NO322254B1 - Virusliknende partikler samt fremgangsmate for fremstilling av disse, rekombinant papillomavirusantigen, vaksine,isolert og renset HPV18L1-DNA-molekeyl og anvendelse av dette. - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter viruslignende partikler samt fremgangsmåte for fremstilling av disse, rekombinant papillomvirusprotein, vaksine, isolert og renset HPV18L1-DNA-molekyl, ekspresjonsvektor, i det vesentlige renset protein, fremgangsmåte for ekspresjon av et humant papillomvirus type 18-protein i en vert samt farmasøytiske preparater.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser HPV18 Ll-nukleotid og utledet aminosyresekvens. Figur 2 er en liste av aminosyrevariasjoner innen Ll-proteinet fra HPV18. Figur 3 viser HPV18 L2-nukleotid og utledet aminosyresekvenser. Figur 4 viser et immunoblot av HPV18 Ll-protein uttrykt i gjær. Figur 5 viser et immunoblot av HPV18 L2-protein uttrykt i gjær. Figur 6 er et elektronmikrografi av viruslignende partikler dannet ved hjelp av HPV18 Ll-protein uttrykt i gjær.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Papillomvirus (PV)-infeksjoner skjer hos ulike dyr, deriblant mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, ormer og kuer. Papillomvirus infiserer epitelceller, og induserer generelt godartede epitel- eller fibroepiteltumorer i infeksjonssetet. PV er artsspesifikke infeksiøse agenser; et humant papillomvirus infiserer ikke et ikke-humant dyr.

Papillomvirus kan klassifiserer i ulike grupper basert på verten de infiserer. Humanpapillomvirus (HPV) er ytterligere klassifisert i mer enn 70 typer basert på DNA-sekvenshomologi. PV-typer ser ut til å være typespesifikke immunogener ved at nøytraliserende immunitet mot infeksjon av en papillomvirustype ikke overfører immunitet mot en annen papillomvirustype.

Forskjellige HPV-typer hos mennesker forårsaker ulike sykdommer. HPV-typene 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker godartede vorter hos både normale og immunkompromiterte individer. HPV-typene 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner hos immunkompromiterte individer. HPV-typene 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker godartede condyloma i de genitale eller respiratoriske slimhinner. HPV-typene 16 og 18 forårsaker epiteldysplasi i de genitale slimhinner og er forbundet med hoveddelen av in situ og inntrengende carcinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen.

Papillomvirus er små (50-60 nm), kappeløse, ikosahedrale DNA-virus som koder for opp til åtte tidlige og to sene gener. De åpne leserammer (ORF'er) til virusgenomene er kalt El til E7 og LI og L2, hvor "E" betyr tidlig og "L" betyr sen. LI og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner slik som virusreplikasjon og celletransformering.

Ll-proteinet er hovedkapsidprateinet og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-proteinet er et underordnet capsidprotein som har en antatt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende molekylvekt på 75-100 kDa som bestemt ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Immunologiske data antyder at det meste av L2-proteinet ligger inni Ll-proteinet i viruskappen. Ll-ORF er meget konservert blant ulike papillomvirus. L2-proteinene er mindre konservert blant ulike papillomvirus.

Li- og L2-genene har blitt identifisert som gode mål for immunprofylakse. Studier av "cottontail"-kaninpapillomvirus (CRPV) og bovint papillomvirus (BPV)-systemer har vist at immunisering med LI- og L2-proteinene uttrykt i bakterier eller ved anvendelse av vacciniavektorer beskyttet dyrene mot viral infeksjon. Ekspresjon av papillomvirus-Ll-gener i baculovirusekspresjonssystemer eller ved anvendelse av vacciniavektorer resulterte i sammensetningen av viruslignende partikler (VLP) som er brukt for å indusere høytitrerte virusnøytraliserende antistoffresponser som korrelerer med produksjon etter viral

"challenge".

