CN116287236A

CN116287236A - 用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法

Info

Publication number: CN116287236A
Application number: CN202211596312.4A
Authority: CN
Inventors: 王冬冬; 牛孝亮; 蔡丽丽; 张腾龙
Original assignee: Nanjing Qiuzhen Gene Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Qiuzhen Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法，通过UCSC数据库调取与肺癌发生发展密切相关SHOX2基因和PTGER4基因序列，针对启动子CpG区域设计特异性引物和荧光探针，通过特异性甲基化PCR评价基因甲基化状态，可以区分肺癌患者与健康人群，筛查过程无创，简单，快捷，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。

Description

用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法。

背景技术

肺癌的发病率和致死率已经逐年攀升，截至2021年底，全球范围内肺癌致死率占所有女性癌症死亡总数的22％，已经超越乳腺癌高居第二，占所有男性癌症死亡综述的22％，成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，每年由于肺癌所致的医疗费用超过千亿，防控形式严峻。

目前临床常用的肺癌早期检测的方法多集中在影像学检测，痰液，肺泡灌洗液检测，检测灵敏度有限，并不能在早期检测发现病灶，通过不同程度的临床干预后也无法明显降低死亡率。低剂量螺旋形计算机断层扫描技术具有更高的灵敏度，能够在甄别早期病灶，但检测方法的偏低的特异性会导致诊断假阳性检出，增加受试者心理压力，造成后期医疗资源的过度消耗。近年来，测序技术发展为分子诊断领域提供了更多的思路，肺癌早期诊断的分子标志无也层出不穷，例如：基因表达，结构变异，DNA甲基化，血液游离DNA片段化特征，末端结构等，转录因子结合位点分析等，其中基因甲基化则通过检测临床样品中特定基因的表观修饰，得到更早期，更稳定，检测结果，该方法可灵活应用于组织样本，血液，尿液等可用于液体活检的样品。因此，如何开发灵敏、特异的生物学标志物和检测技术，为肺癌早期筛查、肺癌诊断，预后监控具有很大的临床价值。

发明内容

针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法，采用荧光定量PCR技术，检测人外周血游离DNA中与肺癌发生和发展紧密关联的基因，评价基因甲基化状态从而达到早期诊断，早期筛查的目的。

一方面，本发明采用的技术方案如下：用于肺癌早筛的特异性甲基化引物，关键在于：包括与肺癌人群早期甲基化位点相关的2对靶标特异引物、2个特异性引物探针；其中所述2对靶标特异引物的序列如下：

Seq ID NO.1：F-TAACCCGACTTAAACGACGA，

Seq ID NO.2：R-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT；

Seq ID NO.3：F-TGGGTATTGTAGTCGCGAGTTATC,Seq ID NO.4：R-CTACGTAAACAAACGATTAACG；

所述特异性引物探针序列如下：

Seq ID NO.5：FAM-CTCGTACGACCCCGATCG-BHQ1；

Seq ID NO.6：

TEXAS RED-CAATCTATACGTCCAACGTACTCTTTTACGCGCTA-BHQ2。

优选的，还包括对应的内参引物、内参引物探针；其中，所述内参引物的序列如下：

Seq ID NO.7：F-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT，Seq ID NO.8：R-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA；

内参引物探针序列如下：

SEQ ID NO.9：JOE-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1。

另一方面，本发明提供一种肺癌早期筛查方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.提取血浆中游离的cfDNA；

S2.将cfDNA进行亚硫酸盐转化成BisDNA；

S3.将权利要求2的引物混合物与PCR预混液混合配制成PCR反应体系；

S4.将步骤S2制得的BisDNA加入S3制得的PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应；

S5.评估肺癌风险。

优选的，所述S1具体为：采用MagMax Cell Free DNAIsolation K试剂盒提取血液中的cfDNA。

优选的，所述S2具体为：采用EZ DNAMethylation-Lightning Kit对DNA样本进行亚硫酸盐转化。

优选的，所述S3中，引物混合物与PCR预混液的体积比为1：3。

优选的，所述S4的扩增反应程序为：95℃/15min，62℃/5s，1个循环；56℃/45s，95℃/10s，40个循环；40℃/5s，1个循环。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过UCSC数据库调取与肺癌发生发展密切相关SHOX2基因和PTGER4基因序列，针对启动子CpG区域设计特异性引物和荧光探针，通过特异性甲基化PCR评价基因甲基化状态，可以区分肺癌患者与健康人群，筛查过程无创，简单，快捷，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。

