CN111690730B - Il-8阳性初始t细胞作为诊断胸腺占位性疾病的靶点的应用 - Google Patents
Il-8阳性初始t细胞作为诊断胸腺占位性疾病的靶点的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及IL‑8阳性初始T细胞作为诊断胸腺占位性疾病的靶点的应用。本发明揭示了外周血中的IL‑8阳性初始T细胞对于胸腺占位性疾病的诊断或分型具有显著的意义，可通过分析外周血中从胸腺中迁出的IL‑8阳性初始T细胞的比例和功能来辅助胸腺瘤的诊断。本发明的技术方案可以显著地提高胸腺占位性疾病的诊断或分型的准确率。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断或诊断试剂领域，更具体地，本发明涉及IL-8阳性T细胞在诊断胸腺占位性疾病中的应用。
背景技术
胸腺占位性疾病包括胸腺增生，胸腺囊肿，胸腺瘤，胸腺鳞癌，淋巴瘤，生殖细胞肿瘤及转移性肿瘤。其中胸腺瘤是人类最常见的纵隔肿瘤，是胸腺上皮细胞(TEC)的肿瘤。胸腺瘤几乎可以发生在任何年龄(8个月～90岁的胸腺瘤病例均有报道)，组织形态表现多样，疾病发展难以预测且有恶变风险，从无症状到一系列伴瘤综合症，常伴有免疫系统异常和自身免疫病，以重症肌无力最为多见。因此，胸腺瘤的准确诊断至关重要。
目前胸腺瘤的诊断手段以临床表现结合影像学判断为主，并通过病理切片确诊。因为胸腺瘤的临床表现多样，因此胸腺瘤的诊断非常依赖影像学，尤其是CT技术。胸腺瘤的CT表现为一侧隔增宽或突向一侧胸腔的圆形或椭圆形致密影，位于左无名动脉下并靠近胸骨，部分伴有钙化。
然而，临床上也发现CT判断胸腺瘤存在一定误诊率，大约为20％的假阳性率和7％的假阴性率，最常见于胸腺瘤和其他胸腺占位性疾病，特别是胸腺囊肿的混淆。假阳性的误诊会导致儿童及少年由于胸腺切除引起免疫缺陷，以及老年人由于胸腺切除造成的手术创伤。假阴性的误诊会导致无症状胸腺瘤的漏诊，延误了治疗时机。若是能够以人体的标志物来加以辅助鉴定，则将有助于提高诊断的准确性，降低误诊率。但是，本领域中尚没有此类标志物。
综上，准确诊断胸腺瘤至关重要，本领域亟待进一步探索可靠的方法来实现胸腺瘤的更准确诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供IL-8阳性T细胞作为诊断胸腺占位性疾病的靶点的应用。
在本发明的第一方面，提供IL-8阳性初始T细胞的用途，用于作为胸腺占位性疾病的诊断或分型的标志物；或，用于制备对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或检测IL-8阳性初始T细胞的物质的用途，用于制备对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂或试剂盒。
在一个优选例中，所述的诊断或分型包括辅助诊断或分型，例如配合CT的辅助诊断或分型。
在另一优选例中，所述的IL-8阳性初始T细胞是为下组细胞表面分子为阳性的细胞：CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31；较佳地为CD4+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞或CD8+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞。
在另一优选例中，所述的IL-8阳性初始T细胞为下组细胞表面分子为阴性的细胞：CD15和/或CD235的细胞。
在另一优选例中，所述的IL-8阳性初始T细胞是激活的T细胞；较佳地，是经过佛波醇酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)刺激的T细胞。
在另一优选例中，述的IL-8阳性初始T细胞是外周血来源的；较佳地为外周血单个核细胞来源的。
在另一优选例中，以应用于免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂来识别或检测IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235；较佳地，选自(但不限于)：特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235的抗体，特异性扩增IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235基因的引物，或特异性识别IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235基因的探针。