Etterfulgt HPV type 16 er HPV18 det nest mest alminnelige HPV-type funnet i cervikale carcinomer. HPV18 ble påvist i 5-20 % av cervikale cancerbiopsier innsamlet fra ulike deler av verden (Ikenbert, H. 1990. Human papillomvirus DNA i invasive genitale carcinomas. In Genital Papillomavirus Infections, G. Gross et al. eds. s. 85-112). Det ser ut til å være en geografisk avhengighet av infeksjon med HPV18 ettersom tumorbiopsier fra afrikanske og sør-amerikanske kvinner inneholder oftere HPV18 enn lignende biopsier fra europeiske og nord-amerikanske kvinner. De underliggende grunner for disse geografiske forskjeller er ikke kjent. Utviklingen av en vaksine mot HPV18-infeksjon ser ut til å være svært betydningsfullt ettersom HPV18 også er forbundet med mer aggressivt voksende cancere og er sjelden funnet i mildere forløperlesjoner, CIN I-II.

Cole et al., "Nucleotide sequence and...", J.mol.biol., 1987,vol 193(4), s599-608, beskriver nukleotidsekvensen til HPV 18 genomet og de åpne leserammene E1-E7 og LI og L2 er kjent herifra, sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse gjengir mer autentiske vip som således gir mer egnede antistoffer sammenlignet med vip basert på sekvensen basert på Cole et al.

NO 1996 4862 omhandler rekombinante

ekspresjonsvektorer som koder for LI og L2 proteinene i papillomavirus (bl a HPV18), fremgangsmåte for fremstilling av rensede VLP fra humant papillomavirus og rekombinante proteiner, samt anvendelse av de rekombinante proteiner. Imidlertid beskrives ikke HPV18 VLP eller sekvensinformasjon om gener som koder for HPV18-proteiner.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot DNA-molekyler som koder for renset humant papillomvirus type 18 (HPV type 18/HPV18) LI og L2 proteiner som vist i figur 1 og 3 og anvendelse av DNA-molekylene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter de ifølge kravene anførte trekk og gir en løsning på problemene angitt ovenfor.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot DNA-molekyler som koder for renset humant papillomvirus type 18 (HPV type 18; HPV18 > LI og L2 proteiner som vist i figur 1 og 3, viruslignende partikler omfattende LI og L2 som vist i figur 1 og 3, peptider og proteiner som kodes av DNA'et, vaksiner omfattende DNA'et eller vaksiner omfattende proteiner kodet av DNA'et, immunologiske preparater omfattende DNA'et eller proteiner kodet av DNA<*>et, sett inneholdende DNA<*>et eller RNA avledet fra DNA'et eller proteiner kodet av DNA'et.

Farmasøytisk anvendbare preparater omfattende dette DNA eller proteiner som vist i figur 1 og 3, kan formuleres i henhold til kjente fremgangsmåter, slik som ved blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på slike bærere og fremgangsmåter for formulering kan finnes i Remington<*>s Pharmaceutical Sciences. For å danne et farmasøytisk akseptabelt preparat egnet for effektiv administrering, må slike preparater inneholde en effektiv mengde av DNA'et eller proteiner eller VLP. Slike preparater kan inneholde DNA eller proteiner eller VLP avledet fra mer enn én type HPV.

Terapeutiske eller diagnostiske preparater ifølge oppfinnelsen administreres til et individ i mengder tilstrekkelig for å behandle eller diagnostisere PV-infeksjoner. Den effektive mengde kan variere ifølge ulike faktorer, slik som individets tilstand, vekt, kjønn og alder. Andre faktorer omfatter administreringsmåten. Generelt vil preparatene bli administrert i doser varierende fra ca. 1 ug til ca. 1 mg.

De farmasøytiske preparater kan tilføres individet ved hjelp av ulike veier, slik som subkutant, topisk, oralt, mukosalt, intravenøst og intramuskulært.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen omfatter DNA, RNA eller proteiner kodet av DNA'et som inneholder antigendeterntinanter som er nødvendige for å indusere dannelsen av nøytraliserende antistoffer hos verten. Slike vaksiner er også trygge nok til å bli administrert uten fare for klinisk infeksjon; har ikke toksiske bivirkninger, kan administreres ved hjelp av en effektiv vei; er stabile; og kan konkurrere med vaksinebærere.

