RO117541B1

RO117541B1 - Procedeu pentru prepararea unui vaccin de papillomavirus uman, pentru administrare la om

Info

Publication number: RO117541B1
Application number: RO96-02165A
Authority: RO
Inventors: Kathrin U Jansen; Iii James C Cook; Hugh A George; Kathryn J Hofmann; Joseph G Joyce; Ernest Dale Lehman; Henry Z Markus; Mark Rosolowsky; Loren D Schultz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-05-16
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2002-04-30
Also published as: PL183781B1; AU693203B2; DK0757717T3; JP3863559B2; ES2264126T3; DE69535018T2; PT757717E; NO322133B1; WO1995031532A1; JPH10500847A; DE69535018D1; CZ336696A3; CA2189882A1; CA2189882C; FI119815B; CN1152935A; SI0757717T1; FI964592A; EP0757717B1; NO964862L

Abstract

Inventia se refera la un procedeu pentru prepararea unui vaccin de Papillomavirus uman, pentru administrare la om. Procedeul cuprinde etapele: (a) se transforma drojdia cu o molecula ADN, respectiva molecula ADN codificand proteinele de Papillomavirus uman L1 sau de Papillomavirus uman L1+L2, cu formarea unei celule de drojdie transformate, (b) se cultiva celula transformata in conditii care permit producerea de proteine recombinante si ansamblul spontan al acestora in particule de tip viral, (c) se recolteaza particulele de tip viral din celula transformata, (d) se purifica particulele de tip viral prin cel putin o etapa cromatografica, si (e) se conditioneaza principiul activ, care poate sa cuprinda un singur tip de particule de tip viral sau un amestec de particule de tip viral si anume particule de tip viral din Papillomavirus uman 11, Papillomavirus uman 16 si Papillomavirus uman 18, astfel incat vaccinul sa poata fi administrat pe cale orala, subcutanat, pe mucoasa, local sau intramuscular, optional principiul activ putand fi adsorbit pe Al(OH)3 la o concentratie de pana la 100 ug/ml.

Description

Invenția se referă la un procedeu pentru prepararea unui vaccin de papillomavirus uman, pentru administrarea la om, utilizat în domeniul medical.

Infecțiile cu papillomavirus apar la o diversitate de animale, incluzând oi, câini, pisici, iepuri, maimuțe, șerpi și vite precum și la om. Papillomavirusurile infectează celulele epiteliale, inducând, în general, tumori benigne, epiteliale sau fibroepiteliale, la locul infecției. Papillomavirusurile sunt agenți infecțioși, cu specificitate de specie; un papillomavirus uman nu poate infecta un animal nonuman.

Papillomavirusurile pot fi clasificate în grupe distincte, în funcție de gazda pe care o infectează. Papillomavirusurile umane sunt, în continuare, clasificate în mai mult de 60 de tipuri, în funcție de omologia secvenței DNA (“Papillomaviruses and Human Cancer¹', H.Pfister (ed). CRC Press, Inc. 1990). Tipurile de papillomavirusuri par a fi imunogene, cu specificitate de tip, și anume că o imunitate dobândită pentru infecția cu un tip de papillomavirus nu conferă imunitate față de un alt tip de papillomavirus.

La oameni, diferitele tipuri de papillomavirus uman produc boli distincte. Tipurile de papillomavirus uman 1,2, 3, 4, 7, 10 și 26-29 produc negi benigni atât la indivizi normali, cât și la cei cu imunodepresie. Tipurile de papillomavirus uman 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 și 46-50 produc leziuni plane la indivizi cu imunodepresie. Tipurile de papillomavirus uman 6, 11, 34, 39, 41-44 și 51-55 cauzează condiloame nemaligne ale mucoasei genitale sau respiratorii. Tipurile de papillomavirus uman 16 și 18 produc displazii epiteliale ale mucoasei genitale și sunt asociate cu majoritatea carcinoamelor in situ și invazive ale colului uterin, vaginului, vulvei și canalului anal. Papillomavirusul uman 6 și papillomavirus uman 11 sunt agenți care cauzează mai mult de 90% din totalitatea condiloamelor (polipi genitali) și a papiloamelor laringeale. Cel mai abundent subtip de papillomavirus uman de tip 6 este papillomavirus uman 6a.

Studiile imunologice, pe animale, au arătat că producerea de anticorpi neutralizanți, pentru antigeni papillomavirali, previne infecția cu virusul omolog. Elaborarea vaccinurilor papillomavirale eficientă a fost încetinită de dificultățile datorate cultivării papillomavirusurilor in vitro. Elaborarea unui vaccin papillomavirus uman, eficient, a fost, în mod special, încetinită de absența unui model animal, adecvat.

Neutralizarea papillomavirusurilor de către anticorpi pare a fi specifică de tip și dependentă de epitopii conformaționali de pe suprafața virusului.

Papillomavirusurile sunt virusuri DNA icosaedrice, neîncapsulate, mici (50-60 nm), care codifică până la 8 gene timpurii și 2 gene târzii. Cadrele deschise de lectură (“open reading frames” = ORF) ale genoamelor virale sunt denumite E1 până la E7 și L1 și L2, unde “E” semnifică timpuriu și “L” semnifică tardiv. L1 și L2 codifică proteinele capsidei virale. Genele timpurii (E) sunt determinantele unor funcții cum ar fi replicarea virală și transformarea celulară.

Proteina L1 este principala proteină a capsidei și are o masă moleculară de 55-60 kDa. Proteina L2 este o proteină secundară a capsidei, care are o masă moleculară presupusă de 55-60 kDa și o masă moleculară aparentă de 75-100 kDa, determinată prin electroforeza în gel de poliacrilamidă. Datele imunologice sugerează că proteina L2 este, în cea mai mare parte, internă proteinei L1. La diferite papillomavirusuri, proteinele L2 sunt bine conservate, în special, cei 10 aminoacizi bazici de la capătul C-terminal. Regiunea ORF a genei L1 este bine conservată la diferite papillomavirusuri.

Genele L1 și L2 au fost utilizate pentru obținerea de vaccinuri pentru prevenirea și tratamentul infecțiilor papillomavirale la animale. Zhou și col. (1991; 1992) au donat gene

L1 și L2 ale papillomavirusului uman, de tip 16, într-un vector viral de tip vaccinia și au infectat celule de mamifere CV-1 cu vectorul recombinant, pentru a produce particule de tip viral (“virus-like particles).

RO 117541 Β1

Au fost obținute proteinele papilomavirale bovine recombinante L1 și L2, provenite 50 din bacterii. Serurile neutralizante pentru proteinele recombinante bacteriene au avut o reacție încrucișată, slabă, cu virusul nativ, probabil datorită diferențelor de conformație între proteinele native și cele provenite din bacteriile recombinante.

Pentru infectarea celulelor SF9, de la insecte, și pentru producerea proteinelor LI și L2, au fost utilizate baculovirusuri recombinante, care exprimă ORF-urile ( cadrele deschise 55 de lectură) ale genelor următoarelor proteine de papillomavirusuri: proteina LI, a papillomavirusului uman 6, proteina L1 a papillomavirusului uman 11, proteina L1 a papillomavirusului uman 16, proteina L1 a papillomavirusului uman 18, proteina L1 a papillomavirusului uman 31 sau proteina L2 a papillomavirusului uman 16. Analizele Western blot au arătat că proteinele L1 și L2, provenite din baculovirus, reacționează cu anticorpul pentru Papillomavirus 60 uman 16. Proteina L1 provenită din baculovirus formează particule de tip viral.

Carter și col. (1991) au demonstrat producerea de proteine L1 și L2, ale papillomavirusului uman 16, de către tulpini recombinante de Saccharomyces cerevisiae. Carter și col. au mai demonstrat și producerea de proteine L1 și L2, de tip Papillomavirus uman 6b. Proteina L1 a papillomavirusului uman 6b nu a fost o proteină L1 completă ca lungime. Prote- 65 inele recombinante au fost obținute atât ca produși intracelulari, cât și ca produși secretați. Proteinele recombinante L1 și L2 au fost similare, din punctul de vedere al masei moleculare, cu proteinele native. în cazul exprimării intracelulare a proteinelor, acestea au fost, în mare parte, insolubile, când celulele au fost lizate, în absența reactivilor pentru denaturare.

Deși această insolubilitate poate ușura purificarea proteinei, ea poate deranja analiza epito- 70 pilor nativi ai proteinei.

Proteinele recombinante secretate de drojdie s-au dovedit a conține carbohidrați cu originea în drojdie. Prezența acestor oligozaharide legate prin N-, poate masca epitopii nativi. în plus, proteinele recombinante, secretate, pot conține și alte modificări, cum ar fi păstrarea secvenței de conducere a secreției. 75

Ar fi utilă elaborarea de metode pentru producerea de cantități mari de proteine papillomavirale, de orice specie și tip, prin cultivarea de drojdii recombinante. Ar fi, de asemenea, utilă și producerea de cantități mari de proteine papillomavirale, cu caracterul imunogen al proteinelor native, cum ar fi conformația proteinei native.

Procedeul pentru prepararea vaccinului de papillomavirus uman, conform invenției, 80 cuprinde etapele:

(a) se transformă drojdia cu o moleculă ADN, respectiva moleculă ADN codificând proteinele de papillomavirus uman L1 sau L1 + L2, cu formarea unei celule de drojdie transformate;

(b) se cultivă celula transformată în condiții care permit producerea de proteine 85 recombinante și ansamblarea spontană a acestora, în particule de tip viral;

(c) se recoltează particulele de tip viral din celula transformată;

(d) se purifică particulele de tip viral, prin cel puțin o etapă cromatografică;

(e) se condiționează principiul activ, care poate să cuprindă un singur tip de particule de tip viral sau un amestec de particule de tip viral și anume particule de tip viral din papi- 90 llomavirus uman 6, papillomavirus uman 11, papillomavirus uman 16 și papillomavirus uman 18, astfel încât vaccinul să poată fi administrat pe cale orală, subcutanat, pe cale mucoasă, local sau intramuscular, opțional principiul activ putând fi adsorbit pe AI(OH)₃ la o concentrație de până la 100 ^g/ml. Drojdia este o tulpină de Saccharomyces cerevisiae. Papillomavirusul uman este selectat din grupele constând din papillomavirus uman tip 6a, papi- 95 llomavirus uman tip 6b, papillomavirus uman tip 11, papillomavirus uman tip 16, și papillomavirus uman tip 18.

Avantajul invenției este acela că se obține, printr-un procedeu nou, un medicament cu calități îmbunătățite.

RO 117541 Β1

Prezenta invenție are deci, ca obiect, procedeul pentru prepararea unui vaccin de papillomavirus uman. Proteinele recombinante ale prezentei invenții sunt capabile să formeze particule de tip viral. Aceste particule de tip viral sunt imunogene și previn formarea negilor la un model animal. Prezenta invenție utilizează, ca sistem model, papillomavirusul de la iepurele de pădure și tipul 6 de papillomavirus uman (subtipul 6a).

Au fost studiate metode, compoziții și procese pentru prevenirea, caracterizarea, detectarea și tratamentul infecției cu papillomavirus (PV). Metodele sunt bazate pe producerea proteinei recombinante L1 sau a proteinei recombinante L2, sau a proteinelor recombinante L1 și L2, în celule de drojdie. Proteinele recombinante sunt capabile să mimeze epitopii neutralizanți conformaționali ai papillomavirusului nativ. Proteinele recombinante L1 sau L1 și L2 pot fi, de asemenea, capabile să formeze particule de tip viral (VLP). Compozițiile includ, dar nu sunt limitate la molecule de DNA recombinant, care codifică proteinele L1 sau L2 sau L1 și L2, proteinele recombinante fie singure, fie în combinație cu alte proteine recombinante, particule de tip viral alcătuite din cel puțin o proteină recombinantă, fragmente de proteine recombinante, compoziții farmaceutice conținând proteinele recombinante, compoziții vaccinuri conținând proteinele recombinante, anticorpi pentru proteinele recombinante sau pentru particule de tip viral, compoziții imunogenice, conținând cel puțin o proteină recombinantă, și kituri de diagnostic conținând moleculele de DNA recombinant sau proteinele recombinante. Procedeul prezentei invenții include, dar nu se limitează la procedeul de producere a unei proteine recombinante, care constă în transformarea unei celule gazdă de drojdie adecvate, cu o moleculă de DNA recombinant, cultivarea drojdiei transformate în condiții care să permită exprimarea DNA-ului care codifică proteina recombinantă, și purificarea proteinei recombinante. Procedeul prezentei invenții mai cuprinde și administrarea proteinei recombinante, a compozițiilor proteice recombinante sau a particulelor de tip viral, la un animal, precum și la om, dar nu numai. Celule gazdă corespunzătoare includ, dar nu se limitează la tulpini de drojdie din genurile Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces și Hansenula.

Infecțiile cu papillomavirusuri apar la o varietate de animale, incluzând oameni, oi, câini, pisici, iepuri, maimuțe, șerpi și vite. Papillomavirusurile infectează celulele epiteliale, inducând, în general, tumori benigne epiteliale sau fibroepiteliale, la locul infecției.

Papillomavirusurile pot fi clasificate în grupe distincte, în funcție de gazda pe care acestea o infectează. Papillomavirusurile umane sunt ulterior clasificate în mai mult de 60 de tipuri bazate pe omologia secvenței de DNA (“Papillomaviruses and Human Cancer’, H.Pfister (ed.l, CRC Press, Inc., 1990). Tipurile de papillomavirusuri par să fie imunogeni cu specificitate de tip, prin aceea că o imunitate neutralizantă pentru infecția cu un tip de papillomavirus nu conferă imunitate față de un alt tip de papillomavirus.

La oameni, diferite tipuri de papillomavirus uman determină boli distincte. Tipurile de papillomavirus uman 1, 2, 3, 4, 7, 10 și 26-29 cauzează negi benigni atât la indivizi normali, cât și la indivizi cu imunodepresie. Tipurile de papillomavirus uman 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 și 46-50 produc leziuni plane (fără excrescențe) la indivizi cu imunodepresie. Tipurile de papillomavirus uman 6, 11, 34, 39, 41-44 și 51-55 cauzează condiloame nemaligne ale mucoasei genitale și respiratorii. Tipurile de papillomavirus uman 16 și 18 cauzează displazii epiteliale ale tractului genital și sunt asociate cu majoritatea carcinoamelor in situ și invazive ale colului uterin, vaginului, vulvei și canalului anal. Papillomavirusul uman 6 și papillomavirusul uman 11 determină majoritatea polipilor genitali și a papiloamelor laringeale.

Studii imunologice pe animale au demonstrat că producerea anticorpilor neutralizanți ai proteinelor capsidei papillomavirusului previne infecția cu virusul omolog. Elaborarea vaccinurilor eficiente pentru papillomavirusuri a fost încetinită de dificultățile datorate cultivării papillomavirusurilor in vitro. Elaborarea unui vaccin eficient pentru papillomavirus uman a fost, în mod special, încetinită de către absența unui model animal adecvat.

RO 117541 Β1

Neutralizarea papillomavirusului de către anticorpi pare să fie specifică de tip și 150 dependentă de epitopii conformaționali de pe suprafața virusului.

Papillomavirusurile sunt virusuri DNA icosaedrice, neîncapsulate, mici (50-60 nm) care codifică până la 8 gene timpurii și 2 gene tardive. Cadrele deschise de lectură ale genomurilor virale sunt notate E1 - E7 și L1 și L2, unde Έ semnifică timpuriu, iar “L” semnifică tardiv. L1 și L2 codifică proteinele capsidei virale. Genele timpurii (E) determină funcții cum 155 ar fi replicarea virală și transformarea.

Proteina L1 este principala proteină a capsidei și are o masă moleculară de 55-60 kDa. Proteina L2 este o proteină secundară a capsidei, care are o masă moleculară presupusă de 55-60 kDa și o MM aparentă de 75-100 kDa, determinată prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. 160

A fost prezentată producerea de proteine L1 papillomavirus uman 16, L2 papillomavirus uman 16 și L1 papillomavirus uman 6 de către tulpini recombinante de Saccharomyces cerevisiae. Ar fi utilă elaborarea de procedee pentru producerea de cantități mari de proteine papillomavirale de la orice specie și tip, prin cultivarea drojdiilor recombinante. Ar fi, de asemenea, utilă producerea de cantități mari de proteine papillomavirale cu proprietățile imuno- 165 gene ale proteinelor native, cum ar fi conformația proteinei native.

Studiile sunt direcționate spre producerea de proteine papillomavirale, recombinante, cu proprietățile imunogene ale proteinelor papillomavirale native, ca și spre metodele de producere, de utilizare a lor și în particular, spre producerea unui vaccin profilactic pentru infecția cu papillomavirus. 170

Prezenta invenție este exemplificată prin următoarele sisteme model: papillomavirusul de la iepurele de pădure și papillomavirusul uman de tip 6. Exemplificarea nu limitează scopul invenției care include și alte tipuri și subtipuri de papillomavirus (PV), incluzând, dar nu limitat la papillomavirus uman tip 16, papillomavirus uman tip 11 și papillomavirus uman tip 18, ca și papillomavirus uman subtipul 6a și papillomavirus uman subtipul 6b. 175

Compoziții farmaceutice utile conținând proteinele sau particulele de tip viral pot fi formulate în conformitate cu procedeele cunoscute, cum ar fi prin amestecarea cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Exemple de astfel de purtători sau de metode de formulare pot fi găsite în Remington’s Pharmaceutical Sciences. Pentru formarea unei compoziții acceptabile farmaceutic și adecvată administrării eficiente, aceste compoziții 180 trebuie să conțină o cantitate eficientă de proteină sau de particulă de tip viral. Asemenea compoziții pot conține proteine sau particule de tip viral provenite de la mai mult de un tip de papillomavirus uman.

