CN114875130A

CN114875130A - Lpin3蛋白或编码lpin3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用

Info

Publication number: CN114875130A
Application number: CN202210339718.8A
Authority: CN
Inventors: 项荣; 刘宇星; 范亮亮; 王芳; 赵美方
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-08-09

Abstract

本发明为LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用，涉及LPIN3蛋白在评估肾毒副作用中的应用，属于生物医药领域。本发明提供了LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因在评估肾毒性副作用中的新应用。所述LPIN3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述编码LPIN3蛋白的mRNA其序列如SEQ ID NO.2所示。所述编码LPIN3蛋白的基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过大量实验证明，LPIN3的表达量的降低，个体使用顺铂或造影剂后肾毒性副作用反应发生的可能性也就越大，反之亦然。因此，LPIN3蛋白的含量高低在一定程度上可以直接用于评估个体使用顺铂或造影剂后肾毒性副作用的严重程度进而对个体是否采用顺铂或造影剂用药提供指导。

Description

LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用

技术领域

本发明涉及LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是由各种原因引起的短时间内肌酐极速上升，肾功能快速减退为特征表现的急危重症。脓毒血症、缺血/再灌注和肾毒性药物的使用均可导致AKI，其中肾毒性药物(如顺铂、造影剂、肾毒性抗生素等)所致的药物相关性肾损伤占所有AKI病例的25％，是发生AKI的主要原因之一。由于对AKI复杂的发生机制仍知之甚少，至今仍缺乏有效的预防和治疗措施，导致其死亡率高且预后差。据统计，全球每年有170万人死于AKI，处于危重病死亡率前列，存活的患者中约有20％将进展为慢性肾脏病，甚至是终末期肾病而需要终身透析治疗，给家庭和社会造成巨大的负担。因此，深入研究AKI的病理生理机制，寻找以发病机制为基础的新的AKI防治策略，对于提高AKI患者的生存水平并阻止其进一步进展意义重大。

顺铂是临床上药物性AKI的常见病因，顺铂因可抑制肿瘤细胞增殖，是一种强效的化疗药物。然而，肾脏毒性是顺铂最常见的副作用，常常表现为AKI。其机制复杂，主要包括脂毒性、氧化应激、炎症反应、线粒体凋亡等，具体还有待研究。据统计，约25％-30％的患者注射顺铂后会出现肾损伤。随着现代造影技术的广泛开展，造影剂为临床诊断带来便利的同时，其肾脏毒性同样引发了肾病工作者们广泛的关注。常用的造影剂一般均为高渗性，其含碘量高达37％，在体内以原形由肾小球滤过而不被肾小管吸收，脱水时该药在肾内浓度增高，可致肾损害而发生急性肾衰竭。因此，如何缓解药物性所致AKI，为AKI的防治提供新的理论依据、潜在诊断标志物及干预靶点对临床治疗具有重要意义。

肾小管上皮细胞是AKI发生的关键靶细胞，肾小管上皮细胞损伤是AKI的主要病理学基础，而细胞死亡是肾小管上皮细胞损伤的主要形式。经典的细胞死亡方式，包括调节性的细胞凋亡和非调节性的细胞坏死已被证实存在并推动了AKI的发生与发展。随着近年来科研的进展，多种新型细胞程序性死亡方式被发现，其中包括细胞焦亡、铁死亡等同样被学者证实在AKI的发生与发展当中发挥着不同程度的重要作用。然而鉴于AKI的病因繁多，信号通路错综复杂，机制各有不同，因此其分子调控机制尚未完全阐明。

脂素(LPIN)是近几年发现的一个蛋白家族，主要参与维持身体脂代谢平衡，该家族在哺乳动物中共有三个成员LPIN1、LPIN2和LPIN3，这些家族成员在细胞的各生理过程中都发挥着重要的作用。虽然LPIN1、LPIN2和LPIN3属于同一家族，但三者有较大的差异性，尤其LPIN3。例如LPIN1、LPIN2在人体肾组织中低表达，而LPIN3则相对高表达(Donkor J,Sariahmetoglu M,Dewald J,et al.Three Mammalian Lipins Act as PhosphatidatePhosphatases with Distinct Tissue Expression Patterns[J].Journal ofBiological Chemistry,2007,282(6):3450-7.)。通过比对LPIN蛋白家族成员的蛋白结构发现，无论是人还是小鼠中，LPIN3蛋白都与家族中另两个成员(LPIN1和LPIN2)存在明显的差异，主要体现在蛋白长度和各结构域的定位和所占比例。以相关研究较多的LPIN1蛋白为参照，LPIN2与LPIN1蛋白差异并不明显，尤其是在人属当中。而LPIN3则与LPIN1蛋白存在明显的差异。提示LPIN3在蛋白功能上，可能与LPIN1存在一定的差异(Csaki L S,Dwyer J R,Fong L G,et al.Lipins,lipinopathies,and the modulation of cellular lipidstorage and signaling[J].Progress in Lipid Research,2013,52(3):305-316.)。