Vaksinene kan administreres ved hjelp av ulike veier, slik som oralt, parenteralt, subkutant, mukosalt, intravenøst eller intramuskulært. Den administrerte dose kan variere med hensyn til tilstand, kjønn, vekt og alder til individet; administreringsvei; og typen PV i vaksinen. Vaksinen kan anvendes i doseformer slik som kapsler, suspensjoner, eliksirer eller væskeoppløsninger. Vaksinen kan formuleres med en immunologisk akseptable bærer.

Vaksinene administreres i terapeutisk effektive mengder, dvs. i mengder tilstrekkelige til å generere en immunologisk beskyttende respons. Den terapeutisk effektive mengde kan variere i henhold til PV-typen. Vaksinen kan administreres i enkle eller multiple doser.

DNA<*>et ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved fremstillingen av immunologiske preparater. Når slike preparater introduseres inn i en egnet vert har de evnen til å indusere en immunrespons hos verten.

DNA'et ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å serotype HPV-infeksjon og HPV-screening. DNA, rekombinante proteiner, VLP bidrar til formuleringen av sett egnet for påvisningen og serotyping av HPV. Slik sett vil omfatte en seksjonsinndelt bærer uten innbyrdes forbindelse lukket i minst én beholder. Bæreren vil dessuten omfatte bestanddeler som HPV18-DNA, rekombinant HPV-protein eller VLP eller anti-HPV-antistoffer egnet for påvisning av ulike HPV-typer. Bæreren kan også inneholde deteksjonsmidler, slik som merket antigen eller enzymsubstrater eller lignende.

DNA'et og avledede proteiner derfra som vist i figur 1 og 3 er også anvendbare som molekylvekt- og molekyl-størrelsesmarkører.

På grunn av at den genetiske kode er degenerert kan flere enn ett kodon anvendes til å kode for en spesiell aminosyre og av denne grunn kan aminosyresekvensen kodes av enhver av et sett av lignende DNA-oligonukleotider. Kun ett medlem av settet vil være identisk med HPV18-sekvensen, men vil ha evnen til å hybridisere til HPV18-DNA selv i nærvær av DNA-oligonukleotider som feilparrer, under egnede betingelser. Ved alternative betingelser kan de feilparrede DNA-oligonukleotidene fortsatt hybridisere til HPV18-DNA for å tillate identifisering og isolering av HPV18-kodende DNA.

Det rensede HPV18-DNA'et ifølge oppfinnelsen kan anvendes for isolering og rensing av homologer og fragmenter av HPV18 fra andre kilder. For å gjennomføre dette kan det første HPV18-DNA blandes med en prøve inneholdende DNA som koder for homologer av HPV18 under egnede hybridiseringsbetingelser. Det hybridiserte DNA-kompleks kan isoleres og DNA som koder for homologt DNA kan renses derfra.

Ulike fremgangsmåter kan anvendes for molekylær kloning av HPV18-DNA. Disse fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til, direkte funksjonell ekspresjon av HPV18-gener etterfulgt av konstruksjon av et HPV18-inneholdende cDNA- eller genomisk DNA-bibliotek i et egnet ekspresjonsvektorsystem. En annen fremgangsmåte er å screene HPV18-inneholdende cDNA- eller -genomisk DNA-bibliotek konstruert i en bakteriofag eller plasmidskyttelvektor med en del av DNA som koder for HPV18. Denne DNA del erholdes ved hjelp av den spesifikke polymerasekjedereaksjon (PCR)-amplifiseringen av HPV18-DNA-fragmenter ved konstruksjon av degenererte oligonukleotidprimere fra aminosyresekvensen til renset HPV18. En annen fremgangsmåte er å isolere RNA fra HPV18-produserende celler og translatere RNA'et til protein ved hjelp av et in vitro eller et in vivo-translasjonssystem. Translasjonen av RNA'et til et peptid eller et protein vil resultere i produksjon av i det minste en del av HPV18-proteinet som for eksempel kan identifiseres ved hjelp av aktiviteten til HPV18-proteinet eller ved hjelp av immunologisk reaktivitet med et anti-HPV18-antistoff. Ved denne fremgangsmåte kan forråd av RNA isolert fra HPV18-produserende celler analyseres med hensyn til nærvær av RNA som koder for minst en del av HPV18. Ytterligere fraksjonering av RNA-forrådet kan utføres for å rense HPV18-RNA'et fra RNA som ikke kommer fra HPV18. Peptidet eller proteinet som produseres ved hjelp av denne fremgangsmåte kan analyseres for å tilveiebringe aminosyresekvenser som så kan anvendes for å tilveiebringe primere for produksjon av HPV18-cDNA, eller så kan RNA'et anvendt for translasjon analyseres for å tilveiebringe nukleotidsekvenser som koder for HPV18 og produsere prober for screening av et HPV18-cDNa-bibliotek. Disse fremgangsmåter er kjente ifølge teknikkens stand og kan for eksempel finnes i Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Det er åpenbart at andre bibliotektyper, i tillegg til biblioteket konstruert fra andre celler eller celletyper kan være anvendbare for isolering av HPV18-kodende DNA. Andre bibliotektyper omfatter, men er ikke begrenset til cDNA-biblioteker avledet fra andre celler eller cellelinjer inneholdende HPV type 18 og genomiske DNA-biblioteker.

