KR20050078864A - 쯔쯔가무시, 렙토스피라 및 한탄 바이러스의 감염에 대한항체를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 편모항원 활성을 갖는 변이체, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵단백항원 활성을 갖는 변이체를 포함하는 쯔쯔가무시, 렙토스피라 인테로간스 및 한탄 바이러스에 의한 감염을 동시에 검출할 수 있는 진단 키트를 제공한다.

Description

쯔쯔가무시, 렙토스피라 및 한탄 바이러스의 감염에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트{A kit capable of detecting tsutsugamushi, Leptospira and Hantaan virus infection simultaneously}

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo), 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10) 및 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)에 각각 특이적인 재조합 단백질 항원을 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시, 렙토스피라 및 한탄 바이러스에 대한 항체 존재 여부를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.

쯔쯔가무시증은 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia Tsutsugamushi)의 감염에 의한 급성 발열성 질환의 하나로 일본, 중국, 말레이시아, 태국, 베트남 등을 포함하는 아시아 지역에서 호발하는 질환으로서(장, 한국의 쯔쯔가무시병, 서흥출판사 p21-27,1994), 10월에 가장 호발하며 대부분 가을철인 9월과 12월 초 사이에 발생한다 (김 등, 감염 20:105-116, 1988). 주로 사람에게는 들판에서 작업이나 캠핑 등의 야외 활동을 하면서 쯔쯔가무시균을 갖고 있는 진드기에 물려 감염된다. 임상증상으로는 감염된 진드기가 부착하여 흡인한 부위에 가피 (eschar)를 동반한 궤양이 나타나는 것이 특징이며, 고열, 오한, 두통, 반점구진성 발진, 림프절 종대가 나타난다.

쯔쯔가무시증의 진단은 크게 임상증상 및 이화학 소견에 의한 임상적 진단, 원인균 분리에 의한 세균학적 진단 및 혈청내 항체 유무를 측정하는 혈청학적 진단에 의해 이루어진다(김 등, 감염 20:105-116, 1988, 장 등, 대한미생물 학회지 24: 281-289, 1989). 임상적 진단은 급성 발열성 질환 환자에서 가피, 발진 및 림프절 종대 등의 존재를 증명함으로써 이루어지나, 초기 임상 증상이 비 특이적인 경우가 있고, 가피(eschar)의 위치에 따라 세심한 주의를 기울이지 않으면 발견하기 힘들며, 재 감염 시에는 가피가 나타내지 않는 경우도 있어 진단 시 문제점이 있다. 또한 비슷한 시기에 급성 발열성 질환인 렙토스피라증, 발진열, 신증후군 출혈열 등이 호발하는데 발병 초기에는 이들 질환의 임상 소견이 유사하여 임상증상 만으로 감별 진단하는데 많은 문제점이 있다 (박 등, 대한 내과학회지 45:497-509,1993, 배현주, 감염학 연수 강좌 p79-87, 2001). 위에서 언급한 가을철 급성 발열성 질환은 1998년부터 기후 온난화, 경제적, 레져 활동이 활발하게 되어 증가 추세를 보이고 있다. 2001년에는 쯔쯔가무시증의 경우 2,638명의 환자 발생이 법정 전염병 전산망에 신고되었으며, 실제 유사 환자를 매년 5만명 정도로 추정하고 있다(2002 전염병 발생 연보 2003, 국립보건원).

원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)를 환자 혈액에서 분리하는 세균학적 진단은 원인균 분리를 위한 감수성 동물 접종, 세포배양과 생물 안전 (Biosafty level 3) 시설이 갖추어져야 하며, 동정에 걸리는 시간이 3주 이상 소요되어 실제 환자 치료에 검사 결과를 이용하기는 불가능하다. 따라서, 쯔쯔가무시증의 진단은 통상 임상 증상과 혈청학적 진단에 의해 이루어지게 된다 (장 등, 대한 미생물 학회지 24:281-289, 1989). 전통적으로 쯔쯔가무시균은 Gillam, Karp, Kato 혈청형 등으로 분류되어 왔으며, 한국, 일본, 태국 등지에서 혈청학적으로 차이를 보이는 균주가 분리됨에 따라 보령(Boryong), 연천(Yonchon)의 국내 분리 균주 및 Shimokoshi, Kawasaki, Kuroki, TA716, TA763, TH1817 등 혈청학적 분류가 더욱 세밀해지고 있다. 혈청학적 방법은 비특이적인 웨일-휄릭스(Weil-Felix) 반응, 보체 결합 시험, 간접 면역 형광항체법, 효소 면역시험, 간접 면역 퍼옥시다제 시험, 수동 적혈구 응집 반응이 있다. 이중 세포배양균을 사용하는 미세 간접면역 형광항체법(Micro Indirect Immunofluroscence Assay; MIFA)이 널리 사용되고 있으나, 진단에 사용되는 쯔쯔가무시균을 세포배양으로 유지 계대하고 배양 기간이 2주 이상 걸리며, 사용되는 배지의 제조 및 가격이 고가이고, 진단의 판독에 숙련도가 요구되는 등 객관적인 표준화에 따른 여러 문제점이 알려져 있다 (Robinson et al., Am. J. Trop. Med. 25:900-905, 1976).

한편, 쯔쯔가무시균의 표현형에 따른 지역별 및 임상상의 특성을 뚜렷히 하기 위한 유전자 검출 방법인 PCR 진단법이 연구되었다 (Sugita Y. 등, J. Med. Microbiol. 37:357-360, 1992). 국내의 경우 보령 분리주의 표면 항원 단백질 (56 kDa)의 재조합 항원을 면양 적혈구에 부착시킨 수동 응집법 (Passive hamagglutination Assay: PHA) (Kim I.S. 등, J. Clin. Microbiol. 31:2057-2060, 1993)과 이를 이용한 진단 키트 및 ELISA 법을 이용한 진단법 (Kim I.S. 등, J. Clin. Microbiol. 31:598-605, 1993)이 개발된 바 있다. 그러나, 널리 사용되고 있는 수동 응집법은 간접 면역 형광항체법과 비교하면 양성 예측도가 낮아 조기 진단에 적용하기 적절치 못한 실정이다.

또한, 국외의 경우 Karp주의 재조합 56 kDa 항원부위를 개량한 ELISA 법 ( Ching W. M. 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5(4):519-526, 1998), 급속 면역크로마토그래피 반응법 (Rapid immunochromatographic flow assay: RAF)(Ching W. M. 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8(2):409-414, 2001)이 개발된 바 있다. 그러나, 일선 의료기관과 임상센타에서 수입품으로 진단하기에는 키트 가격이 비싸 현실성이 떨어지고 국내 분리주의 생산품으로 대체해야 할 필요성이 대두된다. 본 발명자들은 국내에서 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)를 순수분리, 동정한 바 있으며, 이 균주로부터 외피 단백질 (56 kDa)의 유전자 및 해당 유전자로부터 발현된 외피 단백질을 밝혀내어 엔씨비아이 진뱅크 허가번호 (NCBI genbank accession number) 제AF430142호를 획득한 바 있다.