尽管目前对于LPIN的研究主要集中在调节脂代谢功能，以及在一些脂代谢异常、横纹肌溶解等疾病发生发展中所起的作用，但越来越多的研究表明，LPIN的功能并不仅于此。其中LPIN1研究相对较多，LPIN2研究较少，而LPIN3的功能尚不清楚。人类LPIN3基因定位于染色体20q12，编码含851个氨基酸的蛋白质，该蛋白具有N端和C端两个高度保守的结构域，C端含有一个富含赖氨酸和精氨酸的核定位信号(NLS)，表明LPIN3蛋白可以转移进入细胞核发挥生物学功能，此外C端结构域还包含一个核受体相互作用序列(LXXIL)，这段序列起转录协同激活的功能。但LPIN3具体的作用研究国内外尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的提供新的急性肾损伤的生物标志物。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用，所述LPIN3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，LPIN3基因编码蛋白的cDNA序列可通过所述编码LPIN3蛋白的mRNA序列逆转录得到，并可直接翻译成所述LPIN3的蛋白氨基酸序列，因此，所述LPIN3基因编码蛋白的cDNA序列也可作为急性肾损伤的检测标记物。

优选的，所述编码LPIN3蛋白的mRNA其序列如SEQ ID NO.2所示。

所述编码LPIN3蛋白的基因，其Ensembl编号为ENSG00000132793，该基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过ELISA实验检测，对比对照组正常人，急性肾损伤患者的外周血中的LPIN3蛋白表达水平显著下降，提示LPIN3的下降与急性肾损伤的发生发展有密切联系。发现，在急性肾损伤患者中，急性肾损伤标志物肌酐的含量与外周血中的LPIN3蛋白表达呈显著的负相关关系，即随着患者LPIN3表达水平的降低，其体内急性肾损伤反应的程度也在增强。因此，证明了LPIN3的表达水平可作为急性肾损伤的检测标志物。为指导急性肾损伤的临床治疗提供了基础。

优选的，所述急性肾损伤是由顺铂、造影剂或肾毒性抗生素造成。

优选的，所述生物标志物是血清诊断标志物，血浆诊断标志物或组织细胞诊断标志物。

本发明还要求保护用于急性肾损伤检测的试剂盒。本发明中，通过对比对照组正常人，急性肾损伤患者的外周血中的LPIN3蛋白表达水平显著下降，提示LPIN3的下降与急性肾损伤的发生发展有密切联系。以检测LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因的试剂盒作为急性肾损伤检测的试剂盒。

优选的，所述检测包括：胶体金免疫层析法、免疫印迹法、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、酶联免疫法、核酸探针法或qPCR法。例如[Huang M,Wang J,Torre E,etal.SAVER:gene expression recovery for single-cell RNA sequencing[J].Naturemethods,2018,15(7):539-542.]、[Brich S,Bozzi F,Perrone F,et al.Fluorescence insitu hybridization(FISH)provides estimates of minute and interstitial BAP1,CDKN2A,and NF2 gene deletions in peritoneal mesothelioma[J].Modern Pathology,2019:1-11.]、[Chen C Y,Logan R W,Ma T,et al.Effects of aging on circadianpatterns of gene expression in the human prefrontal cortex[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences,2016,113(1):206-211.]等文献所述。

优选的，所述试剂盒中包括抗LPIN3蛋白的特异性抗体、用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物、用于检测编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的探针或芯片中的一种或几种。

优选的，所述用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物的序列如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物还包括内参基因GAPDH的PCR扩增特异性引物，序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

优选的，检测样品为人的血清样本、全血样本及组织细胞样本，以及人类其他来源的细胞系。

本发明还提供了上述试剂盒在制备急性肾损伤检测试剂中的应用。

本发明通过检测如下(1)、(2)和(3)中任一检测物的表达或含量水平作为急性肾损伤的标志物：

(1)LPIN3蛋白；

(2)编码所述LPIN3蛋白的mRNA；

(3)编码所述LPIN3蛋白的基因。

具体方法为：采集待测者样本并与正常对照者或标准样品中所述LPIN3蛋白或所述mRNA或所述基因的表达量进行比较。根据比较的结果，按照如下方法检测/预测待测样本是否存在急性肾损伤反应：若待测样本中所述LPIN3蛋白或所述mRNA或所述基因的表达量越低于所述正常对照者或所述标准样品中所述LPIN3蛋白或所述m RNA或所述基因的正常表达量，则所述待测样本越有可能发生急性肾损伤反应；反之，当待测样本中所述LPIN3蛋白或所述mRNA或所述基因的表达量高于或等于所述正常对照者或所述标准样品中所述LPIN3蛋白或所述mRNA或所述基因的正常表达量，则所述待测样本不存在急性肾损伤反应或者急性肾损伤反应程度可能较低；所述对照者为健康人或人类来源的正常细胞系；优选地，所述待测样本为血清或正常细胞裂解液。其中，所述待测者样本包括但不限于患者血清样本、全血样本、组织细胞样本及相关细胞裂解液。

