CN114134225B - 一种类风湿关节炎（ra）诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诊断和/或预后评估类风湿关节炎的生物标志物及其应用，所述的生物标志物为TMCO1，TMCO1在类风湿关节炎患者中表达水平显著高于骨关节炎患者，通过检测TMCO1的表达水平，可以准确的诊断类风湿关节炎。

Description

一种类风湿关节炎(RA)诊断的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及疾病诊断生物标志物技术领域，具体涉及一种类风湿关节炎(RA)诊断的生物标志物及其应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为特点的自身免疫性疾病，初期主要表现为关节肿痛、晨僵，随着关节逐渐被破坏导致关节变形并失去正常功能。一般情况下，RA患者在发病2年后，可导致机体形成不可逆关节损坏。而不可逆的关节损伤往往在疾病的初始阶段就已经开始，因此，早期诊断和治疗控制疾病进展、预防关节损伤是控制RA免疫炎症、预防并减缓后期骨破坏以致于关节畸形的极为重要的措施。目前，临床上类风湿关节炎的诊断方法包括血清标志物、影像学和临床症状，但这些指标往往在疾病发展到一定阶段才出现，且敏感性与特异性都存在一定的缺陷。研究发现多种自身抗体的形成与RA的发生有关，其中部分抗体目前已经成为诊断RA必不可少的实验室指标。类风湿因子(RF)是第一个纳入RA诊断标准的抗体，但它对RA的特异性较差，还可见于干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、胆汁性胆管炎等自身免疫病及慢性感染、恶性肿瘤等非自身免疫病患者中。5％～10％的健康人群也可能会出现RF水平升高，因此单独用RF诊断存在一定的漏诊率，对于疾病早期诊断有一定困难。2010年抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体也被纳入RA的分类标准和评分系统中，虽然抗CCP抗体具有较高的特异性，仍有约30％的RA患者漏诊，这部分人群常为疾病早期、非典型或者老年RA患者。据报道在具备了RA典型临床表现患者中，约有1/3的患者血清学抗体阴性。
外周血具有获取方便的特性，血浆中蕴含着丰富的蛋白质，可以通过血液循环到达全身所有组织，参与其生物过程。且各个器官的实体细胞也可以通过分泌一些蛋白质等入血，达到整体功能的反馈调节。外周血单核细胞中含有一系列具有免疫功能的细胞，如T细胞、B细胞、单核细胞等，因此目前多数研究从外周血单个核细胞为靶细胞，在外周血清以及外周血细胞中筛选出一些分子作为生物标志物，并研制出相应的辅助诊断试剂盒，将有力推动RA的早期诊断、预测发展以及监测治疗疗效等，具有重要的临床应用价值，例如专利CN110426523A公开了AIM作为生物标志物在诊断、预后和治疗监测类风湿关节炎中的用途。
TMCO1(Transmembrane and coiled-coil domains 1，跨膜和卷曲螺旋结构域1)是内质网中的钙过载激活钙离子通道，其基因位于人类1号染色体，编码239个氨基酸的蛋白。现有技术研究表明TMCO1功能障碍与畸形、智力低下、青光眼或癌症的发生有关。但是现有技术中，并没有公开TMCO1与类风湿性关节炎是否有关，更没有公开TMCO1作为诊断类风湿性关节炎的标志物中的用途。
非专利文献：TMCO1-mediated Ca2+leak underlies osteoblast functions viaCaMKII signaling(JianWei Li等，Nat Commun.2019 Apr 8；10(1):1589)公开了TMCO1对于成骨细胞具有调控作用，提示其在骨质疏松症可以作为一个治疗靶点。但是，骨质疏松症与类风湿关节炎是完全不同的两种疾病，其诊断标准不同，而且，该文献中只是提供了一种可能性，是否能作为骨质疏松症的治疗靶点还需要大量的试验去验证。
发明内容
本申请以TMCO1作为类风湿关节炎诊断或预后评估的生物标志物，从多角度证实TMCO1与类风湿关节炎的正相关性。而且，敲除TMCO1基因的CIA小鼠显示出病情的减轻、症状的缓解；且目前临床常用的有效抗RA药物如雷公藤多苷及甲氨喋呤很可能也是通过降低TMCO1的表达来缓解CIA大鼠症状、改善其病情的，以上表明TMCO1可以作为治疗类风湿关节炎的有效靶点。
本发明的第一方面，提供一种生物标志物或检测生物标志物的试剂在制备诊断和/或预后评估类风湿关节炎的产品中的应用。
优选的，所述的生物标志物为TMCO1。进一步优选为TMCO1基因或TMCO1蛋白。