Compozițiile terapeutice sau de diagnostic sunt administrate unui pacient în cantități suficiente pentru a trata sau diagnostica infecțiile cu papillomavirus. Cantitatea eficientă 185 poate varia, în funcție de o varietate de factori cum ar fi: starea individului, greutatea, sexul și vârsta. Alți factori includ modul de administrare. în general, compozițiile sunt administrate în doze cuprinse între 1 μ$ până la 250 /^g.

Compozițiile farmaceutice pot fi administrate pacientului printr-o varietate de căi, cum ar fi, subcutanat, local, oral, la nivelul mucoasei și intramuscular. 190

Vaccinurile obținute conform procedeului invenției conțin proteine recombinante sau particule de tip viral care conțin determinanții antigenici necesari pentru inducerea formării anticorpilor neutralizanți în gazdă. Astfel de vaccinuri prezintă și o suficientă siguranță pentru a fi administrate fără pericol de infectare clinică, nu prezintă efecte toxice asociate; pot fi administrate pe orice cale eficientă, sunt stabile, și sunt compatibile cu purtătorii vaccinului. 195

Vaccinurile pot fi administrate pe mai multe căi, cum ar fi orală, parenterală, subcutanată, la nivelul mucoasei sau intramusculară. Doza administrată poate varia în funcție de starea, sexul, vârsta și greutatea individului; calea de administrare; și de tipul de papilloma

RO 117541 Β1 virus al vaccinului. Vaccinul poate fi utilizat în forme de dozare cum ar fi: capsule, suspensii, elixiruri, sau soluții lichide. Vaccinul poate fi formulat cu un purtător (excipient) acceptabil din punct de vedere imunologic.

Vaccinurile sunt administrate în cantități eficiente terapeutic, adică, în cantități suficiente pentru a genera un răspuns protector din punct de vedere imunologic. Cantitatea eficientă terapeutic poate varia, în funcție de tipul de papillomavirus. Vaccinul poate fi administrat în doză unică sau în doze multiple.

Procedeul prezentei invenții face posibilă obținerea vaccinurilor subvirale, pentru prevenirea infecției cu papillomavirus. Utilizând aceste procedee, pot fi preparate vaccinuri pentru papillomavirus fie monovalente, fie multivalente. Spre exemplu, un vaccin monovalent de papillomavirus uman de tip 16 poate fi preparat prin formularea proteinelor recombinante: proteina L1 de papillomavirus uman 16, sau proteina L2 papillomavirus uman 16, sau proteinele L1 și L2. Alternativ, un vaccin papillomavirus uman multivalent poate fi obținut prin amestecarea proteinelor L1 sau L2 sau L1 și L2 sau a particulelor de tip viral de la diferitele tipuri de papillomavirus uman.

Proteinele recombinante și particulele de tip viral descrise, conform invenției, pot fi utilizate în formularea compozițiilor imunogenice. Asemenea compoziții, când sunt introduse într-o gazdă adecvată, sunt capabile să inducă un răspuns imunologic în gazdă.

Proteinele recombinante și particulele de tip viral pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi. Termenul “anticorp” utilizat în prezenta invenție include atât anticorpii policlonali, cât și pe cei monoclonali, ca și fragmente ale acestora, cum ar fi fragmente Fv, Fab și F(ab)2 care sunt capabile să lege antigenul sau haptena.

Proteinele recombinante, particulele de tip viral și anticorpii descriși, conform invenției, pot fi utilizați pentru infectarea cu serotipul papillomavirus uman și screeningul papillomavirus uman.

Proteinele recombinante, particulele de tip viral și anticorpii conduc ei înșiși la formularea kiturilor corespunzătoare pentru detectarea și serotipizarea papillomavirusului uman. Un asemenea kit va conține un suport compartimentat corespunzător pentru a menține fix cel puțin un container. Purtătorul va mai cuprinde și reactivi, cum ar fi proteina recombinantă a papillomavirusului uman sau particule de tip viral sau anticorpi anti-papillomavirus uman corespunzători detectării unei varietăți de tipuri de papillomavirus uman. Purtătorul mai poate conține și mijloace de detectare, cum ar fi antigenul marcat sau substraturi enzimatice sau similari.

Proteinele recombinante și particulele de tip viral ale prezentei invenții sunt, de asemenea, utile ca markeri pentru masa moleculară și pentru mărimea moleculară.

Sunt prezentați vectori recombinanți de exprimare care codifică proteinele L1 și L2 ale papillomavirusului, procedee de producere a proteinelor recombinante și metode de utilizare a proteinelor recombinante.

Se dau, în continuare, exemplele de realizare ale invenției în legătură cu fig. 1...14 care reprezintă:

- fig.1, vectorul de expresie bidirecțională în drojdie, utilizat pentru exprimarea proteinelor L1 și/sau L2 ale capsidei papillomavirusului;

- fig.2, exprimarea proteinei L1 din papillomavirus uman 6a la drojdie (imunoblot);

- fig.3, exprimarea proteinei L2 din papillomavirus uman 6a la drojdie. Imunoblotul proteinei L2 din papillomavirus uman 6a exprimat în celula de drojdie; banda 1 - markeri pentru masa moleculară; banda 2 - proteina de fuziune trpE-L2, exprimată în celule de E.coli, ca martor pozitiv; banda 4 - L1 de tip papillomavirus uman 6a exprimată în celule de drojdie, ca martor negativ; banda 5, L2 de tip papillomavirus uman 6a, exprimată în celule de drojdie (pentru detalii experimentale, a se vedea textul);

RO 117541 Β1

- fig.4, fotografie la microscopul electronic a particulelor de tip viral L1 papillomavirus uman 6a, exprimate în celule de drojdie;

- fig.5, fotografie la microscopul electronic a particulelor de tip viral L1/L2 papillomavi- 250 rus uman 6a, exprimate în celule de drojdie;

-fig.6, imunobloturile pentru proteinele L1, L2 și L1 + L2 ale papillomavirusului de la iepurele de pădure (CRPV), exprimate în celule de drojdie. Fotografia (A): Exprimarea proteinei L1 a CRPV, măsurată prin reactivitatea cu antiserul anti-L1 de CRPV. Fotografia (B): Exprimarea proteinei L2 de CRPV măsurată prin reactivitatea cu antiserul anti-L2 de CRPV. 255 Banda 1-markeri pentru MM, în kDa (Markeri Amersham Rainbow™, 14300 - 200000 daltoni); Banda 2, BJ5462 conținând vectorul de exprimare pentru L1 a CRPV; Banda 3, tulpina 1569 conținând vectorul de exprimare pentru L2 de la CRPV; Benzile 4 și 5, două izolate ale tulpinii 1569 cotransformate cu două plasmide pentru exprimarea proteinei L1 CRPV și L2 CRPV; Benzile 6-8, trei izolate ale tulpinii 1569 conținînd un vector singular pentru coexpri- 260 marea proteinelor L1 și L2 CRPV; Benzile 9 și 10, două izolate ale BJ5462 conținând un singur vector pentru coexprimarea proteinelor L1 și L2 ale CRPV. Pozițiile de migrare ale proteinelor L1 și L2 sunt marcate pe axa dreaptă a fotografiei corespunzătoare,

- fig.7, reprezentare schematică a structurii tulpinii 1558 de S.cerevisiae;

- fig.8, reprezentare schematică a structurii tulpinii 1569 de S.cerevisiae; 265

- fig.9, subliniază etapele majore dintr-un procedeu de purificare;

- fig. 10, lista tulpinilor;

- fig.11, un set de analize SDS-PAGE ale proteinelor L1+L2 de papillomavirus uman 16, purificate din drojdie. în afara particulelor de tip viral purificate complet, sunt incluse și resturi din etapele intermediare din procesul de purificare. Tabelul permite identificarea pro- 270 bei în fiecare bandă. Sunt cuprinse un gel colorat cu Coomassie coloidal, ca și bloturi Western sondate cu antiseruri pentru proteinele L1 și L2;

- fig. 12, un proces alternativ, schematic, de purificare a proteinei L1 papillomaviral de iepure de pădure;

- fig.13 și 14, analize SDS/PAGE ale particulei de tip viral purificată. 275

Se dau, în continuare, exemplele de realizare a invenției:

Exemplul 1.

Prepararea tulpinii U9 de drojdie

Tulpina 2150-2-3 de Saccharomyces cerevisiae (MATa, Ieu2-O4, adel, cir⁰) se obține de la Dr.Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Celulele tulpinii 2150-2-3 280 sunt proliferate peste noapte la 30°C în 5 ml de mediu YEHD (Carty et al., J. Ind. Micro. 2 (1987)(117-121). Celulele sunt spălate de trei ori în apă distilată sterilă, resuspendate în 2 ml de apă distilată sterilă, și 0,1 ml de suspensie celulară sunt însămânțate pe fiecare din cele 6 plăci cu acid 5-fluoro-orotic (FOA) în scopul selectării mutantelor ura3. Plăcile sunt incubate la 30°C. Mediul conține următoarele ingrediente pe 250 ml de apă distilată: 3,5 g 285 Difco Yeast Nitrogen Base fără aminoacizi și sulfat de amoniu; 0,5 g acid 5-fluoro-orotic; 25 mg uracil; și 10,0 g dextroză.

Mediul este sterilizat prin filtrare pe membrane de 0,2 μηη și apoi se amestecă cu 250 ml Bacto-Agar 4%, menținut la 50°C, 10 ml dintr-o soluție de adenină 1,2 mg/ml și 5 ml soluție de L-leucină (180 mg/50 ml). Mediul rezultat este repartizat câte 20 ml per placă petri. 290

După 5 zile de incubare, apar numeroase colonii. Coloniile sunt izolate prin reînsămânțarea coloniilor de pe plăcile inițiale cu FOA pe plăci cu FOA proaspăt, care se incubează la 30°C. Un număr de colonii de pe al doilea set de plăci cu FOA se testează din punct de vedere al prezenței mutației ura3 prin plasarea de replici atât pe plăcile YEHD, cât și pe plăcile lipsite de uracil. Rezultatul dorit este creșterea bună pe mediul YEHD și lipsa 295 creșterii pe mediul lipsite de uracil. Se obține un izolat care a prezentat aceste proprietăți

RO 117541 Β1 (U9). El este păstrat sub forma unui stoc înghețat în glicerol(tulpina # 325) la - 70°C pentru utilizare ulterioară.

Exemplul 2.

Prepararea unui vector pentru scindarea genei MNN9 de drojdie în scopul preparării unui vector pentru scindarea genei MNN9, este necesară, mai întâi, donarea genei MNN9 de la DNA-ul genomic de S. cerevisiae. Aceasta se realizează prin utilizarea tehnicii standard PCR de amplificare enzimatică a DNA. Pentru amplificarea enzimatică a secvenței codificatoare MNN9 în toată lungimea ei, se desemnează un primer cu sens 5' și un primer antisens 3', pe baza secvenței publicate a genei MNN9 de drojdie EPO No.88117834.7, publicația Nr. 0-314-096-A2). Se utilizează următorii primeri oligodeoxinucleotidici conținând situsurile Hind III de flancare:

primerul sens: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC

G-3'(SECV. IDNO:1) primerul antisens: 5’-TGA TAAGCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC

CTC-3' (SECV.ID NO:2)

Codonul de inițiere pentru metionină al genei MNN9 este reprezentat prin litere boldate. Tehnica PCR a fost realizată utilizând DNA genomic de la S.cerevisiae, tulpina JRY 188 drept matriță, DNA polimeraza Taq (Perkin Elmer) și 25 de cicluri de amplificare (94°C minut, 37°C 2 min, 72°C 3 min). Fragmentul PCR 1,2 kpb rezultat este digerat de Hindlll, purificat pe gel, și legat cu pUC13 (Pharmacia) tratat cu fosfatază alcalină și digerat cu Hindlll. Plasmida rezultată a fost denumită p1183.

în scopul scindării genei MNN9 de gena URA3 de drojdie, plasmida pBR322-URA3 (care conține fragmentul Hindlll de 1,1 Kpb care codifică gena URA3 de S.cerevisiae subclonată în situsul Hindlll al PBR322) este digerată cu Hindlll, iar fragmentul de 1,1 kpb de DNA care poartă gena URA3 funcțională, se purifică pe gel, are capetele tăiate drept de DNA polimeraza T4, iar apoi se utilizează plasmida p1183 digerată cu Pmll care realizează legarea extremităților drepte (Pmll taie în interiorul secvenței care codifică MNN9). Plasmida p1199 rezultată, conține o genă MNN9 scindată de gena funcțională URA3.

Exemplul 3.

Construirea tulpinii 1372 derivate din U9, conținând scindarea genei MNN9

Pentru scindarea genei MNN9 din tulpina U9 (325), 30 ^g de plasmidă p1199 se digeră cu Hindlll pentru crearea unei casete lineare de scindare mnn9:URA3. Celulele aparținând tulpinii 325 se transformă cu DNA-ul p1199 digerat cu Hindlll, prin metoda sferoplastului ((Hinnen et al., 1978, Proc. Natl.Acad.Sci. USA & 5:1929-1933) iar transformanții se selectează pe un mediu sintetic cu agar lipsit de uracil și conținând 1,0M sorbitol. Mediul sintetic a conținut, per litru de apă distilată: agar, 20 g; sursă azot - drojdia fără aminoacizi, 6,7 g; adenină 0,04 g; L-tirozină, 0,05 g; sorbitol 182 g; glucoză 20 g; și soluție fără leucină * care conține per litru de apă distilată: L-arginină 2 g; L-histidină, 1 g; L-leucină 6 g; L-isoleucină 6 g; L-lizină, 4 g; L-metionină 1 g; L-fenilalanină 6 g; L-treonină, 6 g; L-triptofan 4 g.

Plăcile se incubează la 30°C timp de 5 zile, după care se observă apariția a numeroase colonii. Se obțin preparate de DNA cromozomial, de la 10 colonii, și apoi se digeră cu EcoRI plus Hindlll.Produșii de digestie ai DNA se evaluează prin Southern blot (J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) utilizând fragmentul Hindlll de 1,2 kpb care poartă gena MNN9 (izolat din plasmida p1199) drept sondă. Se identifică un izolat (tulpina * 1372) care prezintă pozițiile benzii DNA dorite pe Southern blot, și se observă agregarea extremă caracteristică pentru mutantele MNN9.

RO 117541 Β1

Exemplul 4.

Construirea unui vector pentru scindarea genei HIS3 de drojdie 345 în scopul construirii unei casete de scindare în care gena HIS3 de la S.cerevisiae este scindată de gena URA3, plasmida Yep6 (K.Struhl et al., 1979, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76:1035) se digeră cu enzima BamHI. Fragmentul BamHI de 1,7 kpb purtând gena HIS3 se purifică în gel, se taie neted cu DNA polimeraza T4, și se leagă la pUC18, care a fost anterior digerat cu BamHI și tratat cu DNA polimeraza T4. Plasmida rezultată (denumită p1501 350 sau pUC18-HIS3) se digeră cu Nhel (care taie în secvența care codifică HIS3), iar fragmentul de vector se purifică în gel, se taie cu capete netede de DNA polimeraza T4, și apoi tratează cu fosfatază alcalină de intestin de vițel. Gena URA3 se izolează din plasmida pBR322-URA3 prin digestie cu enzima Hindlll, iar fragmentul de 1,1 kpb care poartă gena URA3 se purifică pe gel, se taie cu capetele netede cu ajutorul DNA polimerazei T4, și se 355 leagă cu fragmentul pUC18-HIS3 Nhel de mai sus. Plasmida rezultată (denumită pUC18his3::URA3 sau p1505) conține o casetă de scindare în care gena HIS3 de drojdie este scindată de gena URA3 funcțională.

Exemplul 5.

Construirea vectorului pentru scindarea genei PRB1 de drojdie de către gena 360 HIS3

Plasmida FP8AH care poartă gena PRB1 de drojdie a fost furnizată de către Dr.E.Jones de la Carnegie-Mellon Univ. (C.M.Moehle et al., 1987, Genetics 115+255-263). Aceasta se digeră cu Hindlll plus Xhol, iar fragmentul de DNA de 3,2 kpb care poartă gena PRB1 se purifică în gel și se taie cu capete netede prin tratament cu DNA polimeraza T4. 365

Plasmida pUC18 se digeră cu BamHI, se purifică în gel și se taie cu capete netede cu ajutorul DNA polimerazei T4. Fragmentul de vector rezultat se leagă cu fragmentul de genă PRB1 de mai sus pentru obținerea plasmidei pUC18-PRB1. Plasmida Yep6, care conține gena HIS3 se digeră cu BamHI. Fragmentul BamHI de 1,7 kpb rezultat, purtător al genei funcționale HIS 3 se purifică în gel și se netezește la capete prin tratament cu DNA polimeraza T4. 370

PUC18-PRB1 este digerată cu EcoRV plus Ncol care taie în interiorul secvenței codificatoare PRB1 și se îndepărtează situsul activ pentru proteaza B și secvența de flancare. Fragmentul de 5,7 kpb din plasmida EcoRV-Ncol, purtător al porțiunilor 5' și 3' ale secvenței codificatoare pentru PRB1 în pUC18, se purifică în gel, se taie cu capete netede prin tratament cu DNA polimeraza T4, se defosforilează cu fosfatază alcalină de intestin de vițel și se leagă 375 cu fragmentul de HIS3 neted la capete, descris mai sus. Plasmida rezultată (denumită pUC18-prb1::HIS3, stoc * 1245) conține gena funcțională HIS3 în locul fragmentului genei PRB1 a cărei deleție a fost prezentată mai sus.