某些现有技术中公开LPIN1缺陷会导致炎症减轻，说明了LPIN1可能参与某些炎症反应的机理。但其与LPIN3在急性肾损伤中的反应趋势是完全相反的。

根据我们前期研究发现，LPIN3参与了顺铂或造影剂等药物性致急性肾损伤反应的多个过程，在氧化应激、炎症反应、细胞凋亡坏死中也发挥了重要的作用，因此可作为急性肾损伤发生发展的重要标志物。通过对患者LPIN3水平的检测，从而可以检测/预测患者在使用顺铂或造影剂后急性肾损伤的可能性和/或发病程度，进而对个体是否采用顺铂或造影剂用药提供指导。

附图说明

图1为急性肾损伤患者与正常人外周血中LPIN3蛋白表达检测结果；

图2为LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞经顺铂刺激后细胞活力检测结果；

图3为LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞经顺铂刺激后细胞凋亡检测结果；

图4为患者LPIN3蛋白表达水平的分组图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例中所涉及到的LPIN3蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

实施例1、急性肾损伤患者与正常人外周血中LPIN3蛋白表达检测结果以及外周血中单核细胞LPIN3基因mRNA表达检测

供试者：临床确诊的急性肾损伤患者及对照组正常人

(1)抽取病人外周静脉血3-5ml于一次性采血管中。

(2)将血液样本转移至15mL离心管中，转速2000rpm/min离心20分钟，将血清与全血样品分离。

(3)完成离心后，取上清即为血清样本，储存在-80℃的超低温冰箱中以备后用。

(4)使用时，取出溶解，并短暂离心。

(5)使用ELISA试剂盒(凡科维，F9970-A)检测LPIN3的表达水平，具体实验步骤如下：

(5.1)将试剂盒提供的原倍标准品分别稀释成480pg/mL、240pg/mL、120pg/mL、60pg/mL、30pg/mL的梯度浓度。

(5.2)分别设空白孔、标准品孔和待测样品孔。在酶标包被板上，标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)，轻轻晃动混匀。

(5.3)用封板膜封板后放置于37℃烘箱中温育30分钟。

(5.4)将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后备用。

(5.5)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(5.6)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(5.7)重复步骤5.3的温育步骤。

(5.8)重复步骤5.5的洗涤步骤。

(5.9)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

(5.10)每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(6)反应结束后，上多功能酶标仪(Synergy)，以空白孔调零，50nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

(7)以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样本中LPIN3蛋白的实际浓度。

另一部分病人外周静脉血样分离单核细胞进行检测：

(1)吸取2mL病人外周静脉血至15mL离心管中，加入等量PBS磷酸缓冲液，轻柔吹打混匀。

(2)另取一支15mL离心管，加入4mL单核细胞分离液至管底。

(3)吸取混匀后的血液样本轻柔地沿管壁加入到15mL离心管中，此时管内明显分层，下层为透明的单核细胞分离液，上层为红色的混匀血样。

(4)转速1500rpm/min离心20分钟，此时离心管内红色血样转移至下层，上层为单核细胞分离液与血清混合层，混合层中可见一条白线，即为血液中分离出的单核细胞团。

(5)吸取离心管中除红色血样层意外的所有液体至一个新的15mL离心管中，2000rpm/min离心5分钟。

(6)弃上清，取1mLPBS磷酸缓冲液重悬细胞沉淀，转移至新的1.5mL离心管中。

(7)800rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀即为分离的单核细胞团块。

随后提取细胞的总RNA，步骤如下：

(1)往裂解液(Lysis Buffer)中加入相应量的β巯基乙醇(每1000μL裂解液加10μLβ巯基乙醇，每次使用前加)，往盛有单核细胞团块的1.5mL离心管中加入500μL的裂解液，用枪吹打混匀至细胞团块消失不见，转移到无酶的1.5mL离心管中，放在4℃的旋转仪中旋转裂解30分钟。

(2)往离心管中加入等体积的70％的无水乙醇，震荡混匀。

(3)将上述混匀好的液体转移进离心柱中，室温12000×g离心1分钟。

(4)弃去收集管中的废液，往离心柱中加入700μL的Wash Buffer I，室温12000×g离心1分钟。

(5)弃去收集管及其中的废液，换上新的收集管；往离心柱中加入500μL的WashBuffer II(已提前加入相应量的无水乙醇)，室温12000×g离心1分钟。

(6)重复步骤5的离心步骤。

(7)弃去收集管中的废液，以空的吸附柱在离心机中，室温12000×g离心1分钟以干燥吸附柱膜；

(8)弃去收集管，将离心柱套进新的1.5mL无RNA酶离心管中，加入50μL的RNA无酶水到吸附柱中，室温静置1min后，室温12000×g离心5分钟。

(9)保存离心管中的液体即为分离的单核细胞RNA溶液，并置于-80℃长期保存。

取出上述获得的RNA样本进行逆转录，以获得cDNA文库样本：

(1)建立逆转录合成反应体系(20μL体系)，反应体系如下：

(2)建立逆转录合成反应程序，程序如下：

取出上述获得的cDNA文库样本，进行qPCR的扩增和检测：

(1)对于每个样本均应至少同时做3个重复，以下为一个样本的反应体系(25μL体系)：

一个样本需要分别扩增和检测目的基因和内参基因，其中目的基因的扩增的上下游引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，内参基因GAPDH的PCR扩增特异性引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

