KR20000041180A

KR20000041180A - 신증후출혈열의 진단을 위한 합성 올리고펩티드 및 방법

Info

Publication number: KR20000041180A
Application number: KR1019980056981A
Authority: KR
Inventors: 전영중; 노갑수; 김종완; 하석훈
Original assignee: 손경식; 제일제당 주식회사
Priority date: 1998-12-19
Filing date: 1998-12-19
Publication date: 2000-07-15
Also published as: KR100509815B1

Abstract

본 발명은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VRDAEKQYEKD- 또는 서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VKDAEKQYEKD- 을 포함하는 신증후출혈열 진단용의 합성된 올리고펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 올리고펩티드를 이용하여 신증후출혈열을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

신증후출혈열의 진단을 위한 합성 올리고펩티드 및 방법 (Synthetic oligopeptide and process for diagnosing HFRS)

본 발명은 신증후출혈열의 진단방법에 관한 것이다. 보다 특정적으로, 본 발명은 신증후출혈열을 진단하는데 효과적으로 사용될 수 있는 합성된 올리고펩티드에 관한 것이다.

한탄바이러스는 구조상 버냐비리대 (Bunyaviridae)과의 한타바이러스(Hantavirus) 속에 속한다. 유전자는 3개의 대(L, large)분절, 중(M, middle)분절, 소(S, small) 분절로 이루어진 네가티브 RNA로서 이 RNA는 각기 자신의 뉴클레오캡시드 구조를 가지며 G1과 G2라는 당단백질로 만들어진 하나의 지질막에 감싸여져 있다(Schmaljohn 등, J. Infect. Dis. 148 : 1005-1101, 1983). 한탄바이러스의 구조 단백질 중에서 면역반응에 관여하는 것은 뉴클레오캡시드 단백질과 G1, G2 막단백질이라는 것이 밝혀졌으며(Ellidtt 등, J. Gen. Virol. 65 : 1282-1293, 1984), 이들 단백질을 코딩하는 RNA의 종류가 밝혀졌다. L 분절 RNA는 RNA 의존형 RNA 중합효소를 코딩하고 M 분절 RNA는 당단백질인 G1과 G2를 코딩하며 S 분절 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하고 있다.

한탄바이러스 및 그와 유사한 일련의 바이러스 감염으로 인해 야기되는 질병을 신증후출혈열(HFRS: Haemorrhage Fever with Renal Syndrome)이라고 하는데 이 질환은 중국, 한국, 유럽, 미국 등지에서 년간 20만명 이상의 환자가 발생하고 있다. 이병에 걸리면 고열과 더불어 체내 혈관 내벽이 손상되어 전신에 출혈 성향이 높아지고 신장 기능의 장애로 단백뇨가 생기는 것을 주 증상으로 하며 심하면 사망하게 된다. 치사율은 약 3 - 5%로 이 질환에 대한 임상적, 병태 생리학적 연구가 활발히 진행됨에 따라 사망률은 크게 낮아지고 있으나 적절한 치료를 위해서는 조기 진단 및 유사한 임상 증상을 나타내는 리켓치아나 렙토스피라 감염증들과의 감별 진단이 매우 중요하다. 따라서 보다 정확하고 편리한 진단제 개발이 대두되었으며 본 연구에서는 이에 대응하는 합성 펩티드를 이용한 ELISA 진단법을 개발하였다.