Fremstilling av cDNA biblioteker kan utføres ved hjelp av ulike teknikker. cDNA-bibliotekkonstruksjonsteknikker kan finnes i Sambrook, J., et al., supra. Det er åpenbart at DNA som koder for HPV18 også kan isoleres fra et egnet genomisk DNA-bibliotek. Konstruksjon av genomiske DNA-biblioteker kan utføres ved hjelp av ulike teknikker. Genomiske DNA-bibliotekskonstruksjonsteknikker kan finnes i Sambrook, J., et al. supra.

Et klonet HPV18 DNA erholdt ved fremgangsmåtene beskrevet heri kan uttrykkes rekombinant ved hjelp av molekylær kloning inn i en ekspresjonsvektor inneholdende en egnet promoter og andre egnede transkripsjonsregulatoriske elementer og overføres inn i prokaryote eller eukaryote vertsceller for produksjon av rekombinant HPV18. Teknikker for slike manipuleringer er fullt ut beskrevet i Sambrook, J., et al., supra og er kjent ifølge teknikkens stand.

Ekspresjonsvektorer er definert heri som DNA-sekvenser som er krevet for transkripsjon av klonede kopier av gener og translasjon av disse mRNA i en egnet vert. Slike vektorer kan anvendes for uttrykk av eukaryotiske gener i ulike verter, slik som bakterier, blågrønnalger, planteceller, insektceller, soppceller og dyreceller. Spesifikt konstruerte vektorer tillater overføring av DNA mellom verter, slik som bakterie-gjær, bakterie-dyreceller, bakterie-soppceller eller bakterie-invertebratceller. En tilstrekkelig konstruert ekspresjonsvektor burde inneholde: et replikasjonsorigo for autonom replikering i vertsceller, selekterbare markører, et begrenset antall av anvendbare restriksjonsenzymseter, et potensiale for høyt kopiantall og aktive promoterer. En promoter er definert som en DNA-sekvens som dirigerer RNA-polymerase til å binde til DNA og initiere RNA-syntese. En sterk promoter er en promoter som forårsaker at mRNA initieres med høy frekvens. Ekspresjonsvektorer kan omfatte, men er ikke begrenset til kloningsvektorer, modifiserte kloningsvektorer, spesifikt utformede plasmider eller virus.

Ulike pattedyrekspresjonsvektorer kan anvendes for uttrykk av HPV18-DNA i pattedyrceller. Kommersielt tilgjengelige pattedyrekspresjonsvektorer som kan være egnet for rekombinant HPV18-ekspresjon omfatter, men er ikke begrenset til pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2)(ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTåg (ATCC 37460) og AZD35 (ATCC 37565).

Ulike bakterielle ekspresjonsvektorer kan anvendes for uttrykk av HPV18-DNA i bakterieceller. Kommersielt tilgjengelige bakteriekspresjonsvektorer som kan være egnede omfatter, men er ikke begrenset til pETl la (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Ulike soppcelleekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV18 i soppceller. Kommersielt tilgjengelige soppcelleekspresjonsvektorer og kan være egnede omfatter, men er ikke begrenset til pYES2 (Invitrogen), Pichia ekspresjonsvektor (Invitrogen), som Hansenula ekspresjon (Rhein Biotech. Diisselorf, Tyskland) .

