KR0169535B1 - 대장균에서 발현된 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공지의 한탄바이러스 76-118 균주로부터 선별한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 함유하는 발현 플라스미드, 이 발현 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 형질전환체, 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 이를 정제함으로써 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질 및 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후 출혈열 예방 백신에 관한 것이다.

Description

대장균에서 발현된 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 백신

제1도는 한탄바이러스 76-118로부터 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 합성 증폭하기 위한 프라이머들의 염기서열을 나타낸 것이다.

제2도는 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한 발현 플라스미드인 pETNP의 제조과정을 도식화하여 나타낸 것이다.

제3도는 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한 발현 플라스미드인 pKKNP의 제조과정을 도식화하여 나타낸 것이다.

제4도는 pETNP 또는 pKKNP를 함유하는 대장균으로부터 각각 발현된 뉴클레오캡시드 단백질의 정제방법을 나타낸 것이다.

제5도는 대장균 형질전환체 E.coli BL(pETNP)로 부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질의 정제단계별 순도를 나타내는 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴블롯팅(Western blotting) 사진이다.

제6도는 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 확인하기 위해 사람환자 혈액과 단일클론항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 공지의 한탄바이러스 76-118 균주로부터 선별한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 함유하는 발현 플라스미드, 이 발현 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 형질전환체, 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 이를 정제함으로써 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질및 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 한탄바이러스 감염으로 인한 신증후출혈열 예방 백신에 관한 것이다.

버어니아바이러스과의 한타바이러스속에 속하는 한탄바이러스는 신증후군출혈열을 유발시키는 병원균으로서 3개의 세그먼트(S. M. L 세그먼트)로 이루어진 일본쇄 리보핵산 게놈(RNA genome)을 함유한다. 이 중 L 절편 RNA는 RNA의존형 RNA 폴리머라제를 암호화하고 M 절편 RNA는 당단백질인 G1 및 G2를 암호화하며 S 절편 RNA는 뉴클레오캡시드 N단백질을 암호화하는데, 여기서 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 단백질이 면역반응에 관여하는 것으로 밝혀져 있다.

한탄바이러스 감염에 대한 효과적인 예방백신을 개발하고자, 지금까지 바이러스 자체 또는 이들 면역반응에 관여하는 단백질들을 이용한 많은 연구가 이루어져 왔다. 그러나, 바이러스 자체를 약독화 또는 불활화시켜 이용하는 것은 통상 효과면에서 우수한 것으로 알려져 있는 반면, 첫째, 종류에 따라 바이러스 배양자체가 용이하지 않고 배양액으로 부터의 바이러스 정제가 어려울 수 있으며 정제중 바이러스가 파괴되어 온전한 바이러스를 얻을 수 없는 경우가 많고, 둘째 정제된 바이러스를 백신으로 사용하기 위해서는 포르말린이나 열처리를 통하여 약독화 또는 불활화시켜야 하는데 이 과정에서 백신물질이 변성될 수 있으며, 셋째 백신제조에 있어 가장 중요한 관건이라 할 수 있는 안전성이 미흡한 등의 문제를 안고 있다.

즉, 예를 들어 인슐린 또는 성장호르몬 등과 같이 대장균을 이용해 생산된 기존의 유전자 재조합 단백질들은 큰 부작용 없이 의약품으로 널리 이용되고 있으나, 1세대 한탄바이러스 백신의 경우 살아있는 쥐의 뇌에 바이러스를 접종배양 한 후 쥐의 뇌유액으로 부터 바이러스를 정제하기 때문에 아무리 정제를 잘한다 하더라도 이미 부작용의 소지가 있는 것으로 알려진 쥐 뇌의 베이직 미엘린 단백질 (basic myelin protein)을 완전히 제거할 수 없으며 기타 분석되지 않은 쥐 뇌유래의 단백질들이 미량 포함되어 있을 수 있으므로 이들 동물유래 외부 단백질들에 의해 백신의 안전성에 관한 문제가 발생할 가능성이 있다.