렙토스피라증은 전세계에 널리 분포되어 있는 인수 공통전염병으로 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans)에 의하여 발생한다. 렙토스피라 인테로간스에는, 현재까지 약 240 종의 병원성 혈청형이 알려져 있으며, 한국에서 발생하는 렙토스피라증의 90 %는 혈청형 라이 (lai)에 속하는 것으로 밝혀졌다 (오희복 등, 국립보건원, 24 : 64-76 (1990); 오희복 등, 대한미생물학회지, 26 : 253-262 (1991)). 현재 렙토스피라증의 진단은 생균을 사용하는 현미경응집법 (MAT)이 표준 진단법으로 인정되고 있다 (Faine S. Guidelines for the control of Leptospirosis, Offset publication No. 67, WHO (1982)). 그러나, 진단에 사용되는 렙토스피라균을 생균 상태로 계속 계대 보관해야 하고, 배양기간이 5-7일이나 걸리며, 사용되는 배지가 고가이고, 진단의 판독에 숙련도가 요구되는 등 객관적 표준화가 어려운 문제점이 있었다.

이러한 문제점을 해결하고자 여러 진단법, 예를 들면, ELISA 법, 딥스틱 (Dipstick) 법 (면역크로마토그래피 이용) 및 PCR을 이용한 진단법이 연구되었다. 그러나, 종래의 ELISA 법과 딥스틱 법은 모두 렙토스피라 균체를 항원으로 사용하기 때문에, 렙토스피라 균을 배양해야 하는 단점이 있었다. 또한, PCR 법은 검체 종류에 따라 프라이머를 달리하여야 하고, 가격이 비싸다는 단점이 있다. 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하고자, 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 편모항원인 FlaB 중 N 말단과 C 말단의 일부 아미노산을 절단한 재조합 FlaB 절단체 (truncation)가 항원으로서의 민감도와 특이도가 높다는 것을 밝힌 바 있다 (특허공개 제10-2002-0078629호 참조). 상기 특허공개 제10-2002-0078629호의 개시 내용은 원용에 의하여 본 발명의 명세서에 포함되어진다.

신증후군 출혈열 진단에 있어서는, 면역형광항체법이 현재까지 가장 보편적인 방법으로 이용되고 있기는 하지만, 대량 검사 시 처리 검체수가 제한되며, 조직 배양시설 및 형광 현미경과 같은 특수장비가 필요하고, 결과의 정확한 판단을 위한 숙련된 검사원이 필요하다는 단점이 있다. 그 외에, ELISA 법, 혈구응집 저지 반응 및 적혈구 응집반응 등이 신증후군 출혈열의 혈청학적 진단과 연구를 위한 목적으로 이용되고 있으나, 특정 연구 분야에서만 제한되어 사용되고 있다.

한편, 국내에서 개발된 신증후근 출혈열 진단키트는 불용성 담체 입자 응집법, ELISA 법을 이용한 진단 키트가 있지만, 어느 방법에 의한 것이든지 사용할 때, 검사원이 검체의 희석 및 검사시약을 조제하고, 플레이트로 충전해야 하는 불편이 있다.

또한, 종래 이들 3 종의 발열성질환을 동시에 검출하는 방법이 개시되어 있었다. 특허공개 제 10-1998-0077901호에는 신증후군출혈열, 쯔쯔가무시 및 렙토스피라의 균체 항원을 각각 니트로셀룰로즈 막 상의 일정 위치에 블럿팅하는 단계; 검체와 대조혈청을 상기 항원들이 블럿팅된 니트로셀룰로즈 막과 접촉시켜 각각 반응시키는 단계; 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 알칼라인 포스파타제 표지 염소 항 사람 면역글로불린 항체 및 비씨아이피/엔비티(BCIP/NBT) 기질액을 이용하여 각각 검출하는 단계; 및 검체와 대조혈청에서의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 신증후군출혈열, 쯔쯔가무시증, 및 렙토스피라증의 동시 감별 진단 방법이 개시되어 있었다. 그러나, 이러한 진단 키트 역시 렙토스피라균과 쯔쯔가무시균 균체나 한탄 바이러스 자체를 항원으로 사용하고 있어, 항원을 준비하기 위하여는 각 균과 바이러스의 배양, 분리 및 정제를 하여야 하므로, 시간, 비용과 노력을 요하는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 순수 국내 분리주인 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 높게 유지하면서, 유전공학적 방법으로 대량생산이 가능한 재조합 단백질, 및 이를 코딩하는 유전자를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 56 kDa의 표면 항원 단백질의 양 말단에 특정 아미노산 서열을 도입했을 경우, 효과적으로 발현벡터를 제작할 수 있을 뿐 아니라, 진단에 필수적인 민감도와 특이도를 높게 유지할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 쯔쯔가무시균 감염의 검출에 유용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 신규의 재조합 단백질을 포함하고, 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans) 및 한탄 바이러스 (Hantaan virus)의 존재여부를 동시에 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai)의 편모항원 활성을 갖는 변이체, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵 단백항원 활성을 갖는 변이체를 포함하는 쯔쯔가무시, 렙토스피라 인테로간스 및 한탄 바이러스의 감염에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질은 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 다양한 항원 결정기 중 특이 표면항원을 코딩하는 56 kDa 단백질의 양 말단에 추가적으로 아미노산 서열이 도입되어 있다. 즉, N-말단에는 서열번호 9의 22개 아미노산이 추가로 연결되고, C-말단에는 GSF의 3개 아미노산이 추가로 연결된다. 이러한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질은 하기 시험예에서 확인할 수 있는 바와 같이 높은 민감도 및 특이도를 나타냄으로써 쯔쯔가무시 감염의 검출을 위한 진단 키트에 효과적으로 사용될 수 있다.

또한 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체는 상기 양말단에 추가된 아미노산 서열 또는 56 kDa의 표면항원 서열에서 치환, 결손, 또는 삽입과 같은 변형을 갖는 단백질을 말하며, 이러한 변형에도 불구하고 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질은 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 다양한 항원 중 편모 항원인 단백질 FlaB의 양말단을 제거하여, 항원으로서 민감도 및 특이도를 높여 진단에 응용할 수 있도록 한 것이다.

렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 편모항원 활성을 갖는 상기 변이체는, 서열번호 7의 아미노산 서열에서 치환, 결손, 또는 삽입과 같은 변형을 갖는 단백질을 말하며, 이러한 변형에도 불구하고 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 편모항원 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질은 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵 단백항원인 N 단백질을 나타내는 서열로서, 한탄 바이러스에 대한 민감도와 특이도가 높아 진단에 응용할 수 있는 것으로 알려져 있다.