일반적으로 한탄바이러스 감염 초기에는 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 높은 역가의 면역글로블린 M (IgM)과 면역글로블린 G (IgG)가 생성되기 때문에 급성 감염의 진단에 있어 뉴클레오캡시드 단백질은 중요한 지표 항원으로 이용될 수 있다. 신증후출혈열 진단용 항원으로 바이러스를 배양하여 분리정제한 후 바이러스 자체를 진단용 항원으로 이용할 수도 있고 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자만을 클로닝하여 미생물에서 발현 분리 정제하여 이용할 수도 있으나 가장 바람직하기로는 뉴클레오캡시드 단백질 상의 높은 항원성을 갖는 주요 항원 감작부위를 찾아내어 펩티드를 합성하여 이것을 진단용 항원으로 사용하는 방법이라 하겠다. 증식된 바이러스를 이용할 경우 숙주세포나 쥐의 뇌에 바이러스를 직접 접종하여 바이러스만을 분리 정제하여 사용하여야하는데 이 경우 작업의 번거로움과 높은 제작비용 외에도 작업자들의 감염 위험성 등의 문제를 들 수 있다. 유전자 재조합 항원을 사용하는 경우 발현용 숙주 세포 유래의 단백질들에 대한 비특이 반응에 의해 음성 환자 혈청을 양성으로 판정할 소지가 높아 고순도로 항원을 정제해야 하므로 많은 정제 비용이 소요된다. 반면 합성 펩티드는 최근 펩티드 합성 기술의 발달로 20개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드도 단시간내에 다량 합성이 가능하다. 이 경우 따로 항원을 정제할 필요가 없어 항원 생산 비용도 적게 소요되며 제작도 매우 용이하다. 다만 펩티드를 진단용 항원으로 사용하기 위해서는 항원 단백질 중에 대부분의 환자 혈청과 공통적으로 높은 반응성을 보이는 주요 항원 감작부위가 존재해야하며 그러한 감작부위를 찾아내어야 한다.

본 발명에서는 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열로부터 항원성이 높을 것으로 예상되는 부위의 펩티드를 합성하여 환자와 정상인 혈청으로 반응성을 연구하였다. 여러 환자의 혈청에 대하여 공통적으로 반응성이 높게 나오는 부위가 존재한다면 그 부위에 대한 합성 펩티드는 한탄바이러스에 의해 야기되는 신증후출혈열을 조기 진단하는데 이용될 수 있다. 특히 합성 펩티드를 진단용 항원으로 사용이 가능하다면 병원체의 배양 또는 유전자 재조합 방법을 이용하여 병원체의 특정 항원 단백질을 분리 정제하여 진단에 사용하는 것 보다 여러 면에서 매우 유리한 점이 있다.

도1은 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질의 친수성 분석

도2는 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 1차 합성펩티드와 환자 혈청과의 ELISA 반응결과 (1-13: 환자 혈청; 막대 그래프에서 각 막대는 좌측에서 우측 순으로 환자 혈청 1 내지 13에 상응함)

도3은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 2차 합성펩티드와 환자 혈청과의 ELISA 반응결과 (1-16: 환자 혈청; 막대 그래프에서 각 막대는 좌측에서 우측 순으로 환자 혈청 1 내지 13에 상응함)

도4는 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 합성펩티드 B와 C의 환자 및 정상인 혈청과의 ELISA 반응성 (1-5: 환자 혈청, 정1-정5: 정상인 혈청; 막대 그래프에서 각 막대는 좌측에서 우측 순으로 환자 혈청 1 내지 5 및 정상인 혈청 1 내지 5에 상응함)

도5는 서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 합성펩티드 X와 Y의 환자 및 정상인 혈청과의 ELISA 반응성 (1-5: 환자 혈청, 정1-정5: 정상인 혈청; 막대 그래프에서 각 막대는 좌측에서 우측 순으로 환자 혈청 1 내지 5 및 정상인 혈청 1 내지 5에 상응함)

본 발명은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VRDAEKQYEKD- 을 포함하는 신증후출혈열의 진단용 올리고펩티드를 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 -ARQKVRDAEKQYEKD- 또는 -VRDAEKQYEKDPDEL-의 아미노산 서열을 갖는 신증후출혈열 진단용의 합성된 올리고펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VKDAEKQYEKD- 을 포함하는 신증후출혈열의 진단용 올리고펩티드를 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 -ARQKVKDAEKQYEKD- 또는 -VKDAEKQYEKDPDDL-의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VRDAEKQYEKD-(예, -ARQKVRDAEKQYEKD- 또는 -VRDAEKQYEKDPDEL-)을 포함하는 올리고펩티드를 예상되는 환자의 혈청과 반응시킴을 특징으로 하여 신증후출혈열을 진단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VKDAEKQYEKD-(예, -ARQKVKDAEKQYEKD- 또는 -VKDAEKQYEKDPDDL-)을 포함하는 올리고펩티드를 예상되는 환자의 혈청과 반응시킴을 특징으로 하여 신증후출혈열을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열 (Schmaljohn, C.S. 등, Virology, 155 : 633-643, 1986)로부터 Hopp과 Woods법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 : 3824-3828, 1981)을 이용하여 각 아미노산 부위에 대한 친수성을 분석하였다. 분석 결과 항원성이 높을 것으로 예상되는 부위에 대하여 15개의 아미노산으로 이루어진 8개의 펩티드 E25, E26, E27, E28, E29, E30, E31, E32를 일차로 합성하였다(표 1).

