KR101936502B1 - 간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 그의 용도 - Google Patents

간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간암 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 바이오 마커는 특이성과 민감도가 향상된 간암 진단 및 예후 측정용 마커로 이용될 수 있으며, 이를 통해 높은 정확성과 신뢰도로 간암을 진단하거나 그 예후를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 간암 치료제를 효과적으로 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

Description

간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 그의 용도{Biomarkers for diagnosis and prognosis of Hepatoma and uses thereof}
본 발명은 간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 바이오 마커를 이용한 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 간암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법, 바이오 마커 검출 방법, 간암 치료제의 스크리닝 방법 및 간암 치료용 조성물에 관한 것이다.
간암은 전세계적으로 흔하면서도 치명적인 인간 종양의 하나로, 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암(간세포암; hepatocellular carcinoma, HCC)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 크게 구분될 수 있다. 흔히 간암이라 함은 원발성 간암을 지칭하는데, 원발성 간암은 암이 상당히 진행된 이후에 그 증상이 나타나므로 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 빈번히 발생한다. 암은 그 예후에 따라 적절한 치료방법이 적용되어야만 효율적인 치료가 가능하나, 이미 진행되어 버린 간암은 그 예후가 극히 불량하여 높은 치사율을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 간암 환자의 예후를 정확히 예측할 수 있는 진단방법이 절실히 요구됨에도 아직까지 이를 정확히 예측하는 것에는 한계가 있다. 특히 예후의 정확한 예측을 위해서는 환자들을 위험군별로 분류하는 분석방법이 필요한데, 아직까지는 병리임상학적인 간암의 단계와 1차적 외과 치료에만 의존하여 예후를 판단하고 있는 실정이다.
이에 따라 최근 암 진단의 정확성을 높이고 효과적인 치료방법을 적용하기 위해 유전자 분석을 활용하려는 시도가 증가하고 있다. 즉 환자로부터 얻은 혈액 등의 시료로부터 특정 암 관련 유전자를 검출하거나 그 발현정도를 측정하여 암의 진단이나 치료에 활용하는 방법이다. 예컨대 대한민국 공개특허 제10-2010-0115283호는 CBS, NNMT, TKT 등의 유전자를 간암 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커로 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2014-0115490호는 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 간암 진단 또는 예후 측정용 간암 바이오마커를 개시하고 있다. 그러나 암 세포의 복잡성과 다양성 등으로 인해 일부 진단용 바이오 마커만으로 간암의 예후를 정확히 예측하는 것에는 한계가 있다. 따라서 특이성과 민감도가 향상된 바이오 마커의 지속적인 개발과 함께 여러 마커를 조합하여 진단의 정확성을 향상시킴으로써 개별검사의 한계를 극복할 필요가 있다.
1. 대한민국 등록특허 10-0823120 2. 대한민국 등록특허 10-0877554
1. Tony Gutschner et al, HEPATOLOGY, Vol. 59, No. 5, 2014
본 발명의 목적은 특이성과 민감도가 향상된 바이오마커를 이용한 간암 진단 및 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용하여 간암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공방법 및 바이오 마커 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 바이오마커의 억제제를 이용한 간암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간암 진단 및 예후 예측용 바이오 마커로서 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자 바이오 마커를 제공한다.
HELZ (Helicase With Zinc Finger, 서열번호 1(아미노산 서열) 및 서열번호 2(염기서열))는 RNA 헬리카아제(helicases)의 슈퍼패밀리 I 클래스 멤버이다. RNA 헬리카아제는 RNA의 이중가닥 영역을 풀어 구조(conformation) 변화를 일으킴으로써, RNA 분자의 생물학적 활성을 변화시키고 다른 단백질에의 접근을 조절하는 것으로 알려져 있다(Wagner et al., 1999 [PubMed 10471385]).
IMP-1 (IGF2BP1; insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1, 서열번호 3(아미노산 서열) 및 서열번호 4(염기서열)) 유전자는 인슐린-유사 성장인자 2 mRNA-결합 단백질 패밀리(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein family)의 멤버를 암호화한다. 이 단백질은 4개의 K 상동(homology) 도메인과 2개의 RNA 인식 모티프를 포함하며, 인슐린-유사 성장인자 2, 베타-액틴 및 베타-트랜스듀신 반복-포함 단백질과 같은 특정 유전자의 mRNA에 결합하여 기능하고, 이들의 번역을 조절한다. 이 유전자에 대해서는 두 개의 서로 다른 동형단백질(isoform)을 암호화하는 전사 변이체가 발견되었다.
NONO (non-POU domain containing, octamer-binding, 서열번호 5(아미노산 서열) 및 서열번호 6(염기서열)) 유전자는 핵에서 전사조절과 RNA 스플라이싱을 포함한 여러 기능을 수행하는 RNA-결합 단백질을 암호화한다.
RALY (RALY heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, 서열번호 7(아미노산 서열) 및 서열번호 8(염기서열)) 유전자는 hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) 유전자 패밀리의 멤버를 암호화한다. 이 단백질은 pre-mRNA 스플라이싱과 배 발달(embryonic development)에 관여하는 것으로 알려져 있다.