在另一优选例中，所述的胸腺占位性疾病包括：胸腺瘤，胸腺增生，胸腺囊肿，胸腺鳞癌，淋巴瘤，生殖细胞肿瘤及转移性肿瘤；较佳地，所述的分型为将疾病分为将胸腺瘤及胸腺增生与其它胸腺疾病区分。
在本发明的另一方面，提供一种用于对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂盒，其中包括：特异性识别或检测IL-8的物质；特异性识别或检测CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31的物质。
在一个优选例中，其中还包括：特异性识别或检测CD15和/或CD235的物质。
在另一优选例中，所述的特异性识别的物质为：应用于免疫检测、原位杂交、PCR检测的试剂；较佳地，选自(但不限于)：特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235的抗体，特异性扩增IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235基因的引物，或特异性识别IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235基因的探针；更佳地，为特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235的抗体，应用于流式细胞检测。
在另一优选例中，其中还包括：T细胞激活试剂；较佳地，是为佛波醇酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)。
在本发明的另一方面，提供一种从细胞群中识别或区分IL-8阳性初始T细胞的方法，所述方法包括：(1)从细胞群中获得初始T细胞；(2)从(1)获得的初始T细胞中区分IL-8阳性初始T细胞。
在一个优选例中，步骤(1)中，以表面表达CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31的细胞作为初始T细胞；较佳地，所述的初始T细胞为CD4+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞或CD8+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞。
在另一优选例中，步骤(1)中，还包括，从细胞群中排除表面表达CD15和/或CD235的细胞(即排除髓系细胞或红细胞)。
在另一优选例中，所述方法或用途为非诊断性的方法或用途，也即，所述的方法或用途并非以获得疾病诊断的结果为目的。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、胸腺瘤病和其它胸腺占位性疾病患者可通过血中IL8+初始T细胞比例鉴别。
(A)影像学难以鉴别的胸腺瘤患者和其它胸腺占位性疾病患者的CT图易造成误诊；
(B)(A)中患者对应的初始T细胞中IL8流式检测图。初始T细胞指CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+细胞(CD4+初始T细胞)或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+细胞(CD8+初始T细胞)，随后再该群细胞中圈出CD31+IL-8+的细胞。
(C)其它胸腺占位性疾病和胸腺瘤患者在术前和半年随访时血中IL8+初始T细胞比例的比较。
(D)不同年龄的胸腺囊肿和胸腺瘤患者血中IL8+初始T细胞的百分比，其中虚线代表5％的水平。
图2、IL8初始CD4+T细胞可反映胸腺切除术的疗效。
(A，C)术前及术后随访IL8初始CD4+T细胞的统计学差异。
(B，D)术前及术后随访IL8初始CD8+T细胞的统计学差异。
图3、使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断可以大大降低胸腺瘤误诊率。
(A，B)以IL8+初始T细胞辅助CT对患者进行诊断的ROC曲线。
图4、使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断能够有效校正影像学误诊。
(A)代表性的一例胸腺瘤误诊病例的CT(上图)和IL8流式数据(下图)；
(B)代表性一例胸腺瘤误诊病例的CT(上图)和IL8流式数据(下图)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现外周血中的IL-8阳性初始T细胞对于胸腺占位性疾病的诊断或分型具有显著的意义。通过分析外周血中从胸腺中迁出的IL-8阳性初始T细胞的比例和功能来辅助胸腺瘤的诊断。本发明的技术方案可以显著地提高胸腺占位性疾病的诊断或分型的准确率。
