NO:3);
CD272-F:5′-CAGTCTAGAGCCACCATGAAGACAGTGCCTGCCATGC-3′(SEQ ID NO:4);
CD272-R:5′-GTCAAGCTTTCAGCCTGGCCTCTCTTCCATGGTG-3′(SEQ ID NO:5);
GAPDH-F:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′(SEQ ID NO:6);
GAPDH-R:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′(SEQ ID NO:7)。
结果如图1所示,外周血PBMC中,活动性肺结核患者PBMC中miR-16和B12 mRNA相对表达量均显著高于HV志愿者(P<0.05),CD272 mRNA相对表达量显著低于HV志愿者(P<0.05)。这预示:mir-16、B12和CD272可作为活动性结核病辅助诊断的分子标记物。
实施例2、miR-16,B12 mRNA和CD272 mRNA相对表达量与活动性肺结核分类相关
肺结核患者分类标准为:痰液涂片显微镜检查结核菌阳性(痰涂阳性,SS+):痰液涂片显微镜下观察可见结核抗酸杆菌或者一次痰液培养检查结核菌阳性;痰液涂片显微镜检查结核菌阴性(痰涂阴性,SS-):至少3次痰液涂片检查及一次痰液培养检查结核菌阴性。
结合肺结核患者的痰检情况,痰涂阳性15例、痰涂阴性32例,分析miR-16,B12mRNA和CD272 mRNA相对表达量与肺结核分类相关性,结果如图2所示,活动性肺结核患者中,痰阳患者(SS+)的miR-16相对表达量高于痰阴(SS-)患者(P<0.05),而CD272 mRNA相对表达量显著低于痰阴(SS-)患者(P<0.05),该结果证明了miR-16和CD272 mRNA与肺结核临床分类相关,可以进一步辅助诊断结核病的分类状况。
实施例3、通过miR-16,B12和CD272 mRNA组合进行活动性肺结核辅助诊断
根据上述测试结果,取52份活动性肺结核外周血样本、50份正常健康志愿者外周血样本,利用Real-time PCR进行PBMC中单项指标检测和三个指标组合检测。以样本PBMC中miR-16的相对表达量≥1.3、B12 mRNA的相对表达量≥0.5、CD272 mRNA的相对表达量≤20为确认活动性肺结核患者的标准,即为阳性;以《WS 288-2008肺结核诊断标准》确诊作为金标准,以评判指标检测的准确率,准确率=指标检测样本的正确数/总检测数。
表1、肺结核患者和健康志愿单独指标诊断与组合诊断的准确率结果
结果如表1所示,单独以miR-16为检测筛选指标,该方法诊断活动性肺结核的准确率仅为61%、筛选正常志愿者的准确率仅为68%;而以B12 mRNA为检测筛选指标,该方法诊断活动性肺结核的准确率仅为67%、筛选正常志愿者的准确率仅为60%;而以CD272 mRNA为检测筛选指标,该方法诊断活动性肺结核的准确率为88%、筛选正常志愿者的准确率为84%。当我们将三个指标组合后,同时满足三个指标进行检测,该方法诊断活动性肺结核的准确率高达96.3%、筛选正常志愿者的准确率为91.6%。本发明分子标记物组合诊断活动性肺结核的方法准确率高,重复性好,可用于制备诊断肺结核的试剂盒,适用于肺结核的早期筛选、辅助诊断及药物治疗的疗效评价。
Claims (4)
1.检测分子标志物的试剂在制备活动性肺结核的诊断试剂盒、药效评价试剂盒中的应用,其特征在于:所述分子标志物选自以下任意一种:(1)B12;(2)B12 和 miR-16;(3)B12和 CD272;(4)B12、miR-16 和 CD272。
2.根据权利要求 1 所述的应用,其特征在于:所述分子标志物由 miR-16、B12 mRNA、CD272mRNA 构成。
3.根据权利要求 1 所述的应用,其特征在于:以 miR-16 的相对表达量≥1.3、B12mRNA 的相对表达量≥0.5、CD272 mRNA 的相对表达量≤20为确认活动性肺结核的标准。
4.根据权利要求 3 所述的应用,其特征在于:所述相对表达量是在外周血单个核细胞中的相对表达量。
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