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 1차 합성 펩티드의 서열 및 위치

번호	아미노산 서열	위 치
E25	-QLVIARQKVRDAEKQ-	17-31
E26	-KVRDAEKQYEKDPDE-	24-38
E27	-EKQYEKDPDELNKRT-	29-43
E28	-RGRQTTKDNKGTRIR-	144-158
E29	-GTRIRFKDDSSFEDV-	154-168
E30	-ALGNMETKESKAIRQ-	272-286
E31	-VGTSEEKLRKKSSFY-	348-362
E32	-AQSLIDVKVKEISNQ-	410-424

이 펩티드들을 효소면역법(Enzyme Immuno Assay)을 이용하여 환자 혈청과 반응성을 조사한 결과(도2) 아미노산 17번부터 59번 위치에 걸친 E25, E26, E27에서 높은 항원성을 나타내었기 때문에 이 부위를 좀 더 자세히 고찰하기 위해 2차로 이 부위에 대하여 중복되게 8종류의 펩티드를 합성하였다. 2차로 합성한 펩티드 A, B, C, D, E, F, G, H는 15개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고 각각의 인접하고 있는 펩티드는 11개의 아미노산이 중복되어 있다(표 2).

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열 및 위치

번호	아미노산 서열	위치
A	-QLVIARQKVRDAEKQ-	17-31
B	-ARQKVRDAEKQYEKD-	21-35
C	-VRDAEKQYEKDPDEL-	25-39
D	-EKQYEKDPDELNKRT-	29-43
E	-EKDPDELNKRTLTDR-	33-47
F	-DELNKRTLTDREGVA-	37-51
G	-KRTLTDREGVAVSIQ-	41-55
H	-TDREGVAVSIQAKID-	45-59

이들을 환자 혈청과 항원항체 반응성을 조사한 결과(도3) 펩티드 B (-ARQKVRDAEKQYEKD-:21-35)와 펩티드 C (-VRDAEKQYEKDPDEL-:25-39)에서 특이적으로 높은 반응성을 나타내어 펩티드 B와 C의 진단용 항원으로서의 유용성을 확인하였다. 또한 한탄바이러스와 동일한 속에 속하지만 한탄바이러스 보다는 약한 신증후출혈열을 일으키는 서울바이러스의 동일한 부위에 대한 펩티드 X(-ARQKVKDAEKQYEKD-)와 Y(-VKDAEKQYEKDPDEL-)를 합성하여 환자와 정상인 혈청과의 반응성을 조사한 결과 환자 혈청에서 정상인 보다 훨씬 높은 반응성을 보임으로써 펩티드 X와 Y도 신증후출혈열의 진단용 항원으로 사용이 가능함을 확인하였다.

각각의 상세한 방법 및 결과들은 다음의 실시예에서 자세히 설명한다.

실시예 1

간접면역형광 항체법

간접면역형광 항체법은 사람 혈청중의 한탄바이러스에 대한 항체가를 조사하여 양성 또는 음성을 판정하는 시험법으로서, 본 발명에서는 합성 펩티드와 사람혈청과의 반응성을 조사하기 위한 신증후출혈열 양성 또는 음성 혈청으로 분류하기 위하여 수행하였다. 베로-E6 세포를 조직배양 플라스크에서 3일간 배양하고 모노레이어가 형성된 것을 확인한 후 한탄바이러스 일정량을 플라스크에 접종하고 37℃, 5% CO₂배양기 내에서 흡착시킨 후 다시 여기에 5% 우태아혈청이 포함된 EMEM 배지를 가하여 37℃, 5% CO₂배양기 내에서 6일간 배양하였다. 그후 배지를 제거하고 감염된 세포를 트립신으로 처리하여 유리시킨 후 일정량의 세포용액을 스포트 슬라이드에 분주하여 건조시킨 후 -70℃에 보관하였다가 필요시 꺼내어 항원으로 사용하였다.