如本发明所用，所述的“胸腺占位性疾病”与“胸腺占位性病变”可互换使用，是指发生于胸腺的恶性增生性病变(如肿瘤)或良性增生性病变，包括：胸腺瘤，胸腺增生，胸腺囊肿，胸腺鳞癌，淋巴瘤，生殖细胞肿瘤及转移性肿瘤。
诊断靶点
临床研究发现，胸腺瘤是一种能诱发T细胞产生成熟T细胞的肿瘤。而在正常成年人中，随着胸腺功能的退化，由胸腺向外周输出的T细胞显著减少。在此基础上，本发明人研究了具有怎样的特征的T细胞可以作为对于胸腺占位性疾病鉴定的标志物。进而，确定了外周血中的IL-8阳性初始T细胞对于胸腺占位性疾病的诊断或分型具有显著的意义。其中，所述的分型为将疾病分为将胸腺瘤及胸腺增生与其它胸腺疾病区分。
在本发明的优选方式中，通过识别细胞表面标志物来确定感兴趣的IL-8阳性初始T细胞。所述的表面标志物包括CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和/或CD235。
在优选的实施方式中，所述的IL-8阳性初始T细胞是为下组细胞表面分子为阳性的细胞：CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7和/或CD31；较佳地为CD4+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞或CD8+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+T细胞。在另一优选的实施例方式中，所述的IL-8阳性初始T细胞为下组细胞表面分子为阴性的细胞：CD15和/或CD235的细胞。
在本发明的优选方式中，将T细胞进行刺激后再实施检测。所述的激活试剂为佛波醇酯(PMA)或离子霉素(Ionomycin)。两者都是激活T细胞信号通路的，佛波醇酯介导下游有RasGRP1-Erk-AP1以及PKC-NF-kB通路；离子霉素促使钙通道开放，激活NFAT通路。较佳地利用该两者激活3～10小时，更佳地5～8小时(6小时最佳)，之后进行后续检测，例如流式细胞术检测。
试剂及试剂盒
基于本发明人的上述新发现，可以将IL-8阳性初始T细胞作为标志物：(i)进行胸腺占位性疾病的诊断或分型的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群胸腺占位性疾病患病风险，早期监测早期防治。比如，在外周血中发现IL-8阳性初始T细胞比例发生变化的最早期就进行干预，从而可进行更有针对性的治疗。因此，本发明提供了IL-8阳性初始T细胞的用途，用于制备对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂或试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测IL-8阳性初始T细胞的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如免疫检测法、原位杂交、PCR检测、免疫印迹法、DNA序列分析等，这些方法可结合使用。优选地为免疫检测法，例如基于流式细胞技术的检测方法。
本发明还提供了用于在分析物(如外周血或外周血经加工或处理的产物)中检测IL-8阳性初始T细胞的存在与否以及表达情况的试剂。在优选的实施方式中，以应用于免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂来识别或检测IL-8以及上述的表面标志物；较佳地，选自(但不限于)：特异性结合IL-8以及上述的表面标志物的抗体，特异性扩增IL-8以及上述的表面标志物的引物，或特异性识别IL-8以及上述的表面标志物的探针。优选地，当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性抗体来进行。
本发明还提供了用于在分析物中检测IL-8阳性初始T细胞的存在与否以及表达情况、从而可用于对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂盒，该试剂盒包括前面所述的用于在分析物(如外周血或外周血经加工或处理的产物)中检测IL-8阳性初始T细胞的存在与否以及表达情况的试剂。
本发明的方法中，还涉及对T细胞进行激活的步骤。因此，作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括：T细胞激活试剂；较佳地，是为佛波醇酯(PMA)和/或离子霉素(Ionomycin)。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。