한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵 단백항원 활성을 갖는 상기 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 치환, 결손, 또는 삽입과 같은 변형을 갖는 단백질을 말하며, 이러한 변형에도 불구하고 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵 단백항원 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 진단 키트는 상기 3 종류의 항원의 존재 여부를 검출하는 분석 방법에 사용될 수 있는 것이면 어떠한 형태의 키트도 이용할 수 있다. 이러한 진단 키트는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상기 3 종류의 항원이 제공된다면, 당업자에 의하여 용이하게 재구성될 수 있는 것이다. 이러한 상기 진단 키트에는 예를 들면, ELISA 키트, 및 면역크로마토그래피법을 이용하는 키트 (rapid kit)가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역크로마토그래피를 이용하는 키트는 예를 들면, 시료 패드, 접합체 패드, 한탄 바이러스 항원 라인, 렙토스피라증 항원 라인, 쯔쯔가무시 항원 라인, 대조군 라인 및 흡수 패드를 포함하는 형태일 수 있다. 상기 시료 패드는 혈청과 같은 시료를 로딩하기 위한 패드이다. 접합체 패드는 시료 패드 중의 표적 물질 (예, 각각의 항원에 특이적으로 결합하는 항체)과 결합하는 물질 (예, 단백질 A)과 검출 가능한 부위를 포함하는 물질 (예, 골드 입자)의 접합체를 포함하는 패드이다. 3 종의 항원 라인은 다공성 막 (예, 니트로셀룰로즈(NC) 막) 중에 상기 각각의 항원을 고정화시켜 둔 곳으로, 각각의 항원 라인은 검출 신호가 잘 해상이 될 수 있도록 일정한 간격으로 분리되어 있다. 대조군 라인은 시료가 잘 전개되었는지를 확인하기 위한 것으로, 상기 접합체 패드에 포함되어 있는 접합체와 항상 결합하는 물질 (예, 염소 항-인간 IgG)이 포함되어 있다. 흡수 패드는 상기 시료가 다공성 막을 따라 잘 이동할 수 있도록 하는 역할을 한다. 따라서, 상기 면역크로마토그래피 키트에서, 시료를 시료 패드에 첨가하면, 접합체 패드를 거쳐 3 종의 항원 라인과 대조군 라인을 거쳐 전개된다. 이때, 시료 중에 존재하는 표적물질은 접합체 패드를 통과하면서, 접합체 물질과 결합하여 검출가능한 형태로 된 다음, 특이적인 항체가 존재하는 경우, 3 종의 항원 라인을 통과하면서 각각의 항원과 특이적으로 결합함으로써, 상기 3 종의 발열성 질환 병원체의 존재여부를 검출하게 된다. 그러나, 본 발명의 3 종 발열성 질환 진단 키트가 상기 예에 한정되는 것은 아니며, 다른 형태의 면역크로마토그래피 키트 및 ELISA 키트의 형태가 포함될 수 있다. 본 발명의 상기 키트에는, 면역크로마토그래피 반응에 필요한 시약, 및 검출 장치 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 사용되는 상기 3 종류의 단백질 항원은 당 업계에서 알려진 방법, 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 이용하여 해당 유전자를 증폭하거나 제조하고, 이를 적당한 벡터에 삽입한 다음, 이를 이용하여 적당한 숙주세포를 형질전환시키고, 상기 세포를 배양한 다음 그 배양물로부터 단백질을 분리함으로써 생산될 수 있으나, 상기 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시, 렙토스피라 인테로간스 또는 한탄 바이러스의 존재를 검출할 수 있도록, 각각 이들 미생물에 대하여 민감도 및 특이도가 높은 3 종류의 재조합 단백질 항원을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 오리엔티아 쯔쯔가무시의 순수 분리 및 염색체 DNA 분리

오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)를 2% 소태아혈청 (fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양된 L₉₂₉ 세포주(한국세포주은행)에 접종한 후, 34℃의 CO₂ 배양기(5%)에서 배양하였다. 미세 간접 면역형광항체법(MIFA)으로 균의 성장을 확인한 후, 균을 40% 퍼콜(Percoll)과 초원심분리(ultra centrifuge)(Bekman Sw 55Ti)를 이용하여 순수 분리하였다. QIAamp blood DNA kit(Qiagen 사)를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 염색체 DNA를 분리하였다.

실시예 2. 올리고 뉴클레오티드 합성, 정제 및 분석

오리엔티아 쯔쯔가무시 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭하여 그 염기서열을 확인하기 위한 27머(mer)의 2개의 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 합성하였다. 또한, 상기 올리고 뉴클레오티드로 증폭된 DNA 조각으로부터 벡터로의 클로닝을 위한 유전자를 증폭하기 위해, 제한효소 인식 부위가 삽입된 30머의 2개의 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)를 합성하였다.

상기에서, 올리고 뉴클레오티드는 자동화된 뉴클레오티드 합성기(ABI-Pharmacia 사, 미국)를 이용하여 합성하였다. 이렇게 합성된 각 올리고 뉴클레오티드는 15% 폴리아크릴아마이드젤(TE-붕산, pH8.3)에서 전기영동하여 합성 올리고 뉴클레오티드를 분리하였다. 전기영동 후 260 nm와 280 nm 파장을 갖는 자외선으로 올리고 뉴클레오티드의 순도와 농도를 확인하였으며 이렇게 분리된 올리고 뉴클레오티드 용액은 영하 70℃에서 감압하여 동결 건조하였다.

실시예 3. 중합효소연쇄반응(PCR)

주형 DNA(50ng), 10㎕의 10×LA Taq 중합효소완충액(500mM KCl, 15mM MgCl₂ 및 10mM Tris-HCl, pH8.3), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 1.25mM씩 함유), 프라이머(실시예 2에서 합성한 올리고 뉴클레오티드) 1㎕씩, 0.5㎕의 LA Taq DNA 중합효소(Takara 사, 일본)를 혼합한 용액에 증류수를 가하여 전체 양이 50 또는 100㎕가 되게 하였다. 목적 유전자 염기 서열의 경우, 주형 DNA는 실시예 1에서 분리한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 게놈 DNA이고 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고 뉴클레오티드이며; 재조합 단백질의 클로닝을 위한 유전자 증폭의 경우, 주형 DNA는 염기서열 분석을 위한 PCR 결과로 나온 DNA 절편이며 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고 뉴클레오티드이다.

PCR 반응을 위하여 온도순환기(Thermal cycler, Perkin-Elmer사, 미국)를 사용하였으며 변성 (94℃, 30초), 어닐링 (50℃, 30초), 연장 (72℃, 1분)을 30회 진행시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 추가 반응시켰다. 그런 다음, 중합효소를 제거하기 위하여 PCR 정제 키트(Promega 사, 미국)를 사용하였으며 정제된 PCR 산물은 추후의 실험에 사용하였다.