따라서, 세포없는 생산체제(Cell free production system)나 유전자조작에 의해 발열반응 등을 일으킬 가능성이 있는 해로운 물질 및 단백질을 포함하지 않도록 면역 단백질의 유전자만을 생체외에서 발현시키려는 노력들이 많이 진행되어 왔다.

이러한 노력의 일환으로, Schmaljohn 등은 원형 한탄바이러스 76-118의 주의 각 세그먼트에 대한 염기서열 및 유전자 배열을 밝히고, 한탄바이러스의 외피단백질(G1 및 G2를 암호화하고 있는 M 세그먼트를 백시니아 유전자와 결합시켜 동물(Hamster)에 주입시킨 후 한탄바이러스에 대한 방어효과를 관찰하였으며, 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 S 세그먼트는 외피단백질의 방어능을 증가시키는 것으로 보고한 바 있다. 또한, 이들은 바큘로바이러스(Baculovirus)를 이용하여 한탄바이러스의 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 단백질을 곤충세포에서 발현시키고 이 발현세포를 파쇄하여 얻어진 세포 용해물로 동물에 접종하는 시도를 하였으나 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 직접적인 중화항체 형성은 관찰하지 못하였다.

한편, 이와 같이 신증후 출혈열 예방 백신의 제조에 있어 점점 관심이 집중되고 있는 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스의 리보핵산중 S 세그먼트에서 발현되어 각각의 리보헥산과 결합하여 존재하는 바이러스 구조단백질로서 바이러스 단백질 전체의 대부분을 차지하므로 바이러스 배양 후 대량으로 정제하기가 용이하다는 특성을 지니고 있다. 그러나, 이미 언급한 바와 같이 뉴클레오캡시드 단백질의 중화능에 관한 연구로는 유전자를 백시니아 바이러스라는 매개체를 이용하여 부여하거나, 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하고 있는 전체 세포 용해물을 동물에 투여한 것이 전부일 뿐, 순수분리된 뉴클레오캡시드 단백질을 중화 항체형성 연구에 사용한 적이 없었으므로 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 중화능, 특히 중화항체를 형성하여 신증후출혈열을 예방할 수 있는 백신물질로서의 가치를 판별할 수 없었다. 또한, 한탄바이러스 또는 한타바이러스속에 속하는 다른 바이러스의 외피 단백질들(G1 및 G2)의 경우에는 이들 단백질이 정제하기 어려울 뿐만 아니라 대장균, 효모 또는 동물세포에서 유전공학적 방법으로 대량생산이 가능하지 않았으므로, 바이러스 자체를 백신물질로 사용하는 경우의 많은 문제점에도 불구하고 현재 신증후출혈열에 대한 예방 백신으로는 포유마우스의 뇌 또는 동물세포에서 바이러스를 직접 배양한 후 이를 포르말린으로 불활화시켜 제조된 백신만이 공급되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 현재의 불활화바이러스 백신에 의한 안전성의 문제를 해결하기 위하여 집중적인 연구를 수행한 결과, 지금까지 순수분리되어 사용된 적이 없는 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법에 따라 대장균으로 부터 대량 생산해내고 이를 한탄바이러스 예방 백신의 성분으로 사용하면 신증후군 출혈열에 대한 보다 안전하고 예방효과가 우수한 백신을 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명자들은 본 발명의 목적에 따라서 한탄바이러스를 구성하고 있는 다양한 단백질의 항원성을 연구해 왔으며, 그 결과 공지의 한탄바이러스 76-118 균주로 부터 내피단백질, 즉 뉴클레오캡시드 단백질의 유전자를 선별하여 대장균내에서 발현시킨 후, 발현된 단백질을 분리, 정제하고 순수정제된 단백질의 중화항체 형성능을 연구함으로써 백신물질로서의 가치를 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 외래유전자로서 함유하는 제조합 발현 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 및 이 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하고, 분리 및 정제과정을 거쳐 수득된 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질에 관한 것이다.

궁극적으로, 본 발명은 상기와 같은 유전공학적 방법에 의해 순수하게 수득된 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후출혈열 예방 백신을 제공함을 목적으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다.