在本发明的具体实施方式中，公开了一种利用流式细胞术检测外周血IL-8阳性T细胞辅助诊断胸腺瘤和其它胸腺占位性疾病的方法。通过流式细胞术检测并统计了90例初胸腺占位性疾病患者的术前及术后随访过程中外周血IL-8阳性T细胞比例；更特别地，使用流式细胞术检测人外周血CD4+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+细胞以及CD8+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+细胞的比例，证明了本发明的方法可以有效辅助胸腺瘤的诊断，并将之与影像学上容易混淆的其他胸腺占位性疾病有效区分。
本发明的方法具有成本低廉、取材容易、灵敏度高、诊断清楚的优点，可将漏诊率降到0％，误诊率降低到2.8％，为胸腺瘤和其它胸腺占位性疾病的诊断和鉴别诊断提供了良好的技术支持。
尽管在本发明的实施例中，主要以流式细胞术来实施检测。但是，应理解，根据本发明的指示，在明确了所需检测的靶细胞后，本领域技术人员可以制备出多种适合的试剂以及试剂盒，应用多种方法来实施检测，这些也应被涵盖在本发明的保护范围内。
应用
本发明中，首次明确了患者的外周血中IL-8+的初始T细胞的比例与不同胸腺占位性疾病的关系，从而为探究胸腺疾病诊断提供了有效的新方法。同时，本发明也为临床医生制定治疗方案提供了清晰线索，并能辅助判断胸腺瘤的治疗效果。使用该方法大大降低了胸腺瘤的误诊率，具有操作简单、结果可靠等优点，为胸腺瘤的诊断和治疗效果评估提供了良好的技术支持。
本发明的适用人群，不仅包括需要进行胸腺占位性疾病分析的普通患者，还包括那些经CT诊断难以判断是否为胸腺瘤和其它胸腺占位性疾病的疑难患者。
由于胸腺瘤具有恶变倾向并且容易引起重症肌无力等严重并发症，因此一经诊断必须采取及时有效的治疗手段。胸腺切除术结合放化疗是目前治疗胸腺瘤的主要方法。目前实施该手术的手术指征为影像学水平高度疑似胸腺瘤或者患者出现其他伴瘤综合征，如重症肌无力等。然而，某些情况下，如果影像学无法将胸腺瘤与其它胸腺占位性疾病(比如胸腺囊肿)区分开，临床医生便容易受其误导采取错误的治疗方法，导致患者被过度治疗或者缺乏必要的治疗。通过检测外周血IL-8阳性T细胞的水平，不但可以辅助胸腺瘤的诊断，大大提高诊断准确率，并且可以有效得监测患者术后恢复情况，判断是否存在胸腺瘤的复发，具有至关重要的临床意义。
此外，重症肌无力是一种由神经-肌肉接头处传递功能障碍所引起的自身免疫性疾病，症状包括眼睑下垂和吞咽困难等，病因有多种。目前，治疗重症肌无力的主要方法是服用药物。但是对于胸腺瘤引起的重症肌无力，胸腺切除术可以大大降低患者的药物用量，甚至摆脱对药物的依赖。然而，目前确定重症肌无力是否由胸腺瘤引起主要依赖影像学，而影像学只能观察胸腺组织的宏观变化。通过检测外周血IL-8阳性T细胞的水平，可以反应胸腺功能在微观水平的变化，从而确定重症肌无力的病因，对于制定重症肌无力的治疗方法至关重要。此外，通过大量样本的研究，可以进一步探讨是否重症肌无力的产生都与胸腺功能异常有关。
本发明的方法克服了现有胸腺瘤诊断技术的缺点与不足，减少了由于影像学误诊导致的胸腺瘤和其它胸腺占位性疾病的混淆。
本发明还发现CD4+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+在CD4+初始T细胞中的比例及CD8+CD45RA+CCR7+CD31+IL-8+细胞在CD8+初始T细胞中的比例在胸腺瘤患者术后随访时的明显降低，证明IL-8阳性初始T细胞不仅可以用于胸腺瘤患病风险的诊断，还可以用于胸腺瘤手术治疗效果的评估。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、样本处理以及检测方法
1、样品处理
利用密度梯度离心法分离患者术前及随访样本的外周血单个核细胞。具体操作如下：在15ml EP管中加入5ml Ficoll。取5ml抗凝血样本并按照1:1的比例与PBS进行混合。随后将混合后的血样小心地叠加于Ficoll上，注意保持Ficoll与血样界面清晰。随后将该样本置于离心机中，在500g转速下离心20分钟，温度为室温，并将离心机升降速率调制最低。离心结束后，尽量吸走上层PBS和血浆混合的黄色透明层并丢弃，随后小心吸出富含外周血单个核细胞的白膜层。将白膜层转移至另一支15ml EP管中，加入3倍体积的培养基，4℃下350g离心6分钟洗涤。洗涤后，用红细胞裂解液处理并使用台盼蓝染色后计数。
2、使用佛波醇酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)刺激细胞