(2)将反应管放入qPCR仪器中，设置好相应的组别及反应程序，程序如下：

(3)使用2(-△△CT)法来比较待测样本与对照组中相关炎症细胞因子基因的mRNA表达量差异。

结果发现：如图1-1所示，通过ELISA实验检测，对比对照组正常人，急性肾损伤患者的外周血中的LPIN3蛋白表达水平显著下降，提示LPIN3的下降与急性肾损伤的发生发展有密切联系。同时图1-2的数据表示，在急性肾损伤患者中，急性肾损伤标志物肌酐的含量与外周血中的LPIN3蛋白表达呈显著的负相关关系，即随着患者LPIN3表达水平的降低，其体内急性肾损伤反应的程度也在增强。如图1-3所示，通过qPCR实验检测，对比对照组正常人，急性肾损伤患者的外周血中单核细胞的LPIN3基因mRNA表达水平显著下降，与外周血中的LPIN3蛋白表达水平变化一致。因此，证明了LPIN3的表达水平可作为急性肾损伤的检测标志，也就是LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因可作为急性肾损伤检测标记物。

实施例2、LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞经顺铂刺激后细胞活力检测结果

供试者：LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞

LPIN3基因敲除小鼠从广州赛业生物科技有限公司处购买。首先分离小鼠原代肾小管上皮细胞：

(1)颈椎脱臼处死小鼠后，于超净工作台中无菌取肾，冲洗肾脏2-3次.

(2)去除肾蒂和包膜后，用剪刀剪碎肾组织，置于50ml离心管中，用1mL 1mg/ml的Ⅱ型胶原酶消化20分钟。

(3)用2mL含10％胎牛血清的F12高糖培基终止消化，加入等量PBS磷酸缓冲液稀释吹匀，收集液体依次经100目、80目和40目不锈钢筛网。

(4)将过滤的液体置于15ml离心管中，转速800rpm/min离心20分钟，弃上清，将细胞沉淀使用含10％胎牛血清的F12高糖培基重悬至6cm培养皿中培养。

(5)48小时首次换液，以后每2天换液1次，即得到原代肾小管上皮细胞。

随后，给予原代肾小管上皮细胞顺铂刺激，通过CCK8实验检测细胞活力改变情况，具体实施步骤如下：

(1)分别收集野生型小鼠和LPIN3基因敲除小鼠的原代肾小管上皮细胞，在转速800rpm/min下离心5分钟。

(2)离心结束后，弃除上清，每管分别用1mL新的培基将细胞团块重悬，轻柔吹打混匀，并按每孔100μL体积转移到96孔板中，多余的细胞悬液弃去。

(3)在所有实验孔周围的空孔中，每孔加入200μL抽滤过的PBS溶液以作保湿之用，防止实验孔干涸，随后放入培养箱中。

(4)将顺铂储存液在涡旋仪上短暂混匀，混匀之后放入离心机中短暂离心，喷洒酒精放入细胞台中，按照5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM的梯度稀释成不同的工作液浓度，混匀备用。

(5)待过夜细胞贴壁后，弃去孔中培基，将不同梯度浓度的顺铂工作液分别加入到各孔中对细胞进行刺激，刺激时间分别为18h。

(6)待刺激时间结束后，将96孔板取出，向每孔添加10μL的CCK-8溶液，并避免产生气泡。

(7)继续孵育1-4h。

(8)使用多功能酶标仪(Synergy)检测各孔OD值，计算各孔细胞活力百分比。

结果发现：如图2所示，随着顺铂刺激的浓度增大，两组细胞的活力均呈现一个梯度下降的趋势。值得注意的是，与野生型组细胞相比，LPIN3基因敲除组的细胞在同一浓度的顺铂刺激下，细胞活力进一步显著下降。图2的结果表明LPIN3基因敲除后肾小管上皮细胞对顺铂的毒性更敏感。

实施例3、LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞经顺铂刺激后细胞凋亡检测结果

供试者：LPIN3基因敲除小鼠原代肾小管上皮细胞

(1)将细胞接种到6孔板中，选用浓度为20μM的顺铂工作液按照实施例2的方法给予细胞18h和24h刺激。

(2)待刺激时间结束后用PBS洗涤细胞2次，每孔加入300ul不含EDTA的胰酶消化细胞。

(3)待消化完全之后，加入600ul的含10％胎牛血清的F12高糖培基中止消化反应，吹打混匀，吸至15mL离心管中。

(4)转速1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，细胞沉淀用PBS洗涤。

(5)每孔加入500μL结合缓冲液，吹打混匀，转移至流式管中.