실시예 4. 발현벡터의 제조

유전자의 발현을 위하여 실시예 3에서 2차로 증폭한 유전자와 발현벡터인 pET-15b (Novagen 사, 미국)를 Xho I과 BamH I으로 각각 절단한 다음, 발현벡터 0.1㎍과 재조합 단백질 유전자 30ng을 혼합하고 10배 농도의 접합 농축액(10mM DTT 및 100mM MgCl₂, 10mM ATP를 함유한 600mM Tris-HCl, pH7.5) 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(NEB사, 미국) 10 단위(Unit)를 가하여 전제부피를 10㎕로 조정하고 16℃에서 18시간 반응시켜 발현벡터 pET-15b(Novagen 사, 미국)에 상기 유전자가 삽입된 환상의 플라스미드를 제조하였으며, 이를 p56kDa라 명명하였다. 상기 플라스미드는 7308bp이다 (참조: 도1).

도 1은 본 발명에 따른 발현벡터의 구축과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 상기 발현벡터 p56kDa는 형질전환체인 대장균(Escherichia coli) BL21(Novagen사, 미국)에 삽입하였으며 형질전환된 대장균 BL21으로부터 발현벡터인 p56kDa를 재추출하여 제한효소를 처리하고 1% 아가로스 젤 전기영동하여 이중 제한효소 부위가 전기 발현벡터 p56kDa에 존재하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 재조합 단백질 유전자가 바르게 삽입되었다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드(발현벡터)로부터 제조된 DNA 조각의 염기서열을 결정한 결과 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 5. 형질전환체의 제조

실시예 4에서 제조된 발현벡터 p56kDa 10ng을 이미 형질전환에 적합하도록 제조된 대장균(E. coli) NovaBlue(Novagen사, 미국) 20㎕에 첨가하여 얼음 속에서 약 30분간 반응시키고 42℃에서 40초간 열충격을 주어 재조합 벡터가 형질전환체인 대장균 속으로 들어가도록 하였다. 다시 얼음 속에서 2분간 정치시키고 80㎕의 SOC 액체배지(GIBCO BRL사, 미국)를 넣고 37℃에서 1시간 진탕배양하여 엠피실린(Sigma사, 미국)이 100㎍/㎖ 함유된 고체 LB 배지에 배양하여 형질전환체를 선별하였다.

이때 상기 발현벡터 p56kDa를 함유하고 있는 형질전환체를 대장균 NIH/NV/56kDa-GEMT(Escherichia coli)로 명명하였으며, p56kDa 벡터를 함유하고 있는 형질전환체를 대장균 BL21(Novagen사, 미국)로 형질전환시킨 후 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B(Escherichia coli)로 명명하고, 한국 미생물 보존센터에 2003. 4. 30자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM 10489).

실시예 6. 재조합 단백질의 발현

형질전환체 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B을 100㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 LB 고체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하고 배양된 균체를 LB 액체배지 5㎖에 현탁하여 균탁도가 600nm에서 흡광도가 0.6이 되도록 조절한 다음, 이 배양액 5㎖을 엠피실린이 100㎍/㎖ 함유된 LB 액체배지 500㎖에 접종하여 600nm의 흡광도에서 0.7-1.0이 되도록 37℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopylanoside, 바이오니아사, 한국)를 최종 농도가 1mM이 되도록 넣고, 37℃에서 200rpm으로 37℃에서 4∼5시간 진탕배양 (200 rpm)하여 발현을 유도시켰다. 배양 후 원심분리하여 균을 모으고 1/15M 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, pH7.4)에 현탁시키고 균을 파쇄하여 파쇄액을 10% SDS-PAGE하였다(참조: 도2). 도2에서 제 M 레인은 분자량 크기 마커이고, 제 1레인은 IPTG 유도 전의 세포 파쇄액을 전기 영동한 결과이며 제 2레인은 IPTG 유도 후 4시간 배양한 균의 파쇄액을 전기영동한 결과이며 화살표는 발현된 재조합 단백질의 위치를 나타낸다. 도2에 나타낸 바와 같이, 형질전환체 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B에서 재조합 단백질이 발현됨을 알 수 있다.

실시예 7. 재조합 단백질의 정제

재조합 단백질이 삽입된 E.coli BL21을 배양하고 IPTG를 최종 농도 1mM 되도록 넣어주고 37℃에서 1.5시간 진탕배양 (200 rpm)하여 유도(induction) 시킨 후 4℃에서 5000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수하고 PBS로 2회 세척했다. 준비된 균체를 10 ㎖의 PBS로 현탁시킨 후 균액을 얼음 속에서 차게 유지시켜 15,000 psi에서 파쇄한 후 얼음 속에서 차게 유지시킨 후, 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 불용성의 침전체는 PBS 10ml로 2회 세척한 다음 용해액(lysis buffer)(20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH7.8)) 7-8ml에 현탁한 후 4℃에서 하룻밤 용해시켰다. 이 과정을 반복하여 12,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 취한 후 50% Ni-NTA 충진제(slurry) (Qiagen 사) 4㎖를 용해액으로 2-3회 세척한 후 상등액과 섞어 상온에서 2-3시간 동안 결합시켰다. 컬럼에 상등액-충진제 혼합물이 거품이 발생되지 않도록 조심스럽게 충진하고 혼합액을 용출시킨 후 세척액(washing buffer)(10mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH 6.0)) 10㎖으로 컬럼을 4회 세척했다. 세척된 컬럼에 용출 완충액(elution buffer)(300mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH6.0)) 3ml를 통과시켜 재조합 단백질을 회수했다. 정제 과정 중의 단백질 변화 추이를 10% SDS-PAGE로 전기영동을 실시하여 정제과정이 정상적으로 진행되었는지 확인했다 (참조: 도3). 도3에서 레인1은 세포 파쇄액, 레인 2는 유출액, 레인 3-5는 세척된 액, 레인 6-9는 용출액에 대한 결과를 나타낸 것이다. 니켈 충진제를 보유하는 컬럼에 의해 히스티딘 잔기를 갖는 항원 단백질이 정제됨을 관찰 할 수 있었다. 정제된 재조합 항원 단백질의 발현양은 평균 765 ㎍ (17 ㎍/㎖) 이었다.

실시예 8. 정제된 재조합 단백질 항원을 이용한 ELISA 반응

실시예 7에서 정제된 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 ELISA IgG, IgM를 실시하고 MIFA로 측정한 항체가와 민감도, 특이도를 비교하였다.