RBM42 (RNA binding motif protein 42, 서열번호 9(아미노산 서열) 및 서열번호 10(염기서열)) 유전자는 hnRNP K (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)-결합 단백질과 이의 표적 mRNA 중 하나인 p21 mRNA의 3-비번역부위(UTR)에 결합하는 것으로 알려져 있다. hnRNP K는 크로마틴 리모델링, 전사, RNA 스플라이싱, mRNA 안정성 및 번역을 포함한 여러 유전자 발현 프로세스에 관여하는 보존적인 RNA-결합 단백질이다(Fukuda T1, Naiki T, Saito M, Irie K. Genes Cells. 2009 Feb;14(2):113-28. doi: 10.1111/j.1365-2443.2008.01256.x. Epub 2008 Jan 6.).
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 상기 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단 및 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA, 상기 유전자가 암호화하는 단백질, 또는 양자 모두의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출하는 물질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 그에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 및 그에 상보적인 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 앱타머 및 안티센스 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 상보적인 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 코딩되는 폴리펩타이드 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 항체단편, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 및 펩티도모방체(peptidomimetics) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 바이오마커 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자가 전사하는 mRNA의 결합체의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출하는 물질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법으로 유전자 발현을 측정하는 검출시약일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커 유전자를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진단 및 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자를 검출하는 물질은, 상기 유전자의 핵산서열, 이의 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열들의 단편, 또는 상기 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 대상체로부터 얻은 시료로부터, HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 방법은 상기 유전자의 발현 수준이 기준치 보다 높은 경우 간암의 발병가능성이 높거나 또는 예후가 좋지 않을 가능성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 또는 단백질 마이크로어레이 이용법 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 바이오마커 유전자들을 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 HELZ 유전자는 서열번호 11의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 12의 역방향 프라이머(reverse primer)를, 상기 IMP-1 유전자는 서열번호 13의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 14의 역방향 프라이머(reverse primer)를, 상기 NONO 유전자는 서열번호 15의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 16의 역방향 프라이머(reverse primer)를, 상기 RALY 유전자는 서열번호 17의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 18의 역방향 프라이머(reverse primer)를, 상기 RBM42 유전자는 서열번호 19의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 20의 역방향 프라이머(reverse primer)를 각각 사용하여 증폭시킬 수 있다. 따라서 상기 프라이머 세트는 간암 진단 및 예후 예측용 프라이머 세트로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 인간의 생물학적 시료에 존재하는 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준 측정은 상술한 측정 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현되는 세포 또는 실험동물에 대상물질을 처리하는 단계; 및 상기 유전자의 발현수준을 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 대상물질 처리에 의해 상기 유전자의 발현이 억제되는 경우 대상물질을 간암 치료제 후보군으로 판정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준 측정은 상술한 측정 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명은 상기 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 억제제를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 억제제는 siRNA 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 21 내지 서열번호 25로 표시되는 siRNA들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 서열번호 21 내지 서열번호 25으로 표시되는 siRNA들은 각각 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자를 표적으로 한다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 항체는 상기 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법(Benny K. C. Lo ed., Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Humana Press (2004))에 의해 직접 제조할 수 있다.
본 발명의 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자는 간암이 진행됨에 따라 그 발현이 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 유전자들은 조합에 따라 특이성과 민감도가 향상된 간암 진단 및 예후 측정용 마커로 이용될 수 있으며, 이를 통해 높은 정확성과 신뢰도로 간암을 진단하거나 그 예후를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 간암 치료제를 효과적으로 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
도 1은 RNA 염기서열 결정법을 이용하여 인간 암 조직과 정상조직에 대해 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 인간의 정상조직과 암 조직에서의 NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA의 발현양상을 확인한 결과이다.
도 3은 인간의 정상조직과 암 조직에서 NONO 단백질과 RALY 단백질의 발현양상을 확인한 결과이다.
도 4는 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA의 발현차이에 따른 암 환자 군의 생존율을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 비교 분석한 결과이다.
도 5는 초기 암발생 능력과 밀접한 관련이 있는 콜로니 형성실험을 통하여 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 가 세포에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 siRNA 각각을 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 저하된 세포 활성도를 나타낸 결과이다.
도 7은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 siRNA 각각을 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 저하된 세포 성장을 나타낸 결과이다.
도 8은 간암 환자의 혈청에서 RBM42, NONO, RALY의 단백질 발현의 증가를 나타낸 결과이다.
본 발명은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자의 간암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 간암을 신속하고 정확하게 진단하고 예후를 예측할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 연구한 결과, 본 발명의 바이오마커들이 간암을 조기 진단하고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 용어 "간암 (liver cancer)"이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로 부터 간암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 간암의 "예후"는 다양한 관점에서 추정될 수 있지만, 대표적으로 재발가능성, 생존가능성, 무병생존가능성의 관점에서 판단된다.