(6)检测前加入5μL的Annexin-V-FITC和5μL的PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀，避光孵育15分钟。

(7)使用上流式细胞仪(Beckman-Coulter XL-MCL)检测分析。检测数据由贝克曼-库尔特公司提供的EXP032ADC Analysis软件加以分析。

结果发现：如图3-1所示，流式细胞仪检测发现，在20μM的顺铂刺激18h后，两组细胞均出现细胞死亡现象。值得注意的是，与野生型组细胞相比，LPIN3基因敲除组的细胞死亡数量进一步增加。同时，图3-2细胞死亡率分析，即PI阳性细胞百分比的数据显示，与对照组的野生型细胞相比，LPIN3基因敲除组的细胞死亡率明显增加。图3的结果表明LPIN3基因敲除后肾小管上皮细胞对顺铂的毒性更敏感(注：PI是一种不能透过完整细胞膜的核酸染料，当细胞坏死时细胞膜破裂，PI可透过细胞膜使细胞核染红)。

实施例4、患者LPIN3蛋白表达水平高低与顺铂或造影剂给药后是否出现急性肾损伤的关联分析

供试者：临床治疗中需要进行顺铂或造影剂给药的患者

(1)收集临床治疗中需要进行顺铂或造影剂给药的患者，在其给药前，抽取外周静脉血样，按照实施例1中方法分离血清样本，并通过ELISA方法检测LPIN3的表达水平。

(2)由实施例1中可知，正常人LPIN3表达水平的均数约为150pg/mL；AKI病人LPIN3表达水平的均数约为100pg/mL。根据测得LPIN3的表达水平，将这些需要进行顺铂或造影剂给药的患者中LPIN3表达值高于150pg/mL的患者挑选出，作为＞150pg/mL组；再将LPIN3表达值低于100pg/mL的患者挑选出，作为＜100pg/mL组。

(3)对纳入研究组中的患者其顺铂或造影剂给药后的身体情况进行追踪，根据患者是否出现急性肾损伤划分为“用药后发生急性肾损伤”和“用药后未发生急性肾损伤”两种事件进行统计分析。

结果如表1和图4所示。结果发现：如图4所示，通过ELISA实验检测并根据患者LPIN3蛋白表达水平进行挑选分组，＞150pg/mL组收集到18人，＜100pg/mL组收集到12人，一共收集到30人纳入研究组中并进一步分析。

表1患者LPIN3蛋白表达水平高低与顺铂或造影剂给药后是否出现急性肾损伤的关联分析

如表1所示，30人的研究组中，用药后发生急性肾损伤人数为13人，剩余17人在用药后未观测到急性肾损伤的症状。其中，18人的＞150pg/mL组中有2人用药后发生急性肾损伤，概率为11.1％；剩余16人在用药后未观测到急性肾损伤的症状，概率为88.9％。而12人的＜100pg/mL组中有11人用药后发生急性肾损伤，概率为91.7％；剩余仅1人在用药后未观测到急性肾损伤的症状，概率为8.3％。该分析X²值为19.027，P值＜0.001。数据表明LPIN3蛋白表达水平值低的患者，在顺铂或造影剂给药后有很大可能性会发生急性肾损伤，因此，应建议避免给予LPIN3蛋白表达水平值低的患者顺铂或造影剂用药。因此，LPIN3蛋白可以作为急性肾损伤的生物标志物。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用

<130> 3

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 852

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asn Tyr Val Gly Gln Leu Ala Glu Thr Val Phe Gly Thr Val Lys

1 5 10 15

Glu Leu Tyr Arg Gly Leu Asn Pro Ala Thr Leu Ser Gly Gly Ile Asp

20 25 30

Val Leu Val Val Lys Gln Val Asp Gly Ser Phe Arg Cys Ser Pro Phe

35 40 45

His Val Arg Phe Gly Lys Leu Gly Val Leu Arg Ser Arg Glu Lys Val

50 55 60

Val Asp Ile Glu Leu Asn Gly Glu Pro Val Asp Leu His Met Lys Leu

65 70 75 80

Gly Asp Ser Gly Glu Ala Phe Phe Val Gln Glu Leu Glu Ser Asp Asp

85 90 95

Glu His Val Pro Pro Gly Leu Cys Thr Ser Pro Ile Pro Trp Gly Gly

100 105 110

Leu Ser Gly Phe Pro Ser Asp Ser Gln Leu Gly Thr Ala Ser Glu Pro

115 120 125

Glu Gly Leu Val Met Ala Gly Thr Ala Ser Thr Gly Arg Arg Lys Arg

130 135 140

Arg Arg Arg Arg Lys Pro Lys Gln Lys Glu Asp Ala Val Ala Thr Asp

145 150 155 160

Ser Ser Pro Glu Glu Leu Glu Ala Gly Ala Glu Ser Glu Leu Ser Leu

165 170 175

Pro Glu Lys Leu Arg Pro Glu Pro Pro Gly Ser Val Gln Leu Glu Glu

180 185 190

Lys Ser Ser Leu Gln Pro Lys Asp Ile Tyr Pro Tyr Ser Asp Gly Glu

195 200 205

Trp Pro Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ala Gly Glu Leu Thr Ser Pro Lys

210 215 220

Ser Asp Ser Glu Leu Glu Val Arg Thr Pro Glu Pro Ser Pro Leu Arg

225 230 235 240

Ala Glu Ser His Met Gln Trp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Lys Val Ala