시료는 본 실험실에서 보관하고 있는 혈청을 대상으로 MIFA로 측정한 항체가에 따라 선정되었고 렙토스피라증, 신증후군출혈열과 교차 반응을 나타내지 않는 혈청을 사용하였다. ELISA는 정제된 일정량의 재조합 단백질을 코팅용액 (100ml 당 Na₂CO₃ 0.159 g, NaHCO₃ 0.293 g)로 희석해서 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 18-24시간 정치하였다. 재조합 단백질 용액을 완전히 제거하고 2% 소태아혈청을 포함한 완충액(PBS)(NaCl 8 g, KH₂PO₄ 0.2 g, Na₂HPO₄·7H ₂O 2.17 g, KCl 0.2 g/ℓ, 차단 용액) 200 ㎕를 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 차단 용액을 완전히 제거하고 0.01% 트윈-20(Tween-20)을 포함한 완충액 (PBS-T)로 5회 세척하고 1차 항체로 사용할 환자혈청을 완충액으로 1:100으로 희석하여 각 웰 당 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 200 ㎕의 완충액으로 각 웰을 5회 세척하고 2차 항체는 퍼옥시다제로 라벨된 항혈청 IgG (Sigma사, 미국)를 PBS에 1:25,000으로 희석해서 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. IgM을 검출하기 위한 2차 항체도 퍼옥시다제로 라벨된 항혈청 IgM (Sigma사, 미국)을 1:25000으로 희석해서 사용하였다. 반응이 끝난 후 완충액으로 각 웰을 5번 세척하였다. 발색제로 우레아 하이드로젠 퍼록시다제(urea hydrogen peroxide) (268mg)가 포함된 인산염 완충제 (Phosphate-citrate) 1정과 페닐렌디아민 디하이드로크로라이드 (o-Phenylene diamine dihydrochloride)(8mg) 1정을 20ml의 증류수에 10분 이상 녹여 준비하고 충분히 세척된 96웰 플래이트의 물기를 완전히 제거한 후 발색시약 100㎕씩을 웰에 첨가했다. 발색이 시작된 후 20분이 지나면 각 웰에 2 노르말(N)의 과산화수소(H₂O₂) 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 도4a는 재조합 단백질로 얻어진 쯔쯔가무시증 환자 혈청의 IgG ELISA 반응성과 대응하는 MIFA에 의한 역가의 스캐터그램이며, 도4b는 재조합 단백질로 얻어진 쯔쯔가무시증 환자 혈청의 IgM ELISA 반응성과 대응하는 간접 면역형광항체법(IFA)에 의한 역가의 스캐터그램이며, 점선은 대조군 건강한 사람의 평균 플러스 2D 반응을 나타낸다. 하기 표 1에 재조합 단백질 ELISA의 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)을 나타내었다. 활성 감염은 MIFA 역가 1:128 이상 또는 임상 증상의 존재 중 어느 하나로 정의되었으며, 사용된 컷오프는 대조군 건강한 사람의 평균 플러스 2SD 반응으로 결정되었으며, 괄호 안의 숫자는 ELISA양성 (민감도) 또는 음성(특이도) 혈청의 개수를 시험된 각각의 혈청 개수로 나눈 값이다.

표 1.

측정	민감도(%)	특이성(%)
재조합 단백질 IgM	83 (25/30)	97 (29/30)
재조합 단백질 IgG	83.8 (62/74)	96.6 (84/87)

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 쯔쯔가무시증 양성, 음성으로 판정된 혈청을 위 검체를 사용하여 재조합 항원 단백질을 이용한 ELISA(IgG) 결과는 MIFA IgG에 대해 83.8%, IgM은 83%의 민감도를 나타내었으며 특이성의 비교에 있어는 MIFA에 대해 IgG는 96.6%, IgM은 97%의 특이도를 나타냈다. 특히 질병의 진단에 있어 IgM 수치는

초기 감염의 지표로 이용되는 중요한 지표가 되므로 재조합 항원 단백질을 이용한 ELISA(IgM) 결과는 유의성이 높다.

실시예 9. 정제된 재조합 항원에 대한 효능 측정 및 교차반응

실시예 6에서 제조한 재조합 단백질 정제액 중 일정량을 취해 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후 니트로셀룰로오즈(NC)막 (Bio-Rad사, 미국)으로 반건조 전이(Hoefer사, 미국)를 이용하여 항원을 전이시켰다. 전이가 끝난 막을 1× 트리스-완충 식염수(TBS; 50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, pH 7.4)으로 5분간 3회 세척한 후 5% 탈지우유 (Difco Co.사, 미국)가 포함된 1× TBS-0.05% 트윈 20(TTBS)로 24시간 동안 차단반응(blocking)을 실시하였다. 탈지우유로 처리된 NC 막을 TTBS로 5분씩 3회 세척하고 대조군 및 쯔쯔가무시증 양성, 음성 환자 혈청을 5% 탈지우유를 가한 TTBS로 1:100 희석하여 NC 막에 처리하고 상온에서 18시간 동안 교반한 후 TTBS로 5분씩 3회 세척하였다. 알칼리 포스파타제 (AP)가 결합된 항-사람-IgG(Sigma 사, 미국)를 1:3,000으로 5% 탈지우유를 가한 TBS로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 5분씩 3회 세척하였다. 발색은 5% NBT (nitro blue tetrazolium chloride in 70% dimethylformamide, Sigma사, 미국)와 5% BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate in 100% dimethylformamide, Sigma사, 미국)를 이용하여 NC 막을 발색시켰다.

기타 유사질환과의 교차반응 시험은 렙토스피라증, 신증후군출혈열, 바이러스성간염, 말라리아 등의 유사질환 환자 혈청들을 대상으로 위와 동일한 방법으로 웨스턴블럿 시험을 실시하여 교차반응 여부를 실시했다(참조: 도5). 도5의 1 레인은 음성대조군 2-5 레인은 쯔쯔가무시증 양성 혈청, 6레인은 쯔쯔가무시증 음성 혈청, 7 레인은 렙토스피라증 음성 혈청, 8-11 레인은 렙토스피라증 양성 혈청, 12-13 레인은 신증후군출혈열 양성혈청, 14-15 레인은 신증후군출혈열 음성혈청, 16-17 레인은 B형 바이러스성 간염 양성 혈청, 18-19레인은 C형 바이러스성간염 양성 혈청, 20-22 레인은 말라리아 양성 혈청, 23-24 레인은 말라리아 음성 혈청을 대상으로 교차 반응 시험을 한 결과를 나타냈다. 즉 재조합 단백질을 항원으로 한 웨스턴 블럿 결과 쯔쯔가무시증 양성 환자 혈청 모두에서는 특이 밴드가 나타났고, 유사 질환인 렙토스피라증, 신증후군출혈열 혈청과 바이러스성 간염 양성, 말라리아 양성 혈청들과도 교차반응을 보이지 않았다. 그러나 8레인의 렙토스피라 양성 혈청에서 반응을 보인 것은 쯔쯔가무시증과의 이중 감염예로 사료된다. 한편 쯔쯔가무시증, 렙토스피라증, 신증후군출혈열 음성환자 혈청에서 모두 음성 결과를 나타내어 재조합 항원 단백질이 높은 항체 특이도를 갖는 것을 알 수 있으며, 이러한 재조합 항원은 감별진단에 효과적으로 이용될 수 있다.