如前述实施例1获得外周血单个核细胞，计数后，取2×106的外周血单个核细胞重悬于500ul TCM培养基中。另取500ul培养基加入PMA和Ionomycin，分别达到20ng/ml和1μg/ml的浓度。随后将两份培养基混合，并在37℃培养箱中孵育4小时。随后，向培养细胞中加入布雷菲德菌素A(BFA，10ug/ml)以抑制蛋白转运。再孵育两小时后，从培养箱中取出细胞并回收细胞，并在4℃下350g离心6分钟洗涤两次。
3、流式细胞术检测
细胞洗涤两次后，重悬在30μl含1％胎牛血清的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)，使用人Fc Blocker和大鼠血清封闭五分钟后，使用流式抗体染色。
流式染色方案为：
将上述抗体混合后加入细胞，并在冰上避光孵育30分钟。随后将细胞重悬于2mlPBS中，4℃下350g离心6分钟洗涤两次。弃掉上清液后使用300ul 3.7％的福尔马林溶液避光常温孵育15分钟，随后使用PBS洗涤一次，固定后的细胞用1ml 0.2％的Saponin溶液冰上打孔10分钟，随后离心并弃掉Saponin。取5ul 0.2％Saponin溶液，向其中加入1ul的IL-8-FITC抗体，充分混合后加入打孔后的细胞，冰上避光孵育30分钟。随后即可使用流式细胞仪检测。
实施例2、胸腺瘤病和其它胸腺占位性疾病患者以CT鉴定以及以血中IL8+初始T细胞比例鉴定的比较
选择胸腺囊肿以及胸腺瘤的患者，利用传统的影像学方法来进行诊断，代表性的两位患者的影像图如图1A所示。由图可见，两种占位性病变在影像学上非常接近，难以仅根据图像作出准确的鉴别。
接着，获取该两位患者的外周血，如实施例1所述的方法进行流式细胞术分析。图1B为相应的初始T细胞中IL8流式检测图。其中，初始T细胞指CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+细胞(CD4+初始T细胞；由于CD4+T受到PMA+Ionomycin刺激后CD4表达水平下调，阳性群与阴性群难以区分，故采用CD3+CD8-标记CD4+T细胞，此为标记受刺激后的CD4细胞的通用做法)或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+细胞(CD8+初始T细胞)，随后在该群细胞中圈出CD31+IL-8+的细胞。结果显示，胸腺瘤患者的外周血有明显的IL-8阳性初始T细胞，而胸腺囊肿等其他疾病患者外周血几乎没有IL-8阳性初始T细胞。
本发明人分别收集了35例胸腺瘤患者、35例胸腺囊肿患者、10例胸腺鳞癌患者、5例胸腺增生患者、8例生殖细胞肿瘤和7例淋巴瘤患者的外周血单个核细胞。胸腺瘤患者和其它胸腺占位性疾病在术前和半年随访时血中IL8+初始T细胞比例的比较；采用如前述实施例1的方法，以流式细胞术检测IL-8阳性细胞的存在情况。结果如图1C，可见统计学结果显示不论在CD4+初始T细胞中，还是CD8+初始T细胞中，胸腺瘤患者IL-8阳性初始T细胞水平均极为明显地高于其它胸腺占位患者。
将前述收集的患者按照年龄进行分组，分析不同年龄的胸腺囊肿和胸腺瘤患者血中IL8+初始T细胞的百分比，如图1D。结果显示，胸腺囊肿患者的外周血IL-8阳性初始T细胞维持在较低水平，且随年龄上升呈现下降趋势。而胸腺瘤患者外周血IL-8阳性初始T细胞水平较高，且与年龄关系不密切。这是因为胸腺囊肿等其他胸腺占位性疾病不存在胸腺功能异常的现象，胸腺功能维持在正常水平且随着年龄增大逐渐退化，而胸腺瘤患者胸腺功能亢进，并且其胸腺功能与病情关系密切。
实施例3、不同胸腺占位性疾病患者IL8阳性初始T细胞的比例分析
本发明人分别收集了35例胸腺瘤患者、35例胸腺囊肿患者、10例胸腺鳞癌患者、5例胸腺增生患者、8例生殖细胞肿瘤和7例淋巴瘤患者的外周血单个核细胞。采用如前述实施例1的方法，利用流式细胞术检测IL-8阳性细胞的存在情况。
测定结果，不同胸腺占位性疾病患者IL8阳性初始T细胞的比例如表1～表2所示。
表1、IL-8+CD4初始T细胞比例
表2、IL-8+CD8初始T细胞比例
上述结果可见，在使用佛波醇酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)刺激前IL-8阳性初始T细胞水平近似的情况下，刺激后胸腺瘤和胸腺增生的IL-8初始T细胞的比例明显高于其它胸腺占位性疾病。
根据NCCN的指导说明，临床上对于胸腺瘤和其他占位性病变，胸腺增生和其他占位性病变的误诊率较高；其他占位性疾病之间的区别，包括胸腺瘤与胸腺增生的区别，可以通过影像学和血生化轻易区分。本发明中，可以将胸腺瘤及胸腺增生与其它占位性病变分离，后续进一步的区分是非常容易的。
实施例4、IL8初始CD4+T细胞可反映胸腺切除术的疗效