본 발명에서 용어 "마커"란 간암이 발생한 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 판정할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 간암 진단 (바이오)마커는 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자의 뉴클레오타이드(그의 단편 포함) 또는 그에 코딩되는 단백질(그의 단편 포함)로서, 간암 세포에서 발현이 증가하는 유전자이다. 이러한 마커들은 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 어느 하나의 단백질을 사용할 수 있으며, 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'(또는 단백질)는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 더욱 바람직하다. 또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1개 이상 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 베타-아디페이트 경로와 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 더욱 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 '폴리뉴클레오타이드' (또는 뉴클레오타이드, 핵산)는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 간암 진단 또는 예후 추정의 바이오 마커 기능을 하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 길이가 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.
본 발명은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물은 상기 각 유전자의 발현을 측정하는 물질을 각각 포함하거나, 또는 상기 두 유전자의 발현을 동시에 측정하는 물질일 수 있다.
본 발명에서 발현 측정(또는 검출)이란 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA, 상기 유전자가 암호화하는 단백질, 또는 양자 모두의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출하는 물질일 수 있다. 본 발명은 상기 유전자를 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서 정량적 및/또는 정성적 검출을 통해 간세포암의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 그에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 및 그에 상보적인 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 앱타머 및 안티센스 중 어느 하나 이상일 수 있다.
일례로, 상기 유전자의 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위하여, 상기 유전자의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. 프라이머 또는 프로브는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 유전자 발현 측정 물질은 신호검출을 위해 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일례로, mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 본 발명의 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자가 전사하는 전령 RNA(mRNA)의 결합체의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출하는 물질일 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 당해 분야에서 공지된 다양한 유전자(바이오 마커) 검출 방법에 사용되는 물질을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법으로 유전자 발현을 측정하는 검출시약일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 당해 분야에서 공지된 다양한 핵산 및/또는 단백질에 대한 정량 및/또는 정성 분석 방법을 사용하여 해당 유전자의 발현을 측정한다. 일례로, RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로 어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있다.
본 발명은 상기 본 발명의 유전자들을 검출할 수 있는 물질을 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측용 키트(또는 시스템)를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 당해 분야에서 공지된 다양한 키트를 사용할 수 있는데, 일례로 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계; 상기 대상 생물학적 시료로부터 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 기준치와 대비하는 단계를 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로, 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로(in vitro)에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 간암 바이오마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 간암이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 생물체에서 수득한 간조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 간암 진단 또는 예후 예측 방법에서의 유전자의 발현 수준 측정은 상술한 바와 같은 공지된 다양한 핵산 및/또는 단백질에 대한 정량 및/또는 정성 측정 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 간암 진단 또는 예후 예측 방법에서 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 대조군에 대한 측정 결과와 대비하여 간암을 진단하고 예후를 예측한다. 대조군 또는 참조군으로는 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 간세포암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 양성대조군으로 본원에 따른 마커 이외에 방법으로 간세포암으로 판정된 환자 유래의 시료, 간경화 환자 유래의 시료, 간염 유래 환자의 시료일 수 있다. 일례로, 정상인 유래의 시료, 간암 판정 환자에서 채취한 정상 조직 시료, 간세포암으로 판정후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용된다. 일례로, 본 발명에 따른 간암 바이오 마커 유전자는 정상 세포 및 조직에 비하여 간암 세포 및 조직에서 발현이 증가하였다.
대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교를 참조할 수 있다. 본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 일례로 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 간암 진단 및 예후 추정 방법의 유의성을 확인하기 위하여, 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용될 수 있다. 또한, 통계처리를 통해 HCC로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다. 이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상 적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.
본 발명에 따른 간암 진단 및 예후 추정 방법은 간암의 심각성 정도를 판단하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 양성대조군 및 음성대조군의 프로파일과 비교하여, 경증, 중간 정도 또는 중증으로 평가될 수 있다. 나아가 일정한 간암 집단에 대한 마커 프로파일 분석을 수행하여, 프로파일 결과를 근거로 일정 기준에 따라 분류할 수 있다.
본 발명에 따른 간암 진단 및 예후 추정 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 간암의 상태와 연관지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, HCC 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 바이오 마커의 변화를 근거로 간암 진행을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다. 나아가 간암 확진을 위해, 기존의 간암 진단 방법인 AFP 테스트, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography(CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 간암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 생물학적 시료에 있는 상기 본 발명의 유전자들의 발현 수준을 측정하는 단계를 통해 간암 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 간암 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커를 검출하는 방법에서의 유전자의 발현 수준 측정은 당해 분야에서 공지된 다양한 핵산 및 단백질에 대한 정량 및 정성 측정 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 시험 대상 화합물에서 본 발명의 바이오마커 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 간암 치료제의 스크리닝 방법에서의 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부 확인은 상술한 바와 같은 공지된 다양한 핵산 및/또는 단백질에 대한 정량 및/또는 정성 측정 방법을 사용할 수 있다.
