CN111650381B - 蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用，β‑Catenin和APJ蛋白作为指示剂在急性乳腺炎的诊断中具有突出的敏感性和特异性，为临床疾病的早期发现提供诊断依据。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域和检测试剂盒领域，具体地说涉及蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用。
背景技术
哺乳期乳腺炎是乳腺的一种良性炎症过程，可伴有或不伴有感染。根据患者的临床症状可分为不同的类型，其中最常见的是哺乳期产妇乳腺的细菌性感染，即急性乳腺炎。有研究报道，在哺乳期产妇中急性乳腺炎的发生率约为3％~20％，且是临床危害产妇和婴儿健康的首要疾病之一。急性乳腺炎是乳腺的急性化脓性炎症，主要侵犯乳腺管内和周围结缔组织且通常伴有乳腺管的堵塞,又称产褥期乳腺炎。急性乳房脓肿期的患者还可并发脓毒血症和菌血症，并出现转移性脓肿。此外，治疗方法不当或者处理不及时，还会导致病情的迁延并极有可能发展成为慢性乳腺炎。总之，急性乳腺炎的病情复杂并且给产妇带来了严重的身体和心理负担。
哺乳期乳腺炎是乳腺的一种炎症，在此期间，人乳微生物组的生态失调，会表现出机会性致病菌的出现和健康共生细菌的减少。已经可以查阅到的文献证明了大多数乳腺炎病例是由较高的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，以及链球菌、棒状杆菌、假单胞菌、克雷伯菌属和支原体属等感染引起的。在爱沙尼亚，仅有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌占全部乳腺炎病例的近30％。目前临床上，针对产后急性乳腺炎的诊断主要依据患者的临床表现。在疾病的初期，血常规等实验室检查还未表现出明显的异常时，有经验的医师会根据患者出现的相应临床症状，预防性的使用广谱抗生素治疗感染。但此时存在一个严重的问题那就是，致病株尚未明确，广谱抗生素的滥用容易使细菌对其敏感性降低，从而构成传播耐药菌的全球威胁。
β-Catenin，即Catenin beta-1，来源于人类CTNNB1基因的转录蛋白，最早作为一种粘附因子被发现，后来人们发现它还是一种细胞骨架蛋白，其主要功能是介导细胞间黏附和参与基因的表达，其在Wnt信号通路中起细胞内信号转导的作用。
APJ（Angiotensin II Receptor-like 1）是血管紧张素II的1型受体蛋白，在胎盘和新生儿中高表达，参与调控多种生理功能，如早期胚胎发育、血管生成、体液平衡、摄食与饮食行为控制等；同时还参与多种疾病的发生发展过程，如心衰、先兆子痫、急性肾损伤、高血压和糖尿病等。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用，为临床检测急性乳腺炎提供参考。
技术方案：本发明所述的蛋白标志物来源于人离体血清，选自β-Catenin和APJ，通过检测β-Catenin或APJ，或两者在患者血液中的表达，即可较灵敏地预测患者患有急性乳腺炎的可能性，通过建立ROC曲线，可判断出β-Catenin和APJ作为急性乳腺炎测试指标都具有显著的特异性和敏感性，而β-Catenin比APJ具有更高的特异性和敏感性。
现有技术作为血液中炎症判断常使用较高敏感度的免疫因子包括CD40、CCR、BMP等，而β-Catenin和APJ作为判断炎症因子目前未见公开。
本发明通过蛋白芯片检测血清中507种炎症相关免疫因子的表达水平，统计分析后筛选出25种免疫因子（比正常对照组相比，差异倍数大于2且具有统计学意义p <0.05）；通过建立蛋白芯片扩大样本量检测，可见在血清中β-Catenin和APJ相比较于对照组呈高表达状态，且β-Catenin的敏感程度高于APJ的表达。利用ROC曲线分析可知β-Catenin的曲线下面积（AUC）大于APJ的曲线下面积，其敏感性和特异性最高。
基于本发明所述的新用途，可基于ELISA技术制备检测血清/乳汁中β-Catenin蛋白和/或APJ的试剂盒，也可基于现有的蛋白电泳、Western Blot等技术检测血清中β-Catenin蛋白和/或APJ的表达水平，或制备对应的检测试剂盒。
有益效果：β-Catenin和APJ的作用已有相关的研究报道过，而其与急性乳腺炎形成之间的分子机制还尚未有研究报道。本发明为急性乳腺炎的认识提供了新的思路，填补了急性乳腺炎早期诊断的检验学手段。β-Catenin和APJ因子均具有显著特异性和敏感度，可帮助急性乳腺炎患者做出早期诊断，并提供最佳个性化治疗。
附图说明
图1是实施例1急性乳腺炎相关25个免疫因子的表达量热图，control为对照组，mastitis为急性乳腺炎组；
图2是实施例2蛋白芯片实验检测β-Catenin和APJ在急性乳腺炎患者组和对照组的表达水平；
图3是实施例3的ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行一步说明。
实施例1
委托广州瑞博奥生物科技有限公司设计含有507种蛋白因子单抗的抗体蛋白芯片。
样品的准备和透析
血清样品在生物素标记前需要利用透析管进行透析。取40µL血清样本加入到1.5mL离心管中，另加入160µL pH为8.0的PBS溶液，混合均匀后，吸取200µL混合液加到透析管中。将透析管放在4000 mL的1×PBS（pH=8）中4℃边搅拌边透析。每间隔3小时更换透析液一次。透析完成后，进行测定蛋白浓度。用BCA标准曲线法测定蛋白浓度。
将标准液2mg/ml的BSA用水稀释成不同浓度梯度，并在96孔板中进行上样，上样量如表1所示：