优选的，所述检测生物标志物的试剂为检测TMCO1的mRNA表达水平和/或TMCO1蛋白表达水平的试剂。
优选的，所述的生物标志物为外周血(优选外周血清)、细胞(例如滑膜细胞、外周血单核细胞)、组织(例如关节组织(优选软骨、滑膜、骨小梁)、肝组织、脑组织)或器官(例如肝、脑)中的TMCO1蛋白。
本发明的第二方面，提供了一种生物标志物或检测生物标志物的试剂在制备区分类风湿关节炎与骨关节炎的产品中的应用。
优选的，所述的生物标志物为TMCO1。进一步优选为TMCO1基因或TMCO1蛋白。
优选的，所述检测生物标志物的试剂为检测TMCO1的mRNA表达水平和/或TMCO1蛋白表达水平的试剂。
优选的，所述的生物标志物为外周血(优选外周血清)、细胞(例如滑膜细胞、外周血单核细胞)、组织(例如关节组织(优选软骨、滑膜、骨小梁)、肝组织、脑组织)或器官(例如肝、脑)中的TMCO1蛋白。
本发明的第三方面，提供一种检测生物标志物的试剂。
优选的，所述的试剂检测TMCO1的mRNA或蛋白表达水平。
优选的，所述的试剂可以包括PCR所需试剂、Western blot所需试剂、免疫组化所需试剂、测序所需试剂、液相所需试剂或者质谱所需试剂等等。
本发明的第四方面，提供生物标志物或抑制生物标志物的试剂在制备治疗类风湿关节炎的产品中的应用。
优选的，所述的生物标志物为TMCO1。进一步优选为TMCO1基因或TMCO1蛋白。
优选的，所述抑制生物标志物的试剂为抑制TMCO1的mRNA表达水平和/或TMCO1蛋白表达水平的试剂。
优选的，所述的生物标志物为外周血(优选外周血清)、细胞(例如滑膜细胞、外周血单核细胞)、组织(例如关节组织(优选软骨、滑膜、骨小梁)、肝组织、脑组织)或器官(例如肝、脑)中的TMCO1蛋白。
优选的，所述的治疗类风湿关节炎为缓解或消除关节红肿、关节畸形、炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨侵蚀以及骨组织破坏。
本发明的第五方面，提供生物标志物或抑制生物标志物的试剂在制备降低破骨细胞的活化、降低肌动蛋白环的形成、抑制破骨细胞的骨吸收或抑制破骨细胞分化基因表达的产品中的应用。
优选的，所述的破骨细胞分化基因包括但不限于NFATc1、TRAP、MMP-9或CTSK基因。
优选的，所述的生物标志物为TMCO1。进一步优选为TMCO1基因或TMCO1蛋白。
优选的，所述抑制生物标志物的试剂为抑制TMCO1的mRNA表达水平和/或TMCO1蛋白表达水平的试剂。
优选的，所述的生物标志物为外周血(优选外周血清)、细胞(例如滑膜细胞、外周血单核细胞)、组织(例如关节组织(优选软骨、滑膜、骨小梁)、肝组织、脑组织)或器官(例如肝、脑)中的TMCO1蛋白。
本发明的第六方面，提供一种抑制生物标志物的试剂。
优选的，所述的试剂抑制TMCO1的mRNA或蛋白表达水平。
优选的，所述的试剂包括敲除TMCO1基因所需的试剂，或者抑制TMCO1转录的试剂、抑制TMCO1翻译的试剂等等。
本发明的第七方面，提供了一种类风湿关节炎或骨破坏的生物标志物，所述的生物标志物为TMCO1。
本发明的第八方面，提供一种降低破骨细胞的活化、降低肌动蛋白环的形成、抑制破骨细胞的骨吸收或抑制破骨细胞分化基因表达的方法，所述的方法包括降低TMCO1的表达。
优选的，所述的破骨细胞分化基因包括但不限于NFATc1、TRAP、MMP-9或CTSK基因。
优选的，所述的方法包括向个体施加有效量的抑制生物标志物的试剂。
本发明的第九方面，提供一种TMCO1基因敲除非人动物在制备治疗、诊断和/或预后评估类风湿关节炎的产品中的应用。
本发明的第十方面，提供一种筛选类风湿关节炎治疗药物的方法，所述的方法包括将待测药物与TMCO1混合，检测TMCO1表达水平。
本发明的第十一方面，提供了一种类风湿关节炎的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含检测生物标志物的试剂，所述的生物标志物为TMCO1。
本发明所述的诊断试剂盒可以为免疫磁珠检测试剂盒、凝集检测试剂盒、液相芯片检测试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫检测试剂盒。
优选的，所述的诊断试剂盒还包含微球、探针分子、报告分子、固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体、显色液、磁珠或荧光物质。所述的诊断试剂盒还包含微球、探针分子或报告分子，其中，所述的微球为聚苯乙烯微球或磁性微球，所述的探针分子是可以和微球表面的羧基等基团偶联并能与被检测物特异性结合的生物分子，所述的报告分子可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料，也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。