本发明人还分析了胸腺瘤患者(10人)术前及术后随访IL8初始CD4+T细胞及CD8+T细胞的统计学差异。结果如图2A～D。其呈现的趋势为：胸腺瘤患者进行胸腺切除术后，由于胸腺被切除，不存在由肿瘤组织引起的胸腺功能亢进，因此外周血中与胸腺功能密切相关的IL8初始CD8+T细胞及术前及术后随访IL8初始CD8+T细胞水平相对于术前大大下降，而在影像学上难以区分的胸腺囊肿等其它胸腺疾病，其IL-8+初始T细胞无论术前术后均维持在较低状态。
上述结果表明，外周血IL-8阳性初始T细胞水平能够有效评估胸腺瘤患者手术治疗的疗效，并且如果存在复发情况，外周血IL-8阳性初始T细胞水平也能先于宏观的影像学将病情提示给临床医生。
实施例5、使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断可以大大降低胸腺瘤误诊率
本发明人进一步验证了临床联合诊断的可行性。以前述方法测定患者IL8+初始T细胞(共100例)，获得的ROC曲线如图3A～B。
以CT对患者进行诊断，CT准确率：AUC＝87.5，Sensitivity＝100％，Specificity＝75％(来自一次回顾性研究数据)。
将两种数据进行比较，外周血IL-8阳性T细胞辅助诊断的准确率远高于CT准确率。
上述数据说明，外周血IL-8阳性T细胞辅助胸腺瘤诊断有较高准确率，假阳性率和假阴性率都比单纯CT诊断要低，证明了外周血IL-8阳性T细胞辅助胸腺瘤和其它胸腺疾病诊断的可靠性。
实施例6、使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断能够有效校正影像学误诊本发明人获得了两例已知临床上CT误诊的代表性患者病例，对该些病例进行既往诊断数据的分析以及利用本发明方法的诊断。流式检测方法同实施例1。
一例胸腺瘤误诊为胸腺囊肿的病例如图4A，呈现了CT(上图)和IL8流式数据(下图)。
一例胸腺囊肿误诊为胸腺瘤的病例如图4BA，呈现了CT(上图)和IL8流式数据(下图)。
结果说明，在临床实践中，对于影像学上误诊的胸腺瘤，外周血IL8+初始T细胞辅助诊断能明显纠正影像学的误诊，提示临床医生重新考虑临床诊断以及相应的治疗方法，避免患者由于不当治疗造成的损害。
进一步地，本发明人进行临床诊断观察，对于前来诊断的患者，对一部分患者在CT诊断的同时利用本发明方法进行IL8+初始T细胞辅助诊断；而另一部分患者仅常规的CT诊断。
结果发现，使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断可以大大降低胸腺瘤误诊率，胸腺瘤病人使用IL-8辅助CT与单用CT诊断的误诊率对比如表3所示；胸腺囊肿病人使用IL-8辅助CT与单用CT诊断的误诊率对比如表4所示。
表3
| 误诊例数 | 正确诊断例数 | 误诊率 | |
| CT诊断 | 3 | 35 | 7.9％ |
| IL8辅助CT诊断 | 0 | 38 | 0％ |
表4
| 误诊例数 | 正确诊断例数 | 误诊率 | |
| CT诊断 | 8 | 27 | 22.9％ |
| IL8辅助CT诊断 | 1 | 34 | 2.8％ |
因此，使用IL8+初始T细胞辅助CT诊断可以大大降低胸腺囊肿误诊率。统计学数据同样表明，实际临床实践中，外周血IL8+初始T细胞辅助诊断能有效提高诊断准确率，是一种可靠的胸腺瘤及其它胸腺疾病诊断手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.IL-8阳性初始T细胞在制备对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂中的用途；其中，所述的IL-8阳性初始T细胞为外周血单个核细胞经过佛波醇酯和离子霉素刺激后以布雷菲德菌素A 抑制蛋白转运后获得的CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+的CD4+初始T细胞或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+的CD8+初始T细胞；
所述的胸腺占位性疾病为胸腺瘤或胸腺增生；
所述的分型为将胸腺瘤及胸腺增生与其它胸腺疾病区分，所述其它胸腺疾病为胸腺囊肿和胸腺鳞癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，以免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂来识别或检测IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂选自：特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235的抗体，特异性扩增IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的引物，或特异性识别IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的探针。