Ulike insektcelleekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV18-DNA i insektceller. Kommersielt tilgjengelige insektcelleekspresjonsvektorer som kan være egnet omfatter, men er ikke begrenset til pBlue Bae III (Invitrogen) og pAcUW51 (PharMingen, Inc.)

En ekspresjonsvektor inneholdende DNA'et som koder for HPV18 som vist i figur 1 og 3 kan anvendes for uttrykk av HPVl8-proteiner i en celle, vev, organer eller dyr. Vertsceller kan være prokaryote eller eukaryote deriblant, men ikke begrenset til bakterier, slik som E. coli, soppceller slik som gjær, pattedyrceller, deriblant, men ikke begrenset til cellelinjer med humant, bovint, porcint, ape- og gnager-opprinnelse og insektceller, deriblant, men ikke begrenset til Drosophila- og silkeormavledede cellelinjer. Cellelinjer avledet fra pattedyrarter som kan være egnede og som er kommersielt tilgjengelige omfatter, men er ikke begrenset til, L-celler L-M(TK") (ATCC CCL 1,3), L-celler L-M (ATCC CCL 1,2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271(ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) og MRC-5 (ATCC CCL 171).

Ekspresjonsvektoren kan introduseres inn i vertsceller via enhver av flere teknikker, deriblant, men ikke begrenset til transformasjon, transfeksjon, lipofeksjon, protoplastfusjon og elektroporering. Ekspresjonsvektorinneholdende celler formeres klonalt og administreres individuelt for å bestemme hvorvidt de produserer HPV18-protein. Identifisering av HPV18-uttrykkende vertscellekloner kan gjøres på flere måter, deriblant, men ikke begrenset til immunologisk reaktivitet med anti-HPVl8-antistoffer og tilstedeværelse av vertscelleforbundet HPV18-aktivitet, slik som HPV18-spesifikk ligandbinding eller signaloverføring angitt som en respons formidlet av interaksjonen av HPV18-spesifikke ligander med uttrykte HPV18-proteiner.

Uttrykk av HPV-DNA kan også utføres ved anvendelse av in vitro-produsert syntetisk mRNA eller nativt mRNA. Syntetisk mRNA eller mRNA isolert fra HPVl8-produserende celler kan effektivt translateres i ulike cellefrie systemer, deriblant, men ikke begrenset til hvetekimekstrakter og reticulocyttekstrakter, i tillegg til at det effektivt kan translateres i cellebaserte systemer, deriblant, men ikke begrenset til mikroinjeksjon inn i froskeoocytter, der mikroinjeksjon inn i froskeoocytter er foretrukket.

Etter uttrykk av HPV18-protein(er) i en vertscelle kan HPV18-protein utvinnes for å tilveiebringe HPV18 i renset form. Flere HPV18-rensingsprosedyrer er tilgjengelige og egnet for anvendelse. Som beskrevet heri kan rekombinant HPV18-protein renses fra cellelysater og ekstrakter ved hjelp av ulike kombinasjoner av, eller individuell anvendelse av saltfraksjoner, ionebyttekromatografi,

størrelsesekskluderingskromatografi,

hydroksylapatittadsorpsjonskromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi.

Dessuten kan rekombinant HPV18 separeres fra andre celleproteiner ved anvendelse av en immunaffinitetskolonne laget av monoklonale eller polyklonale antistoffer som er spesifikke for fullengde nascerende HPV18, eller polypeptidfragmenter av HPV18.

Sett inneholdende HPV18-DNA, HPV18-RNA eller HPV18-protein kan fremstilles. Slike sett anvendes for å påvise DNA som hybridiserer til HPV18-DNA eller for å påvise nærvær av HPV18-protein(er) eller peptidfragmenter i en prøve. Slik karakterisering er anvendbar av ulike årsaker deriblant, men ikke begrenset til rettsanalyser og epidemiologiske studier.

For kombinasjonsbehandling med mer enn ett aktivt middel hvor de aktive midler er i separate doseformuleringer kan de aktive midler administreres samtidig eller de kan administreres til forskjellig tid.