所述的诊断试剂盒还可以包含固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体和显色液，固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯，进一步优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板或96孔板；优选的，所述的补体能够与抗原抗体复合物反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，所述的抗体可以与待测抗体结合。
所述的诊断试剂盒还可以包含荧光物质，所述的荧光物质包括酶、接受体或抗体。
所述的诊断试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。
本发明的第十二方面，提供了一种药物，所述的药物包括抑制生物标志物的试剂。
优选的，所述的药物还包含药学上可接受的辅料。包括但不限于载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂。
给药方式包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。
剂型包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、注射剂、吸入剂、含片、栓剂、乳剂、微乳剂、亚微乳剂、纳米颗粒、凝胶剂、粉剂、悬乳液、乳膏剂、胶冻剂、喷雾剂等。所述药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明的第十三方面，提供了一种诊断和/或预后评估类风湿关节炎的方法，所述的方法包括检测TMCO1的mRNA或蛋白的表达水平。
本发明的第十四方面，提供了一种治疗类风湿关节炎的方法，所述的方法包括降低TMCO1的mRNA和/或蛋白的表达水平。
本发明的第十五方面，提供了TMCO1作为生物标志物在制备诊断和/或预后评估类风湿关节炎的产品中的应用。
本发明的第十六方面，提供了TMCO1作为生物标志物在制备区分类风湿关节炎与骨关节炎的产品中的应用。
本发明的第十七方面，提供了TMCO1作为靶基因在制备治疗类风湿关节炎的产品中的应用。
本发明的第十八方面，提供了TMCO1作为靶基因在制备降低破骨细胞的活化、降低肌动蛋白环的形成、抑制破骨细胞的骨吸收或抑制破骨细胞分化基因表达的产品中的应用。
本发明所述的“产品”包含检测生物标志物的试剂和/或抑制生物标志物的试剂。包括但不限于药物、试剂盒、设备等等。
本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
本发明所述的“治疗”，表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的药物的量或剂量。
本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。
本申请中简写与全称对照：
TMCO1：Transmembrane and coiled-coil domains 1，跨膜和卷曲螺旋结构域1。
NFATc1：nuclear factor-activated T cell 1，活化T细胞核因子1。
MMP-9：matrix metalloprotein 9，基质金属蛋白酶-9。
CTSK：Recombinant Cathepsin K，组织蛋白酶K。
TRAP：tartrate resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶。
TNF-α：tumor necrosis factor-α，肿瘤坏死因子。
M-CSF：macrophage-stimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子。
RA：Rheumatoid Arthritis，类风湿关节炎。
OA：Osteoarthritis，骨关节炎。
BMMs：bone marrow-derived macrophage，骨髓巨噬细胞。
RANKL：Receptor activator of NF-КB ligand，核因子κB受体活化因子配体。