상기 시험 대상 화합물은 본원에 따른 마커 유전자의 발현을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 다른 양태로서, HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 억제제를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 억제제는 siRNA인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
siRNA를 상기 유전자 억제제로 사용할 경우 siRNA의 전달을 위해 공지되어 있는 적절한 약물전달시스템을 사용할 수 있다. 예컨대, siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는, 바이러스성 벡터(레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 등), 비-바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 마이셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등과 같은 핵산 전달체를 사용할 수 있다.
본 발명의 간암 예방 또는 치료용 조성물에 사용되는 제형은 당업계에 공지되어 있는 것을 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 일례에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 이온 교환 수지, 레시틴, 혈청 단백질, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 물, 염 또는 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 siRNA 또는 약학적 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 치료적 유효량은 질환의 종류, 증상의 정도, 투여되는 siRNA의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 병용투여제 등의 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실험방법
1. 조직 준비
본 실험에 이용된 조직은 가톨릭 연구조직은행에서 구입하여 실험에 이용하였다. 총 24쌍의 환자로부터 정상 간 조직 세포와 간암세포를 구입하여 실험에 이용하였다. 인체조직 사용의 모든 규정은 가톨릭대학교 기관윤리 위원회의 규정을 준수하여 실험을 진행하였다.
2. 세포 배양
실험에 이용된 모든 세포주의 배양에는 10%의 소혈청이 포함된 DMEM 배양액을 사용하였다. 37℃ 가 유지되는 향온배양기 내에서 5% CO2 농도를 유지시킨 환경에서 세포주를 배양하였다. 외부유전체의 세포 내 주입 시에는 35-mm2 배양접시를 이용하여 실시하였으며 미토콘드리아 기능 분석관련 실험은 96 well 배양접시를 이용하여 실시하였다. 그 외의 모든 상황에서는 100-mm2 배양접시를 이용하여 세포주를 배양 및 유지 하였다.
3. 외부 유전체 전달자 제작
총 6가지 siRNA 형태의 외부유전체가 세포 내 주입법을 통하여 실험에 이용되었다. 6가지 siRNA의 경우 Genolution사의 제품을 구입하여 이용하였다. 각각의 표적 유전자에 대한 siRNA 서열은 다음과 같다.
- HELZ : GCAGUUGAUCCUCGAAUUA (서열번호 21)
- IMP-1 : CCGGGAGCAGACCAGGCAA(dTdT) (서열번호 22)
- NONO : GGUGCAUUCCUGAAGUCUCUAAUGU (서열번호 23)
- RALY : UAACGUACCUGUCAAGCUC (서열번호 24)
- RBM42 : GCAAUGAGGUGAACGAUGAUU (서열번호 25)
4. 외부 유전체의 세포 내 주입
실험에 이용된 모든 외부 유전체의 주입에는 Invitrogen 사에서 나온 리포펙타민 2000을 이용하여 진행하였다. 각각의 외부유전체를 실험에 따라 일정량을 제조사의 매뉴얼대로 리포펙타민2000으로 처리한 후 세포배양액에 혼합하는 방법을 통하여 외부 유전체를 세포 내로 주입하였다.
5. 세포 및 조직 내 유전자 발현 변화 분석
구입한 조직 및 실험에 이용된 세포의 유전자 발현 및 변화양상의 분석을 위하여 Invitrogen 사의 트라이졸 용액을 이용하였다. 조직분쇄 및 세포포집 후 트라이졸 용액을 처리하여 mRNA를 수득한 후 Toyobo사의 cDNA 합성 Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 real-time quantitative PCR 방법을 통해 실험군 및 대조군의 유전자 발현 및 변화양상을 정량화 하였다.
유전자 발현 검증을 위해 사용한 프라이머 서열은 아래 표 1과 같다.
유전자명 프라이머 서열
HELZ F AGAGCTGAAAAGTCATGTGAACA (서열번호 11)
R ACTCTCGATTTTGATGCGTTCT (서열번호 12)
IMP-1 F GCGGCCAGTTCTTGGTCAA (서열번호 13)
R TTGGGCACCGAATGTTCAATC (서열번호 14)
NONO F CTAGCGGAGATTGCCAAAGTG (서열번호 15)
R GTTCGTTGGACACATACTGAGG (서열번호 16)
RALY F GTCCGGCGTGTCAAAACTAAC (서열번호 17)
R TTTGCTCCGCAGCGATCTG (서열번호 18)
RBM42 F CCTGTGATCCGCCCAATTATC (서열번호 19)
R CATGGGAGGAACTACTGTGGC (서열번호 20)
6. 세포 내 단백질 발현 변화 분석
표집된 세포를 RIPA용액을 이용하여 세포내의 단백질을 수득한 후 동일한 양의 전체 단백질을 SDS-PAGE 젤 내에서 전기영동을 통하여 크기에 따라 분리하였다. 분리된 단백질 중 확인하고자 하는 특정사이즈 부분을 PVDF 막으로 옮긴 후 해당 단백질의 항체를 PVDF 막에 붙였다. 특정단백질을 발현 정도를 정량화 할 수 있는 2차 항체를 처리한 후 X-ray 필름에 특정 단백질에서 조사되는 빛을 기록하여 관찰하고자 하는 단백질의 발현 변화를 정량적으로 분석하였다.