실시예 10 : 3종 발열성 질환 고속검사 키트 (Rapid kit)의 제조 및 검사

(1) 적정 항원 및 골드-접합체 농도의 결정

본 실시예에 사용된 항원 중 정제된 쯔쯔가무시 재조합 56K 항원은 상기 실시예에 의하여 제조된 것을 사용하였으며, 렙토스피라 재조합 FlaB 항원(서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 가짐)은 특허공개 번호 제 10-2002-0078629에 개시된 방법에 따라 제조하였고, 정제된 한탄 바이러스 재조합 N 항원(서열번호 10의 아미노산 서열을 가짐)은 Hantaan virus 76-118 (국립보건원)으로부터 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 증폭하고, 이를 도 7에 나타낸 바와 같은 과정을 거쳐 N 유전자를 pBAD/Thio TOPO(Invitrogen 사) 벡터에 재조합한 재조합 벡터를 제조하고, 이를 E.coli에 형질전환시켜 얻어진 형질전환 E.coli 를 배양하고, 그 배양물로부터 정제한 것을 사용하였다.

정제된 쯔쯔가무시 r56K 항원, 정제된 한탄 바이러스 재조합 N 항원, 및 렙토스피라 재조합 FlaB 항원을 농도별로 분사하고 분석한 결과 3 종의 재조합 항원 500 ㎍/ml을 적정항원 농도로 결정하였다.

그레그 (Greg) 등의 방법에 따라 제작된 20 nm 골드 현탁액을 사용하여 단백질 A를 접합하고, O.D. 10의 농도로 10mM 보락스 버퍼 (Borax buffer)에 현탁시켰다. 단백질 A-골드 접합체를 소혈청, 자당, 트윈-20이 함유된 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)로 접합체 패드 (conjugate pad)에 30 ㎕/cm 로 분사하고 건조시켜 분석한 결과, O.D. 5.0∼8.0을 적정 농도로 결정하였다.

(2) 고속검사 키트의 제작

항원을 10 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.2)에 희석하여 도 6에 나타낸 바와 같이, 분주기 (dispencer) (CAMAG 또는 BIODOT)를 사용하여 NC 막 (Satorius 사)에 1.0 ㎕/cm의 농도로 분사하였다. 3 종 동시 진단 키트는 각각의 항원을 3 mm 간격으로 동일한 NC 막에 분사하였다.

대조군으로서 염소 항-사람 IgG (Sigma 사)를 1.0 mg/ml 농도로 희석하여 항원과 동일한 방법으로 분사하였다. 분사된 NC 막을 건조시킨 후, 상기 단백질 A-골드 접합체를 분사한 접합체 패드와 시료 패드 (sample pad), 흡수 패드 (absorbent pad)를 각각 라미네이터 카드 (Laminator card)에 부착하고 0.4 cm 간격으로 잘라 스트립을 제작하였다.

검사는 혈청 5 ㎕를 스트립에 떨어뜨리고, 분석 완충액 (assay buffer) (3 % BSA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0)을 100 ㎕ 첨가한 다음 5 분 내지 10 분 후에 결과를 판독하였다. 제작된 키트는 양성 혈청과 음성 혈청으로 반응의 적절성을 평가하였다. 실험에 사용된 혈청은 표준 진단법에 따라 렙토스피라증은 MAT 를 이용하고, 쯔쯔가무시증과 신증후군출혈열은 IFA를 이용하여 양성과 음성으로 판정된 혈청을 사용하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2. 3 종 발열성 질환의 동시진단 고속검사 키트의 민감도 및 특이도

질 병	민감도 % (혈청의 수)	특이도 % (혈청의 수)
렙토스피라증	95.0 (20)	99.3 (151)
쯔쯔가무시증	97.1 (71)	98.9 (91)
HFRS	84.6 (26)	91.8 (170)

또한, 상용 진단 키트인 딥스틱 (Dipstick)(면역크로마토그래피) 키트와 수동응집 (passive hemagglutination) 키트를 표준 진단 방법에 따라 검사하여 민감도와 특이도를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3. 상용 진단 키트의 민감도 및 특이도

상용 키트	민감도 % (혈청의 수)	특이도 % (혈청의 수)
렙토스피라증 (딥스틱 키트)	85.7 (14)	81.8 (33)
쯔쯔가무시증 (딥스틱 키트)	87 (87)	81 (59)
HFRS (PHA 키트)	83.3(6)	57.1 (7)

실시예 9 : 3종 발열성 질환 진단용 ELISA 키트의 제조 및 검사

(1) 항원

사용된 3종의 항원은 실시예 8에서 사용된 것과 동일한 것을 사용하였다. 각각의 항원은 히스티딘-태그된 단백질을 Ni-NTA 칼럼 (Qiagen 사)을 이용하여 정제하고, SDS-PAGE 를 사용하여 항원의 존재여부를 확인한 다음 사용하였다. 항원성은 항-His 단일클론 항체 (Qiagen 사)와 각 질병의 양성 환자의 혈청 또는 가토면역 혈청(항원을 토끼에 접종하여 얻어진 항 혈청임)을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 검사하고 항원으로 사용하였다. 항원의 단백질 정량은 BCA 단백질 분석 (Pierce 사)을 이용하여 정량하고 -70 ℃에 보관하면서 키트 제작에 사용하였다.

(2) 2차 항체

HRP 항-사람 IgG 와 HRP 항-사람 IgM (Sigma 사)를 적정 농도로 희석하여 사용하였다.

(3) 기질 및 중단 용액

TMB (Moss Inc)를 HRP의 기질로 사용하였으며, 0.5 M 황산 용액을 반응 정지액으로 사용하였다.

(4) 희석액 및 세척액

0.005% 트윈 20 (Sigma 사)을 함유한 인산 완충액 (pH 7.2)를 희석액과 왼충액으로 사용하였다.

(5) 적정 항원 농도 및 접합체의 농도

체크-보드 적정 (check board titration)을 실시한 결과, 적정 항원 농도는 1 ㎍/ml 의 농도에서 적정 반응을 나타내었으며, HRP 항-사람 IgG 및 IgM (Sigma 사)은 0.2 ㎍/ml의 농도에서 적정 반응을 나타내었으므로, 상기 농도로 ELISA 키트를 제작하였다.

제작된 ELISA 키트를 사용하여 시료 혈청을 검사하였다. 검사에 사용된 혈청은 실시예 8에 사용된 것과 같은 방법으로 검사하여 양성과 음성 혈청으로 구분하였다. 그 결과는 표 4와 같다.