HE染色：hematoxylin-eosin staining，苏木精—伊红染色法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：Western blot检测TMCO1在RA和OA患者关节滑膜组织中的表达，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，##表示P<0.01；
图2：免疫组化实验检测TMCO1在RA和OA患者关节滑膜组织中的表达，其中，图A为免疫组化染色图，图B为定量柱形图，#表示P<0.05；
图3：TNF-α诱导不同时间RA患者滑膜成纤维细胞TMCO1的表达，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，##表示P<0.01；
图4：Western blot检测CIA大鼠外周血血清中TMCO1的表达情况，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，纵坐标中蛋白相对表达量是用丽春红将整个膜染色，通过与泳道中所有蛋白的表达量比较获得，##表示P<0.01)；
图5：Western blot检测CIA大鼠关节组织中TMCO1及骨破坏相关因子NFATc1、MMP-9、CTSK的表达情况，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，##表示P<0.01，#表示P<0.05)；
图6：免疫组化检测CIA大鼠三种关节组织中TMCO1的表达情况，其中，图A为免疫组化染色图，图B为滑膜中TMCO1的表达定量柱形图，图C为软骨中TMCO1的表达定量柱形图，图D为骨小梁中TMCO1的表达定量柱形图，##表示P<0.01，#表示P<0.05；
图7：Western blot检测CIA小鼠关节组织中TMCO1及骨破坏相关因子NFATc1、CTSK的表达情况，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，##表示P<0.01；
图8：免疫组化检测CIA小鼠三种关节组织中TMCO1的表达情况，其中，图A为免疫组化染色结果图，图B为滑膜中TMCO1的表达定量柱形图，图C为软骨中TMCO1的表达定量柱形图，图D为骨小梁中TMCO1的表达定量柱形图，##表示P<0.01；
图9：RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞不同时间点TMCO1的表达情况，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，**表示P<0.01，*表示P<0.05；
图10：TMCO1基因敲除后CIA小鼠的足肿胀情况，其中，WT表示野生型，TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子，Ctrl表示对照，CIA表示CIA小鼠模型；
图11：TMCO1基因敲除后CIA小鼠的关节炎评分，其中，Ctrl-WT表示野生型对照组，Ctrl-TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子的非模型对照组，CIA-WT表示野生型CIA小鼠模型组，CIA-TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子CIA小鼠模型组；
图12：TMCO1基因敲除后CIA小鼠的发病率，其中，Ctrl-WT表示野生型对照组，Ctrl-TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子的非模型对照组，CIA-WT表示野生型CIA小鼠模型组，CIA-TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子CIA小鼠模型组；
图13：TMCO1基因敲除后CIA小鼠的关节组织病理学评分，其中，图A为组织切片图，图B为定量柱形图，WT表示野生型，TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子，Ctrl表示对照，CIA表示CIA小鼠模型，##表示P<0.01；
图14：TMCO1基因敲除后CIA小鼠的关节组织TRAP阳性细胞数，其中，图A为TRAP染色图，图B为定量柱形图，WT表示野生型，TMCO1+/-表示TMCO1基因敲除杂合子，Ctrl表示对照，CIA表示CIA小鼠模型，##表示P<0.01；
图15：Western blot鉴定小鼠TMCO1基因敲除，其中，TMCO1+/+表示未被敲除TMCO1基因，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子；