한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자로 부터 본 발명이 궁극적으로 목적하는 효과적이면서도 안전한 한탄바이러스 예방 백신은 제조하기 위해서는 먼저 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 증폭, 재조합 발현 플라스미드 및 형질전환체의 제조, 형질전환체의 배양및 뉴클레오캡시드 단백질의 분리, 정제 과정을 거쳐야 하며 최종적으로 제조된 백신의 효능성을 조사함으로써 발명이 완성될 수 있다.

먼저, 본 발명에서는 제1도에 나타낸 5가지의 프라이머를 사용하여 각각 2회에 걸친 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 플라스미드에 클로닝하기에 충분한 양의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 확보하였고, 이들 유전자에 각각 플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3에 클로닝될 수 있도록 적절한 제한효소 인식부위를 첨가하였다. 즉, 1차 중합효소 연쇄반응에서 동일하게 NP1 및 NP3의 두가지 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 2차 중합효소 연쇄반응에서는 pET-3a에 삽입하기 위한 유전자는 BglII 및 EcoRI 인식부위를 함유하도록 NP2 및 NP3를 이용하여 증폭시켰고, pKK223-3에 삽입하기 위한 유전자는 EcoRI 및 SalI 인식부위를 함유하도록 NP4 및 NP5를 이용하여 증폭시켰다.

여기서 뉴클레오캡시드 단백질 유전자와 재조합시키기 위해 사용된 출발 플라스미드중에서 pET-3a는 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함하므로 이 플라스미드에 클로닝되어 발현된 뉴클레오캡시드 단백질은 N 말단에 12개의 아미노산을 더 함유한 융합단백질로 발현되는 반면, 플라스미드 pKK223-3에는 이러한 서열이 없으므로 융합단백질이 아닌 원래의 단백질 형태로 발현되게 된다.

플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3 각각에 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 클로닝하여 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pETNP 및 pKKNP를 제조하기 위한 과정은 제2도 및 제3도에 도식화하여 나타낸 바와 같다. 또한, 이러한 절차에 따라 제조된 각각의 발현 플라스미드를 전기장충격법을 사용하여 숙주세포인 대장균 BL21(DE3) 및 HB101 내로 삽입함으로써, 원하는 뉴클레오캡시드 단백질을 대량으로 생산해 낼 수 있는 대장균 형질전환체 E.coli BL(pETNP) 및 E.coli BL (pKKNP)를 수득하였다. 이들은 1995년 8월 18일자로 사단법인 한국종균 협회에 기탁되었으며 기탁번호를 부여받았다(KFCC-10866 및 KFCC-10867).

다음단계로, 본 발명에서는 유전공학분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라, 수득된 대장균 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하여 단백질을 대량으로 발현시키고, 제4도에 구체적으로 도시한 과정을 수행함으로써 발현된 단백질을 정제하였다. 즉, 암모늄 설페이트 침전법, 겔 필트레이션, 음이온 교환 수지 컬럼 및 면역친화(immunoaffinity)컬럼을 이용하는 정제방법에 의해 단백질을 순수하게 수득하였으며, 이에 대한 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴블롯팅을 수행한 결과는 제5도 및 6도에 나타낸 바와 같다. 본 발명자들은 이들 결과로도 부터 정제된 단백질이 목적하는 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인할 수 있었으며, 특히 전기영동결과로 부터 판단된 정제된 단백질의 순도는 95% 이상 이었다.

한편, 발현 플라스미드 pETNP로부터 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질의 분자량은 약 49.5kDa으로 측정된 반면, pKKNP로 부터 얻어진 단백질의 분자량은 약 48kDa 으로 측정되었는데, 이는 앞에서 이미 언급한 바와 같이 pETNP의 제작에 사용된 pET-3a의 플라스미드 클로닝 부위인 BamHI 부위 앞쪽에 존재하는 s10 리더(leader)서열에 기인하는 것이다. 즉, pETNP로 부터 생산된 뉴클레오캡시드 단백질은 천연상태의 단백질에 비해 12개의 아미노산을 더 함유하고 있으며, 이러한 구조상의 차이는 형질전환체에서의 단백질 생산량도 월등히 증대시키는 역할을 하는 것으로 생각한다. 이는 pETNP 및 pKKNP에 의해 각각 형질전환된 대장균에서 생산된 뉴클레오캡시드 단백질을 웨스턴블롯팅으로 분석해본 결과 pETNP 유래의 뉴클레오캡시드 단백질 양이 pKKNP 유래의 단백질 양보다 5배 가량 더 많은 사실로 부터 뒷받침된다.