7. 세포 활성도 분석
후보 단백질로 선정된 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42가 암세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 통하여 대조군과 실험군의 세포활성도를 측정하였다. 대조군과 실험군 세포를 동일한 양으로 96-well 배양접시에 접종 후 각각 2일간 배양 후와 3일간 배양 후 세포 활성도를 측정하여 정량화 하였다.
8. 세포 성장능 분석
HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42가 암세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 시간별 세포 총계를 측정하는 방법을 통하여 대조군과 실험군의 세포 성장능을 측정하였다. 대조군과 실험군 세포를 동일한 양으로 6-well 배양접시에 접종 후 각각 2일간 배양 후와 3일간 배양 후 세포 총계를 측정하여 정량화 하였다.
9. 세포의 콜로니 형성능 분석
암세포주의 초기 암발생 능력 정도를 측정할 수 있는 콜로니 형성능 분석을 통하여 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 가 세포주의 초기 암발생 능력에 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다. 대조군과 실험군을 각각 6-well 배양접시에 세포를 100개씩 접종한 후 3주간 배양을 하였다. 배양접시에 콜로니 형성을 확인 후 크리스탈 바이올렛 염색을 통하여 콜로니 개수를 정량화 하였다.
10. 인간 간암 병변에 따른 유전자 발현 변화 분석
TNM(Tumor-Node-Metastasis)분류법을 통해 병변에 따라 분류된 인간 간암 조직을 RNA 염기서열 결정법을 이용하여 유전자 발현 및 변화양상을 분석한 자료를 통해 인간 간암의 병기별 유전자 발현 변화를 분석하였다. 자료에서 측정된 병기별 유전자 발현 정도를 수치화 한 값을 통계처리 하여 유전자 발현 및 변화양상을 분석하였다.
11. 유전자 발현 변화에 따른 생존율 변화 분석
다양한 인간 암 환자 군에서 유전자 발현 및 변화양상의 차이를 분석한 자료를 통해 유전자 발현 및 변화에 따른 다양한 인간 암 환자 군의 생존율 변화를 분석하였다. 자료에서 측정된 유전자 발현 정도에 따른 생존일을 통계처리 하여 유전자 발현의 차이에 따른 생존율 변화를 분석하였다.
12. 혈청 준비 및 혈청 내 단백질 발현 변화 분석
본 실험에 이용된 혈청은 한국인체자원은행네트워크 전북대학교병원 인체자원은행과 경상대학교병원 인체자원은행을 통하여 분양받아 실험에 이용하였다. 총 100명의 환자와 20명의 대조군으로부터 간암 환자의 혈청과 정상 혈청을 분양받아 실험에 이용하였다. 인체조직 사용의 모든 규정은 가톨릭대학교 기관윤리 위원회의 규정을 준수하여 실험을 진행하였다.
분양받은 혈청에서의 단백질 발현 및 변화양상의 분석을 위하여 점블럿법(Dot-blotting)을 이용하였다. 분양받은 혈청 45μl를 이용하여 Merk Millipore사의 PVDF(poly-vinyl difluoride) 막에 고정시켜 특정 단백질의 항체로 발현을 검출하는 방법이다. 이를 통해 실험군 및 대조군의 관련 단백질의 발현 및 변화양상을 정량화 하였다.
실험결과
1. 암 조직에서 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현의 증가 확인
암 발병에 있어서 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA의 발현양상이 어떠한 차이를 보이는지 확인하기 위하여 인간 암 조직과 정상조직을 이용해 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현을 RNA 염기서열 결정법을 통해 확인하였다.
그 결과, 암 조직에서의 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현이 증가됨을 확인한 그래프이며(도 1A), 정상대비 암 조직에서 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현이 증가됨을 확인한 그래프이다(도 1B). 이를 통해 암이 진행됨에 따라 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA의 발현이 증가하는 것을 알 수 있다.
2. 암에서의 NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현의 증가 확인
NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA가 체내에서 암이 발병됨에 따라 어떠한 발현 차이를 보이는지 확인하기 위하여 인간의 정상조직과 암 조직에서의 NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현양상을 확인한 결과이다(도 2). 그 결과 정상조직 대비 암 조직에서 NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
3. 암에서의 NONO 단백질과 RALY 단백질 발현의 증가 확인
NONO 단백질과 RALY 단백질이 체내에서 암이 발병됨에 따라 어떠한 발현 차이를 보이는지 확인하기 위하여 인간의 정상조직과 암 조직에서의 NONO 단백질과 RALY 단백질 발현양상을 확인한 결과이다(도 3). 그 결과 정상조직 대비 암 조직에서 NONO 단백질과 RALY 단백질 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
4. HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현 차이에 따른 생존율의 증가 확인
암 환자 군에서 생존율에 따른 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현차이를 확인하기 위하여 컴퓨터 프로그램을 통해 HELZ mRNA, IMP-1 mRNA, NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA 발현차이에 따른 암 환자 군의 생존율을 비교 분석한 결과이다(도 4). 그 결과 NONO mRNA, RALY mRNA, RBM42 mRNA의 발현이 저하되어 있는 환자의 생존율이 더 증가 되어 있음을 확인할 수 있었다.
5. HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 의 발현 저하에 따른 콜로니 형성능 변화
초기 암발생 능력과 밀접한 관련이 있는 콜로니 형성실험을 통하여 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 가 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과이다(도 5). 그 결과 각각의 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 siRNA를 처리한 실험군에서 콜로니 형성이 저하되는 것을 확인하였다.
6. HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 의 발현 저하에 따른 세포활성도 변화
각각의 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 siRNA를 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 저하된 세포 활성도를 나타낸 것이다(도 6). 이를 통해 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 가 세포의 활성도를 증가시키는 것을 확인하였다.
7. HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 의 발현 저하에 따른 세포성장능 변화
각각의 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 siRNA를 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 저하된 세포 성장을 나타낸 것이다(도 7). 이를 통해 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42 가 세포의 성장능을 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 토대로, 본 발명자들은 HELZ, IMP-1, NONO, RALY, RBM42의 발현정도 분석을 통해 간암의 발병여부 및 중증도 등을 사전에 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
8. 간암 환자의 혈청에서 RBM42, NONO, RALY 단백질 발현의 분석
간암 환자의 혈청에서 RBM42, NONO, RALY 단백질의 발현양상이 어떠한 차이를 보이는지 확인하기 위하여 점블럿법을 통해 분석한 결과이다. RBM42, NONO, RALY 단백질들을 표적으로 하는 각각 RBM42, NONO, RALY 항체를 이용하였다. 이때 실험에 이용된 혈청은 한 사람당 45μl가 사용 되었으며 항체는 다음과 같다. RBM42는 BETHYL 사의 1mg/ml 농도의 항체를, NONO 항체와 RALY 항체는 모두 Abcam 사의 항체를 사용하였고 사용시 농도는 1:1000 비율로 사용하였다. 이를 통해 간암 환자의 혈청에서 RBM42, NONO, RALY 단백질들의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 구체적으로 총 100명의 간암환자 및 20명의 정상인 혈청을 위와 같은 조건으로 분석한 결과, RBM42 단백질은 20개의 정상인 혈청에서는 검출되지 않았으나 간암 환자 혈청의 경우 100개 중 32개에서 검출되었다. 또한, NONO 단백질은 20개의 정상인 혈청 중 2개에서, 100개의 간암 환자 혈청 중 54개에서 검출되었고, RALY 단백질은 16개의 정상인 혈청 중 2개에서, 80개의 간암 환자 혈청 중 24개에서 검출되었다(도 8).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers for diagnosis and prognosis of Hepatoma and uses thereof <130> PN1703-128 <150> KR 10-2016-0066377 <151> 2016-05-30 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1942 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HELZ(Helicase With Zinc Finger) <400> 1 Met Glu Asp Arg Arg Ala Glu Lys Ser Cys Glu Gln Ala Cys Glu Ser 1 5 10 15 Leu Lys Arg Gln Asp Tyr Glu Met Ala Leu Lys His Cys Thr Glu Ala 20 25 30 Leu Leu Ser Leu Gly Gln Tyr Ser Met Ala Asp Phe Thr Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Leu Glu Ile Glu Arg Ile Lys Ile Glu Ser Leu Leu Tyr Arg Ile 50 55 60 Ala Ser Phe Leu Gln Leu Lys Asn Tyr Val Gln Ala Asp Glu Asp Cys 65 70 75 80 Arg His Val Leu Gly Glu Gly Leu Ala Lys Gly Glu Asp Ala Phe Arg 85 90 95 Ala Val Leu Cys Cys Met Gln Leu Lys Gly Lys Leu Gln Pro Val Ser 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Lys Ser Leu Thr Gly Glu Ser Leu Asn Gly Met Val 115 120 125 Thr Lys Asp Leu Thr Arg Leu Lys Thr Leu Leu Ser Glu Thr Glu Thr 130 135 140 Ala Thr Ser Asn Ala Leu Ser Gly Tyr His Val Glu Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Asn Gly Trp His Phe Arg Pro Pro Pro Arg Gly Ile Thr 165 170 175 Ser Ser Glu Glu Tyr Thr Leu Cys Lys Arg Phe Leu Glu Gln Gly Ile 180 185 190 Cys Arg Tyr Gly Ala Gln Cys Thr Ser Ala His Ser Gln Glu Glu Leu 195 200 205 Ala Glu Trp Gln Lys Arg Tyr Ala Ser Arg Leu Ile Lys Leu Lys Gln 210 215 220 Gln Asn Glu Asn Lys Gln Leu Ser Gly Ser Tyr Met Glu Thr Leu Ile 225 230 235 240 Glu Lys Trp Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Lys Val Leu Ser Glu Cys 245 250 255 Ile Glu Gly Val Lys Val Glu His Asn Pro Asp Leu Ser Val Thr Val 260 265 270 Ser Thr Lys Lys Ser His Gln Thr Trp Thr Phe Ala Leu Thr Cys Lys 275 280 285 Pro Ala Arg Met Leu Tyr Arg Val Ala Leu Leu Tyr Asp Ala His Arg 290 295 300 Pro His Phe Ser Ile Ile Ala Ile Ser Ala Gly Asp Ser Thr Thr Gln 305 310 315 320 Val Ser Gln Glu Val Pro Glu Asn Cys