Exemplul 6.

Construirea unei tulpini de drojdie înrudite cu U9, conținând scindări ale 380 genelor MNN9 și PRB1

Tulpina 1372 înrudită cu U9, care conține o scindare a genei MNN9, a fost descrisă în exemplul 3. Izolatele clonale ale tulpinii 1372 se trec pe plăci cu FOA pentru selectarea mutantelor ura3. Se obține un număr de izolate ura3 ale tulpinii 1372, iar un izolat (tulpina 12930-190-S1-1) se selecționează pentru scindarea ulterioară a genei HIS3. Vectorul 385 (p1505) de scindare a genei pUC18-his3::URA3 se digeră cu Xbal plus EcoRI pentru a genera o casetă lineară de scindare his3::URA3 și se utilizează pentru transformarea tulpinii 12930-190-S1-1 prin metoda cu acetat de litiu (Methods in Enzymology, 194:290 (1991)). Transformantele ura⁺ au fost selecționate pe mediu sintetic cu agar lipsit de uracil, reînsămânțate pe același mediu în scopul izolării clonelor, iar apoi au fost plasate replici pe mediu 390 lipsit fie de uracil, fie de histidină pentru screeningul acelor izolate care au fost atât Ura⁺, cât

RO 117541 Β1 și His’. Un izolat (tulpina 12930-230-1) a fost selecționat pentru scindarea ulterioară a genei PBR1. Vectorul de scindare a genei PRB1 (pUC18-prbi::HIS3, stoc * 1245) se digeră cu enzimele Saci plus Xbal pentru generarea unei casete de scindare lineară prbl::HIS3, și se utilizează pentru transformarea tulpinii 12930-230-1 prin metoda cu acetat de litiu. Transformantele His⁺ se selecționează pe mediu cu agar lipsit de histidină, și se reînsămînțează pe același mediu pentru izolarea clonelor. DNA-ul genomic se prepară dintr-un număr de izolate His⁺ rezultante, se digeră cu EcoRI, și apoi se supune electroforezei pe geluri de agaroză 0,8%. Se efectuează analize Southern blot prin utilizarea unei sonde de 617 pb radio-marcate, pentru gena PRB1 care se prepară prin tehnica PCR (amplificare enzimatică a DNA), utilizând următorii primeri oligodezoxinucleotidici:

5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3' (SECV. ID Nr.:3)

5’ CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (SECV. ID Nr:4)

Se obțin 11 izolate care prezintă hibridizarea prevăzută a sondei cu un fragment de DNA de 2,44 kpb prb1:HIS3. Aceasta este în contrast cu hibridizarea sondei cu fragmentul de 1,59 kpb, în cazul genei PRB1 de tip sălbatic. Unul dintre aceste izolate conținând scindarea dorită prb1::HIS3 este selecționat pentru utilizarea ulterioară, și acesta este denumit tulpina * 1558.

Exemplul 7.

Construirea unui vector pentru scindarea genei PEP4 de drojdie

Gena PEP4 de S.cerevisiae se donează dintr-o bibliotecă genomică de drojdie, în următoarea manieră: celule de E.coli conținând biblioteca genomică de drojdie pLS101 (Schultz și Friesen, 1983, J.Bacteriol. 155:8-14)) se cultivă peste noapte în 5ml de mediu LB conținând ampicilină 100 ^g/ml. Din această cultură, se însămânțează diluții de W⁴ și 10 ⁵ pe plăci cu LB plus ampicilină. Coloniile se prepară cu ajutorul filtrelor de nitroceluloză. O sondă de 600 pb (perechi de baze) pentru gena PEP4 din genomul de drojdie, se prepară cu tehnica PCR utilizând DNA polimerază Taq, întregul DNA plasmidic din biblioteca pS101 de drojdie, și următorii primeri oligodezoxinucleotidici denumiți pe baza secvenței de DNA publicate pentru PEP4 (C.A.Woolford et al., Mol. Cell. Biol,6:25Q0 (1986)).

Primer sens: 5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3' (SECV.ID Nr.5) Primer antisens: 5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3'(SECV.ID Nr.6).

Tehnica PCR se realizează în 25 de cicluri de amplificare (94°C 1 min, 37°C 2 min, 72°C 3 min). Sonda PCR se purifică în gel, se marchează radioactiv, și hibridizează cu filtrele de colonii de mai sus. Câteva colonii sunt pozitive din punct de vedere al hibridizării cu sonda PEP4 și se reînsămânțează pe plăci LB plus ampicilină pentru monocolonii. DNA-ul plasmidic se prepară prin liză alcalină-SDS (Sambrook et al., supra) a câtorva izolate și apoi, se digeră cu BamHI. Se observă banda vectorului de 14 kpb prevăzut, și banda de inserție pentru PEP4 de 6,9 kpb. După dubla digestie cu EcoRI plus Xhol, se observă banda de 1,5 kpb prevăzută pentru PEP4. Un izolat (tulpina * 860) prezentând rezultatele așteptate, se selecționează pentru utilizare în continuare. DNA-ul plasmidic din tulpina * 860 se digeră cu BamHI, iar fragmentul de DNA BamHI de 6,9 kpb purtător al genei cromozomiale PEP4, se subclonează în situsul BamHI al pUC13 pentru producerea plasmidei p890. Plasmida p890 se digeră apoi cu Ncol (care taie în interiorul secvenței de codificare a PEP4), se purifică în gel, se taie cu capete netede prin tratament cu DNA polimerază T4, și se leagă la fragmentul de 1,1 kpb neted la capete care poartă gena funcțională URA3 (preparată ca în exemplul 2). Plasmida rezultată, conținând gena PEP4 scindată de gena URA3, a fost denumită pUC13-pep4::URA3 (tulpina * 906).

RO 117541 Β1

Exemplul 8.

Construirea tulpinii de drojdie * 1569 care este derivată din tulpina U9 care conține mutațiile prb1 și pep4 în scopul scindării genei HIS3 în tulpina U9, vectorul de scindare pUC18-his3::URA3 se digeră cu EcoRI plus Xbal și utilizează, apoi, pentru transformarea tulpinii U9 prin metoda cu acetat de litiu. Transformantele Ura⁺ se selecționează pe mediu cu agar lipsit de uracil, și se reînsămînțează pe același mediu pentru izolarea clonelor. Un număr de izolate Ura⁺rezultate se plasează în replică pe mediu cu agar lipsit, fie de uracil, fie de histidină și sunt alese cele care au fost atât Ura⁺, cât și His'. Un izolat (tulpina * 1524) se selecționează pentru scindarea ulterioară a genei PRB1. Vectorul pUC18-prb1::HIS3 de scindare a genei PRB1, se digeră cu Saci plus Xbal și apoi, se utilizează pentru transformarea tulpinii * 1524 prin metoda cu acetat de litiu. Transformantele His⁺ se selecționează pe mediu cu agar lipsit de histidină, și se reînsămînțează pentru izolarea clonelor, pe același mediu. DNA-ul genomic se prepară dintr-un număr de izolate His⁺ și se evaluează prin hibridizare Southern blot cu o sondă PRB1 radio-marcată. Unul dintre izolate (tulpina * 1537), prezentând scindarea dorită a genei PRB1 de gena HIS3 (adică prb1::HIS3) se selecționează pentru scindarea ulterioară a genei PEP4. Tulpina * 1537 se trece pe plăci FOA în scopul obținerii de izolate ura 3, iar un izolat (tulpina * 1541) se selecționează pentru utilizare în continuare.

în scopul scindării genei PEP4 în tulpina * 1541, vectorul pUC13-pep4.:URA3 cu gena PEP4 scindată se digeră cu Xhol pentru producerea unei casete lineare de scindare pep4::URA3 și se utilizează pentru transformarea tulpinii * 1541 prin metoda cu acetat de litiu. Transformantele Ura⁺ se selecționează pe mediu cu agar lipsit de uracil și se însămânțează pentru izolarea clonelor pe același mediu. DNA-ul genomic este preparat dintr-un număr de transformante Ura⁺ și evaluat prin Southern blot utilizând o sondă radiomarcată pentru gena PEP4. Un izolat (tulpina + 1569), prezentând scindarea dorită a genei PEP4 de gena URA3, se selecționează pentru utilizare în continuare.

Exemplul 9.

Construirea vectorului pentru exprimarea genei L1 de papillomavirus de iepure de pădure (CRPV)

Gena CRPV L1 se amplifică prin tehnica PCR, din plasmida pLAII care conține genomul viral complet de CRPV (Dr.Peter Howley, NCI), cu ajutorul polimerazei Vent (New England Biolabs, Inc.); au fost utilizate 35 de cicluri de amplificare (94°C, 1 minut; 50°C, 1 minut; 72°C, 2 min) și următorii primeri oligonucleotidici care conțin situsuri Bglll de flancare (subliniate): primerul sens: 5-GAA GAT CTT CAA AAC AAAĂTG GCA GTG

TGG CTG TCT AC-3' (SECV. ID Nr.:7) primerul antisens: 5'-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG

CGT TTAG-3' (SECV. ID Nr.: 8)

Primerul sens introduce o secvență conducătoare netradusă, de drojdie, imediat înainte de codonul pentru inițierea metioninei din gena CRPV L1 (scris cu litere boldate). Produsul L1 de 1,6 kb obținut prin tehnica PCR, a fost digerat cu Bglll, purificat în gel, și subclonat în situsul Bgl II al vectorului pSP72 pentru producerea plasmidei pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1).

O subclonă se secvențializează complet și se observă că diferă prin 4 nucleotide față de secvența CRPV L1 publicată. Modificările nu au ca rezultat modificări de aminoacizi.

Gena L1 este tăiată și se îndepărtează din pSP72-CRPV-L1 sub forma unui fragment Bgl

II după care este subclonată în unicul situs Bam HI localizat între promotorul GAL10 de drojdie și terminatorul transcripțional ADH1 din vectorul de exprimare în drojdie pC1/1-GAL10p440

445

450

455

460

465

470

475

480

485

RO 117541 Β1

ADHIt care conține promotorul GAL 10 din Yep52 (Broach et al., Exp.Manipulation of Gene

Expression, 1983, 83:81-116) și terminatorul transcripțional ADH1 dintr-un vector de bază pC1/1). Plasmida rezultată este denumită p12930-323-6-1.

Exemplul 10.

Construirea vectorului de exprimare pentru gena L2 de CRPV

Gena L12 de CRPV (papillomavirus de iepure de pădure) se amplifică prin tehnica PCR utilizând polimerază Vent (New England Biolabs, Inc.), din plasmida pLAII după digerarea plasmidei cu Sall, purificarea fragmentului de 7,9 Kb și legarea acestuia cu el însuși. Se realizează 35 de cicluri de amplificare (90°C, 1 minut; 50°C, 1 minut; 72°C, 2 min) și se utilizează următorii primeri oligonucleotidici care conțin situsurile de flancare ale EcoRI subliniate: primer sens: 5'-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC

GGG CAC GAA AAC -3'(SECV. ID Nr.:9) primer antisens: 5'-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA

CAC TG-3' (SECV. ID Nr.:10)

Primerul sens introduce o secvență conducătoare netradusă de drojdie, imediat înaintea codonului de inițiere pentru metionină al genei L1 de la CRPV (cu litere boldate). Produsul de 1,5 kb obținut prin PCR a fost digerat cu EcoRI, purificat pe gel și subclonat în situsul pentru EcoRI al vectorului promotor bidirecțional pUC18-GAL1p-GAL10p conținând promotorul divergent de drojdie GAL1/GAL10. Acest vector conține un situs unic pentru BamHI între promotorul GAL1 și o primă copie a terminatorului transcrierii ADH1. Caseta de expresie rezultată este transferată pe un fragment Sphl de 1,4 kb. O clonă (p12930-295-2-2) conținând inserția dorită a genei L2 adiacentă promotorului GAL10, a fost complet secvențializată și s-a dovedit a conține 6 nucleotide schimbate față de secvența publicată, dintre care 4 au avut drept rezultat modificări de aminoacizi. Analiza secvenței matriței originale a DNA a confirmat că modificările au fost prezente și în pLAII, și nu au fost introduse prin PCR. Vectorul pUC18-GAL1p-GAL10p conținând gena L2, a fost tăiat cu Sphl, iar fragmentul de 2,9 kb care poartă caseta de exprimare ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t a fost legat cu fragmentul mare Sphl din vectorul suveică de drojdie pC1 /1. Plasmida rezultată a fost denumită p12930-323-2-3 (pC1/1-GAL1p-GAL10p-CRPV-L2).

Exemplul 11.

Exprimarea proteinelor L1 și L2 din capsida CRPV în drojdie

Plasmidele p12939-323-6-1 și p12930-323-2-3 (pC1/1-GAL10p-CRPV/L1 și pC1/1GAL1p-GAL10P-CRPV/L2) au fost utilizate pentru transformarea tulpinilor de S.cerevisiae * 1569, B15462 (E.W.Jones, Methods in Enzymology, 194 (1991) 428-453) și BJ1995 (Jones, ibid.). Izolatele clonale au fost cultivate la 30°C în mediu YEHD conținând 2% galactoză timp de 48-72 h. După recoltarea celulelor, acestea au fost lizate cu mărgele de sticlă, Triton X-100 a fost adăugat până la concentrația finală de 0,5%, iar lizatele celulare rezultate au fost evaluate din punct de vedere al exprimării proteinelor L1 și L2 de CRPV, prin analize de imunobloting. Probele care au conținut 40 ^g de proteină celulară totală, au fost supuse electroforezei pe geluri de Tris-glicină 12% (Norvex) în condiții reducătoare și denaturante, și electroblotingului pe membrane de PVDF (Norvex). Proteinele L1 și L2 de la CRPV au fost detectate cu ajutorul antiserurilor policlonale de iepure anti-L1 sau anti-L2 (dăruite de Dr.John Kreider, Hershey Medical Center) ca anticorpi primari și proteina A cuplată cu peroxidază din hrean (Amersham, Inc.), ca anticorp secundar. Membranele au fost prelucrate utilizând kitul de detecție chemiluminiscentă ECL™ (Amersham, Inc.). O bandă a proteinei L1 de 55-61 kDa a fost detectată în toate probele care conțin plasmida de exprimare pentru L1, iar o proteină pentru L2, de 90 kDa a fost detectată în toate probele de clone de drojdie care conțin plasmida de exprimare pentru L2.

RO 117541 Β1

Nu a fost detectat nici un semnal în probe provenite din clonele de drojdie purtătoare 535 ale plasmidei de exprimare pentru L1 cu antiseruri anti-L2 sau invers.

Exemplul 12.

A. Purificarea proteinei recombinante L1 din capsida CRPV

Toate etapele au fost realizate la 4°C, dacă nu este altfel specificat. Celulele, stocate la - 70°C, au fost dezghețate și suspendate într-un volum egal de “Tampon L1 (20 mM fos- 540 fat de sodiu, pH7,2, 100 mM NaCI, 1,7 mM EDTA).

La această suspensie s-au adăugat inhibitorii proteazei PMSF și Pepstatina A până la concentrația finală de 2 mM și, respectiv 1,7 μΜ. Celulele au fost lizate prin 10 treceri printr-un microfluidizator. Lizatul a fost clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantul a fost întins pe suprafața unui strat de 5 cm de sucroză 45% (gr./vol) în tam- 545 ponul pentru L1, iar L1 a fost separată prin centrifugare la 100000 x g timp de 4 h. Depozitul a fost resuspendat în tampon pentru L1, 1/10 volume și clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantului i s-a adăugat Tween-80 până la o concentrație finală de 0,01% (v/v), iar supernatantul a fost fracționat la temperatura camerei prin cromatografie selectivă pe baza dimensiunii pe o coloană de 1700 ml (5 cm diametru intern) de rășină 550 Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Tamponul de eluare pentru această coloană a fost 10 mM fosfat de sodiu, pH7,2, 150 mM NaCI, 0,01% (v/v) Tween-80. Fracțiile conținând material imunoreactiv observat prin imunoblotting, au fost reunite și concentrate până la 1/6 din volum prin ultrafiltrare, utilizând un agitator de celule Amicon cu o membrană subțire, de diametru 76 mm YM-100 (100000 MWCO). Produsul a fost filtrat steril printr-o membrană 555 de 0,22 μπι MiIlex-GV (Millipore). Proteina L1 a capsidei papillomavirale de iepure de pădure, purificată, a fost adsorbită pe hidroxid de aluminiu la o concentrație de 100 Mg/ml.