将反应液A和反应液B（BCA蛋白定量试剂盒（TIANGEN, 北京））按照50:1的稀释比例配制成BCA反应液，上样时每孔200ul；于37℃温箱，恒温孵育30分钟；取出96孔板，用酶标仪测定样品的吸光度值，选择波长为550nm，震荡时间为10s开始测量；根据BSA浓度和相应的吸光度值绘制出标准曲线，并得出回归方程及R平方值；根据回归方程算出待测样品的浓度。
根据需要的总蛋白量和总体积算出需要的全细胞裂解液的量，用RIPA裂解液将蛋白终浓度调到一致。
生物素标记样品
将标记试剂小管在离心机中快速离心后，向管中加入100µL 1×PBS溶解粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成1×标记试剂溶液。
向新的离心管中加入适当量的样品与标记试剂。快速混匀后置于摇床上，室温孵育30 min，并且每隔5 min轻弹离心管数次，充分混合反应试剂，然后进行样品的标记，具体上样方案如下表：
反应液中加入6µL终止液，分别各取500µL样品加入到透析管中，然后在4000 mL的1×PBS（pH=8）中4 ℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。透析三次以后收集样品。在整个生物素标记样品的过程，避免任何试剂受到胺类物质或叠氮钠（例如Tris，甘氨酸）的污染。
封闭和孵育
在孵育盒中加入8mL 封闭缓冲液，用镊子拖着膜或者夹着膜的边缘将膜缓慢浸没到封闭缓冲液中，有标志的面朝上，避免气泡产生，盖上孵育盒的盖子，室温振荡孵育1小时。用抽液泵抽去封闭液后，每张膜芯片加入8mL封闭液稀释好的样品，盖上盖子，包上塑料薄膜，4℃过夜。注意用封闭液40倍稀释生物素标记的样品。
抽去样品，每个孵育盒中加入约8mL 的1×洗液I（20×洗液用去离子水稀释）室温振荡洗膜，洗膜4次，每次5min；抽去1×洗液I，加入1×洗液II室温振荡洗膜，洗膜3次，每次5min；抽去1×洗液II（Wash Buffer II, Item H ），每张膜加入8mL 用封闭液500倍稀释的HRP-链霉亲和素。室温避光振荡孵育2小时。
配制检测液C (Detection Buffer C, Item K, 2张膜配5mL) 和检测液D（Detection Buffer D, Item K, 2张膜配5mL）的混合液，取出3mL C液和3mL D液混匀备用。抽去1×洗液II，用干净平整的滤纸从边缘把每张膜上的液体吸干，向每个张膜上加入6mL的C、D混合液，缓慢摇动2min，立即用滤纸再次吸干C、D混合液。
底物显色
用ImageQuant LAS4000化学发光成像分析系统将底物显色并进行分析。
通过常规消毒无菌采集患有急性乳腺炎患者的血液，离心样品待血液分层后收集上层血清。对急性乳腺炎患者的诊断标准参照表2所示。急性乳腺炎组患者也为后面实施例的样本。
然后对样品进行了507种的免疫因子敏感度的筛选，处理实验数据并分析结果后，初步筛选出了急性乳腺炎组比对照组差异倍数大于2 (fold change>2)且具有统计学意义的25种免疫因子。根据表达量用GraphPad Prism软件绘制热图，结果如图1所示。从图1可看出，现有技术使用的常规免疫因子CD40、CCR、BMP与本发明的β-Catenin和APJ均具有统计学意义。当选取急性乳腺炎组比对照组细胞因子信号值大于200，差异倍数大于2且T检验值小于0.05时，只有β-Catenin (T=0.024)和APJ (T=044)具有显著性差异。
实施例2 蛋白芯片检测实验
委托广州瑞博奥生物科技有限公司设计了APJ蛋白芯片和β-Catenin蛋白芯片，分别在急性乳腺炎患者和对照组进行检测，本实施例测试样品的准备方法和实施例1完全相同。
如图2所示，通过蛋白芯片显示了APJ和β-Catenin在急性乳腺炎患者和对照组的表达水平，可见急性乳腺炎患者组APJ和β-Catenin蛋白的表达相比较于对照组呈高表达的状态。
实施例3 ROC曲线分析
本实施例进一步建立ROC曲线来评估APJ和β-Catenin的特异性和敏感性。利用Image J软件灰度图扫描实施例2蛋白芯片的灰度值，然后使用SPSS 20.0 (SPSS Inc.,Chicago) 软件对灰度数据进行分析，用标准法检测ROC曲线的最优敏感性和特异性的指标。所有p值均为双侧且 p < 0.05 为差异有统计学意义。
利用ROC曲线分析可知急性乳腺炎组APJ和β-Catenin的水平明显高于对照组，且急性乳腺炎组β-Catenin的敏感性高于APJ。β-Catenin的曲线下面积大于APJ的曲线下面积，说明β-Catenin的敏感性和特异性高于APJ (p<0.5)。
Claims (5)
1.蛋白标志物在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用，其特征在于，所述蛋白标志物选自β-Catenin或APJ。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白标志物为β-Catenin。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒的样本来自人离体血清。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：基于ELISA技术制备检测血清中β-Catenin蛋白的试剂盒。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：基于Western Blot方法检测血清中β-Catenin蛋白表达水平。
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