표 4. ELISA 키트의 민감도 및 특이도

항원	민감도 % (혈청 수)		특이도 % (혈청 수)
	IgG	IgM	IgG	IgM
rFlaB	90.0 (20)	100 (20)	91.4 (151)	80.4 (151)
r56K	97.2 (71)	85.7 (91)	85.7 (91)	94.5 (91)
N	96.2 (26)	80.1 (26)	79.4 (170)	83.5 (170)

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 서열번호 1의 재조합 단백질 또는 변이체는 쯔쯔가무시 감염자 또는 환자의 혈청 내의 항체에 대하여 우수한 반응성을 나타내었다.

또한, 본 발명에 따른 3 종 발열성 질환 키트는 본 발명의 재조합 56KDa 단백질, 재조합 FlaB 단백질 및 재조합 N 단백질을 사용함으로써, 렙토스피라증, 쯔쯔가무시증 및 신증후군출혈열을 진단하는데 있어서 민감도와 특이도가 아주 높아, 이들 3 종 발열성 질환을 동시에 효과적으로 진단할 수 있다.

도 1은 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo) 재조합 표면항원을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 p56 kDa를 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 발현벡터 p56 kDa로 형질 전환된 대장균의 세포파쇄액을 12% SDS-PAGE 한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 발현된 재조합 단백질의 정제과정을 확인하기 위한 10% SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.

도 4a 및 4b는 재조합 단백질로 얻어진 IgG 및 IgM ELISA 반응성과 대응 미세간접 면역 형광항체법 (MIFA) 역가의 스캐터그램이다.

도 5는 쯔쯔가무시증 및 이와 유사질환과의 교차반응 시험결과(웨스턴 블롯팅)를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 3 종의 발열성질환을 진단하기 위한 고속 면역크로마토그래피 키트의 배치를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 7은 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 재조합 핵 단백항원 N 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pBAD-HTN을 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.