B. Caracterizarea proteinei recombinante L1 a capsidei papillomavirale de la iepurele de pădure

Identificarea produsului final a fost confirmată prin Western blotting și prin analiza 560 secvenței N-terminale. Puritatea a fost determinată prin SDS/PAGE cu colorare cu Coomassie și argint, și prin electroforeză cu cernere capilară (“Solution Sieving Capillary Electrophoresis” = SSCE) cu detecție optică la 215 nm. Preparatul a fost proteina L1 de puritate 75%, prin SSCE.

Exemplul 13. 565

Purificarea proteinei L2 recombinante din capsida papillomavirală de iepure de pădure

Toate etapele au fost derulate la 4°C, acolo unde nu se specifică altfel. Celulele, păstrate la - 70°C, au fost dezghețate și suspendate înfr-un volum egal de “tampon L1 (20 mM fosfat de sodiu, pH7,2, 100 mM NaCI, 1,7 mM EDTA). Suspensiei i s-au adăugat inhibitorii 570 proteazici PMSF și Pepstatina a, până la concentrația finală de 2mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Celulele au fost lizate prin 10 treceri printr-un microfluidizator. Lizatul a fost clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantul a fost întins pe un strat de 5 cm de 45% sucroză (v/v) în tampon L1, iar L2 a fost separată prin centrifugare la 100000 x g timp de 4 h. Depozitul a fost resuspendat în tampon L1 în raport de 1/10, în volum. Depozitul 575 resuspendat a fost clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantului i s-a adăugat Tween-80 până la o concentrație finală de 0,01 % (v/v), iar supernatantul a fost fracționat la temperatura camerei prin cromatografie selectivă, pe o coloană de 1700 ml (5 cm ID) de Sephacryl S-1000 (rășină Pharmacia). Tamponul de eluare pentru această coloană a fost fosfat de sodiu 10 mM, pH7,2, NaC1150 mM, Tween-80 0,01% (v/v). Fracțiile 580 conținând material imunoreactiv evaluat prin imunobloting, au fost reunite. Fracțiile reunite au fost analizate prin SDS/PAGE (argint) și prin Western blotting.

RO 117541 Β1

Exemplul 14.

A. Purificarea proteinei L1 recombinante a capsidei papillomavirale de la iepurele de pădure - Schema 1

Celulele păstrate la - 70°C se dezgheață și se suspendă într-un volum egal de tampon de liză (20 mM fosfat de sodiu, pH7,2, NaC1100 mM, EDTA 1,7 mM). La această suspensie se adaugă inhibitorii proteazei PMSF și Pepstatina A, până la concentrații finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Celulele se lizează prin 10 treceri într-un microfluidizator. Lizatul se clarifică prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantul se întinde pe un strat de 5 cm de sucroză 45% (masă/volum) în tampon L1, iar proteina L1 a fost separată prin centrifugare la 100000 x g, timp de 4 h. Depozitul se resuspendă în 1/10 părți în volum de tampon L1. Depozitul resuspendat se clarifică prin centrifugare la 5000 g timp de 10 min. Supernatantului i s-a adăugat Tween-80 până la o concentrație finală de 0,01%, iar supernatantul a fost fracționat la temperatura camerei prin cromatografie selectivă pe o coloană de 1700 ml (5 cm ID) de rășină Sephacryl S-1000. Tamponul de eluare a acestei coloane a fost fosfat de sodiu 10 mM, 7,2, NaCI 150 mM, Tween-80 0,01%. Fracțiile conținând material imunoreactiv determinat prin imunoblotting, sunt reunite și concentrate până la 1&6 în volum, prin ultrafiltrare, utilizând un agitator celular Amicon cu o membrană YM-100 cu un diametru de 76 mm (100000 MWCO). Produsul se filtrează steril printr-o membrană MiIlex-GV cu 0,22 /jm (Millipore).

B. Caracterizarea proteinei L1 recombinante a capsidei papillomavirale de la iepurele de pădure

Identificarea produsului final se confirmă prin Western blotting și prin analiza secvenței N-terminale. Puritatea se determină prin SDS/PAGE cu colorare cu Coomassie și argint, și prin electroforeză de cernere moleculară (Solution Sieving Capillary Electrophoresis = SSCE), cu detectare optică la 215 nm. Prin SSCE, L1 a fost de puritate 75%. Microscopia electronică arată că sunt prezente particule de tip viral cu un diametru cuprins între 50 și 55 nm.

C. Lichid cromatografia de înaltă performanță (HPLC) selectivă analitică

Pentru determinarea particulelor de tip viral, probele se fracționează în conformitate cu dimensiunea, prin cromatografia de selecție după mărime. Cromatografia se realizează cu un HPLC Perkin-Elmer Series 410 Biopump cu un autoinjector ISS 100 prevăzut cu o buclă de injectare de 200 de microlitri. Coloana este un gel TSK G500PW, 7,5x600 mm. Pentru a monitoriza eluarea proteinei de pe coloană, detecția optică la 280 nm se realizează cu un detector prevăzut cu o diodă LC-235 Perkin-Elmer. Faza mobilă este NaCI 0,5 M în fosfat de sodiu 10 mM, pH7,2. Debitul fluxului este de 0,5 ml/min., și se colectează fracții de 1 ml. Coloana de calibrare se realizează cu standarde proteice de la sigma, ca și antigen de suprafață recombinant pentru hepatita B. Detectarea antigenului în fracțiile colectate în timpul eluării este realizată prin determinarea imunologică.

D. Determinarea imunologică

O probă de 10 μΙ din fiecare fracție, se aplică pe o bandă din membrană PVDF (Immobilon-P. Millipore corp., Bedford, MA) care a fost preumectată și plasată pe hârtie de blotting umezită. Proba se lasă să se îmbibe în membrană, iar membrana se plasează într-o soluție de fixare (5% (masă/volum) de lapte praf degresat dizolvat în NaCI 0,15 M, azidă de sodiu 0,02% (masă/volum), și fosfat de sodiu 0,01 M, pH7,2) și se incubează la temperatura camerei cu agitare ușoară timp de cel puțin 3 h. Soluția de fixare se decantează și se înlocuiește cu soluția primară de anticorp.

Anticorpul primar utilizat variază în funcție de antigenul care trebuie detectat:

Proteina L1 de papillomavirus de iepure de pădure a fost determinată cu ser “cu

RO 117541 Β1 răspuns tardiv” anti-CARPV de iepure (Biodesign Internațional, Kennebunk, ME). Proteina L2 de papillomavirus de iepure de pădure (CRPV) a fost determinată cu ser anti-CRPV L2 de iepure. Proteina L1 de la papillomavirusul uman (HPV) de tip 6a a fost determinată cu anticorp monoclonal MAB 837 (Chemicon Internațional, Inc., Temecula, CA). Proteina L2 a Papillomavirusului uman de tip 6a a fost determinată cu ser de șoarece anti-HPV6a L2-fuzio- 635 nată cu trpE.

Vizualizarea complexelor imune s-a făcut prin metode standard, utilizând un al doilea anticorp conjugat cu fosfatază alcalină, și substratul cromogenic NBT/BCIP.

E. Electroforeză de cernere capilară (SSCE = Solution Sieving Capillary

Electrophoresis) 640

Probe de particule de tip viral (VLP) Papillomavirale de iepure de pădure (~ 0,2 mg/ml) se încălzesc timp de 15 min la 100°C în 2-mercaptoetanol 1% și SDS 1% (masă/volum). Proba se aplică electrocinetic alături de un marker de referință, acid melitic, pe o coloană capilară de silice, 42 cm (22 cm de detector) x 0,05 mm ID., preechilibrată cu 10 volume luminare de NaOH 0,1 N, apă, și reactiv de cernere Pro Sort (Applied Bio- 645 systems, Foster City, CA). Se aplică un voltaj de separare de 300 de volți/cm, cu ajutorul unui instrument Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Eluarea probei se monitorizează prin absorbanța la 215 nm, iar datele se colectează cu ajutorul unui sistem soft Nelson Turbochrom 3.

F. Prepararea vaccinului din proteina L1 recombinantă a capsidei papilloma- 650 virale de la iepurele de pădure

Proteina L1 purificată a capsidei papillomavirale de la iepurele de pădure se adsoarbe pe A1(OH)₃ la o concentrație de 100 ^g/ml.

Exemplul 15.

Protecție împotriva dezvoltării papilloamelor cauzate de CRPV (Papillomavirus 655 de iepure de pădure), prin vaccinare cu particule de tip viral L1 de papillomavirus de la iepurele de pădure, particule provenite din drojdie iepuri albi din Noua Zeelandă se imunizează intramuscular fie cu 135 mg de particule L1 de tip viral (75% puritate, a se vedea exemplul 17) adsorbite pe alaun, fie cu 100 mg de antigen de suprafață recombinant pentru hepatita B (99% puritate) adsorbit pe hidroxid 660 de aluminiu, ca martor negativ. Animalele au primit încă 2 doze, cu peste 8 săptămâni înainte ca ele să fie provocate cu papillomavirus de iepure de pădure, și la 10 zile după ultima dozare. Serurile recoltate înaintea imunizării, la fiecare dozare, și înainte de provocare, se analizează prin test ELISA specific pentru L1-VLP (particule de tip viral-L1). O determinare ELISA indirectă se utilizează pentru determinarea răspunsurilor anticorpilor din 665 ser la particulele de tip viral L1 CRPV exprimate în celule de drojdie. Antigenele utilizate în tehnica ELISA sunt particule de tip viral L1 CRPV exprimate în celule de insecte cu un baculovirus recombinant, așa cum s-a descris de către Christensen et al., (J.Virol. 64:3151-3156, 1990; J.Gen. Virol. 75:2271-2276 (1994). Al doilea anticorp utilizat este serul de capră antiIgG de iepure - sintetizată împotriva fosfatazei alcaline, iar ca substrat s-a folosit p-nitrofenil 670 fosfat (Kirkegaard și Perry Labs., Inc.). S-a măsurat absorbanța la 405 nm. Titrul a fost determinat prin diluții (diluții de 3 ori ale serurilor, plecând de la 1:100) și a fost considerat pozitiv dacă absorbanța specifică pentru L1 a depășit absorbanța medie plus 2 deviații standard ale serurilor preimune de iepure. Titrurile exacte au fost calculate din aceste date utilizând programul SOFT max, versiunea 2.3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA). 675

Titrurile anticorpului anti-particulă de tip viral L1 au fost prezente 4 săptămâni după prima imunizare, și au crescut cu fiecare dozare suplimentară. Animalele martor au fost negative. La 6 săptămâni după provocarea cu CRPV (Papillomavirus de la iepure de pădure), la animalele vaccinate prezența negilor a dispărut în 15 din 15 locuri (stocul de virus

RO 117541 Β1 diluat 1:1 sau 1:12), în timp ce animalele martor au prezentat formarea de negi în 12 din 15 situsuri (virusul diluat 1:1) sau 9 din 15 (virusul diluat 1:12). După 15 săptămâni, la animalele vaccinate nu au apărut negi.

Determinările de neutralizare a virusului au fost realizate (în principal conform metodei lui Christensen și col., 1991, Virology, 181: 572-579) prin amestecarea serurilor de iepure cu CRPV (Papillomavirus de iepure de pădure) și ulterior prin provocarea iepurilor cu CRPV tratat. Standardul pentru determinarea anticorpului neutralizant a fost neutralizarea completă a virusului (3/3 situsuri negative din punct de vedere al formării negilor). Au fost analizate seruri de la 5 animale vaccinate și 5 animale martor. Serurile colectate după 1 doză de particule de tip viral L1 CRPV, au conținut anticorpi care au neutralizat complet virusul nediluăt la 80% din iepuri (4/5). După 2 sau 3 doze de particule de tip viral L1 de CRPV, 100% din iepuri (5/5) au avut anticorpi neutralizanți ai virusului. Serurile martor nu au prezentat nici o activitate de neutralizare a virusului. în funcție de titrurile finale, serurile de la animale vaccinate selecționate ar putea fi diluate între 10-1000 de ori, cu păstrarea 100% a activității neutralizante.

Pentru a testa dacă răspunsul neutralizant al anticorpului a fost specific pentru particulele de tip viral L1 native ale CRPV, a fost ales un ser imun, care a fost incubat cu pătrate de nitroceluloză care fuseseră acoperite cu particule de tip viral L1 de CRPV provenite din celule de drojdie, fie native, fie denaturate. Pătratele de nitroceluloză (1 cm² au fost acoperite cu particule de tip viral L1 de CRPV, fie native, fie denaturate (reduse și alchilate cu acid iodoacetic în uree 8M), exprimate în celule de drojdie. Ca martori s-au folosit extracte de drojdie native sau denaturate. Serul imun de iepure a fost incubat serial de 4 ori cu pătrate de nitroceluloză timp de 8-14 h la 4°C, fiind testat înainte prin determinarea de neutralizare a virusului, așa cum s-a descris mai sus. Doar particulele de tip viral L1 native de CRPV au fost capabile să absoarbă anticorpii responsabili de neutralizarea CRPV, în timp ce particulele denaturate sau proteinele martor de drojdie nu au adsorbit acești anticorpi. în plus, particulele de tip viral L1 native de CRPV au anulat și reactivitatea ELISA, față de particulele de tip viral L1 de CRPV exprimate în celule de insecte (datele nu sunt prezentate).

Exemplul 16.

Construirea vectorului pentru coexprimarea genelor L1/L2 de CRPV dintr-o singură plasmidă

Plasmida pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1) se digeră cu enzima Bglll, iar fragmentul de 1,5 kpb Bglll purtător al cadrului deschis de lectură (ORF) pentru gena CRPV L1 cu un capăt 5' conducător netradus, de drojdie, se purifică pe gel. Plasmida p12930-323-2-3 (pC1/1-GAL1p-GAL 10p-CRPV-L2) se digeră cu enzima BamHI care taie între promotorul GAL1 și terminatorul transcripțional ADHI. Fragmentul vector linear se purifică în gel și apoi se leagă cu fragmentul CRPV-L1 Bglll menționat mai sus, pentru producerea plasmidei p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1+L2). Această plasmidă rezultată conține cadrul deschis de lectură (ORF) pentru gena CRPV-L1 sub controlul promotorului GAL1, și cadrul deschis de lectură pentru CRPV-L2 sub controlul promotorului GAL10.

Exemplul 17.

Construirea unui vector pentru exprimarea simultană a genelor L1/L2 din CRPV, din două plasmide

Vectorul pUC18-GAL 1p-GAL10p, conținând gena L2 se taie cu enzima Sphl, iar fragmentul de 2,9 kb purtător al casetei de exprimare ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t, se purifică în gel și se netezește la capete prin tratament cu DNA polimeraza T4. Vectorul suveică de drojdie Yep24 (Botstein și col, Gene 8:17(1979)) se digeră cu BamHI, se netezește la capete prin tratament cu DNA polimeraza T4, se defosforilează cu fosfatază alcalină din intestin de vițel, și apoi se leagă la caseta de exprimare a genei L2 cu capete netede, prezentată mai sus, pentru producerea plasmidei p1594.

RO 117541 Β1

Exemplul 18. 730

Coexprimarea genelor L1 și L2 ale CRPV în drojdie

Plasmida 12930-366-1 -2 (pC1 /1-GAL1 /10p-CRP/L1 +L2) se utilizează pentru transformarea tulpinilor de S.cerevisiae + 1569 și BJ5462 (un sistem uniplasmidial), iar transformantele rezultate se selecționează pe mediu sintetic cu agar minus leucină. într-un experiment paralel, tulpina 1569 a fost cotransformată cu vectorul de exprimare al pC1/1-GAL10p- 735

CRPV-L1-p12930-323-6-1, plus vectorul de exprimare pentru Yep24-GAL10p-L2- p1594 (sistem biplasmidial), iar transformantele rezultate conținând ambii vectori, se selecționează pe mediu sintetic agarizat, lipsit atât de leucină, cât și de uracil. Izolatele clonale, atât cele pentru sistemul uniplasmidial, cât și cele pentru sistemul biplasmidial, se cultivă la 30°C în mediu complex YEHD conținând 2% galactoză, timp de 48-72 h. După recoltarea celulelor, 740 acestea se lizează cu mărgele de sticlă. Se adaugă Triton X-100 până la concentrația finală de 0,5%, iar lizatele celulare se analizează din punct de vedere al exprimării genelor L1 și L2 ale CRPV, prin analiza de imunoblotting. Probele conținând 50 din proteina celulară totală, se supun electroforezei pe geluri în gradient de Tris-Glicină 8-16% (Novex) în condiții reducătoare și denaturante, și electroblottingului pe membrane PVDF (Novex). Proteinele 745 L1 și L2 ale CRPV se detectează prin utilizarea antiserurilor policlonale de iepure anti-L1 sau anti-L2 (dăruite de Dr. John Kreider, Hershey Medical Center) ca anticorpi primari, și proteina A cuplată cu peroxidaza din hrean (Amersham, Inc.) ca anticorp secundar. Membranele au fost prelucrate cu ajutorul kitului de detecție chimioluminiscent ECL^T _M (Amersham, Inc.). în toate probele provenite din clonele de drojdie purtătoare ale plasmidei de exprimare 750 a genelor L1 și L2, se detectează o bandă de proteină L1 de 55-61 kDa și o bandă de proteină L2 de ~ 90 kDa. în probele provenite din clone de drojdie purtătoare ale plasmidei de exprimare pentru L1, nu se detectează nici un semnal pentru L2. în probele provenite din celule conținând doar vectorul de exprimare pentru L2, nu se detectează nici un semnal pentru L1. 755

Exemplul 19.