정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 백신의 정제원액으로 하고 이 정제원액으로부터 최종 백신제품을 제조하기 위한 과정에서 보조제로 알루미늄하이드록사이드 겔을 첨가할 수 있으며, 그 이외에도 치메로살 및 정제젤라틴을 첨가할 수 있다. 알루미늄하이드록사이드 겔은 면역보조제용으로 사용하는데 바람직한 첨가량은 백신제조용 정제원액 0.5㎖ 당 최대 0.625㎎이고, 치메로살은 보존제로서 0.01%(w/v)양으로 사용함이 바람직하며, 정제젤라틴은 안정화제로서 0.02%(w/v)의 양으로 사용함이 바람직하다. 이들 이외에도 Tween 80을 0.01%(w/v)양으로 첨가할 수 있다.

이상 설명한 방법에 의한 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질로부터 제조된 본 발명의 백신제품 효능성을 조사하기 위해 현재 시판중인 주식회사 녹십자의 한타박스를 비교백신으로 하여 플라크감소 중화시험법으로 실험한 결과, 본 발명의 백신이 비교백신에 비해 탁월한 중화능력을 나타냄을 확인하였으며, 백신 효능 테스트를 위해 기니픽에 40㎍씩 10일 간격으로 3회 접종한 경우에도 별다른 이상 증상은 발견되지 않았다. 더구나, 본 발명에 따른 백신은 불활화시키거나 약독화바이러스 자체를 백신물질로 사용함에 따른 안전사고 발생의 소지를 완전히 배제하기 위하여 그로부터 항원성을 나타내는 것으로 규명된 특언의 단백질 성분, 즉 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산 및 정제하여 백신물질로 사용하였으므로 신증후 출혈열 예방 백신에 있어서 지금까지 끊임없이 제기되어온 안전성 문제를 완전히 해결한 획기적인 발명으로 생각된다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해 추가된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[한탄바이러스 76-118로부터 RNA 게놈의 정제 및 cDNA의 합성]

한탄바이러스 76-118 균주의 배양액 100㎕를 취하여 용액 A (4.2M Gu-anidine isothiocyanate, 25mM Tris-HC1(pH8.0), 0.5% Sarkosy1, 0.7% β-mercaptoethanol) 400㎕와 잘 혼합하였다. 여기에 용액 B(1M Tris-HC1(pH8.0), 0.1M EDTA, 10% SDS)50㎕를 가하고 잘 혼합한 후 65℃에서 5분간 용해시켰다.

혼합용액에 동일부피의 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액을 가하고 65℃ 에서 30분 동안 방치한 다음 원심분리하여 상등액만을 취하고, 남은 용액에 다시 용액 A를 300㎕더 가하여 65℃에서 5분간 방치한 후 원심분리하였다. 여기서 취한 상등액을 먼저 취한 상등액과 합한 다음, 이를 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액으로 1회, 클로로포름으로 1회 추출하였다. 추출된 용액에 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 및 2배 부피의 이소프로필알콜을 가하고 잘 혼합후 -20℃에서 16시간 보관하였다.

이것을 마이크로 원심분리기에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 침전시키고 침전을 70% 에틸알콜로 2회 세척한 후 건조시켰다. 건조된 침전을 리보핵산 분해효소(RNase)가 없는 멸균수 10㎕에 용해시킨 다음 4℃에 보관하였다. 리보핵산 5㎕를 취해 전체 20㎕부피에서 cDNA를 합성하였는데, 이때의 반응조건은 하기 표1에 나타낸 바와 같으며 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

[실시예 2]

[중합효소 연쇄반응에 의한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 증폭]

본 발명에 따라 공지의 플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자는 제1 도에 나타낸 프라이머들을 사용하여 다음에 설명하는 대로 각각 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭시켰다.