图16：TMCO1基因敲除后RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化程度，其中，图A为TRAP染色图，图B为定量柱形图，WT表示野生型，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子，##表示P<0.01)；
图17：TMCO1基因敲除后RANKL诱导小鼠破骨细胞活化程度，其中，图A为肌动蛋白环染色图，图B为定量柱形图，WT表示野生型，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子，##表示P<0.01；
图18：TMCO1基因敲除后RANKL诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能，其中，图A为破骨细胞骨吸收甲苯胺蓝染色图，图B为定量柱形图，WT表示野生型，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子，##表示P<0.01；
图19：TMCO1基因敲除后RANKL诱导小鼠破骨细胞标志基因CTSK、TRAP和MMP-9的表达，其中，横坐标中的M表示α-MEM完全培养基只有M-CSF，M+R表示α-MEM完全培养基含有M-CSF和RANKL；WT表示野生型，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子，**或##表示P<0.01；
图20：免疫荧光检测TMCO1基因敲除后RANKL诱导小鼠破骨细胞中NFATc1(图A)、MMP-9(图B)、CTSK蛋白(图C)的表达情况，其中，WT表示野生型，TMCO1-/-表示TMCO1基因敲除纯合子；
图21：Western blot检测雷公藤多苷和甲氨蝶呤对CIA大鼠TMCO1表达的影响，其中，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，图B中Model表示未给药CIA模型组，9mg/kg，36mg/kg，54mg/kg为在制备CIA模型基础上给药雷公藤多苷的使用剂量，MTX表示在制备CIA模型基础上给药甲氨喋呤，##表示P<0.01，**表示P<0.01；
图22：Western blot检测雷公藤多苷对RANKL诱导破骨细胞分化过程中TMCO1的表达的影响，其中，M-CSF代表α-MEM完全培养基只含有M-CSF，RANKL代表α-MEM完全培养基含有M-CSF和RANKL，图A为凝胶电泳图，图B为定量柱形图，##P<0.01，**P<0.01。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所用到的CIA大鼠/小鼠模型为Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠/小鼠经典模型，可以作为RA动物模型。
本发明实施例中所用到的SD大鼠为大鼠的一个品系，1925年，美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)农场用Wistar大鼠培育而成。其毛色白化。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。
除另有说明外，本实施例中蛋白表达采用半定量分析或者计算表达面积的表示方式。其中，TMCO1蛋白的相对表达量，是将各样品目的蛋白TMCO1量分别除以其内参(例如GAPDH或β-actin)含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，设定对照组为1，其他组相对对照组的值即为TMCO1在其他组表达的相对量，即TMCO1相对表达量。
TMCO1表达面积＝通过IPP软件分析测得的阳性表达面积/所测视野的总面积X100％。
实施例1临床RA与OA患者关节滑膜组织TMCO1表达的差异研究
在西安交通大学附属红会医院获取全膝关节置换术后的RA和OA患者膝关节关节滑膜临床标本各5例。参照1966年美国风湿病协会制定的RA诊断标准，有发作性膝关节疼痛史或膝关节关肿胀、活动受限、强直，加上x线改变：有骨破坏或血清类风湿因子(RF)阳性，均可诊断为类风湿性膝关节炎。对照纳入标准：选择西安交通大学附属红会医院OA患者关节置换术后临床标本。准备RA与OA滑膜组织蛋白，将滑膜在研钵中加液氮把组织碾碎至粉末状，部分常规方法提取蛋白，石蜡包埋，应用Western blot和免疫组化实验以及半定量分析，评价TMCO1在RA与OA患者关节滑膜组织中的表达。分离培养RA滑膜细胞，经TNF-α诱导后，收集细胞提取蛋白，检测诱导不同时间(12-48h)，TMCO1表达变化。