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Asp Ala Pro Ile Arg Lys Arg Phe Lys Leu Thr Pro Pro Gln Pro 145 150 155 160 Thr Ile Met Pro Ile Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gly Ile Asp Ile 165 170 175 Arg Asn Ile Pro Gln Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Pro Gln Leu Asn 180 185 190 Asp Glu Gln Arg Ala Ala Ala Arg Val Ala Trp Leu Lys Asn Tyr Ala 195 200 205 Gly Ile Asp Tyr Arg Val Lys Asp Pro Asn Asn Pro Asn Gly Pro Met 210 215 220 Val Ile Asn Pro Val Leu Leu Asn Ile Pro Gln Gly Asn Pro Asn Pro 225 230 235 240 Val Gly Asn Pro Pro Gln Arg Ala Asn Gln Pro Ala Asp Phe Ala Ile 245 250 255 His Asn His Glu Gln Trp Arg Tyr Met Val Leu Asp Leu Leu His Tyr 260 265 270 Gln Met Leu Ile Asn Leu Ala Ile Leu Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp 275 280 285 Lys Ile Thr Gln Ile Tyr Asn Asp Ile Arg Pro Phe Ala Asp Ile Val 290 295 300 Gly Ile Asp Val Pro Asn Gly Ala Leu Pro Asn Ser Ala Ser Val Glu 305 310 315 320 Gln Ile Gln Asn Lys Met Gln Glu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Glu Val 325 330 335 Arg Asp Ser Phe Glu Gly Tyr Ile Gly Gly Asn Ala Phe Ala Asn Gln 340 345 350 Ile Gln Leu Asn Phe Val Ile Pro Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln 355 360 365 Gln Gly Gln Gly Gln Gln Gln Gln Ala Gln Ala Thr Ala Gln Glu Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Leu Asn Gly Asn Asp Gln Ile Val 385 390 395 400 Gln Leu Tyr Lys Asp Leu Val Lys Leu Lys Arg His Ala Gly Phe Lys 405 410 415 Lys Ser Met Asp Lys Leu Ala Ala Gln Gln Glu Glu Asp Ala Lys Gln 420 425 430 Lys Glu Glu Asp Ala Lys Gln Lys Glu Gly Ser Cys Lys Lys Asp Asp 435 440 445 Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Thr Glu Phe Asp Leu Ser Met Ile Val 450 455 460 Gly Gln Val Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Val Ala Thr Glu Ser Phe Ser 465 470 475 480 Ile Tyr Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala His Thr Tyr Gly Lys Ile 485 490 495 Asp Asp Lys Asp Ile Lys Gly His Thr Gly Met Val Ala Ser Gly Ala 500 505 510 Leu Gly Val Ala Ile His Ala Ala Glu Gly Val Tyr Val Asp Ile Glu 515 520 525 Gly Ser Tyr Met Tyr Ser Phe Ser Lys Ile Glu Glu Arg Tyr Ser Ile 530 535 540 Asn Pro Leu Met Ala Ser Ile Ala Val Arg Tyr Asn Phe Gly Ser Phe 545 550 555 560 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for modified 56 kDa <400> 2 ggctcgagaa ttagtttaga atggttacca ctaaaaaata aatttaattc ttttaaggag 60 attagaatga aaaaaattat gttaattgct agtgcaatgt ctgcgttgtc gttgccgttt 120 tctgctagtg cgatagaatt gggggatgaa ggaggattag agtgtggtcc ttatgctaaa 180 gttggagttg tcggaggaat gattactggc gcagaatctg ctcgcttgga tcaagctgat 240 actactggca aaaaacactt gccattaaca acctcgatgc catttggtgg tacattaaat 300 gcaggtatga caattactcc atggcttaga gcagagctag gggttatgta ccttagaaat 360 ataagcgctg aggttgaagt aggtaaaggc aaggttgaag taggtaaagg caaggcagat 420 tctggaggtg ggacagatgc tcctatacgt aagcggttta aacttacacc tcctcagcct 480 actataatgc ctataagtat agctgatcgt gactttggga ttgatattcg taacatacct 540 caggcgcaag cgcaagctgc gcagcctcag cttaatgatg agcaacgtgc tgcagctagg 600 gtcgcttggt taaagaatta tgctggtatt gactataggg taaaagatcc taataatcct 660 aatgggccta tggttataaa tccggtgttg ttaaatattc cacagggtaa ccctaatcct 720 gttggaaatc caccgcagcg agcaaatcag cctgcagatt ttgcgataca taaccatgag 780 caatggaggt atatggtatt ggacttgctg cattatcaaa tgctaataaa cctagcgatc 840 ctcctgtcaa agtatctaag tgataaaatt actcagatat ataatgatat aaggccattt 900 gctgatatag ttggtattga tgttcctaat ggtgctttgc ctaatagtgc atctgtcgaa 960 cagatacaga ataaaatgca agaattaaac gagctattag aagaggtcag agattctttt 1020 gaggggtata ttggtggtaa tgcttttgct aatcagatac agttgaattt tgtcataccg 1080 cagcaagcac agcagcagca gcagcagggg caagggcagc aacagcaagc tcaagctaca 1140 gcgcaagaag cagcagcagc agcagctgtt aggcttttaa atggcaatga tcagattgtg 1200 cagttatata aagatcttgt taaattgaag cgtcatgcag gatttaagaa atctatggat 1260 aaattagctg ctcaacaaga agaagatgca aagcaaaaag aagaagatgc aaagcaaaaa 1320 gaaggtagct gcaagaagga cgataaagaa ggagtaagca aagaaacaga gtttgatctg 1380 agtatgattg ttggtcaagt taaactctat gctgatctag ttgcaactga atcattctca 1440 atatatgctg gtgttggtgc agggttagct catacttatg gaaaaataga tgataaggat 1500 attaaagggc atacaggcat ggttgcatca ggggcgcttg gtgtagcaat tcatgctgct 1560 gagggtgtgt atgtggacat agaaggtagt tatatgtact cattcagtaa aatagaagag 1620 aggtattcaa taaatcctct tatggcaagt attgctgtac gctataactt ctagggatcc 1680 ttt 1683 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 3 tagtgtggct aaataattag tttagaa 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 4 tttaaagaaa aactagaagt tatagcg 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 ggctcgagaa ttagtttaga atggttacca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 aaaggatccc tagaagttat agcgtacagc 30 <210> 7 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified FlaB protein <400> 7 Leu Arg Gln Ala Glu Arg Asn Thr Glu Asp Gly Met Ser Phe Ile Gln 1 5 10 15 Thr Ala Glu Gly Phe Leu Glu Gln Thr Ser Asn Ile Ile Gln Arg Ile 20 25 30 Arg Val Leu Ala Ile Gln Thr Ser Asn Gly Ile Tyr Ser Asn Glu Asp 35 40 45 Arg Gln Leu Val Gln Val Glu Val Ser Ala Leu Val Asp Glu Val Asp 50 55 60 Arg Ile Ala Ser Gln Ala Glu Phe Asn Lys Phe Lys Leu Phe Glu Gly 65 70 75 80 Gln Phe Ala Arg Gly Ser Arg Val Ala Ser Met Trp Phe His Met Gly 85 90 95 Pro Asn Gln Gln Arg Glu Arg Phe Tyr Ile Gly Thr Met Thr Ser Lys 100 105 110 Ala Leu Lys Leu Val Lys Ala Asp Gly Arg Pro Ile Ala Ile Ser Ser 115 120 125 Arg Gly Glu Ala Asn Asp Val Ile Gly Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr 130 135 140 Lys Ile Met Lys Gln Arg Ala Asp Met Gly Ala Tyr Tyr Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Tyr Thr Ala Lys Gly Leu Met Gly Ala Tyr Glu Asn Met Gln Ala Ser 165 170 175 Glu Ser Arg Ile Arg Asp Ala Asp Met Ala Glu Glu Val Val Ser Leu 180 185 190 Thr Thr Lys Gln Ile Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met 195 200 205 <210> 8 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for modified FlaB <400> 8 ctcaccgttc tctaaagttc aacgaacttg ctgtggacaa gacgatgaaa gctgtgtctt 60 ccggtatgcg gattaattcc gctgcggacg acgcttccgg acttgcggtt tctgaaaagc 120 ttagaacgca gatcaacggt ctgcgtcagg ccgaaagaaa caccgaagac ggaatgagtt 180 tcattcaaac tgccgaggga tttctggagc agacgtctaa catcattcaa agaattcggg 240 tgctcgccat ccagacttcg aatggtatct acagcaacga agataggcag cttgtgcagg 300 tggaagtatc tgcgctggtg gatgaagtcg atcgaattgc ttctcaggct gaatttaata 360 agttcaaact ttttgaaggc caattcgcta gaggttccag ggttgcatcc atgtggtttc 420 atatgggtcc aaaccaaaat cagcgtgaaa gattttacat aggcacgatg acttcaaagg 480 ctctgaagct tgtaaaagcg gacgggaggc cgatcgcgat ctcttctcgg gagaggctaa 540 cgacgtgatc ggtttggcag atgctgccct tacgaagatc atgaagcaga gagcggatat 600 gggagcttat tataataggc ttgaatatac cgcaaagggt ctgatgggtg cgtatgaaaa 660 tatgcaggca tctgaatcta gaattcgaga cgccgatatg gcggaggaag ttgtctcgct 720 gaccacaaaa caaatacttg tacagagtgg tacggcaatg ttggatcccc g 771 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences added to the N-terminal of 56 kDa protein <400> 9 Gly Ser Arg Ile Ser Leu Glu Trp Leu Pro Leu Lys Asn Lys Phe Asn 1 5 10 15 Ser Phe Lys Glu Ile Arg 20 <210> 10 <211> 429 <212> PRT <213> Hantaan virus 76-118 <400> 10 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala 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220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ile Glu Gln Trp Leu 225 230 235 240 Ile Glu Pro Cys Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ala Ala Val Ser Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Arg Gln Val Ala 260 265 270 Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu Ser Lys Ala Ile Arg Gln His Ala 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ser Glu 340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ile Val Leu Phe 370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu Ile Asp Val 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425 <210> 11 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gtggcattag gcaatatgga gacaaaggag 840 tcaaaggcta tacgccagca tgcagaagca gctggctgta gcatgattga agatattgag 900 tcaccatcat caatatgggt ttttgctgga gcaccagacc gttgtccacc aacatgtttg 960 tttatagcag gtattgctga gcttggggca tttttttcca tcctgcagga catgcgaaat 1020 acaatcatgg catctaagac agttggaaca tctgaggaga agctacggaa gaaatcatca 1080 ttttatcagt cctacctcag aaggacacaa tcaatgggga tacaactagg ccagagaatt 1140 attgtgctct tcatggttgc ctggggaaag gaggctgtgg acaacttcca cttaggggat 1200 gatatggatc ctgagctaag gacactggca cagagcttga ttgatgtcaa agtgaaggaa 1260 atctccaacc aagagccttt gaaactctaa 1290

Claims (4)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushi Pajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이 (Leptospira interrogans serovar lai HY10)의 편모항원 활성을 갖는 변이체, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 한탄 바이러스 (Hantaan virus 76-118)의 핵 단백항원 활성을 갖는 변이체를 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시, 렙토스피라 인테로간스 및 한탄 바이러스의 감염에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 키트는 면역크로마토그래피 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 3 종류의 단백질 항원은 니트로셀룰로즈 막에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
4. 제2항에 있어서, 상기 3 종류의 단백질 항원이 중합체 지지체에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.