플라스미드 pET-3a에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 증폭 시키기 위해서는 먼저 실시예 1에서 합성한 뉴클레오캡시드 단백질 cDNA가 포함된 용액 5㎕를 취해 프라이머 NP1 및 NP3를 사용하여 1차 증폭시켰다.

1차 반응한 용액중에는 원하는 뉴클레오캡시드 유전자가 충분하지 않으므로 1차 반응용액 5㎕를 취하여 프라이머 NP2 및 NP3를 사용하여 2차 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 NP2 및 NP3의 5' 말단 쪽에는 각각 BglII(AGATCT) 및 EcoRI(GAATTC)의 제한효소 인식부위가 포함되어 있다.

중합효소 연쇄반응에 사용된 기기는 퍼킨엘머사(PERKIN ELMER)의 데옥시리보핵산 온도 사이클러(DNA thermal cycler 480)를 사용하였으며, 중합효소 연쇄반응의 조건은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

한편, 플라스미드 pKK223-3에 클로닝하기 위한 단백질 유전자는 2차 중합효소 연쇄반응시 프라이머 NP2 및 NP2를 사용하는 대신에 EcoRI(GAATTC) 인식부위를 함유하는 프라이머 NP4 및 SalI(GTCGAC) 인식부위를 함유하는 NP5를 사용하는 점을 제외하고는 pET-3a의 경우와 동일한 방법을 제조하였다.

[실시예 3]

[발현 플라스미드 pETNP 및 pKKNP의 작제]

뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 클로닝 과정은 제2도 및 3도에 나타내었다. 실시예 2의 방법에 따라 증폭된 두종류의 이본쇄 DNA는 아가로오스겔 전기영동상에서 그 크기를 확인한 후, 1.3kb 크기의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한 DNA 절편을 진크린 키트를 사용하여 회수하였다. 회수된 DNA 절편들은 각각 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함하는 플라스미드 pET-3a 및 유도 아미노산 서열을 전혀 포함하지 않는 플라스미드 pKK223-3 내로 클로닝하였다.

회수된 DNA 절편중 pET-3a에 클로닝하기 위한 유전자는 제한효소 BglII 및 EcoRI로 이중소화하였고, pKK223-3에 클로닝하기 위한 유전자는 클레노우 효소로 처리하여 양말단을 블런트 엔드(blunt end)로 만든후 EcoRI 만을 사용하여 절단하고 페놀/클로로포름 혼합액(1:1)으로 1회 추출한 뒤 최종 2㎕의 멸균 증류수에 용해 시켰다. 한편, 유전자 운반체인 pET-3a 5㎕을 EcoRI 과 BamHI으로 이중소화하고 동량의 pKK223-3를 EcoRI과 SmaI로 이중소화한 후 최종농도 5mM의 EDTA 존재하에 70℃에서 10분간 열처리하고 페놀/클로로포름 혼합액(1:1)으로 1회 추출한 뒤 각각 20㎕의 멸균 증류수에 용해시켰다. 절단된 각 유전자 운반체 5㎕와 뉴클레오캡시드 DNA 10㎕를 혼합하고 T4 DNA 리가아제를 이용하여 25℃에서 3시간 동안 반응시켜 접합함으로써 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pETNP 및 pKKNP의 작제를 완료하였다.

[실시예 4]

[형질전환체의 제조]

대장균의 형질전환은 전기장 충격법을 사용하였으며 숙주세포로서는 pETNP는 대장균 BL21(DE3) 그리고 pKKNP는 대장균 HB101 을 각각 사용하였다.