Gln Glu Trp Ile Gly Gly Lys 325 330 335 Met Ala Gln Asn Gly Leu Asp His Tyr Val Tyr Lys Val Gly Ile Ala 340 345 350 Phe Asn Thr Glu Ile Phe Gly Thr Phe Arg Gln Thr Ile Val Phe Asp 355 360 365 Phe Gly Leu Glu Pro Val Leu Met Gln Arg Val Met Ile Asp Ala Ala 370 375 380 Ser Thr Glu Asp Leu Glu Tyr Leu Met His Ala Lys Gln Gln Leu Val 385 390 395 400 Thr Thr Ala Lys Arg Trp Asp Ser Ser Ser Lys Thr Ile Ile Asp Phe 405 410 415 Glu Pro Asn Glu Thr Thr Asp Leu Glu Lys Ser Leu Leu Ile Arg Tyr 420 425 430 Gln Ile Pro Leu Ser Ala Asp Gln Leu Phe Thr Gln Ser Val Leu Asp 435 440 445 Lys Ser Leu Thr Lys Ser Asn Tyr Gln Ser Arg Leu His Asp Leu Leu 450 455 460 Tyr Ile Glu Glu Ile Ala Gln Tyr Lys Glu Ile Ser Lys Phe Asn Leu 465 470 475 480 Lys Val Gln Leu Gln Ile Leu Ala Ser Phe Met Leu Thr Gly Val Ser 485 490 495 Gly Gly Ala Lys Tyr Ala Gln Asn Gly Gln Leu Phe Gly Arg Phe Lys 500 505 510 Leu Thr Glu Thr Leu Ser Glu Asp Thr Leu Ala Gly Arg Leu Val Met 515 520 525 Thr Lys Val Asn Ala Val Tyr Leu Leu Pro Val Pro Lys Gln Lys Leu 530 535 540 Val Gln Thr Gln Gly Thr Lys Glu Lys Val Tyr Glu Ala Thr Ile Glu 545 550 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1375 His Thr Leu Leu Asn Gln Gln Gln Asn Asn Leu Pro Glu Gln Pro Asn 1380 1385 1390 Gln Ile Pro Pro Gln Pro Asn Gln Val Val Gln Gln Gln Ser Gln Leu 1395 1400 1405 Asn Gln Gln Pro Gln Gln Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Ala Tyr Gln 1410 1415 1420 Ala Gly Pro Asn Asn Ala Phe Phe Asn Ser Ala Val Ala His Arg Pro 1425 1430 1435 1440 Gln Ser Pro Pro Ala Glu Ala Val Ile Pro Glu Gln Gln Pro Pro Pro 1445 1450 1455 Met Leu Gln Glu Gly His Ser Pro Leu Arg Ala Ile Ala Gln Pro Gly 1460 1465 1470 Pro Ile Leu Pro Ser His Leu Asn Ser Phe Ile Asp Glu Asn Pro Ser 1475 1480 1485 Gly Leu Pro Ile Gly Glu Ala Leu Asp Arg Ile His Gly Ser Val Ala 1490 1495 1500 Leu Glu Thr Leu Arg Gln Gln Gln Ala Arg Phe Gln Gln Trp Ser Glu 1505 1510 1515 1520 His His Ala Phe Leu Ser Gln Gly Ser Val Pro Tyr Pro His His His 1525 1530 1535 His Pro His Leu Gln His Leu Pro Gln Pro Pro Leu Gly Leu His Gln 1540 1545 1550 Pro Pro Val Arg Ala Asp Trp Lys Leu Thr Ser Ser Ala Glu Asp Glu 1555 1560 1565 Val Glu Thr Thr Tyr Ser Arg Phe Gln 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gacgtcatcc tcgggagccc acccggacga 60 agggggagag tagacagcag aaccagcggc ggcggctaag cagagactgt agtagcggcg 120 acagcgacga cggcagcgat ggctggggcg gggccagccc cgggactccc gggtgcagga 180 ggacccgtgg tcccgggtcc tggcgctggc atcccgggca aaagcggcga ggaacgcttg 240 aaggaaatgg aggcggagat ggccctgttt gagcaggaag ttctgggggc tccagtacct 300 ggaatcccaa ctgctgtgcc tgcggtgccc actgtcccca cggtccccac agtagaagcg 360 atgcaggtcc cagcggctcc tgtgatccgc ccaattatcg cgaccaacac ataccagcag 420 gtccagcaga ctctggaggc ccgagcagct gctgcagcca cagtagttcc tcccatggtg 480 ggtggccctc cttttgtagg ccctgttggc tttggccctg gtgatcggag tcacctggac 540 agcccagagg ctcgagaagc catgttcctg cggcgggcag ctgtggcccc ccagagggcc 600 cctatcctgc gtccagcctt cgtcccccac gtgctacaga gagcagattc cgctctctcc 660 tctgcagcag ccggcccccg ccctatggcc ctacggcccc ctcaccaggc cctcgtgggc 720 ccccctctgc ctgggccccc tggaccaccc atgatgctgc caccaatggc tcgggctcca 780 gggcccccgc tgggctccat ggctgcactg aggccccctc tggaagagcc agcagcaccc 840 cgagagctgg gcctaggcct ggggttgggc ctgaaagaga aggaagaggc agtggtggcg 900 gcggcggctg ggctggagga ggctagcgcg gctgtggccg tgggggcagg aggtgcccca 960 gctggccctg cagtcattgg gcccagcctg ccgctggccc tggccatgcc attgcccgag 1020 cctgagcccc tgcccctccc gttggaggtc gtccgcggcc tcctgccccc gctgcgcatt 1080 cctgaactcc tgtccctgcg tcctcggccc cggccccctc ggccagagcc acccccaggc 1140 ctcatggctc ttgaggtccc agagcccctg ggtgaagaca agaagaaggg gaagccagag 1200 aaattgaaac ggtgcattcg cacagcggca gggagcagct gggaggaccc cagcctgctg 1260 gagtgggatg cagatgactt ccggatcttc tgtggggatc tgggcaatga ggtgaacgat 1320 gacatcttgg cacgcgcctt