Purificarea particulelor de tip viral CRPV L1 și CRPV L1 + L2 pentru studii de microscopie electronică

Proteinele L1 din CRPV și L1 și L2 din CRPV, exprimate în drojdie, se purifică parțial și se concentrează pentru studii de microscopie electronică (EM). 1-1,5 litri de mediu YEHD 760 conținând 2% galactoză se inoculează cu tulpina + 1569 sau BJ5462 de S.Cerevisiae transformată cu vectorul de coexprimare pentru L1+L2: p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10pCRPV/L1+L2) și se cultivă la 30°C timp de 48-72 h. într-un experiment paralel, celule ale tulpinii * 1569 co-transformate cu vectorul de exprimare pentru GAL10p-CRPV-L1: p12930323-6-1 plus plasmida p1594 pentru YEp24-GAL10p-L2, au fost cultivate în mod similar. 765 Celulele au fost recoltate, iar depozitul celular a fost înghețat la - 70°C. Toate etapele următoare se realizează la 4°C. Depozitul celular a fost dezghețat și suspendat într-un volum egal de “tampon L1 (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1100 mM, EDTA 1,7 mM). Suspensiei i s-au adăugat inhibitorii proteici PMSF și Pepstatina A, la o concentrație finală de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Celulele au fost lizate prin 3-5 treceri printr-un microfluidizator. Lizatele 770 au fost clarificate prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantul a fost întins pe o suprafață de 5 cm de sucroză 45% (v/v) în tampon L1, iar proteinele L1, L2, sau L1 și L2 au fost separate prin centrifugare la 100000 x g, timp de 4 h. Depozitul a fost resuspendat în 1/10 volume din tamponul L1. Depozitul resuspendat a fost clarificat prin centrifugare la 5000 x g, timp de 10 min. 775

Pentru analiza electrono microscopică (EM) (Structure Probe, West Chester, PA), câte un alicot din fiecare probă a fost plasat pe grile de cupru acoperite cu carbon de 200

RO 117541 Β1 de meshi. O picătură de acid fosfotungstic 2% (PTA), pH7,0 a fost plasată pe grilă timp de de secunde. Grilele au fost lăsate să se usuce la aer anterior examinării TEM. Toate determinările microscopice au fost făcute cu ajutorul unui microscop cu transmisie electronică JEOL 100CX (JEOL USA, Inc,) la un voltaj de accelerare de 100 KV. Fotografiile electronomicroscopice generate au o multiplicare finală de 100000X.

în toate probele de drojdie purtătoare fie a plasmidei de exprimare a CRPV L1, fie a plasmidelor pentru co-exprimarea L1 și L2 de CRPV și a particulei de tip viral (VLP), au fost observate particule de diametru cuprins între 50 și 55 nm. Nu au fost observate VLP (particule de tip viral) în probele martor de drojdie sau în probele de drojdie purtătoare doar a plasmidei de exprimare pentru L2. (Figurile 7, 8, 9).

Exemplul 20.

Purificarea proteinei L1 recombinante a capsidei papillomavirale de la iepurele de pădure - Schema 2

Toate etapele s-au desfășurat la 4°C, dacă nu se menționează altfel.

Celulele păstrate la - 70°C se dezgheață și se suspendă într-un volum egal de tampon de liză (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1100 mM, EDTA 1,7 mM). La această suspensie se adaugă inhibitorii de protează PMSF și Pepstatina A, până la concentrația finală de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Celulele se lizează cu ajutorul unui sistem bio Neb Cell Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lizatul se clarifică prin centrifugare la 5000 x g, timp de 10 min.

Supernatantul se întinde pe o suprafață de 5 cm sucroză 45% (masă/volum) în tampon L1, iar proteina L1 separă prin centrifugare la 100000 x g, timp de 4 h. Depozitul resuspendat se clarifică prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min.

Supernatantul se diluează 1:5 cu tampon fosfat salin (PBS = phosphat buffer salin), reclarificat prin centrifugare în rotor Sorvall SA-600 la 6500 rpm, timp de 10 min la 4°C. Supernatantul se filtrează printr-un filtru de 0,22 microni și se fracționează prin cromatografie de schimb anionic.

Cromatografia de schimb anionic se efectuează cu un HPLC Perkin Elmer Series 410 cu o buclă de injecție de 5 ml, Mediul pentru cromatografie a fost o rășină cu 25-40 microni, Fractogel EMF TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ), într-o coloană de sticlă de 150 mm x 10 mm ID. Pentru monitorizarea eluării proteinei de pe coloană, se realizează detecția optică la 280 nm cu un detector diodă Perkin-Elmer LC1 235. Coloana se preechilibrează cu NaCI 0,15 M în tampon fosfat salin 0,01 M, pH7,2 (tampon A). Coloana se eluează cu o viteză de 0,75 ml/minut. Proba se încarcă pe coloană, iar coloana se spală cu tamponul A pentru îndepărtarea materialului nelegat. Materialul legat se eluează cu un gradient linear de concentrație de clorură de sodiu, 0,15 M până la 0,65 M, timp de 5 min, urmat de un gradient linear 0,65 M până la 1,15 m, timp de 30 min. Detectarea antigenului în fracțiile colectate în timpul eluării se realizează prin testul de imunoblotting. Fracțiile conținând material imunoreactiv (adică fracțiile eluate între 0,81 M și 1,05 M NaCI) se reunesc.

Fracțiile reunite se concentrează în dispozitive de concentrare centrifugală Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) până la 1/5 din volum.

Concentratul se fracționează prin cromatografie selectivă după mărime, utilizându-se rășina Sephacryl S-1000 SF, într-o coloană de 87 cm x 27 mm. Coloana se eluează cu un debit de 2,5 ml/minut. Eluarea proteinei se monitorizează prin absorbanța la 280 nm. Antigenul se detectează prin imunoblotting.

Fracțiile conținând material imunoreactiv se reunesc și se concentrează prin ultrafiltrare, utilizând un dispozitiv amicon, Inc., Beverly, MA, cu un diametru de 43 mm al membranei YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA), în atmosferă de azot, la o presiune de 10 psi.

RO 117541 Β1

Produsul final se caracterizează prin SDS/PAGE (cromatografie în gel de poliacrilamidă - SDS, cu colorare cu Coomassie, și prin electroforeză de cernere capilară (SSCE).

Produsul final din schema 2 este de puritate 88% prin SSCE.

Exemplul 21.

A. Purificarea proteinei L1 recombinante a capsidei CRPV- Schema 3 830

Toate etapele se realizează la 4°C, dacă nu se specifică altfel.

Celulele păstrate la - 70°C se dezgheață și se suspendă într-un volum egal de tampon de liză (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1100 mM, DTA 1,7 mM). La această suspensie se adaugă inhibitori de protează PMSF și pepstatina A, până la concentrații finale de 2 nM, și respectiv 1,7 μΜ. Celulele se lizează cu ajutorul unui sistem Bio Neb Cell Disruptor 835 (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lizatul se clarifică prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min.

Supernatantul se pune pe o suprafață de 5 cm de sucroză 45% (masă/volum) în tamponul L1, iar proteina L1 se separă prin centrifugare la 100000 x g, timp de 4 h. Depozitul se resuspendă în 1/10 volume de tampon L1. Depozitul resuspendat se clarifică prin centrifu- 840 gare la 5000 x g timp de 10 min.

Supernatantul se extrage cu 1/2 volume de cloroform. Stratul apos se îndepărtează și se clarifică prin centrifugare la 12000 rpm într-o microcentrifugă Beckman timp de 5 min, la temperatura camerei.

Supernatantul se diluează 1:5 cu tampon fosfat salin, se reclarifică prin centrifugare 845 în rotor Sorvall SA-600 la 6500 rpm, timp de 10 min la 4°C. Supernatantul se filtrează printrun filtru pompă de 0,22 microni, și se fracționează prin cromatografie de schimb anionic.

Cromatografia de schimb anionic se realizează cu un HPLC Perkin-Elmer Series 410 Biopumps, cu o buclă de injecție de 5 ml. Mediul pentru cromatografie este o rășină de 2540 microni Fractogel EMF TMAE-650 într-o coloană de sticlă de 150 mm x 10 mm. Pentru 850 monitorizarea eluării proteinei de pe coloană, se efectuează detecția optică la 280 nm cu un detector diodă Perkin-Elmer LC-235. Coloana se preechilibrează cu NaCI 0,15 M în tampon fosfat salin 0,01 M, pH7,2 (tampon A). Coloana se eluează cu un debit de 0,75 ml/minut. Proba se încarcă pe coloană, iar coloana se spală cu tampon A pentru îndepărtarea materialului nelegat. Materialul legat se eluează cu un gradient linear de concentrație de clorură de 855 sodiu, 0,15 M până la 0,65 M timp de 5 min, urmat de un gradient linear 0,65 M până la 1,15 M timp de 30 min. Detecția antigenului în fracțiile colectate în timpul eluării se efectuează prin testul de imunoblotting. Fracțiile conținând material imunoreactiv (adică fracțiile eluate între 0,81 M și 1,05 M NaCI) se reunesc.

Fracțiile reunite se concentrează în dispozitive de concentrare centrifugală Macrosep 860 până la 1%5 din volum.

Concentratul se fracționează prin cromatografie selectivă în funcție de dimensiune utilizând rășină Sephacryl S-1000 SF pe o coloană de 87 cm x 27 mm. Coloana se eluează cu un debit de 2,5 ml/ minut. Eluarea proteinei se monitorizează prin detecția absorbției la 280 nm. Antigenul se detectează prin imunoblot. 865

Fracțiile conținând material imunoreactiv se reunesc și se concentrează prin ultrafiltrare cu ajutorul unei celule cu o membrană YM-100 cu diametru de 43 mm în atmosferă de azot la 10 psi presiune.

Produsul final se caracterizează prin SDS/PAGE cu colorare cu Coomassie, și prin electroforeză de cernere capilară (SSCE). Produsul final din schema 3 este de puritate 95% 870 prin SSCE.

RO 117541 Β1

Exemplul 22.

Exprimarea genei L1 de CRPV și L1 de HPV de tip 6a (tulpina 1644) în medii îmbogățite complexe, definite chimic

Inoculul pentru aceste tulpini se elaborează în mediu sintetic lipsit de leucină, așa cum s-a descris mai sus, pentru transferarea în flacoanele agitate de culturi. Flacoanele agitate utilizate se răstoarnă pentru mărirea capacității de aerare (70 ml de lichid per flacon de 300 ml, Tunair Labware), iar mediile se suplimentează cu circa 0,5 ml/l dintr-un antispumant (UCON LB-625, Union Carbide). Mediul complex îmbogățit a conținut (per litru): 40 g extract de drojdie Difco; 20 g peptonă Sheffield HySoy; 30 g glucoză; 50 g galactoză; înaintea sterilizării, pH-ul mediului a fost ajustat la 5,3. Mediul definit chimic utilizat este similar celui descris de către Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16: 1197-1212, 1974), dar suplimentat cu (per litru): 0,1 g clorură de colină; 0,4 g adenină; 30 g glutamat monosodic ca sursă de azot; 0,2 g uracil; 20 g glucoză; 40 g galactoză. Flacoanele se inoculează cu 3 ml de inocul și se incubează timp de 66 h la 28°C, pe un agitator rotativ, cu 250 rpm. Au fost prelevate probe din flacoane la anumite intervale, pentru verificarea exprimării, prin imunoblotting, utilizând antiseruri anti-L1 de CRPV și anti-Li de HPV 6a.

Exemplul 23.

Clonarea genomului HPV-6a

Țesutul provenit de la un pacient diagnosticat cu condiloame acuminate severe (furnizat de dr.Darron Brown, Indiana University School of Medicine) se evaluează prin digestie cu enzime de restricție și amplificarea enzimatică a DNA-ului (PCR) și se observă că conține HPV de tip 6a. DNA-ul se extrage din proba de țesut și se digeră cu enzima Hindi11. După separarea în funcție de mărime printr-un gel preparativ de agaroză 0,8% cu punct de topire scăzut, regiunea de 8-kb a fost excizată din gel, iar agaroza se digeră cu enzima Gelase™. Proba se leagă la pUC18 care este digerată cu Hindlll și defosforilată. După transformarea celulelor competente de E.coli DH5 (BRL), harta plasmidei se cercetează din punct de vedere al clonelor pozitive HPV-6a, cu ajutorul unui oligodezoxinucleotid marcat cu ³²P care este complementar genei L1 a HPV-6a. O plasmidă pUC18 conținând genomul de 8-kb HPV, se izolează și se caracterizează cu enzime de restricție și analize de Southern blot. Această plasmidă este denumită pl)C18-HPV-6a. Genomul complet de 8-kb HPV-6a se secvențializează cu ajutorul secvențializatorului automat ABI (* 373 A), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Se obține de la o pacientă de 25 de ani, lăuză o leziune mare de condilom acuminat vulvar. Un fragment din leziune se îngheață în azot lichid, apoi se prelucrează cu un microdismembrator Braun II. Materialul rezultat se solubilizează cu dodecil sulfat de sodiu (SDS) 0,6% (masă/volum), se tratează cu proteinaza K (50 mcg/ml) și se extrage cu fenol/ cloroform/alcool isoamilic. DNA-ul se precipită cu etanol și se cuantifică prin spectrofotometrie în UV. Prezența DNA cu masă moleculară mare este stabilită prin electroforeza în gel de agaroză, urmată de colorarea cu bromură de etidiu.

Tipul de DNA din HPV se determină cu ajutorul metodei de captură a hibridului comercializat sub denumirea de Vira Type Plus. Sondele de HPV utilizate se împart în două grupe, a căror compoziție se bazează pe asocierea fiecărui tip cu malignitățile tractului genital. Grupul A de sonde conțin tipurile “cu risc redus”: HPV6, 11, 42, 43 și 44, în timp ce sonda B este constituită din tipurile “cu risc ridicat: tipurile 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 și 56. DNA-ul total se digeră cu Pstl, BamHI și Hindlll, iar Southern bloturile se realizează în condiții de mare strictețe (T_m-15°C) pentru determinarea subtipului de HPV.

Pentru determinarea secvenței complete a HPV6a, se sintetizează primeri de secvențializare, pe baza secvenței publicate a HPV6b. Ambele catene ale genomului de 8,1 kpb, complet, al HPV6a au fost secvențializate prin metoda terminării lanțului didezoxi, cu

RO 117541 Β1 folosirea kitului PRISM™ și a unui secvențializator automat Applied Biosystems (ABI) (* 920

373A). în cazurile în care secvența sens și antisens nu sunt complementare, se sintetizează primeri specifici suplimentari pentru HPV6a, pentru a resecvențializa în ambele direcții zona în cauză, pentru obținerea consensului.

Secvențele de DNA ale HPV6a și HPV6b prezintă o identitate de peste 97% cu un total de 229 schimbări de pb identificate în afară de 8010 pb. Cele mai semnificative dife- 925 rente față de secvența HPV6b se găsesc în regiunea lungă martor. în afară de câteva modificări de nucleotide în LCR a HPV6a, se mai găsesc o inserție de 94 perechi de baze la nucleotidul 7350 și altă inserție de 19 perechi de baze la nucleotidul 7804. La nucleotidul 7615, 6 perechi de baze au fost șterse din genomul HPV6a.

Exemplul 24. 930

Construirea vectorului de exprimare în drojdie, pentru HPV6a L1

Ca matriță pentru amplificarea enzimatică a DNA se utilizează HPV de tip 6a. Gena L1 a HPV6a se amplifică prin tehnica PCR, utilizând polimerază Vent, 35 de cicluri de amplificare (94°C 1 minut, 48°C 1 minut, 72°C 1 minut 45 secunde), și următorii primeri oligodezoxinucleotidici care conțin situsurile de flancare pentru Bgl II: 935 primer sens: 5-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC

GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3’ (SECV.ID Nr.:11) primer antisens: 5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG

CGC TTA C.3' (SECV. ID Nr.: 12)

Primerul sens introduce o secvență conducătoare târzie de drojdie, netradusă, ime- 940 diat în amonte față de codonul de inițiere pentru metionină al genei L1 a HPV6a (reprezentat prin litere boldate). Produsul L1 de 1,5 kpb amplificat prin tehnica PCR, a fost digerat cu Bglll și purificat pe gel. Vectorul de exprimare pC1/1-GAL a fost construit prin izolarea fragmentului de 1,4 kpb Sphl din vectorul promotor bidirecțional pUC18-GAL1p-GAL10p care conține promotorul divergent GAL 1/GAL10 din plasmida pBM272 (furnizat de Dr.Mark 945 Johnston, Washington University, St.Louis) flancat pe fiecare parte de o copie a terminatorului transcripțional de drojdie ADH1 (Bennetzen, J.L. și Hali, B.d. (1982) J.Biol.Chem.257:3018-3025). în caseta de expresie rezultată, un situs BamHI este localizat între promotorul GAL1 și prima copie a terminatorului transcripțional ADH1, iar un situs de donare pentru Smal este localizat între promotorul divergent GAL10 și a doua copie a termi- 950 natorului transcripțional ADH1. Vectorul suveică de drojdie pC1/1 (Rosenberg și col., Nature 312 (1984 77-80) a fost digerat cu Sphl și legat la fragmentul promotor de 1,4 kpb Sphl GAL. Vectorul rezultant, pC1(1-GAL, a fost linearizat cu BamHI care taie între promotorul GAL1 și terminatorul de transcripție ADH1. Vectorul pC1/1-GAL digerat cu BamHI și fragmentul obținut prin PCR din HPV6a L1, digerat cu Bglll au fost legați și utilizați pentru 955 transformarea celulelor DH5 de E.coli (BRL). A fost izolată o plasmidă pC1/1-GAL care conține gena L1 din HPV-6a, denumită p13173-357-6. Gena L1 din p13173-357-6 a fost secvențializată (ABI Sequencer * 373A) și s-a dovedit a fi identică cu gena L1 din clona pUC18-HPV6a.