형질전환용 숙주세포를 다량으로 수득하기 위해서 20㎖의 LB 배지에 대장균 BL21(DE3) 또는 HB101을 한천 평판배지로 부터 접종하여 37℃에서 18시간동안 진탕배양하였다. 이들 각각을 1리터 새로운 LB 배지에 접종하여 600mn의 파장에서 홉광도가 0.5 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃ 에서 진탕 배양하였다. 균체를 회수하기 위해 배양액을 0℃에서 20분간 방치한 후 원심분리로 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 1리터의 냉 멸균 증류수로 1회 세척한 후 다시 0.5리터로 세척하고 최종적으로 20% 글리세롤로 세척하였다. 이를 3㎖의 10% 글리세롤 용액에 재현탁시킨 다음, 분주하여 -70℃에 보관하고 각 형질전환시 1개씩 꺼내어 사용하였다. 전기장 충격법에 사용한 기기는 Bio-Rad 사에서 제작한 Gene-Pulser를 사용하였으며, 형질전환 방법은 다음과 같다. -70℃에 보관된 균체 40㎕와 데옥시리보핵산 2㎕를 혼합하여 전극 간격이 0.2cm 인 큐벳에 넣고 Gene-Pulser를 정전용량 25μF, 저항 200Ω, 전기장의 세기 12.5kV/cm에 고정하여 1회 전기장 충격을 가하고 즉시 1㎖의 SOC 배지(2% 박토트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaC1, 2.5mM KC1, 10mM MgC1, 10mM MgSO, 20mM 글루코오스)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 진탕배양한 후 50㎍/㎖의 암피실린이 첨가된 2개의 LB 한천평판배지에 각각 0.1㎖, 0.9㎖씩 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 12 내지 18시간 배양하였다. 제조합 플라스미드의 스크리닝은 단일콜로니의 크래킹(cracking)방법을 사용하였다. 즉, 크래킹 퍼버(0.05M Tris(pH6.8), 1% SDS, 2mM EDTA, 0.4M 수크로오스, 0.01% 브로모페놀 블루) 80㎕ 에 한천평판배지로 부터 1루프의 균체를 넣고 볼택스믹서로 현탁하여 마이크로 원심분리기로 12,000 rpm에서 15분간 원심분리한 다음 상등액을 취해 아가로오스겔 전기영동으로 원하는 뉴클레오캡시드 유전자 운반체인 pETNP와 pKKNP 플라스미드를 확인하였다. 또한, 최종적으로는 분리한 재조합 플라스미드를 제한효소로 절단하여 확인함으로써 스크리닝을 수행하였다.

[실시예 5]

[형질전환체의 배양]

대장균의 배양을 위해서는 LB 배지(효모엑기스 0.5%, 박토트립톤 1%, NaC1 1%, pH7.0)에 포도당과 엠피실린을 각각 0.5%, 100㎍/㎖ 되게 첨가하여 사용하였으며 밤새 배양한 종균액을 새로운 배지 1 리터에 5% 되게 접종하여 37℃에서 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도(A)가 0.5 내지 0.8에 도달했을 때 IPTG를 0.1 내지 2mM 되게 첨가하여 4 내지 8시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 0.8% NaC1 용액으로 1회 세척하였다.

[실시예 6]

[뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제]

pETNP 및 pKKNP를 포함한 대장균들로 부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 정제하는 방법은 제4도에 간단히 나타내었다. 회수된 균체는 50내지 100㎖의 TE 완충용액(50mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)에 현탁시키고 초음파기(sonicator)를 사용하여 균체를 파쇄하였는데 파쇄의 정도는 브래드포드 정량(Bradford assay)방법을 사용하여 파쇄액의 단백질 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 수행하였다. 파쇄된 용액을 8,000 x g에서 1 시간동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액에 암모늄설페이트를 포화농도의 25내지 50% 되게 첨가하여 용해시킨 후 상온에서 1시간 동안 방치한 다음 8,000 x g에서 다시 30분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물은 20㎖의 TE 완충용액에 재현탁시켰다.