4. 特异性识别或检测IL-8阳性初始T细胞的物质在制备对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的IL-8阳性初始T细胞为外周血单个核细胞经过佛波醇酯和离子霉素刺激后以布雷菲德菌素A 抑制蛋白转运后获得的CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+的CD4+初始T细胞或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+的CD8+初始T细胞；
所述的胸腺占位性疾病为胸腺瘤或胸腺增生；
所述的分型为将胸腺瘤及胸腺增生与其它胸腺疾病区分，所述其它胸腺疾病为胸腺囊肿和胸腺鳞癌。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，以免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂来识别或检测IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述免疫检测试剂、原位杂交试剂、PCR检测试剂选自：特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235的抗体，特异性扩增IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的引物，或特异性识别IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的探针。
7.一种用于对胸腺占位性疾病进行诊断或分型的试剂盒，其中包括：
T细胞激活试剂佛波醇酯和离子霉素；
特异性识别或检测IL-8的物质；
布雷菲德菌素A；
特异性识别或检测CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31的物质；特异性识别或检测CD15和CD235的物质；
其中，所述的特异性识别的物质为：应用于免疫检测、原位杂交、PCR检测的试剂，选自：特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235的抗体，特异性扩增IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的引物，或特异性识别IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235基因的探针；
所述的胸腺占位性疾病为胸腺瘤或胸腺增生；
所述的分型为将胸腺瘤及胸腺增生与其它胸腺疾病区分，所述其它胸腺疾病为胸腺囊肿和胸腺鳞癌。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性识别的物质为特异性结合IL-8，CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD31，CD15和CD235的抗体，应用于流式细胞检测。
9.一种从细胞群中识别或区分IL-8阳性初始T细胞的方法，所述的IL-8阳性初始T细胞为CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+的CD4+初始T细胞或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+的CD8+初始T细胞，所述方法包括：
(1) 从外周血单个核细胞中获得初始T细胞，以佛波醇酯和离子霉素刺激后以布雷菲德菌素A 抑制蛋白转运，获得CD15-CD235-CD3+CD8-CD45RA+CCR7+的CD4+初始T细胞或CD15-CD235-CD3+CD8+CD45RA+CCR7+的CD8+初始T细胞；
(2) 从(1)获得的初始T细胞中区分IL-8阳性初始T细胞。
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| WO2018187332A1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Kite Pharma, Inc. | Treatment using chimeric receptor t cells incorporating optimized polyfunctional t cells |
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