245 250 255

Arg Ala Glu Arg Pro Glu Ser Ser Val Val Leu Glu Gly Arg Ala Gly

260 265 270

Ala Thr Ser Pro Pro Arg Gly Gly Pro Ser Thr Pro Ser Thr Ser Val

275 280 285

Ala Gly Gly Val Asp Pro Leu Gly Leu Pro Ile Gln Gln Thr Glu Ala

290 295 300

Gly Ala Asp Leu Gln Pro Asp Thr Glu Asp Pro Thr Leu Val Gly Pro

305 310 315 320

Pro Leu His Thr Pro Glu Thr Glu Glu Ser Lys Thr Gln Ser Ser Gly

325 330 335

Asp Met Gly Leu Pro Pro Ala Ser Lys Ser Trp Ser Trp Ala Thr Leu

340 345 350

Glu Val Pro Val Pro Thr Gly Gln Pro Glu Arg Val Ser Arg Gly Lys

355 360 365

Gly Ser Pro Lys Arg Ser Gln His Leu Gly Pro Ser Asp Ile Tyr Leu

370 375 380

Asp Asp Leu Pro Ser Leu Asp Ser Glu Asn Ala Ala Leu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Gln Ser Asp Ser Gly Leu Gly Ala Arg Arg Trp Ser Glu Pro Ser Ser

405 410 415

Gln Lys Ser Leu Arg Asp Pro Asn Pro Glu His Glu Pro Glu Pro Thr

420 425 430

Leu Asp Thr Val Asp Thr Ile Ala Leu Ser Leu Cys Gly Gly Leu Ala

435 440 445

Asp Ser Arg Asp Ile Ser Leu Glu Lys Phe Asn Gln His Ser Val Ser

450 455 460

Tyr Gln Asp Leu Thr Lys Asn Pro Gly Leu Leu Asp Asp Pro Asn Leu

465 470 475 480

Val Val Lys Ile Asn Gly Lys His Tyr Asn Trp Ala Val Ala Ala Pro

485 490 495

Met Ile Leu Ser Leu Gln Ala Phe Gln Lys Asn Leu Pro Lys Ser Thr

500 505 510

Met Asp Lys Leu Glu Arg Glu Lys Met Pro Arg Lys Gly Gly Arg Trp

515 520 525

Trp Phe Ser Trp Arg Arg Arg Asp Phe Leu Ala Glu Glu Arg Ser Ala

530 535 540

Gln Lys Glu Lys Thr Ala Ala Lys Glu Gln Gln Gly Glu Lys Thr Glu

545 550 555 560

Val Leu Ser Ser Asp Asp Asp Ala Pro Asp Ser Pro Val Ile Leu Glu

565 570 575

Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Pro Pro Ser Thr Pro Thr Tyr Lys

580 585 590

Lys Ser Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gln Ile Arg Arg Leu Asn Leu Gln

595 600 605

Glu Gly Ala Asn Asp Val Val Phe Ser Val Thr Thr Gln Tyr Gln Gly

610 615 620

Thr Cys Arg Cys Lys Ala Thr Ile Tyr Leu Trp Lys Trp Asp Asp Lys

625 630 635 640

Val Val Ile Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ile Thr Lys Ser Asp Ala Leu

645 650 655

Gly His Ile Leu Pro Gln Leu Gly Lys Asp Trp Thr His Gln Gly Ile

660 665 670

Thr Ser Leu Tyr His Lys Ile Gln Leu Asn Gly Tyr Lys Phe Leu Tyr

675 680 685

Cys Ser Ala Arg Ala Ile Gly Met Ala Asp Leu Thr Lys Gly Tyr Leu

690 695 700

Gln Trp Val Ser Glu Gly Gly Cys Ser Leu Pro Lys Gly Pro Ile Leu

705 710 715 720

Leu Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ser Ala Leu His Arg Glu Val Ile Glu

725 730 735

Lys Lys Pro Glu Val Phe Lys Val Ala Cys Leu Ser Asp Ile Gln Gln

740 745 750

Leu Phe Leu Pro His Gly Gln Pro Phe Tyr Ala Ala Phe Gly Asn Arg

755 760 765

Pro Asn Asp Val Phe Ala Tyr Arg Gln Val Gly Leu Pro Glu Ser Arg

770 775 780

Ile Phe Thr Val Asn Pro Arg Gly Glu Leu Ile Gln Glu Leu Ile Lys

785 790 795 800

Asn His Lys Ser Thr Tyr Glu Arg Leu Gly Glu Val Val Glu Leu Leu

805 810 815

Phe Pro Pro Val Ala Arg Gly Pro Ser Thr Asp Leu Ala Asn Pro Glu

820 825 830

Tyr Ser Asn Phe Cys Tyr Trp Arg Glu Pro Leu Pro Ala Val Asp Leu

835 840 845

Asp Thr Leu Asp

850

<210> 2

<211> 4462

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agattggggc ctgtggaggc cgcactagga tcgtagaagg agtggagccg tgctctcacc 60