재현탁시킨 용액중의 암모늄설페이트를 제거하기 위해 2리터의 TE 완충용액에 2시간씩 2회 투석을 수행하였다. 투석한 용액은 1차로 파마시아사의 세파크릴 S200을 사용하여 겔 필트레이션(filtration)을 수행하고 이것을 2차로 DEAE 세파덱스 A-50음이온 교환 수지를 사용하여 2차 정제하였다. 음이온 교환 수지에 사용한 용출액은 50mM Tris(pH8.0)에 NaC1을 1.0M 농도가 되도록 첨가한 것을 사용하였다. 여기서 받은 용출액은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일클론항체가 커플링된 면역친화(immunoaffinity)컬럼에 적하하고 PBS 완충용액(8gNaC1, 0.2gKC1. 1.44g NaHPO, 0.24g KHPO/리터, pH8.0)으로 세척한 후 100mM의 초산을 사용하여 용출하였다. 용출액의 pH를 조정하기 위해서 2M Tris 완충용액(pH8.0)을 용출액 부피의 0.3배 첨가하였다. 이것을 다시 PBS 완충용액으로 투석하고 단백질을 원하는 농도로 농축하기 위해 아미콘사에서 제작한 센트리콘 또는 센트리프랩을 사용하였다. 각 단계에서의 정제된 단백질은 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인하였는데 (제5도 참조), 이로부터 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 95% 이상인 것으로 판단 되었다.

면역친화 컬럼에 사용된 단일균 항체로는 하이브리도마를 배양하고, 프로테인 A 컬럼을 사용해 배양액으로부터 정제한 것을 사용하였다. 여기서 하이브리도마를 포유마우스에서 배양한 한탄바이러스 원형 76-118을 정제하여 발브C(Balb/c)마우스에 접종하고 이로부터 자라세포와 미엘로마 (myeloma)세포를 얻은 다음, 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 이를 융합시키고 융합된 세포중에서 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일군 항체를 생산하는 융합세포만을 스크리닝함으로써 제작하였다. 또한, 정제된 단일클론항체의 커플링은 파마시아사의 CNBr에 의해 활성화된 세파로즈 4B를 사용하여 제조회사의 추천방법에 따라 수행하였다.

[실시예 7]

[뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯팅]

대장균에서 발현된 단백질이 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인하기 위해 재조합 플라스미드로 부터 발현되어 정제된 단백질에 대해 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동을 수행하였으며, 전기영동한 겔로부터 단백질들을 멤브레인에 옮기고 신증후출혈열 환자의 혈청과 항 뉴클레오캡시드 단백질 단일클론 항체 ht9040을 이용하여 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하였다. 이때, 특이성을 갖는 단백질만의 접착을 위해 멤브레인을 5%의 스킴밀크(skim milk)를 포함한 PBS 용액(1리터당 8g NaC1, 0.2g KC1, 1.44g NaHPO, 0.24g KHPO, pH7.4)과 30분간 충분히 반응시킨 후 위에서 언급한 1차 항체와 실온에서 1시간 이상 반응시켰다. 부착되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBST용액(PBS+0.5% Tween20)으로 멤브레인을 3 내지 4회 각각 5내지 10분간 세척하였다. 세척완료된 멤브레인은 적당히 희석되고 퍼옥시다제(peroxidase)효소가 부착된 항토끼항체G(antirabbit immunoglobulin G) 및 5% 스킴밀크를 포함한 PBS 용액의 혼합액과 1시간 동안 진탕하여 반응시켰다. 다시금 PBST 용액으로 멤브레인을 3 내지 4회 각각 5 내지 10분간 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨을 발색시약으로 사용하여 발색반응을 수행한 결과 예상된 위치에서 원하는 뉴클레오캡시드 단백질 특유의 밴드(약 50Kd)를 확인하였다.(제6도 참조).

[실시예 8]

[정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 백신의 효능성 조사]

실시예 6 에서 정제된 백신 정제원액 0.5㎖ 당 보조제인 알루미늄 하이드록사이드 겔을 0.625㎎의 배합비로 첨가하고 4℃에서 15일간 정치시켰다. 그 후, 0.01%(w/v) 치메로살과 0.02% 정제젤라틴을 가하여 최종 시험백신을 제조하였다.