Exemplul 25. 960

Construirea vectorului de expresie în drojdie a genelor L1 și L2 din HPV6a

Plasmida p13173-357-6 (pC1/1-GAL+ HPV6a L1) se digeră cu Smal, care taie între promotorul GAL10 și terminatorul de transcripție ADH1. Gena L2 de 1,4-kpb din HPV6a se amplifică prin tehnica PCR utilizând ca matriță DNA-ul din pUC18-HPV6a, polimerază Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 cicluri de amplificare PCR (94°C, 1 minut; 48°C, 1 minut; 965 72°C, 1 minut și 45 secunde) și următorii primeri oligodezoxinucleotidici care conțin siturile de flancare pentru Smal:

RO 117541 Β1

ΑΤΑ GTA GGG CCC GAC GAC-3' (SECV. ID Nr.: 13) primer antisens: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA

AAA AAA TAA GG-3' (SECV. ID Nr.: 14)

Primerul sens introduce o secvență târzie de drojdie ne-tradusă, imediat în amonte față de codonul de inițiere pentru metionină al genei L2 a HPV6a. Fragmentul PCR a fost digerat cu enzima Smal, purificat în gel și legat de plasmida p13173-357-6 digerată cu Smal. O plasmidă pC1/1-GAL conținând ambele gene L1 și L2 ale HPV6a a fost izolată și denumită p14049-7-2. Gena L2 a fost secvențializată (ABI Sequencer * 373A) și s-a dovedit a fi identică cu gena L2 din clona pUC18-HPV6a.

Exemplul 26.

Exprimarea genei L1 din HPV6a și co-exprimarea genelor L1 și L2 din HPV6a, în drojdie

Plasmidele p13173-357-6 (pC1/1-GAL + HPV6a L1) și p14049-7-2 (pC1/1-GAL + HPV6a L1 și L2) se utilizează pentru a transforma tulpinile de S.cerevisiae + 1569 (MATa, Ieu2-O4, prb1, ade1, pep4, cir°)și * 1558 (MATa, Ieu2-O4, prb1, mnn9, adel, cir⁰). Tulpinile rezultante recombinante, obținute utilizând tulpina + 1558 ca gazdă, au fost tulpinile * 1644 /HPV6a L1) și + 1670 (HPV6a L1 + L2=, așa cum se arată în tabel. Izolatele clonale au fost cultivate la 30°C în mediu YEHD conținând 2% galactoză, timp de 68-78 h. După recoltarea celulelor, acestea au fost lizate cu mărgele de sticlă, iar lizatele celulare au fost analizate din punct de vedere al exprimării proteinei L1 din HPV6a sau L2 din HPV6a, prin analiza de imunoblotting. Probele conținând 40 //g din proteina celulară totală, au fost supuse electroforezei pe geluri de Tris-Glicină 10%, în condiții reducătoare și denaturante și electroblotate pe filtre de nitroceluloză. Proteina L1 a fost imunodetectată utilizând antiseruri de iepure produse împotriva unei proteine de fuziune trpE-HPV11 (Brown, D.R. și col., Virology 201: 4654) ca anticorp primar, și întreg anticorpul de măgar anti-lgG de iepure legat de peroxidaza din hrean (HRP) (Amersham, Inc.), ca anticorp secundar. Filtrele au fost prelucrate utilizând kitul de detecție chimioluminiscent ECL™ (Amersham, Inc.). O bandă de proteină de 50 - 55 kDa - L1 a fost detectată în toate probele, cu excepția martorului negativ (pC1 /1 fără gena L1 sau L2).

Proteina L2 a fost detectată ca o bandă de proteină de 70 kDa, prin analiza Western, utilizând seruri diluate 1:250 de la șoareci care au fost imunizați de 3 ori cu o proteină de fuziune trpE-HPV6a L2, preparată, în principal, conform metodei lui Carter și col., ca anticorp primar, și anticorp de oaie anti-lgC de șoarece, ca anticorp secundar (diluție 1:1000).

Pentru analiza electrono-microscopică (EM), un alicot din fiecare probă a fost plasat pe grile de cupru acoperite cu carbon de 200 meSh. O picătură de acid fosfotungstic 2% (PTA), pH7,0, a fost plasată pe grilă timp de 20 de secunde. Grilele au fost lăsate să se usuce la aer, anterior examinării TEM. Toate observațiile microscopice au fost efectuate cu ajutorul unui microscop cu transmisie elecronică JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.), la un voltaj de accelerare de 100 KV. Fotografiile obținute la microscopul electronic au avut o mărire de 100000X.

Au fost observate particule de tip viral cu diametru de 50-55 nm, în toate probele de drojdie care poartă plasmidele de co-exprimare fie pentru L1 de HPV6a, fie pentru L1 și L2 ale HPV6a. în probele martor de drojdie nu au fost observate deloc particule de tip viral.

Exemplul 27.

Fermentarea L1 + L2 HPV6a (tulpina * 1670)

Creșterea în suprafață a unei culturi plane de tulpină 1670 se transferă aseptic pe un mediu lichid lipsit de leucină conținând (per litru): 8,5 g drojdie Difco, drept sursă de azot, fără aminoacizi și sulfat de amoniu; 0,2 g adenină; 0,2 g uracil; 10 g acid succinic; 5 g sulfat

RO 117541 Β1

1020 de amoniu; și 0,25 g L-tirozină; acest mediu se ajustează la pH5,0-5,3 cu NaOH, anterior sterilizării. După creștere timp de 25 h la 28°C, cu agitare pe un agitator rotativ la 250 rpm, au fost preparate flacoane de cultură înghețate, prin adăugare de glicerol steril până la o concentrație finală de 17% (masă(volum) înaintea păstrării la -70°C (1 ml pe flacon înghețat). Inoculul pentru fermentarea tulpinii 1670 a fost elaborat în același mediu (500 ml per balon de 2 I) și a fost inițiat prin transferarea conținuturilor dezghețate ale culturilor înghețate din 2 sticle, în flacoane de 2 I și incubarea la 28°C, pe un agitator rotativ, cu 250 rpm, timp de 25 h. Fermentarea tulpinii 1670 a necesitat utilizarea unui fermentator New Brunswick SF116 cu un volum de lucru de 10 I după inoculare. Mediul de producție utilizat a conținut (pe litru): 20 g extract de drojdie Difco; 10 g peptonă Sheffield HySoy; 20 g glucoză; 20 g gălactoză; mediul a fost ajustat la pH5,3, anterior sterilizării. Conținuturile întregi (500 ml) ale flacoanelor de inocul de 2 litri au fost transferate în fermentatorul care a fost incubat la 28°C, 5 l/minut, 400 rpm, presiune 3,5 psi.Agitarea a fost intensificată, dacă este necesar, pentru menținerea nivelelor de oxigen dizolvat mai mari de 40% din nivelul de saturație. Desfășurarea fermentației a fost monitorizată prin măsurători de glucoză) și prin spectrometrie de masă. După 69 h de incubație, a fost atinsă o densitate celulară de 9,9 g masă celulară uscată per litru. Cultura a fost concentrată prin filtrare pe fibră până la circa 2 I, diafiltrată cu 2 I de tampon fosfat salin și concentrată în continuare (până la cca. 1 I) înaintea repartizării în tuburi de centrifugă de 500 ml. Fragmentele celulare au fost colectate prin centrifugare la 8000 rpm timp de 20 min la 4°C. După decantarea supernatantului, depozitul (în total 225 g celule umede) a fost păstrat la - 70°C până la întrebuințare.

Exemplul 28.

Purificarea proteinelor recombinante L1 + L2 ale capsidei papillomavirale umane HPV6a

Toate etapele s-au desfășurat la 4°C, dacă nu se specifică altfel.

Celulele tulpinii + 1670 se păstrează înghețate la - 70°C. Celulele înghețate (masă umedă = 38,0 g) se dezgheață la 20 - 23°C și se resuspendă în 50 ml “tampon L1 (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaCI, 100 mM, EDTA 1,7 mM). Se adaugă inhibitori proteazici PMSF și pepstatina A până la concentrații finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia celulară se lizează la o presiune de aproximativ 8000 psi prin 3 treceri printr-un Microfluidizator M110. Suspensia celulară lizată se centrifughează la 5000 x g timp de 10 min pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând antigenul L1 + L2 se recuperează. Supernatantul lichid a fost diluat 1:5 prin adăugare de tampon A (20 mM MOPS, pH7,0) și aplicat pe o coloană cu captură de schimb anionic (5,0 cm ID x 4,0 cm) de rășină FractogeP EMD TMAE - 650 (S) echilibrată în tampon A. După o spălare cu tampon A, antigenul a fost eluat cu un gradient de 0-1,0 M NaCI în tampon A. Pentru a determina care fracții de pe coloană conțin proteina L1, s-a făcut analiza de imunoblotting.

Fracțiile conținând proteina L1 determinată prin imunoblotting, au fost analizate din punct de vedere al proteinei totale prin metoda Bradford, urmată de electroforeză în gel de poliacrilamidă cu SDS (SDS/PAGE) folosind colorare cu argint, și Western blotting.

Fracțiile TMAE care au prezentat puritate comparabilă și un conținut asemănător de proteină L1, au fost reunite. Antigenul a fost concentrat prin fracționare pe sulfat de amoniu. Soluția a fost ajustată la saturație 63% cu sulfat de amoniu prin adăugarea reactivului solid, cu agitare ușoară peste 30 min. Proba a fost plasată pe gheață și lăsată să precipite timp de 30 min. Proba a fost centrifugată la 12000 x g. Depozitul a fost resuspendat în 20,0 ml tampon fosfat salin (6,25 mM fosfat de sodiu, pH7,2, NaC1150 mM).

Depozitul resuspendat a fost cromatografiat pe o coloană selectivă după mărime (2,6 cm ID x 89 cm) de rășină Sephacryl 500 HR. Tamponul de eluare a fost tamponul fosfat salin.

1025

1030

1035

1040

1045

1050

1055

1060

1065

RO 117541 Β1

Cromatografia s-a realizat la 20-23°C. Fracțiile au fost analizate prin SDS/PAGE utilizând colorarea cu argint și detecția prin Western blot. Au fost reunite fracțiile cele mai pure.

Rezultatul obținut prin reunirea fracțiilor a fost concentrat.

Produsul final a fost analizat prin SDS/PAGE utilizând colorarea cu Coomassie coloidal. Proteinele L1 și L2 au fost estimate ca având omogenitate de 85%. Identificarea proteinelor L1 și L2 a fost confirmată prin Western blotting, utilizând antiserurile corespunzătoare. Produsul final a fost împărțit în cote părți și păstrat la - 70°c. Acest proces a avut drept rezultat un total de 3,0 mg proteină.

Analiza de microscopie electronică (EM) a fost realizată cu ajutorul unei Sonde Structurale (West Chester, PA). Un alicot din probă a fost plasat pe o grilă de cupru acoperită cu cărbune de 200 mesh. Pe grilă a fost plasată o picătură de acid fosfotungstic 2%, pH7,0, timp de 20 secunde. Grila a fost lăsată să se usuce la aer, anterior examinării TEM. Toate observațiile microscopice au fost realizate cu ajutorul unui microscop cu transmisie electronică JEOL 100 CX. Cu un voltaj de accelerare de 100 kV. Fotografiile realizate la microscopul electronic au avut o amplificare de 100000x. A fost confirmată prezența particulelor de tip viral cu dimensiunea cuprinsă între 50 - 55 nm.

Exemplul 29.

Purificarea particulelor de tip viral L1 și L1/L2 din HPV6a pentru studii de microscopie electronică (EM)

Proteinele L1 a HPV-6a și L1 + L2 ale HPV-6a exprimate în drojdie se purifică parțial și se concentrează pentru sudiile de microscopie electronică (EM). Unul până la 1,5 I de mediu YEHD conținând 2% galactoză și 0,1 M sorbitol au fost inoculați cu tulpina * 1558 de S.cerevisiae purtătoare fie a plasmidei p13173-357-6 (vectorul de exprimare a genei L1), fie a plasmidei p14049-7-2 (vectorul de exprimare simultană a genelor L1 și L2) și au fost cultivați la 30°C timp de 68-78 h. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4000 x g timp de 10 min, iar depozitul a fost înghețat la - 70°C. Toate etapele următoare au fost efectuate la 4°C. Depozitul de celule a fost dezghețat și suspendat într-un volum egal de tampon L1 (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1100 mM, EDTA 1,7 nM). La această suspensie s-au adăugat inhibitorii de protează PMSF și pepstatina A, până la concentrațiile finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 /zM. Celulele au fost lizate prin 3-5 treceri printr-un microfluidizator. Lizatul a fost clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Supernatantul a fost întins pe suprafața unui strat de 5 cm de sucroză 45% (masă/volum) în tampon L1, iar proteinele L1 sau L1 + L2 au fost separate prin centrifugare la 100000 x g timp de 4 h. Depozitul a fost resuspendat în 1/10 volume de tampon L1 și clarificat prin centrifugare la 5000 x g timp de 10 min. Probele au fost studiate prin EM (microscopie electronică) și s-au dovedit a conține particule de tip viral.

Exemplul 30.

Clonarea genelor L1 și L2 ale HPV16

DNA-ul genomic total se extrage din celulele Caski (ATCC * CRL 1550) prin tehnici standard (Sambrook și col., supra). DNA.ul se digeră cu endonucleazele Bst1 1071 și Sphl și este supus elecroforezei pe un gel preparativ de agaroză cu temperatură de topire joasă, 0,8%. O regiune corespunzătoare DNA-ului de 3,5-kpb a fost excizată din gel, iar agaroza a fost digerată cu enzima Gelase™ (Epicentre Technologies, Inc.). DNA-ul gel-purificat se netezește la capete cu DNA polimeraza T4 și se leagă cu linkeri oligodezoxinucleotidici fosforilați, cu capete netede, care conțin un situs pentru Hindlll ascuns. Amestecul de ligare se digeră complet cu Hindlll, iar fragmentul de DNA de -3,5-kpb se fracționează în funcție de mărime, printr-un gel de agaroză, așa cum s-a descris mai sus, DNA-ul purificat în gel se leagă cu DNA-ul plasmidei pUC18 care se digeră cu Hindlll și se defosforilează. După transformarea celulelor competente de E.coli DH5 (BRL), harta plasmidei se cercetează în

RO 117541 Β1

1115 legătură cu clonele HPV16-pozitive prin hibridizarea coloniei cu ajutorul unui oligodezoxinucleotid antisens marcat cu ³²P, care este complementar capătului 3' al genei L1 a HPV-16 (5-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). O plasmidă pUC18 conținând un fragment genomic din HPV16 de 3,3-kpb se izolează și caracterizează cu enzime de restricție și analize de Southern blot. Această plasmidă se denumește pUC18-HPV16 L1/L2 și conține toate secvențele de DNA care codifică L1 și L2. DNA-ul plasmidic se prepară utilizând kitul Qiagen™ Plasmid Maxi.

Exemplul 31.

Construirea vectorului de expresie în drojdie pentru L1 din HPV16

Clona pUC18-HPV16 L1/L2 se utilizează ca matriță pentru tehnica PCR (amplificare enzimatică a DNA). Gena L1 din HPV16 se amplifică prin tehnica PCR, utilizând: polimeraza Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 cicluri de amplificare (94°C, 1 minut; 48°C, 1 minut; 72°C, 1 minut și 45 secunde), și următorii primeri oligodezoxinucleotidici care conțin situsurile de flancare ale Bglll. primer sens: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT

CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3’(SECV.ID Nr.15) primer antisens: 5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG

CGT TTA GC-3' (SECV. ID Nr.16)

Primerul sens introduce o secvență conducătoare netradusă, de drojdie, imediat în amonte față de codonul de inițiere pentru metionină din gena L1 din HPV16 (reliefat prin litere boldate). Produsul reacției de amplificare enzimatică (PCR) a genei L1 de 1,5 kpb a fost digerat cu Bglll, purificat în gel, și legat cu vectorul pC1/1-GAL digerat cu BamHI. A fost izolată o plasmidă pC1/1-GAL, care conține gena L1 a HPV16, plasmidă desemnată ca p140-49-37-1. Gena L1 din p14049-37-1 a fost secvențializată utilizând kitul PRISM™ (ABI, Inc.) și un Secvențializator ABI, model + 373A, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. S-a dovedit că gena L1 din acest izolat conține 3 modificări de nucleotide față de secvența prototip publicată, corectată (Kirnbauer, R. și col. (1993) J. Virol. 67: 6929-6936), ceea ce are ca rezultat 2 modificări de aminoacizi: His-202 cu Asp; Thr-266 cu Ala. Analiza secvenței matriței originale DNA a confirmat că aceste modificări sunt prezente și în clona genomică pUC18-HPV16 L1/L2 și nu sunt introduse prin tehnica PCR.