Western blot实验结果显示，TMCO1在RA患者的关节滑膜中的表达显著高于OA患者(P<0.01)，见图1；免疫组化结果显示：RA患者关节滑膜组织阳性着色程度显著高于OA患者，表示RA患者的TMCO1表达显著高于OA患者(P<0.05)，见图2；RA滑膜细胞经TNF-α(肿瘤坏死因子-α)诱导后，随着时间延长，TMCO1表达逐渐升高，显著高于未诱导组，见图3。
综上，不管是Western blot实验还是免疫组化，均显示TMCO1在RA患者的关节滑膜组织和体外培养的滑膜细胞上的表达量显著高于在OA患者中的表达量，提示TMCO1与RA成正相关，且可用于区分RA患者和OA患者。
实施例2 TMCO1与CIA大鼠发病的相关性研究
本实施例通过建立胶原诱导关节炎大鼠经典模型(CIA大鼠模型)，通过免疫组化、Western blot实验，验证TMCO1在CIA大鼠关节组织中的表达。
1、试验步骤：体重在160-180g范围内的雄性SD大鼠20只，随机分为空白对照组(Ctrl)及模型组(CIA大鼠模型)，造模：第0天(初次免疫)于大鼠尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂组成的乳化剂200μL/只，第7天(加强免疫)于相同部位注射牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂组成的乳化剂100μL/只。第二次免疫后3周，腹主动脉取血后分离血清，通过Western blot检测TMCO1的表达；取右后肢，剔除周围软组织后于4％多聚甲醛中固定后脱钙，石蜡包埋，切片，用于免疫组化染色；其余三肢冻存后提取蛋白用于Western blot检测。
2、试验结果：Western blot结果显示，CIA大鼠外周血清和关节组织中TMCO1及骨破坏相关蛋白NFATc1、MMP-9和CTSK的表达显著高于对照组(P<0.05或P<0.01，见图4、图5)；免疫组化结果显示，CIA大鼠在三种关节组织中TMCO1的表达量显著高于对照组(P<0.05或P<0.01，见图6)。
综上，以上结果提示不论是外周血还是关节滑膜组织中，CIA大鼠模型中TMCO1的表达均显著高于对照组，且与骨破坏呈正相关趋势。
实施例3 TMCO1与CIA小鼠发病的相关性研究
本实施例通过建立胶原诱导关节炎小鼠经典模型(CIA小鼠模型)，通过免疫组化、Western blot实验，验证TMCO1在CIA小鼠关节组织中的表达。
1、试验步骤：选取30只体重在18-20g范围内的雄性C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组(10只)及模型组(CIA小鼠模型，20只)，造模：第0天(初次免疫)于小鼠尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂组成的乳化剂100μL/只，第21天(加强免疫)于相同部位注射牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂组成的乳化剂100μL/只。第一次免疫后第42d取材：取左后肢膝关节和左后肢踝关节，剔去皮毛，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，后续进行病理组织学以及免疫组化检测。右后肢膝关节和右后肢踝关节，液氮冷冻后置于-80℃冰箱，用前提取蛋白，用于Western blot检测。分离培养小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)，RANKL诱导向破骨细胞分化3-48h不同时间点，收集细胞提取蛋白，进行Western blot检测。
2、试验结果：(1)Western blot结果显示，与对照(Ctrl)组相比，CIA小鼠关节组织中TMCO1及骨破坏相关因子的表达显著升高(P<0.01，见图7)；(2)免疫组化结果显示，与对照组相比，CIA小鼠关节组织无论滑膜、软骨还是骨组织，TMCO1的表达显著升高(##P<0.01，见图8)；(3)经RANKL诱导3、6、12、24及48h后，TMCO1的表达呈现不同程度升高，以48h升高最为显著(P<0.01，见图9)。
以上结果提示CIA小鼠模型中TMCO1的表达均显著升高，且与骨破坏呈现正相关趋势；此外小鼠BMMs在向破骨细胞分化过程中，TMCO1的表达均明显提高。
实施例4 TMCO1基因敲除后对CIA小鼠病情以及骨破坏的影响
本实施例建立胶原诱导关节炎TMCO1基因敲除小鼠经典模型，通过发病症状观察、临床积分、关节肿胀度、发病率、HE染色、TRAP染色来验证TMCO1基因敲除后对CIA小鼠病情以及骨破坏的影响。