이와 같이 제조된 시험백신의 중화 효능을 조사하기 위해 기니픽을 대상으로 실험하였으며, 비교백신으로는 현재 시판되고 있는 주식회사 녹십자의 한타박스를 사용하였다. 이때, 항원은 10㎍/0.5㎖, 20㎍/0.5㎖ 및 40㎍/0.5㎖의 3가지 농도로 기니픽에 접종시켰고, 시험백신과 비교백신을 기니픽에 접종한 후 얻어진 기니픽의 혈청을 플라크감소 중화시험법으로 검사함으로써 백신의 면역원성을 판정하였다. 플라크감소 중화시험은 아래 서술한 바와 같이 진행되었다.

1) 플라크감소 중화시험을 위한 항체를 얻기 위하여, 3가지의 서로 다른 농도로 제조된 상기 시험백신과 비교백신을 기니픽에 10일 간격으로 3회 피하접종 (0.5㎖/접종)을 하였다.

2) 기니픽으로 부터 혈청을 채취하여 56℃에서 30분간 비동화 처리한 후 3% 우태아혈청을 함유하는 유지용 배지(MEM + M199 = 1:1)를 사용하여 각각 1:10, 1:20, 1:40 및 1: 80으로 희석하였다.

3) 희석시킨 혈청과 70PFU/배양용기(직경 6cm) 되도록 희석시킨 한탄바이러스 공격균주 76-118을 동량씩 시험관에 혼합한 후 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다.

4) 미리 준비된 6cm의 세포배양 용기에서 단층배양한 베로E6 세포에 상기 혼합액을 0.2㎖씩 접종한 다음 37℃에서 90분간 반응시켰다.

5) 반응 후 접종액을 제거하고 각 배양용기당 5㎖씩의 1차 한천중층배지(Agarose overlay)를 분주하였다. 1차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.

M199 배지 50㎖

우태아 혈청 10㎖

7% NaHCO3㎖

아가로오스 0.8g

증류수 50㎖

이때 M199는 피놀레드를 함유하지 않은 배지로 사용하였으며 우태아 혈청은 56℃에서 30분간 열처리한 것을 사용하였다.

6) 1차 한천중층이 끝나면 각기 접종된 세포들은 37℃에서 10내지 11일간 배양하였다.

7) 배양 후 각 배양용기당 3 내지 3.5㎖씩의 2차 한천중층배지를 분주하였으며 2차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.

M199 50㎖

400mM MES 10㎖

(2-(N-Morpholino)ethane sulfonic acid, monohydrate)

5% BSA 5㎖

0.6% 중성적(neutral red) 1㎖

1N NaOH 1.5㎖

아가로오스 0.7g

증류수 32.5㎖

8) 2차 한천중층이 끝나면 3일간 배양한 후 직경 2mm 정도의 플라크 수를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 시험백신의 경우 40㎍/0.5㎖ 및 20㎍/0.5㎖의 농도에서는 비교 백신에 비해 탁월한 중화능력을 나타내었으며, 10㎍/0.5㎖의 농도에서는 동등한 중화능력을 나타내었다.

따라서, 공지균주인 한탄바이러스 76-118에서 항원성을 나타내는 물질중 하나인 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산하여 제조된 본 발명의 백신은 기존의 백신에 비해 신증후군 출혈열에 대하여 뛰어난 면역원성을 지니고 있을 뿐아니라, 특히 독성물질이 필연적으로 함유되게 마련된 바이러스 자체를 백신 물질로 사용하지 않고 성분이 규명된 단일 단백질을 백신 물질로 사용함으로써 백신제제의 독성문제를 완전히 해결한 우수한 백신이다.

Claims (3)

1. 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 백터내로 삽입시켜 발현 플라스미드를 작제하고, 상기 발현 플라스미드로 E. coli를 형질전환시켜 E. coli 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 배양하여 얻은 배양액으로부터 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질을 분리, 정제함으로써 제조되는 한탄바이러스 76-118의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후출혈열 예방 백신.
2. 제2항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 보조제를 함유하는 백신.
3. 제3항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 보조제가 알루미늄 하이드록사이드겔, 치메로살, 정제 젤라틴 중에서 선택된 1종 이상인 백신.