Exemplul 32.

Construirea vectorului de drojdie pentru exprimarea genelor L1 și L2 din HPV16în drojdie

Plasmida p14049-37-1 (pC1/1-GAL+HPV16 L1) se digeră cu Smal, care taie între promotorul GAL10 și terminatorul transcrierii ADH1. Gena L2 de 1,4-kpb din HPV16 se amplifică prin tehnica PCR utilizând ca matriță DNA-ul pUC18-HPV16 L1/L2; polimeraza Vent, 10 cicluri de amplificare PCR (94°C, 1 minut; 48°C, 1 minut; 72°C, 1 minut și 45 secunde) și următorii primeri oligodezoxinucleotidici care conțin situsurile de flancare pentru Smal:

primer sens: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA

TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3'(SECV.ID Nr.17) primer antisens: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC

ATC TGA-3' (SECV. ID Nr.18)

Primerul sens introduce o secvență de drojdie netradusă, conducătoare, imediat în amonte față de codonul de inițiere pentru metionină din gena L2 a HPV16 (reliefat prin litere boldate). Produsul de amplificare prin PCR a genei L2 de1,4 kpb a fost digerat cu Smal, purificat în gel și legat de vectorul p14049-37-1 digerat cu Smal. O plasmidă pC1/1-GAL conținând ambele gene L1 și L2 ale GPV16, a fost izolată și denumită p14049-42-2. Gena L2 din p14049-42-2 a fost secvențializată utilizând kitul PRISM™ (ABI, Inc.) și un Secvențializator ABI de tip * 373A, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Gena L2

1120

1125

1130

1135

1140

1145

1150

1155

1160

RO 117541 Β1 din acest izolat s-a dovedit a conține 5 schimbări de nucleotide față de secvența prototip publicată (Kirnbauer, R. și col. (1993) supra), având ca rezultat o schimbare de aminoacid:

Ser-269 cu Pro. Analiza secvenței din clona genomică pUC18-HPV16 L1/L2 a confirmat că această modificare a fost prezentă și în DNA-ul matriță original, și nu a fost introdusă prin tehnica PCR.

Exemplul 33.

A. Exprimarea genei L1 a HPV16 și co-exprimarea geneleor L1 și L2 ale HPV16, în celula de drojdie

Plasmidele p14049-37-1 (pC1/1-GAL+HPV16 L1) și p14049-42-2 (pC1/1GAL+HPV16 L1 și L2) se utilizează pentru transformarea tulpinii + 1558 de S.cerevisiae. Tulpinile recombinante rezultate au fost * 1678 (HPV16-L1) și * 1679 (HPV16 L1+L2), așa cum este arătat în tabel. Izolatele clonale se cultivă la 30°C în mediu YEHD conținând 2% galactoză, timp de 68-78 h. După recoltarea celulelor, acestea se lizează cu bile de sticlă, iar lizatele celulare se analizează din punct de vedere al exprimării proteinei L1 sau L2 din HPV16, prin analiza de imunoblot. Probe conținând 40 mcg din proteina celulară totală, se supun electroforezei pe geluri de 10% Tris-glicină, în condiții reducătoare și denaturante, și electroblottingului pe filtre de nitroceluloză. Proteina L1 din HPBV16 a fost imunodetectată cu ajutorul antiserurilor policlonale de iepure produse împotriva unei proteine de fuziune trpE-HPV11 L1 (D.Brown și col., Virology 201: 46-54) ca anticorp primar, și anticorpul de catâr (măgar) anti-lgG de iepure legat de HRP (Amersham, Inc.), ca anticorp secundar. Filtrele au fost prelucrate utilizând kitul de detecție chimioluminiscent ECL. O bandă de proteină L1 de 50-55 kDa a fost detectată în toate probele, cu excepția martorului negativ (pC1 /1 fără gena L1 sau L2). Proteina L2 a fost detectată ca o bandă de proteină de 70 kDa, prin imunoblot, utilizând seruri de șoarece anti-HPV16 L2 realizate împotriva proteinelor fuzionate trpE-L2, exprimate în E.coli, ca anticorp primar. Ca anticorp secundar a fost utilizat anticorpul de capră anti IgG de șoarece legat de HRP (Amersham Inc.), iar filtrele au fost prelucrate așa cum s-a descris mai sus.

B. Purificarea proteinelor recombinante, de capsidă, L1 + L2 ale HPV de tip 16

Toate etapele se efectuează la 4°C, dacă nu se specifică altfel.

Celulele se păstrează înghețate la - 70°C. Celulele înghețate (greutate umedă = 27,6 g) au fost dezghețate la 20-23°C și resuspendate în 40 ml de “tampon L1 (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1100 mM, EDTA 1,7 mM). Se adaugă inibitori de protează PMSF și pepstatina A, până la concentrațiile finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia celulară se lizează la o presiune de aproximativ 8000 psi prin 3 treceri printr-un Microfluidizator M110. Suspensia celulară lizată se centrifughează la 5000 x g timp de 10 min, pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând antigenele L1 + L2, se recuperează.

Supernatantul lichid se diluează 1:5 prin adăugare de tampon A (20 mM MOPS, pH7,0) și se aplică pe o coloană cu captură de schimb anionic (5,0 cm ID x 4,8 cm) cu rășină Fractogel^R EMD TMAE-650 (S), echilibrată în tampon A. După o spălare cu tampon A, antigenul se eluează cu un gradient de NaCI O-1,0 M în tampon A. Pentru a determina care dintre fracțiile de pe coloană conține proteina L1, se realizează imunoblottingul.

Fracțiile conținând proteina L1, determinată prin imunoblotting, se analizează din punct de vedere al proteinei totale, prin metoda Bradford urmată de SDS/PAGE cu colorare cu argint, și Western blotting.

Fracțiile TMAE care prezintă o puritate comparabilă și un conținut mai mare de proteină L1, se reunesc. Antigenul se concentrează prin fracționare cu sulfat de amoniu. Probele se ajustează la 48% saturație cu sulfat de amoniu, prin adăugare de reactiv solid, sub agitare ușoară, peste 30 min. Probele se plasează pe gheață, iar precipitarea se desăvârșește peste noapte. Probele se centrifughează la 12000 x g. Depozitele se resuspendă în 20 ml TFS (6,25 mM fosfat de sodiu, pH7,2, 150 mM NaCI).

RO 117541 Β1

1215

Depozitele resuspendate se cromatografiază separat pe o coloană de selecție după dimensiune (2,6 cm ID x 89 cm) de rășină Sephacryl 500 HR la 20-23°C. Tamponul de eluare este TFS (tampon fosfat salin). Fracțiile se analizează prin SDS/PAGE, utilizând colorarea cu argint și detectarea Western blot. Fracțiile cele mai pure se reunesc. Fracțiile reunite se concentrează într-o celulă de agitare de 50 ml, cu ajutorul unor membrane de 43 mm TM-100, la o presiune de 4-6 psi de azot.

Produsul final se analizează prin SDS/PAGE, cu colorare cu Coomassie coloidal. Se estimează o omogenitate de 70% a proteinelor L1 și L2. Identitatea proteinelor L1 și L2 se confirmă prin Western blotting, utilizând antiserurile corespunzătoare. Produsul final se împarte în cote părți, și se păstrează la - 70°C. Acest proces are ca rezultat 0,53 mg proteină totală.

Analiza de microscopie electronică se efectuează cu o sondă structurală. Un alicot se plasează pe o grilă de cupru acoperită cu carbon de 200 mesh. Pe grilă se depune o picătură de acid fosfotungstic 2%, pH7,0, timp de 20 de secunde. Grila se lasă să se usuce la aer înaintea examinării TEM. Toate determinările microscopice se efectuează cu ajutorul unui microscop cu transmisie electronică JEOL 100 CX, la un voltaj de accelerare de 100 kV. Fotografiile microscopice realizate au o mărire de 100000 x. Se confirmă prezența particulelor de tip viral, cu mărime cuprinsă între 50-55 nm.

C. Purificarea proteinelor recombinante, de capsida, ale HPV de tip 16; L1 + L2

Toate etapele se desfășoară la 4°C, dacă nu se specifică altfel.

Celulele se păstrează înghețate la - 70°C. Celulele înghețate (greutate umedă = 92,8 g), se dezgheață la 20-23°C și se resuspendă în 105 ml “tampon L1 (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaCI 100 mM, EDTA 1,7 mM). Se adaugă inhibitorii de pretează PMSF și pepstatina A, până la concentrațiile finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia celulară se lizează la o presiune de aproximativ 16000 psi, prin trei treceri printr-un Microfluidizator M110-Y. Suspensia astfel lizată, se centrifughează la 6100 x g timp de 15 min pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând antigenele L1 + L2 se recuperează.

Supernatantul lichid se diluează 1:5 prin adăugare de tampon A (MOPS 20 mM, pH7,0) și se aplică pe o coloană cu captură de schimb anionic (5,0 cm ID x 4,2 cm) de rășină Fractogel ^REMD TMAE-650(S) echilibrată în tampon A. După o spălare cu tampon A, antigenul se eluează cu un gradient de 0-1,0 M NaCI în tampon A. Pentru a determina care dintre fracțiile culese de pe coloană conțin proteina L1, se efectuează determinarea prin imunoblotting.

Fracțiile conținând proteina L1, determinate prin imunoblotting, se testează pentru determinarea proteinei totale prin metoda Bradford, urmată de SDS/PAGE cu colorare cu argint, și Western blotting.

Fracțiile TMAE care prezintă puritate comparabilă și conținut mare de proteină L1, se reunesc. Antigenul se concentrează prin fracționare cu sulfat de amoniu. Probele se ajustează la 35% saturație în sulfat de amoniu, prin adăugare de reactiv solid, cu agitare ușoară timp de 10 min. Probele se plasează pe gheață și se lasă să precipite timp de 4 h. Probele se centrifughează la 12000 x g. Depozitul se resuspendă în 20 ml tampon fosfat salin (6,25 mM fosfat de sodiu, pH7,2, 150 mM NaCI) care conține 1 mM EDTA.

Depozitul resuspendat se cromatografiază separat pe o coloană de selecție după dimensiune (2,6 cm ID x 89 cm) cu rășină Sephacryl 500 HR. Tamponul de curgere este

TFS (tampon fosfat salin) + EDTA 1 mM. Fracțiile se analizează prin SDS/PAGE utilizând colorarea cu argint, și detecția prin Western blotting. Se reunesc fracțiile cele mai pure.

Rezultatul obținut prin reunire este concentrat într-o celulă de agitare de 50 ml, utilizând membrane YM-100 de 43 mm la o presiune de azot de 4-6 psi.

Produsul final se analizează prin SDS/PAGE, utilizând colorarea cu Coomassie

1220

1225

1230

1235

1240

1245

1250 t

1255

1260

RO 117541 Β1 coloidal. Se estimează că omogenitatea proteinelor L1 și L2 este de 70%. Identitatea proteinelor L1 și L2 este confirmată prin Western blotting, utilizând antiserurile adecvate.

Produsul final se împarte în alicoți, și se păstrează la - 70°C. Acest proces are ca rezultat un total de 3,8 mg de proteină.

Exemplul 34.

A. Fermentarea tulpinii 1679 (L1 + L2 din HPV de tip 16)

Procedeele utilizate pentru prepararea culturilor stoc înghețate, elaborarea inoculului, fermentația și recuperarea celulară, a tulpinii 1679, sunt în esență, cele descrise mai sus. După 67 h de incubație este atinsă o densitate celulară de 4,2 g masă celulară uscată per litru, și se obține un total de 93 g depozit celular după recuperare,.

B. Fermentarea tulpinii 1678 (L1 din HPV de tip 16)

Procedeele utilizate pentru prepararea culturilor stoc înghețate, elaborarea inoculului, fermentație, și recuperarea cellară a tulpinii 1678, sunt, în esență, descrise mai sus. După 70,5 h de incubație, conținuturile a două fermentatoare de 10 litri se reunesc (o densitate celulară de 8,7 g masă celulară uscată per litru), care produc un total de 258 g depozit celular umed, după recuperare.

C. Purificarea proteinelor recombinante L1 ale capsidei de HPV de tip 16

Toate etapele se efectuează la 4°C, dacă nu se specifică.

Celulele tulpinii * 1678 se păstrează înghețate la - 70°C. Celulele înghețate (greutate umedă = 128 g) se dezgheață la 20-23°C și se resuspendă în 140 ml de “tampon mM). Se adaugă inhibitorii de protează PMSF și pepstatina A, până la concentrații finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia celulară se lizează la o presiune de aproximativ 16000 psi, prin 3 treceri printr-un Microfluidizator Μ 110-Y. Suspensia celulară lizată se centrifughează la 11000 x g timp de 40 min pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând antigenul L1 se recuperează.

Supernatantul lichid se diluează 1:5 prin adăugare de tampon A (MOPS 20 mM, pH7,0) și se aplică pe o coloană cu captură, de schimb anionic (5,0 cm ID x 6,4 cm) cu rășină FractogeP EMD TMAE-650 (S), echilibrată în tampon A. După o spălare cu tampon A, antigenul se eluează cu un gradient de 0-1,0 M NaCI în tampon A. Se efectuează testul de imunoblotting pentru a determina care fracții de pe coloană conțin proteina L1.

Fracțiile conținând proteina L1 determinată prin imunoblotting, se analizează din punct de vedere al proteinei totale prin metoda Bradford, urmată de SDS/PAGE cu colorare cu argint și Western blotting.

Fracțiile TMAE care prezintă puritate comparabilă și sunt bogate în proteina L1, se reunesc. Antigenul se concentrează prin fracționare cu sulfat de amoniu. Probele se ajustează la 35% saturație în sulfat de amoniu, prin adăugare de reactiv solid cu agitare ușoară, peste 10 min. Probele se pun pe gheață și se lasă să precipite timp de 5 h. Probele se centrifughează la 12000 x g. Depozitul se resuspendă în 20 ml TFS (fosfat de sodiu 6,25 mM, pH7,2, NaC1150 mM).

Depozitul resuspendat se cromatografiază separat pe o coloană de selecție după mărime (2,6 cm ID x 89 cm) cu rășină Sephacryl 500 HR. Tamponul de eluare este TFS. Fracțiile se analizează prin SDS/PAGE cu colorare cu argint și se detectează prin Western blot. Fracțiile cele mai pure se reunesc. Rezultatul reunirii se concentrează într-o celulă de 50 ml, utilizând membrane YM-100 de 43 mm la o presiune de azot de 4-6 psi.

Produsul final se analizează prin SDS/PAGE utilizând colorare cu Coomassie. Se estimează că proteina L1 are 70% omogenitate. Identitatea proteinei L1 este confirmată prin

Western blotting, utilizând antiserurile adecvate. Produsul final se repartizează în cote părți

RO 117541 Β1

1315 și se păstrează la - 70°C. Acest proces are ca rezultat un total de 7,4 mg proteină.

D. Procedee analitice

Procedeul de imunoblotting

Probele se diluează (când este cazul) 1:10 cu Milli-Q-H₂O, iar 10 mcl de probă se aplică pe membrane dePolyScreen™ PVDF. După uscarea spoturilor, membranele se spală cu apă și se lasă să se usuce. Soluția de anticorp primar se prepară prin diluarea antiserului corespunzător cu tampon de blotting (5% lapte degresat în fosfat de sodiu 6,25 mM, pH7,2, NaC1150 mM, NaN₃ 0,02%). Incubarea se face cel puțin o oră la 20-23°C. Blotul se spală de trei ori, câte 1 minut, cu TFS (fosfat de sodiu 6,25 mM, pH7,2, NaC1150 mM). Soluția de anticorp secundar se prepară prin diluarea antiserului conjugat corespunzător, legat de fosfataza alcalină, în tamponul de blotting. Incubarea se efectuează în aceleași condiții timp de cel puțin o oră. Bloturile se spală ca mai înainte și se detectează utilizând o etapă NBT/substrat BCIP.

Anticorpii utilizați sunt următorii:

L1 din HPV 6a a fost detectat cu MAB 837, L2 din HPV 6a a fost detectat cu ser de șoarece anti-L2 de HPV 6a-fuzionată cu trpE, fracțiile * 641 și 647. L1 din HPV 16 a fost detectat cu MAB 885, L2 din HPV 16 a fost detectată cu ajutorul serului de șoarece anti-L2 de HPV 16 fuzionată cu trpE, ser din fracția *611.

Determinarea Bradford pentru proteina totală

Proteina totală se determină cu ajutorul unui kit disponibil comercial Coomassie Plus. Probele se diluează corespunzător cu Milli-Q-H₂O. Volumele necesare sunt de 0,1 și 1,0 ml pentru standard și, respectiv, pentru protocoalele de microdeterminare. Pentru ambele protocoale se utilizează albumină serică bovină, pentru elaborarea curbei etalon. Determinarea se efectuează în conformitate cu recomandările producătorului. Curbele etalon se realizează pe un computer Macintosh IIci, utilizând un software CricketGraph^R.

Exemplul 35.

Purificarea proteinelor recombinante L1 ale capsidei de HPV de tip 11

Toate etapele se efectuează la 4°C, dacă nu se specifică altfel.