Doseregime utvelges i overensstemmelse med ulike faktorer deriblant type, art, alder, vekt, kjønn og medisinsk tilstand til pasienten; alvoret i tilstanden som skal behandles; administreringsvei; pasientens nyre- og leverfunksjon; og i forhold til anvendelse av den særskilte forbindelse. En vanlig lege kan med letthet bestemme å foreskrive effektiv mengde av medikamentet krevet for å forebygge, imøtegå eller stoppe tilstandens progresjon. Optimal presisjon for å oppnå medkamentskonsentrasjoner innen området som i effektivitet uten toksisitet krever et regime basert på kinetikken ved medikamentets tilgjengelighet til målsetene. Dette involverer en betraktning av fordeling, likevekt og eliminering av et medikament.

Eksempel 1

Kloning av HPV18- genom

Totalt genomisk DNA ble fremstilt fra den humane cervikale karsinomavledede cellelinje. SW756 (Freedman, R.S., et al., 1982. In Vitro, 18, sider 719-726) av vanlige fremgangsmåter. DNA'et ble fordøyd med EcoRl og det ble utført elektroforese på en 8 % agarosegel med lav smeltetemperatur. En gelbit ble tatt ut tilsvarende DNA-fragmenter med en lengde på ca. 12 kbp. Agarosen ble oppløst ved anvendelse av Agaraseenzym (Boehringer Mannheim, Inc.) og størrelsesfraksjonert DNA ble presipitert, defosforylert og ligert med EcoRl-fordøyd lambda EMBL4-armer (Stratagene, Inc.). Lambdabiblioteket ble pakket ved anvendelse av Gigapack II Gold pakkingsekstrakt (Stratagene, Inc.). HPVl8-positive kloner ble identifisert ved anvendelse av en HPV18 Ll-DNA-probe på 700 bp som ble fremstilt ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av SW756-DNA som templat og oligonukleotidprimere som var oppløst på bakgrunn av den publiserte HPV18 Ll-DNA-sekvens Cole og Danos. 1987. J. Mol. Biol., 193:599-608: Genbank Accession # X05015). En HPV18-positiv lambdaklon ble isolert som inneholdt et EcoRl-fragmentinnskudd på 12 kbp og ble kalt # 187-1.

Eksempel 2

Konstruksjon av gjærekspresjonsvektorer

Den åpne leseramme (ORF) til HPV18L1 ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av klon # 187-1 som templat, Ventpolymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifiseringssykluser (94 °C, 1 min; 50 °C, 1 min; 72 °C, 2 min) og følgende oligonukleotidprimere som inneholdt flankerende Bglll-seter (understreket):

Sensprimeren introduserer en ikke-translatert ledersekvens i gjær (Kniskern, et al., 1986 Gene, 46:135-141) umiddelbart oppstrøms for HPV18L1 som initierer metioninkodon {uthevet med bold skrifttype). LI PCR-produktet på en 1,5 kbp ble oppløst med Bglll og gelrenset.

pGALl-10 gjærekspresjonsvektoren ble konstruert ved isolering av et Sphl-fragment på 1,4 kbp fra et pUC18/bidireksjonelt GAI-promoterplasmid som inneholdt de Saccharomyces cerevisiae-avledede GALI- GALI0-promoterene fra plasmidet pBM272 (tilveiebragt av Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). De innbyrdes forskjellige promoterer var flankert på hver side av en kopi av ADH1-transkripsjonell terminator fra gjær, et BamHI-kloningssete lokalisert mellom GAU-promoteren og den første kopi av den AD/fl-transkripsjonelle terminator og et Smal-kloningssete lokalisert mellom GALIØ-promoteren og den andre kopi av den ADH1 transkripsjonene terminator. En gjærskyttelvektor som besto av pBR322, gjær LEC72cf-genet og gjær 2 y plasmid {gave fra Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA) ble oppløst med SphI og legert med det Shpl divergerende GAL-promoterfragment på 1,4 kbp, noe som resulterte i pGALl-10. pGALl-10 ble linearisert med BamHI som kutter mellom GAL1-promoteren og ADffl-1ranskripsjonsterminatoren. Den BamHI-oppløste vektor og det Bglll-oppløste HPV18 Ll-PCR-fragment ble ligert og anvendt for transformasjon av E. coli DH5-celler (Gibco BRL, Inc.). Et pGALl-10-plasmid ble isolert som inneholdt HPV18 Ll-genet og ble kalt pl91-6.