1、试验步骤：将C57BL/6的WT小鼠和TMCO1敲除(TMCO1+/-)小鼠分别随机分为2组，空白对照组3只，模型组(CIA小鼠模型)4只，即WT-Ctrl组、WT-CIA组、TMCO1+/--Ctrl组、TMCO1+/--CIA组。模型组制备CIA小鼠模型，免疫后观察以下指标：(1)发病症状观察：观察动物的关节红肿和畸形表现，并进行拍照留存；(2)临床积分：每肢评分为0～4，0分为无肿胀，1分为只红不肿，2分为轻微红肿，3分为中度红肿，4分为重度红肿甚至畸形。每只动物的四肢评分之和为其临床积分，四肢总分为16分。从第一次免疫的第0d起，进行临床积分评定，每天评分一次。(3)发病率：以动物有一只爪的临床积分为1或以上者即为发病。第一次免疫后第42d取材：取左后肢膝关节和左后肢踝关节，剔去皮毛，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，用于组织病理学以及破骨细胞特异性TRAP染色；右后肢膝关节和右后肢踝关节，液氮冷冻后置于-80℃冰箱，以备后续进行组织匀浆提取蛋白。
2、试验结果：(1)TMCO1基因敲除后可降低CIA模型小鼠的关节红肿表现，在二次免疫后的第3d，WT-CIA组小鼠后肢开始出现多趾间关节红肿，并逐渐蔓延至足垫及踝关节，有时累及前肢，随着时间的推移关节的红肿程度逐渐减轻并出现畸形及僵硬的症状。而同样时间点下，TMCO1+/--CIA组小鼠的临床症状轻于WT-CIA组(见图10)；(2)TMCO1基因敲除后可显著下调CIA模型小鼠的临床积分，WT-CIA组小鼠在第二次免疫第3d开始出现关节肿胀，随着时间的推移，临床积分逐渐升高，且在第15d达到顶峰，相同条件下，TMCO1+/--CIA组临床积分要低于WT-CIA组(见图11)；(3)TMCO1基因敲除后可降低CIA模型小鼠的发病率，在二次免疫后第3d时，WT-CIA组小鼠开始出现发病症状，并且随着时间推移，发病率呈上升趋势，最终达到49％。相同条件下，TMCO1+/--CIA组小鼠发病率也呈上升趋势，但发病率低于WT-CIA组(见图12)；(4)TMCO1基因敲除后降低CIA模型小鼠的病理学评分：正常组小鼠关节组织切片关节间隙明显、滑膜无增生、骨表面完整平滑。模型组小鼠关节组织切片出现了大量炎性细胞浸润、滑膜增生、大量血管翳形成，同时伴有软骨侵蚀和骨组织破坏(P＜0.01)。相同条件下，TMCO1+/--CIA组小鼠组织学评分值明显低于WT-CIA组(P＜0.01，见图13)；(5)TMCO1基因敲除后降低CIA模型小鼠膝关节组织中破骨细胞数目：各组CIA小鼠膝关节组织切片经TRAP染色后，观察各组TRAP染色情况，统计TRAP染色阳性且细胞核数≥3的破骨细胞数目，与正常组相比，模型组破骨细胞数目明显增多(P＜0.01)，相同条件下，TMCO1+/--CIA组破骨细胞数量明显低于WT-CIA组(P＜0.01，见图14)。
以上结果显示TMCO1基因敲除可显著减轻CIA小鼠的肿胀度、关节炎评分以及发病率，降低组织病理改变以及TRAP阳性数。提示TMCO1与CIA小鼠的病情以及骨破坏正相关。
实施例5 TMCO1基因敲除后对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
分离5-6周龄的WT与TMCO1-/-小鼠骨髓细胞，接种到培养板里，放入37℃、5％CO2培养箱培养。20ng/mL M-CSF诱导，3d后用含20ng/mL M-CSF及50ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基向破骨细胞诱导，正常组不加RANKL。诱导不同时间点进行TRAP染色、肌动蛋白环染色和免疫荧光双标以观察对破骨细胞分化和活化的影响；接种到牛骨骨片上，采用甲苯胺蓝染色观察破骨细胞骨吸收作用；提取RNA，进行realtime-PCR检测破骨细胞关键基因的表达。
本试验通过建立体外破骨细胞分化模型，应用TRAP染色、肌动蛋白环染色、骨片甲苯胺蓝染色、实时荧光定量PCR来验证TMCO1基因敲除后对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响，结果如下：(1)TMCO1基因敲除的鉴定：Western blot结果显示，未敲除TMCO1基因(TMCO1+/+)的小鼠肝组织和脑组织中TMCO1呈现一定量表达，而TMCO1-/-小鼠无表达(见图15)；(2)TMCO1敲除后显著降低破骨细胞分化：经M-CSF及RANKL诱导后，可观察到大量TRAP阳性的多核细胞(核≥3个)，胞浆可见明显的酒红色，破骨细胞胞膜边界不整，其周边可见伪足伸展。