Celulele se păstrează înghețate la - 70°C. Celulele înghețate (greutate umedă = 180 g) se dezgheață la 20-23°C și se resuspendă în 900 ml de “tampon de liză” (MOPS 50 mM, pH7,2, NaCI 500 mM, CaCI₂1 mM). Se adaugă inhibitorii de protează AEBSF și pepstatina A până la concentrațiile finale de 1 mM, și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia celulară se lizează la o presiune de aproximativ 16000 psi prin 4 treceri printr-un Microfluidizator M110-Y. La suspensia celulară lizată se adaugă un volum suficient de detergent Triton X100^R 10% pentru a atinge concentrația de 0,5% în TX100. Suspensia se agită timp de 20 h. Uzatul tratat cu Triton X100 se centrifughează la 12000 x g timp de 40 min pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând proteina L1 se recuperează.

Supernatantul lichid se diafiltrează relativ la 5 volume de fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaCI 0,5 M, utilizând o casetă de flux tangențial prin membrană 300 K. Prin radioimunodeterminare se dovedește că materialul reținut de membrană conține proteina L1; aceasta se mai dovedește și prin Western blotting.

Produsul reținut pe filtru se aplică pe o coloană de afinitate de înaltă rezoluție 811,0 cm ID x 5,3 cm) cu rășină SP Spherodex (M)^R echilibrată în fosfat de sodiu 20 mM, OâpH

7,2, NaCI 0,5 M. După o spălare cu tampon de echilibrare și o etapă de spălare cu fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC11,0 M, proteina se eluează printr-o spălare cu fosfat de sodiu 20

MM, pH7,2, NaCI 2,5 M. în timpul spălărilor și eluării, fracțiile se colectează. Fracțiile de pe coloană se testează din punct de vedere al proteinei totale prin metoda Bradford. Fracțiile se analizează apoi prin Western blotting și SDS/PAGE cu detectare prin Coomassie coloidal.

1320

1325

1330

1335

1340

1345

1350

1355

RO 117541 Β1

Fracțiile se analizează și prin radioimunodeterminare.

Fracțiile SP Spherodex care prezintă puritate și conținut ridicat de proteină L1, comparabile, se reunesc.

Produsul final se analizează prin Western blotting și SDS/PAGE prin detecție cu Coomassie coloidal. Proteina L1 dovedește prin densitometria gelurilor colorate cu Coomassie, o omogenitate de 90%. Identitatea proteinei L1 este confirmată prin Western blotting. Produsul final este filtrat aseptic printr-o membrană de 0,22 gm și păstrat la 4°C. Acest proces are ca rezultat un total de 202 mg proteină.

Analiza de microscopie electronică se realizează cu Sonda structurală. Un alicot din probă se plasează pe o grilă de cupru acoperită cu carbon de 200 mesh. O picătură de acid fosfotungstic 2%, pH7,0 se plasează pe grilă timp de 20 de secunde. Grila se lasă să se usuce la aer anterior examinării TEM. Toată microscopia se realizează cu ajutorul unui microscop cu transmisie electronică la un voltaj de accelerare de 100 kV. Microfotografiile obținute realizează o mărire de 100000 x.

Determinări SDS/PAGE și Western blot

Probele sunt diluate până la concentrații egale de proteină cu Milli-Q-H₂O și se amestecă în raport 1:1 cu tamponul de incubare al probei conținând 200 mM DTT. Probele se incubează timp de 15 min la 100°C și se încarcă pe geluri de Tris-glicină 12% pre-topite. Probele se supun electroforezei la 125 V timp de 1 oră și 45 min. Gelurile se developează prin colorare cu Coomassie coloidal, cu ajutorul unui kit obținut comercial.

Pentru Western blot, proteinele se transferă pe membrane de PVDF la 25 V timp de 40 min. Membranele se spală cu Milli-Q-H₂O și se usucă la aer. Anticorpul primar este antiserul policlonal de iepure produs împotriva unei proteine de fuziune TrpE-HPV 11 L1. Soluția de anticorp se prepară prin diluarea antiserului în tampon blotting (5% lapte degresat în 6,25 mM fosfat de sodiu, pH7,2, NaC1150 mM, NaN₃ 0,02%). Incubarea se face cel puțin o oră la 20-23°C. Blotul (pata) se spală de 3 ori câte un minut în TFS (tampon fosfat salin = fosfat de sodiu 6,25 mM, pH7,2, NaC1150 mM). Soluția de anticorp secundar se prepară prin diluarea antiserului conjugat de capră anti-lgG de iepure lergat de fosfatază alcalină în tampon de blotting. Incubarea se face în aceleași condiții, timp de cel puțin o oră. Bloturile se spală ca mai sus, și se detectează cu o etapă NBT/cu substrat BCIP.

Exemplul 36.

Exprimarea genelor L1 și L2 ale HPV 18, în drojdie

Plasmidele p191-6 (pGAL1-10+HPV 18L1) și p195-11 (pGAL1-10+HPV 18 L1+L2) se utilizează pentru transformarea tulpinii + 1558 de S.cerev/s/ae (MATa, Ieu2-O4, prb1::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir⁰). Izolatele clonale se cultivă la 30°C, în mediu YEHD conținând 2% galactoză, timp de 88 h. După recoltarea celulelor, depozitul celular se lizează cu bile de sticlă, iar lizatele celulare analizate din punct de vedere al exprimării proteinelor L1 din HPV 18 și/sau L2 din HPV 18, prin analiza de imunoblot. Probele conținând 25 ^g proteină celulară totală se supun electroforezei pe geluri de 10% TRis-glicină în condiții denaturante, și electroblotate pe filtre de nitroceluloză. Proteina L1 se detectează imunologic, utilizând ca anticorp primar antiser de iepure produs împotriva proteinei de fuziune trpE- L1 de HPV11 iar ca anticorp secundar, anticorpul de catâr anti-lgG de iepure legat de peroxidaza din hrean. Filtrele se prelucrează cu ajutorul kitului de detecție chimioluminiscent ECL™ O bandă proteică L1 de 50-55 kDa se detectează în ambele clone de drojdie coexpresoare L1 și L1+L2 (tulpinile 1725 și, respectiv, 1727) și nu se detectează în martorul negativ (pGAL1-10 fără genele L1 sau L2).

Proteina L2 din HPV 18 se detectează prin analiza Western, utilizând antiser policlonal de capră produs împotriva proteinei de fuziune trpE-L2 de HPV 18, ca anticorp primar, urmat de anticorpul de iepure anti-lgG de capră, conjugat de peroxidaza din hrean (HRP).

RO 117541 Β1

Filtrele se prelucrează așa cum s-a descris mai sus. Proteina L2 se detectează ca o bandă de proteină de 75 kDa în clona de drojdie co-expresoare pentru L1+L2 (tulpina 1727), dar nu este detectată nici în martorul negativ, nici în clona de exprimare a proteinei L1.

Exemplul 37.

Fermentarea HPV18 L1 (tulpina 1725) și 18 L1+AL2 (tulpina 1727)

Creșterea la suprafață a unei culturi a tulpinilor 1725 și 1727) se transferă aseptic pe un mediu lichid lipsit de leucină, conținând (per litru): 8,5 g drojdie Difco, ca sursă de azot, fără aminoacizi și sulfat de amoniu; 0,2 g adenină; 0,2 g uracil; 10 g acid succinic; 5 g sulfat de amoniu; 40 g glucoză; 0,25 g L-tirozină; 0,1 g L-arginină; 0,3 g L-izoleucină; 0,05 g L-metionină; 0,2 g L-triptofan; 0,05 g L-histidină; 0,2 g L-lizină; 0,3 g L-fenilalanină; acest mediu a fost ajustat la pH5,0-5,3 cu NaOH, anterior sterilizării. După cultivare la 28°C, 250 rpm pe un agitator rotativ, se prepară flacoane de cultură înghețată prin adăugare de glicerol steril până la o concentrație finală de 17% (masă/volum), anterior păstrării la - 70°C (1 ml per flacon). înoculurile se elaborează în același mediu (500 ml per flacon de 2 litri) și se inițiază prin transferarea conținuturilor dezghețate ale flaconului cu cultura înghețată și incubarea la 28°C, 250 rpm pe un agitator rotativ, timp de 29 h. Pentru fermentațiile fiecărei tulpini s-a utilizat un fermentator cu un volum de lucru de 10 litri, după inoculare. Mediul de producție a conținut (per litru): 20 g extract de drojdie Difco; 10 g peptonă Sheffield HySoy: 20 g glucoză; 20 g galactoză; 0,3 ml antispumant Union Carbide UCON LB-625; pH-ul mediului a fost ajustat la 5,3 anterior sterilizării. întregul conținut (500 ml) al flaconului de 2 I pentru inocul se transferă în fermentatorul care se incubează la 28°C, 5 litri de aer per minut, 400 rpm, 3,5 psi presiune. Agitația se intensifică, la nevoie, pentru menținerea nivelelor de oxigen dizolvat mai mari de 40% saturație. Evoluția fermentației se monitorizează prin măsurători “off-line” de glucoză și “on-line de spectrometrie de masă, după 66 h de incubare sunt atinse densități celulare de 9,5-9,7 o masă celulară uscată per litru. Culturile se concentrează prin filtrare pe fibră 43, până la circa 2 litri, se diafiltrează cu 2 litri tampon fosfat salin, și se concentrează în continuare (până la circa 1 litru) înaintea repartizării în tuburi de centrifugă de 500 ml. Depozitele celulare se colectează prin centrifugare la 8000 rpm timp de 20 min la 4°C. După decantarea supernatantului, depozitul (în total 191-208 g masă celulară umedă) se păstrează la - 70°C până la utilizare.

Exemplul 38.

Purificarea proteinelor recombinante de capsidă ale HPV18, L1

Toate etapele se desfășoară 4°C, dacă nu se precizează altfel.

Celulele au fost înghețate la -70°C. Celulele înghețate (greutate umedă = 126 g) se dezgheață la 20-23°C și se resuspendă în 70 ml “tampon de liză” (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaCI 100 mM). Se adaugă inhibitori de protează PMSF și pepstatina A până la concentrațiile finale de 2 mM și, respectiv, 1,7 μΜ. Suspensia se lizează la o presiune de aproximativ 16000 psi, prin 4 treceri printr-un Microfluidizator M110-Y. Suspensia celulară lizată se centrifughează la 12000 x g timp de 40 min pentru îndepărtarea detritusurilor celulare. Supernatantul lichid conținând antigenul L1 se recuperează.

Supernatantul lichid se diluează 1:5 prin adăugare de tampon A (MOPS 20 mM, pH7,0) și se aplică pe o coloană cu captură de schimb anionic (9,0 cm ID x 3,9 cm) de rășină Fractogel* EMD TMAE-650 (M), echilibrată în tampon A. După ce se spală cu tampon A, antigenul se eluează cu un gradient de 0-1,0 M NaCI în tampon A. Fracțiile de pe coloană se analizează din punct de vedere al proteinei totale prin metoda Bradford. Fracțiile au fost apoi analizate la încărcări egale de proteină totală prin Western blotting și SDS/PAGE cu detecție prin colorare cu argint.

Fracțiile TMAE care prezintă puritatea și conținutul în proteina L1 comparabile, se reunesc. Antigenul se concentrează prin fracționare cu sulfat de amoniu. Soluția se

1410

1415

1420

1425

1430

1435

1440

1445

1450

1455

RO 117541 Β1 ajustează la 35% saturație în sulfat de amoniu prin adăugare de reactiv solid cu agitare ușoară, peste 10 min. Proba se plasează pe gheață și se lasă să precipite timp de 4 h.

Proba se centrifughează la 16000 x g timp de 45 min. Depozitul se resuspendă în 20,0 ml

TFS (fosfat de sodiu 20 mM, pH7,2, NaC1150 mM).

Depozitul resuspendat se cromatografiază pe o coloană de selecție după mărime (2,6 cm ID x 89 cm) de rășină Sephacryl 500 HR. Tamponul de eluare este TFS. Fracțiile se analizează prin Western blotting și SDS/PAGE cu detecție prin colorare cu argint. Fracțiile cele mai pure se reunesc. Rezultatul reunirii fracțiilor se concentrează într-o celulă de 50 ml agitată, utilizând membrane TM-100 de 43 mm la o presiune de azot de 4-6 psi.

Produsul final se analizează prin Western blotting și SDS/PAGE cu detecție cu Coomassie coloidal. Se estimează omogenitatea proteinei L1 la 50-60%. Identitatea proteinei L1 este confirmată prin Western blotting. Produsul final se repartizează în cote părți (alicoți) și se păstrează la - 70°C. în urma acestui proces rezultă un total de 12,5 mg proteină.

Exemplul 39.

Prepararea compozițiilor imunogene

Particulele de tip viral (VLP) purificate se formulează conform metodelor cunoscute, cum ar fi prin amestecarea cu purtători acceptabili farmaceutic, stabilizatori, sau cu un adjuvant pentru vaccin. Particulele de tip viral (VLP) imunogene din prezenta invenție, pot fi preparate în scopul utilizării ca vaccin prin combinare cu o compoziție acceptabilă fiziologic cum ar fi, spre exemplu, tamponul fosfat salin, serul fiziologic, sau apa distilată. Particulele de tip viral (VLP) imunogene sunt administrate în doze cuprinse între 0,1 și 100 /zg, preferabil între 1 și aproximativ 20 μg, în scopul obținerii efectului imunogen dorit. Cantitatea de particule de tip viral per formulare poate varia în conformitate cu o varietate de factori, incluzând, dar nu limitați la starea individului, greutate, vârstă și sex. Administrarea formulării particulei de tip viral se poate realiza printr-o varietate de căi, incluzând, dar nu limitându-se la căile: orală, subcutanată, topică, mucoasă, și intramusculară. Asemenea formulări VLP pot fi constituite dintr-un singur tip de particulă de tip viral (VLP) (ex. VLP din HPV 6a) sau dintrun amestec de VLP (ex.VLP din HPV 6a, HPV 11, HPV16 și HPV 18).

Poate fi prezent, opțional, un conservant antimicrobian, ex. thimerosal. Antigenele imunogene din prezenta invenție pot fi folosite, dacă se dorește, în combinație cu stabilizanți și adjuvanți de vaccin. Stabilizatori tipici sunt compușii specifici, exemplu polianionii cum ar fi heparina, inozitol hexasulfat, betaciclodextrina sulfatată, excipienții mai puțin specifici, ex.aminoacizi, sorbitol, manitol, xilitol, glicerol, sucroză, dextroză, trehaloză, și variațiile parametrilor soluției, exemplu, pH-ul neutru, tăria ionică ridicată, (circa 0,5-2,0 M săruri), cationii bivalenți, (Ca²⁺, Mg²⁺). Exemple de adjuvanți sunt AI(OH)₃ și AI(PO₄). Vaccinul prezentei invenții poate fi păstrat sub formă înghețată sau liofilizată.

Exemplul 40.

Prepararea anticorpilor împotriva particulelor de tip viral (VLP)

Pentru generarea anticorpilor se folosesc particule de tip viral purificate. Termenul “anticorp” folosit aici include atât anticorpii policlonali cât și pe cei monoclonali, ca și fragmente din aceștia, cum ar fi fragmentele Fv, Fab și F(ab)2 care sunt capabile să lege antigenul sau haptena. Anticorpii sunt utilizați într-o varietate de forme, incluzând, dar nu limitate la purificarea VLP recombinante, purificarea proteinelor native L1 și L2, și la kituri. Kiturile conțin un purtător compartimentat corespunzător pentru a păstra într-o strânsă limitare, cel puțin un recipient. Purtătorul mai cuprinde reactivi cum ar fi anticorpul anti-VLP sau VLP adecvat pentru detectarea HPV sau a fragmentelor de HPV, sau anticorpi împotriva HPV. Purtătorul poate să mai cuprindă modalități de detecție cum ar fi antigenul marcat sau substrate enzimatice, sau similare. Anticorpii sau VPL sau kiturile sunt utile pentru o varietate de scopuri, incluzând, dar nelimitându-se la analizele medico-legale și la studiile epidemiologice.

Claims

1. Procedeu pentru prepararea unui vaccin de papillomavirus uman, pentru administrare la om. care conține particule de tip viral de papillomavirus uman, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde etapele:

(a) se transformă drojdia cu o moleculă ADN, respectiva moleculă ADN codificând proteinele de papillomavirus uman L1 sau de papillomavirus uman L1 + L2 cu formarea unei celule de drojdie transformate;

(b) se cultivă celula transformată în condiții care permit producerea de proteine recombinante și ansamblul spontan al acestora în particule de tip viral;

(c) se recoltează particulele de tip viral din celula transformată;

(d) se purifică particulele de tip viral prin cel puțin o etapă cromatografică; și (e) se condiționează principiul activ, care poate să cuprindă un singur tip de particule de tip viral sau un amestec de particule de tip viral și anume particule de tip viral din papillomavirus uman 11, papillomavirus uman 16 și papillomavirus uman 18, astfel încât vaccinul să poată fi administrat pe cale orală, subcutanat, pe cale mucoasă, local sau intramuscular, opțional principiul activ putând fi adsorbit pe AI(OH)₃ la o concentrație de până la 100 wg/ml.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că drojdia este o tulpină de Saccharomyces cerevisiae.

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că papillomavirusul uman este selectat din grupele constând din papillomavirus uman tip 6a, papillomavirus uman tip 6b, papillomavirus uman tip 11, papillomavirus uman tip 16, și papillomavirus uman tip 18.