ctgtcttaga ggacccggaa gcgccaagtg actgagggcc gaagacactc acctgtggag 120

cctgtgcacg taggtagagg cggcggctct gagtccagga gctccagtgg gcagctcccc 180

agcaccagcc atgaactacg tggggcagct ggcggagacg gtgtttggga cggtgaagga 240

gctgtaccgg ggcctgaacc cagccacact gagcggcggc attgacgtgc tggtggtgaa 300

gcaggtggac ggctcgttcc ggtgctcacc cttccacgtg cgttttggca agctgggcgt 360

cctgcggtcg cgggagaagg tggtagacat tgagctcaat ggggagcctg tggacttgca 420

catgaagctt ggggacagcg gggaggcctt ctttgttcag gagctggaga gcgatgatga 480

acatgtgcct cccggcctgt gcacctcacc catcccttgg gggggtctgt ctggcttccc 540

ctcggactcc cagctgggca ctgccagtga gcctgagggc ctcgtcatgg caggcacggc 600

ctccactggg cggaggaaga ggcgtcgcag gaggaaaccc aagcagaaag aggatgcagt 660

ggcaactgat tctagtccag aggaactgga ggcaggcgct gagagtgagc tatccctgcc 720

ggaaaagctg aggccagagc ccccaggtgt ccagttggaa gagaagtctt cactgcagcc 780

caaagacatc tacccctact cggatggcga gtggcccccc caggccagcc tctcagcagg 840

tgagctaaca tcccctaaga gcgactcgga gctggaggtg cggaccccgg agcccagtcc 900

cctaagagcc gagtcccaca tgcagtgggc ctgggggagg ctgcctaagg tggccagagc 960

tgagcggccc gagtcctcag tggtccttga aggcagagct ggggcaacct ctcctcctcg 1020

gggaggaccc agcactccct ctacctctgt ggctggcggc gtggaccctt tgggactccc 1080

aatccagcaa acagaggctg gtgccgacct tcagcctgac acagaggatc ccactctagt 1140

gggtccccct ctccacaccc cagagacaga ggaaagcaag actcagagct ctggggacat 1200

gggcctccct cctgcctcca agtcatggag ctgggccact ctggaggttc cagttcccac 1260

cgggcagcca gagagggtct ccagggggaa aggctcccca aagagaagcc agcacctggg 1320

ccccagtgac atctacctgg atgacttgcc ctccctggac tctgagaatg cagcgcttta 1380

cttcccccaa agtgactctg ggctgggggc cagaagatgg agtgaaccca gcagtcagaa 1440

gtccctgagg gaccccaacc ctgaacatga acctgaaccc actctggaca cagtggatac 1500

aatagcactg tccctctgtg gtggactggc tgacagccgg gacatctccc tagagaaatt 1560

caaccagcac agcgtctctt accaggacct caccaaaaac cccggacttt tggatgaccc 1620

aaacctagtg gtgaaaatca atggaaagca ttataactgg gctgtggctg cccccatgat 1680

cctctccctg caagccttcc agaaaaactt gcccaagagc accatggaca agctggagag 1740

ggagaagatg ccccggaagg gtgggcgatg gtggttttcc tggcgacgca gggacttcct 1800

ggccgaggag cgcagtgccc agaaggagaa gactgcagcc aaggagcagc agggggagaa 1860

gacagaagtc ctgagcagtg atgacgatgc cccagacagc cctgtgatcc tggagatccc 1920

ctccttgcca ccctccactc caccctccac tcctacctac aagaagtccc tccgcctctc 1980

ctccgatcag atccggcgcc tgaacctgca agaaggtgcc aatgatgtgg tcttcagcgt 2040

gaccactcag taccagggca cctgccgctg caaggccacc atctacctgt ggaaatggga 2100

cgacaaggtg gtcatctctg acatcgacgg caccatcacc aagtcagatg ctctgggcca 2160

tatcctgccc cagctgggga aagactggac acaccagggc atcaccagtc tctatcacaa 2220

aatccaacta aatgggtaca agttcctgta ctgctcggcg cgggccattg gcatggcgga 2280

cctcaccaag gggtacctgc agtgggtgag cgaggggggc tgtagcctcc ccaagggccc 2340

catccttctg tctcccagca gcctcttctc tgccctccac agagaggtga tcgagaagaa 2400

accagaggtg ttcaaggtcg cctgcctgag tgacatccag cagctgtttc tgccccacgg 2460

acagcccttc tatgctgcct ttgggaatag gcccaatgat gtctttgcct accggcaggt 2520

gggcctgcct gagtcacgca tcttcacagt caacccccgg ggagagctca tccaggagct 2580

cataaagaac cacaaatcca cgtatgagcg gcttggtgaa gtggtcgagc tcctcttccc 2640

acctgtggcc cgtggcccca gcacagacct ggccaaccct gaatacagta acttctgcta 2700

ctggcgggag ccactgcctg ctgtggacct tgataccctg gactgaacct gccctggctg 2760

gctcctcctc cctggcccgg cccaggactg gctaggtgtc ctggggtata ggagggtggg 2820

aattggagtg tcatggggca aacccactga aggggaagga ggaggctgca ggttggttgg 2880

cagctagaga gactccccca tcttccccgt catatttttg ccagctaagc tgcagctgct 2940

ccaggcgtca gtgtggcact gtcctggggc aattagcttg tcatctgggc ccttgcaggg 3000

ttcttttttt tttttttttt ttttttttcc tgagacaggg tcttgttctg ttgcccaggc 3060

tggagtgcag tggcatgatc tctcggctca ctgcaacctc cgcctcccgg gttcaagcga 3120

ttcacctgcc tcagcctccc aagtagctgg gattacaggc gtgtaccacc acgcctggct 3180

aattttcgtg tttttagtag agatgggttt tcaccacatt ggccaggctg gtctcgaact 3240

cctgacctca agtgatttgc ccacctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcatgag 3300