与正常组相比，RANKL诱导组破骨细胞成熟度，即每孔TRAP阳性细胞数明显提高(见图16A)；与RANKL诱导WT比较，RANKL诱导TMCO1-/-小鼠时破骨细胞成熟度明显偏低(P<0.01，见图16B)；(3)TMCO1敲除后显著降低破骨细胞的活化：肌动蛋白环形成是破骨细胞活化的特异标志，经M-CSF及RANKL诱导后，可见明显肌动蛋白环形成，且观察到细胞内的大量细胞核。与WT比较，TMCO1-/-组肌动蛋白环形成比例明显偏低(P<0.01，见图17)；(4)TMCO1敲除后显著抑制破骨细胞的骨吸收功能：经M-CSF及RANKL诱导后，可见明显蓝紫色骨吸收陷窝形成。与WT诱导组比较，TMCO1-/-诱导组骨吸收陷窝形成比例明显偏低(P<0.01，见图18)；(5)TMCO1敲除后显著抑制破骨细胞分化基因表达：经M-CSF及RANKL诱导培养5d后进行qPCR检测，破骨细胞分化的特异性基因TRAP，MMP-9以及CTSK mRNA的表达均有明显的提高(P＜0.01)；与WT诱导组比较，TMCO1-/-诱导组TRAP和CTSK mRNA表达明显偏低(均P＜0.01，见图19)；(6)免疫荧光检测结果显示WT诱导组中NFATc1、MMP-9、CTSK蛋白在破骨细胞中大量表达，且表达趋势与mRNA一致，而TMCO1-/-诱导组明显抑制NFATc1、MMP-9、CTSK蛋白的表达(P＜0.01，见图20)。
以上结果显示TMCO1敲除后可显著降低破骨细胞的分化、活化以及骨吸收功能，且抑制破骨细胞关键基因的表达。提示TMCO1与破骨细胞分化和功能正相关。
实施例6临床常用抗RA药物对TMCO1表达的影响
体重在160-180g范围内的雄性SD大鼠60只，随机分为空白对照组及模型组、雷公藤多苷(GTW，9、36和54mg/kg)以及甲氨喋呤(MTX)组，除对照组外，其他各组均制备CIA模型，造模：第0天(初次免疫)于大鼠尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂组成的乳化剂200μL/只，第7天(加强免疫)于相同部位注射牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂组成的乳化剂100μL/只。第二次免疫时给予雷公藤多苷以及甲氨喋呤，二免3周取右后肢，提取蛋白用于Western blot检测。分离培养小鼠骨髓细胞，经20ng/mL M-CSF诱导，3d后即为BMMs。后用含20ng/mL M-CSF及50ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基向破骨细胞诱导分化，同时给予GTW(2.5、5和10μg/kg)，诱导72h后提取蛋白进行Western blot检测。
本试验通过建立体外破骨细胞分化模型，给予GTW进行细胞给药，应用Westernblot来验证GTW对TMCO1表达的影响。结果如下：(1)雷公藤多苷和甲氨喋呤均显著抑制CIA大鼠TMCO1表达：雷公藤多苷和甲氨喋呤均为临床上用于治疗RA的常用有效药物，Westernblot结果显示，与Ctrl组比较，CIA模型TMCO1的表达显著升高；与CIA模型组比较，雷公藤多苷和甲氨喋呤均可以显著抑制TMCO1的表达(均P＜0.01，见图21)；(2)雷公藤多苷可明显降低RANKL诱导的破骨细胞TMCO1表达：经RANKL诱导后，BMMs向破骨细胞分化过程中TMCO1的表达明显升高；而雷公藤多苷可浓度依赖性显著降低TMCO1的表达(均P＜0.01，见图22)。
以上结果显示临床一线用于RA治疗的药物(雷公藤多苷和甲氨喋呤)可显著降低TMCO1的表达，提示TMCO1可作为RA治疗药物的靶标。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (4)

1.检测生物标志物的试剂在制备诊断和/或预后评估类风湿关节炎的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物为TMCO1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为TMCO1基因或TMCO1蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，检测生物标志物的试剂为检测TMCO1的mRNA表达水平和/或TMCO1蛋白表达水平的试剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为外周血、破骨细胞或关节组织中的TMCO1蛋白。
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