항원 슬라이드는 찬 아세톤으로 고정시키고 PBS 용액(1리터당 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g KH₂PO₄, pH 7.4)으로 2배씩 제한 희석한 혈청을 가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS 용액과 증류수로 세척하고 건조하였다. 그후 FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer I)가 부착된 항인간 면역글로블린 G 원액을 32배로 희석하여 각 웰에 25 ㎕씩 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 PBS 용액과 증류수로 세척하고 건조시킨 후 마운팅 용액(글리세롤:인산완충식염수 = 1:9)을 3-4 방울 가하여 커버글라스를 덮고 형광 현미경에서 400배의 대물렌즈로 관찰하여 형광항체가를 정하였다. 형광항체가는 특이항원이 관찰되는 최고 혈청희석배수의 역수로 정하였다. 이 시험방법으로 분석했을 때 1:512 이상의 항체가를 보이는 혈청을 양성 혈청으로 판정하였다.

실시예 2

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유래의 1차 합성 펩티드와 환자 혈청과의 반응성 조사

펩티드 합성은 Applied Biosystems사의 432A Personal Peptide Synthesizer Synergy를 이용하여 수행하였다. 합성하고자 하는 펩티드의 위치는 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 유전자로부터 유추한 아미노산 서열을 Hopp과 Woods방법 (Hopp, T. P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 3824-3828, 1981)에 의해 분석하여 친수성이 가장 높은 부위들로 정하였다(도1). 분석 결과에 의거하여 상기 표1에서와 같이 15개의 아미노산으로 이루어진 8 종류의 펩티드를 1차로 합성하였다. 상기 표1은 펩티드의 아미노산 서열과 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터의 위치를 나타낸다.

여기서 합성된 펩티드와 신증후출혈열 환자 혈청과의 반응성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 여기서 사용된 신증후출혈열 환자 혈청은 실시예 1에서 수행한 간접면역형광 항체법으로 신증후출혈열 양성 판정을 받은 사람들의 혈청을 이용하였다. 합성된 펩티드를 100 ㎍/㎖ 농도로 코팅버퍼(0.1 M 중탄산나트륨, pH9.6)에 희석한 후 EIA 96 well 플레이트(Costar, Massachusetts, USA, cat. No 3590)의 각 웰에 100㎕씩 넣고 4℃에서 16시간 동안 고정시켰다. 각 웰당 PBS 용액 (1리터당 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g KH₂PO₄, pH7.4)에 3%되게 용해된 우혈청알부민 100㎕씩을 가하여 37℃에서 2시간 동안 블로킹한 후 200㎕의 PBST 용액(PBS 용액 + 0.05% Tween 20) 으로 3회 세척하였다. 인간 혈청을 PBS 용액으로 1:2000으로 희석한 후 각 웰당 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 200㎕의 PBST 용액으로 3회 세척하였다. 퍼록시데이즈가 부착된 2차 항체(HRP-labelled goat anti-human IgGAM)를 PBS 용액으로 1:1000으로 희석한 후 각 웰당 100㎕ 씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 200㎕의 PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 사이트레이트 버퍼(0.25M 인산나트륨, 이염기성/ 0.25M 사이트레이트, pH4.9)에 OPD (o-페닐렌디아민디하이드로클로라이드)를 1 mg/ml 되게 용해하고 과산화수소를 0.03% 되게 첨가한 발색시약을 각 웰당 100㎕씩 첨가하였다. 약 5분 후 50 ㎕의 1 M 황산를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 492nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도2에서 보는 바와 같이 E25, E26, E27의 펩티드에서 타 펩티드들 보다 월등히 높은 반응성을 보였으며 펩티드를 이용한 신증후출혈열 진단의 가능성을 확인하고 이 부분에 대하여 보다 세부적인 조사를 하기 위해 2차 펩티드를 합성하였다.