cagccgcttc ccatccttcc ttaaggccaa ggtgatccgt 1380 gacaagcgca caggcaagac caagggctac ggcttcgtca gcttcaagga ccccagcgac 1440 tacgtgcgcg ccatgcgtga gatgaatggg aagtatgtgg gctcgcgccc catcaagctt 1500 cgcaagagca tgtggaagga ccggaatctg gacgtggtcc gcaagaagca gaaggaaaag 1560 aagaagctgg gcctgagata gggtctgtgg ccaggcaccc gctcccacct ggccgggcgc 1620 tggctcctcc ctcagttctc tttggaaaac ccccagctgt ccacccatcc cctgccccaa 1680 aaccagtttc aataaattta cgttcatttc cacaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1731 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HELZ primer forward <400> 11 agagctgaaa agtcatgtga aca 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HELZ primer reverse <400> 12 actctcgatt ttgatgcgtt ct 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 primer forward <400> 13 gcggccagtt cttggtcaa 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 primer reverse <400> 14 ttgggcaccg aatgttcaat c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NONO primer forward <400> 15 ctagcggaga ttgccaaagt g 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NONO primer reverse <400> 16 gttcgttgga cacatactga gg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RALY primer forward <400> 17 gtccggcgtg tcaaaactaa c 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RALY primer reverse <400> 18 tttgctccgc agcgatctg 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM42 primer forward <400> 19 cctgtgatcc gcccaattat c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM42 primer reverse <400> 20 catgggagga actactgtgg c 21 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HELZ siRNA <400> 21 gcaguugauc cucgaauua 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 siRNA <400> 22 ccgggagcag accaggcaa 19 <210> 23 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NONO siRNA <400> 23 ggugcauucc ugaagucucu aaugu 25 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RALY siRNA <400> 24 uaacguaccu gucaagcuc 19 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM42 siRNA <400> 25 gcaaugaggu gaacgaugau u 21

Claims (14)

  1. 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 HELZ (Helicase With Zinc Finger) 유전자 증폭용 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 IMP-1 (Insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 NONO (Non-POU Domain Containing) 유전자 증폭용 프라이머 세트;
    서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 RALY (RALY heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및
    서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 RBM42 (RNA binding motif protein 42) 유전자 증폭용 프라이머 세트;를 포함하는 간암의 진단 및 예후 예측용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항의 조성물을 포함하는 간암의 진단 및 예후 예측용 키트.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 삭제
  7. 분리된 생물학적 시료로부터 HELZ, IMP-1, NONO, RALY 및 RBM42 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 간암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공 방법으로서,
    상기 HELZ 유전자의 발현 수준은 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 측정되고,
    상기 IMP-1 유전자의 발현 수준은 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 측정되고,
    상기 NONO 유전자의 발현 수준은 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 측정되고,
    상기 RALY 유전자의 발현 수준은 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 측정되고,
    상기 RBM42 유전자의 발현 수준은 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 간암의 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준이 기준치 보다 높은 경우 간암의 발병가능성이 높거나 또는 예후가 좋지 않을 가능성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HELZ 유전자 억제용 siRNA;
    서열번호 22의 염기서열로 이루어진 IMP-1 유전자 억제용 siRNA;
    서열번호 23의 염기서열로 이루어진 NONO 유전자 억제용 siRNA;
    서열번호 24의 염기서열로 이루어진 RALY 유전자 억제용 siRNA; 및
    서열번호 25의 염기서열로 이루어진 RBM42 유전자 억제용 siRNA;를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
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