附图说明

图1为基于本发明的风险判定图；

图2为基于本发明的风险模型测试图；

图3为基于本发明的分类性能AUC曲线图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。

实施例1特异性引物的设计和合成

通过UCSC数据库调取SHOX2基因和PTGER4基因序列，针对启动子CpG区域设计特异性引物和荧光探针，选择ACTB基因作为内控，用于质控PCR反应体系是否存在足量得转化后的DNA样本；具体序列如下表1所示

表1特异性甲基化引物和荧光探针序列

引物和探针名称	序列信息(5’-3’)
		Seq ID NO.1	F-TAACCCGACTTAAACGACGA
Seq ID NO.2	R-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT
		Seq ID NO.3	F-TGGGTATTGTAGTCGCGAGTTATC
Seq ID NO.4	R-CTACGTAAACAAACGATTAACG
		Seq ID NO.5	FAM-CTCGTACGACCCCGATCG-BHQ1
Seq ID NO.6	TEXASED-CAATCTATACGTCCAACGTACTCTTTTACGCGCTA-BHQ2
		Seq ID NO.7	F-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT
Seq ID NO.8	R-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
		Seq ID NO.9	JOE-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1

实施例2提取血浆中游离的cfDNA

1.血液收集管1600g离心15分钟，小心取上上层血浆至无菌15毫升离心管中，避免将血细胞吸入血浆而造成的基因组DNA污染；

2.将已经收集的血浆在4℃，16000g高速离心15分钟去除血浆中细胞碎片等杂质，吸取上清液于洁净的离心管，即为分离好的血浆，可置于-80℃冰箱中保存备用；

3.采用MagMax Cell Free DNA Isolation Kit(Thermofisher)依据试剂盒使用说明书从血浆中提取cfDNA，最后将其溶解在30μL TE Buffer中备用，若游离核酸无法及时进行定量检测，可于-80℃保存。

实施例3重亚硫酸盐转化

1.准备与样本数量一致的离心管，做好标记，每管加入20μLDNA样本和130μL转化反应液，盖好盖子，涡旋混匀，瞬时离心；

2.打开PCR仪，设置程序(98℃/8min，54℃/60min，4℃/hold，热盖温度105℃)，将离心好的样本管放置于PCR仪上，运行程序；

3.将吸附柱装入收集管中，向吸附柱中加入600μL结合液；

4.将样本加入吸附柱中，盖上盖子，颠倒混匀数次，全速离心30s(＞10000g)，弃掉收集管里的液体；

5.向吸附柱加入100μL洗涤液，全速离心30s(＞10000g)；

6.向吸附柱加入200μL脱硫液，室温孵育15min，孵育结束后全速离心30s(＞10000g)；

7.向吸附柱加入200μL洗涤液，全速离心30s(＞10000g)，弃掉收集管里的液体；

8.向吸附柱加入200μL洗涤液，全速离心30s(＞10000g)；

9.将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，加入35μL洗脱液，全速离心30s(＞10000xg)回收DNA，回收的DNA即亚硫酸盐转化的DNA(BisDNA)。

实施例4PCR反应

1.将PCR预混液和引物混合液于-20±5℃取出解冻后，涡旋混匀10s，瞬时离心5s，其中，引物混合物包括表1中引物及探针，PCR预混液包含了耐高温高保真DNA聚合酶，酶促反应缓冲液，Nuclease-free Water；