실시예 3

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유래의 2차 합성 펩티드와 인간 혈청과의 반응성 시험

실시예 2의 결과로부터 환자 혈청과의 높은 반응성을 보인 뉴클레오캡시드 단백질 아미노 말단으로부터 아미노산 위치 17-43을 포함한 17-59의 위치에 대하여 상기 표2에 나타낸 바와 같이 11개의 아미노산이 중첩되게 15개의 잔기로 이루어진 2차 펩티드를 재합성하였다. 2차 합성 펩티드 A, B, C, D, E, F, G, H를 각각 환자 혈청에 대해서 실시예 2 에서와 동일한 방법으로 환자 혈청과의 반응성을 조사하였다. 그 결과 도3에서 보는 바와 같이 합성펩티드 A, B 및 C에서 매우 높은 반응성을 보였다. A의 경우는 타 펩티드에 비해 약 1.5배 이상, 그리고 B와 C는 타 펩티드들에 비해 작게는 2배 많게는 5배의 반응성을 보였다. 따라서 B와 C 펩티드에 대하여 정상인과 환자 혈청에 대하여 동시에 반응성 시험을 수행해 보기로 하였다. B와 C 펩티드에 대하여 정상인 혈청 5종과 신증후출혈열 양성혈청 5종을 사용하여 시험을 수행하였다. 그 결과를 도4에 나타내었는데 B와 C 펩티드 모두 환자혈청에 대하여 정상인 혈청에 비해 5배 이상의 높은 반응성을 보였다. 이로써 펩티드 B와 C는 한탄바이러스에 감염에 의해 사람의 혈청에 생성되는 항체의 공통된 항원 감작부위를 포함함을 알 수 있었다. 또한 B와 C 펩티드 모두에서 높은 반응성을 보임으로써 중첩된 부위인 -VRDAEKQYEKD-(25-35) 중에 주요 항원 감작부위(epitope)가 포함됨을 알 수 있다.

실시예 4

서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유래의 합성 펩티드 인간 혈청과의 반응성 조사

실시예 2와 3은 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열에 대하여 조사를 수행하였으나 한탄바이러스와 같은 속에 속하는 서울바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 동일한 부위가 신증후출혈열 환자의 항체와 반응하는지를 알아보기 위하여 실시예 3에서 합성한 B와 C의 동일한 부위에 대한 서울바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 21-35의 위치와 25-39 위치의 펩티드 X(-ARQKVKDAEKQYEKD-)와 Y(-VKDAEKQYEKDPDDL-)를 합성하였다. X, Y는 앞의 한탄바이러스의 펩티드 B, C와 각각 비교했을 때 X는 1개 Y는 2개의 아미노산이 치환되었다. 합성된 X, Y 펩티드를 이용하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 동일한 정상인과 환자 혈청 각각 5종에 대하여 시험을 수행한 결과(도5) 역시 환자 혈청에서 정상인 혈청보다 월등히 높은 반응성을 보임으로써 한탄바이러스 외에도 서울바이러스의 펩티드 X, Y로도 환자 혈청과 정상인 혈청의 구분이 가능함을 알 수 있었고 펩티드 X와 Y의 중첩부위인 -VKDAEKQYEKD-에 주요 항원 감작 부위가 포함됨을 알 수 있었다.

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VRDAEKQYEKD- 을 포함하는 본 발명의 합성 올리고펩티드 및 서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VKDAEKQYEKD- 을 포함하는 본 발명의 합성 올리고펩티드는 신증후출혈열의 진단제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VRDAEKQYEKD- 을 포함하는 신증후출혈열의 진단용 올리고펩티드.
제1항에 있어서, -ARQKVRDAEKQYEKD- 또는 -VRDAEKQYEKDPDEL-의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드.
서울바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 25-35 위치의 아미노산 서열 -VKDAEKQYEKD- 을 포함하는 신증후출혈열의 진단용 올리고펩티드.
제3항에 있어서, -ARQKVKDAEKQYEKD- 또는 -VKDAEKQYEKDPDDL-의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드.
신증후출혈열의 진단방법에 있어서, 제1항의 올리고펩티드를 예상되는 환자의 혈청과 반응시킴을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 진단방법이 효소면역법인 방법.
신증후출혈열의 진단방법에 있어서, 제5항의 올리고펩티드를 예상되는 환자의 혈청과 반응시킴을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 진단방법이 효소면역법인 방법.