ctaccatgcc aggcctcctt gcagggtttt ctatgccctt gatatctgtc tccctgtcaa 3360

cctgggacct tgctgtaagt cttgatagga cagggagaag agggaggccc taccgaggct 3420

cgaggcttca gtgaagggtg acagcagtgg gagtgtggta cagcctctgg aaggacacag 3480

tgttctcccc gccccttgtc tgggagccag gactgtaccc tccgaagcca gacatcactg 3540

ccaacatatc ccccttgctg gtgccctggc atctcagcac atgacacaca cccacacctg 3600

caggctgtgg ttccggcttg gcctgctccc cgtccggctg ctgccgctgc ctctctccag 3660

acctcgctta aggacagtcc caaactcagc tggggcaggt gttggcctga aagtcctccc 3720

ccagcctctg ctggccagct tggtgctcac agctgctggg taagctcttg cctaaggagc 3780

tgtgggaagc agggctgatg ccccagcaac ctctcctccc actgtctttg aagaaagtag 3840

ctttagaccg gctaaaagct ttaatccaga gcctgcccta ctctgatagt accagagtgg 3900

agggcagaat accaaatgtc caggaaccaa aggcagggct gtggggacct gaagagcagc 3960

acagtggggc ccgtgctgct gtgggggaaa ctgaggctgg gagcctcagc agagaccggt 4020

gtcaagagtc tctgggaact gcataggcct gaggaacatg cattttcaag ttgtccattg 4080

atggtttcgt acctgaattt ctcacctttt gtgaacatct tgggagggtg ggggttttgc 4140

aggggtgtta aaagcaaggc ttggagcccc tttcctccag ctggtggctc cttctcaggg 4200

cctggcctca ttcaggccac tttgtagaga aatgccctga cctcgcagga aggatttccc 4260

cacccccaag tggaaggaag aggacagtgt gggcaccaga gggccctgga aacatcttag 4320

gggaaggaaa ggaaaaggat aaatttggag tggggggtct ctaaacagat tgcctggatt 4380

ccgttctttc ctggggttct acagctgcct aagccctcac cttgggggag gatcaaaggg 4440

aataaagaga actcttggct ga 4462

<210> 3

<211> 2559

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgaactacg tggggcagct ggcggagacg gtgtttggga cggtgaagga gctgtaccgg 60

ggcctgaacc cagccacact gagcggcggc attgacgtgc tggtggtgaa gcaggtggac 120

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cgggagaagg tggtagacat tgagctcaat ggggagcctg tggacttgca catgaagctt 240

ggggacagcg gggaggcctt ctttgttcag gagctggaga gcgatgatga acatgtgcct 300

cccggcctgt gcacctcacc catcccttgg gggggtctgt ctggcttccc ctcggactcc 360

cagctgggca ctgccagtga gcctgagggc ctcgtcatgg caggcacggc ctccactggg 420

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gagcgcagtg cccagaagga gaagactgca gccaaggagc agcaggggga gaagacagaa 1680

gtcctgagca gtgatgacga tgccccagac agccctgtga tcctggagat cccctccttg 1740

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ctgtctccca gcagcctctt ctctgccctc cacagagagg tgatcgagaa gaaaccagag 2220

gtgttcaagg tcgcctgcct gagtgacatc cagcagctgt ttctgcccca cggacagccc 2280

ttctatgctg cctttgggaa taggcccaat gatgtctttg cctaccggca ggtgggcctg 2340

cctgagtcac gcatcttcac agtcaacccc cggggagagc tcatccagga gctcataaag 2400

aaccacaaat ccacgtatga gcggcttggt gaagtggtcg agctcctctt cccacctgtg 2460

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

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<400> 4

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<210> 5

<211> 19

<212> DNA

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<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

gagaagtatg acaacagcct caa 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

agttgtcatg gatgaccttg g 21

Claims

1.LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因在作为急性肾损伤的生物标志物中的应用，其特征在于，所述LPIN3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码LPIN3蛋白的mRNA其序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码LPIN3蛋白的基因的Ensembl编号为ENSG00000132793，该基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述急性肾损伤是由顺铂、造影剂或肾毒性抗生素造成。

5.一种急性肾损伤检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测LPIN3蛋白或编码LPIN3蛋白的mRNA或编码LPIN3蛋白的基因的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测包括：胶体金免疫层析法、免疫印迹法、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、酶联免疫法、核酸探针法或qPCR法。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括抗LPIN3蛋白的特异性抗体、用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物、用于检测编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的探针或芯片中的一种或几种。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增编码LPIN3蛋白的mRNA或基因的特异性引物还包括内参基因GAPDH的PCR扩增特异性引物，序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示。

10.如权利要求5-9任一项所述的试剂盒在制备急性肾损伤检测试剂中的应用。