2.根据样本数量计算需要配制的反应数，每个PCR反应需要15ul PCR预反应液和5ul引物混合液，涡旋混匀PCR反应液30s，瞬时离心；

3.将配制好的PCR反应液按照20ul分装至PCR反应管/板中；

4.加入10ulBisDNA加到PCR反应管/板的对应孔中，使PCR反应体系为30ul；

5.盖好管盖或封膜后，离心1min，立即进行PCR扩增反应；

6.按照基因荧光选择对应得荧光通道和淬灭基团，按表2设置荧光PCR反应程序，点击运行按钮，每个反应三次重复数据采使用ABI7500荧光定量软件完成。

表2：荧光PCR反应程序

注：**标识荧光信号收集

随机选取肺癌患者(n＝118)和健康人的外周血样品(n＝72)，非癌症其他肺病患者样品(n＝21)同时采用本发明评估肺癌风险性能，肺癌患者要求无化疗，放射性治疗，靶向药物，免疫治疗等干预手段，样本操作各个环节采用随机、盲法减少分析过程中引入的偏倚，选择人甲基化DNA(Zymo Research D5014)作为阳性对照，人类基因组(G3041，Promega)作为阴性对照。通过特异性甲基化PCR评价与肺癌发生发展密切相关两个基因SHOX2和PTGER4甲基化状态，如图1所示，横坐标代表的是不同分类的人群(Clinical Cases指的是经过临床确认的肺癌患者样本，Controls指的是健康人的样品；纵坐标代表的是特异性甲基化荧光PCR的结果平均CT值，CT越大说明基因位点甲基化程度更低。图1A表明肺癌患者SHOX2基因的甲基化普遍高于健康人群；图1B表明PTGER4基因的甲基化状态在肺癌患者中明显高于健康人群。

采用Logistic Regression对PTGER4基因、SHOX2基因的CT值计算，确定Methylation Score值，构建风险模型，对健康者和肺癌患者进行风险等级评估，见图2。

图3表示基于Methylation Score的ROC分析结果，横坐标为1-特异度，纵坐标为敏感度，AUC为0.927，特异性为96.77％，灵敏度为85.59％。表明Methylation Score具有较好的分类效果，可作为用于区分患者和健康人的指标。

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于肺癌早筛的特异性甲基化引物，其特征在于：包括与肺癌人群早期甲基化位点相关的2对靶标特异引物、2个特异性引物探针；其中所述2对靶标特异引物的序列如下：

Seq ID NO.1：F-TAACCCGACTTAAACGACGA，

Seq ID NO.2：R-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT；

Seq ID NO.3：F-TGGGTATTGTAGTCGCGAGTTATC,

Seq ID NO.4：R-CTACGTAAACAAACGATTAACG；

所述特异性引物探针序列如下：

Seq ID NO.5：FAM-CTCGTACGACCCCGATCG-BHQ1；

Seq ID NO.6：

TEXAS RED-CAATCTATACGTCCAACGTACTCTTTTACGCGCTA-BHQ2。

2.根据权利要求1所述的用于肺癌早筛的特异性甲基化引物，其特征在于：还包括对应的内参引物、内参引物探针；其中，所述内参引物的序列如下：

Seq ID NO.7：F-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT，

Seq ID NO.8：R-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA；

内参引物探针序列如下：

SEQ ID NO.9：JOE-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1。

3.肺癌早期筛查方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.提取血浆中游离的cfDNA；

S2.将cfDNA进行亚硫酸盐转化成BisDNA；

S5.评估肺癌风险。

4.根据权利要求3所述的筛查方法，其特征在于所述S1具体为：采用MagMax Cell FreeDNAIsolation K试剂盒提取血液中的cfDNA。

5.根据权利要求3所述的筛查方法，其特征在于所述S2具体为：采用EZDNAMethylation-Lightning Kit对DNA样本进行亚硫酸盐转化。

6.根据权利要求3所述的筛查方法，其特征在于所述S3中，引物混合物与PCR预混液的体积比为1：3。

7.根据权利要求3所述的筛查方法，其特征在于所述S4的扩增反应程序为：95℃/15min，62℃/5s，1个循环；56℃/45s，95℃/10s，40个循环；40℃/5s，1个循环。