En gjærekspresjonsvektor som samtidig uttrykker både HPV18 LI og L2-genene ble konstruert. Plasmid pl91-6 (pGALl-10+HPV18 LI) ble oppløst med Smal som kutter mellom GAL10-promoteren og ADJfl-trans kripsjonstermina toren. HPV18 L2-genene på 1,4 kbp ble amplifisert ved PCR, som beskrevet ovenfor, ved anvendelse av følgende oligonukleotidprimere som inneholdt flankerende Smal-seter (understreket):

Sensprimeren introduserer en ikke-translatert ledersekvens fra gjær (Kniskern et al., 1986, supra) umiddelbart oppstrøms for HPV18L2-initierende metioninkodon (uthevet med bold skrifttype). PCR-fragmentet ble oppløst med Smal, gelrenset og ligert med det Smal-oppløste pl91-6-plasmid. Et pGALl-10-plasmid inneholdende både HPV18 LI og -L2-genene ble isolert og oppløst, pl95-ll.

Eksempel 3 •

Typeangivelse av kliniske prøver

Cervikale biopsiprøver ble innsamlet fra Veterans Administration Medical Center i Indianapolis, IN (stilt til rådighet av dr. Darron Brown) og ved Albert Einstein Medical Center i Philadelphia. PA (stilt til rådighet av dr. Joan Adler) og ble frosset ved -20 °C. DNA ble isolert som beskrevet av Brown et al., 1993 (Brown, D. et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 31:2667-2673. I korte trekk ble kliniske prøver prosessert med en Braun mikro-dismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, Tyskland) og oppløst i buffer inneholdende 10 mM EDTA og 0,6 % (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS). Prøver ble justert til 20 mM Tris pH 7,4 og protein ble oppløst med 50 mcg/ml proteinase K i nærvær av 0,1 mcg/ml RNase A etterfulgt av ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol. DNA ble metanolutfelt og kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri.

DNA-prøvene ble screenet med hensyn til nærvær av HPV18 ved hjelp av PCR og Southernblotanalyser. Et 256 bp-område av HPV18 Ll-ORF ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av følgende oligonukleotidprimere, PCR-betingelsene var som anngitt i produsentenes anbefalinger for AmpliTaq DNA-polymerase/GenAmpsettet (Perkin Eimer Corp.) bortsett fra at 0,5 ul av klinisk DNA-prøve ble anvendt som templat og 10 pmol av hver primer, 2 mM dNTP og 2,0 mM MgCl2 var tilstede i den endelige reaksjonsblanding. Et 2 min, 94 °C denatureringstrinn ble etterfulgt av 40 sykluser med amplifisering (94 °C, 2 min; 45 °C, 1 min; 72 °C, 1 min).

PCR-produktene ble undersøkt ved hjelp av elektroforese på en 3 % agarosegel, blotet på nylonmembraner og hybridisert med en 32p-merket ved HPV18 Ll-spesifikk oligonukleotid probe.

Eksempel 4

DNA- sekvensering av LI- og L2- gener

HPVI8 LI- og L2-genene fra klonene #187-1, pl91-6 og pl95-ll ble sekvensert ved anvendelse av PRIZM-sekvenseringssett og den automatiserte DNA-ABI-sekvenser #373A (Applied Biosystems). For å erholde en konsensus HPV18-sekvens ble deler av Ll-gen-DNA amplifisert ved hjelp av PCR fra humane kliniske isoleringer, sekvensert og sammenlignet med de krevede og publiserte sekvenser. Et fragment (nukleotidene 817-1072) på 256 bp ble amplifisert fra hvert kliniske DNA-isolat til dette formål ved anvendelse av oligonukleotidene og varmesyklusene som beskrevet i Eksempel 3. De følgende primere:

ble anvendt for å amplifisere en amino-terminal del av Ll-DNA på 432 bp (nukleotidene 1-431) ved anvendelse av varmesyklusene beskrevet i Eksempel 3. Begge PCR-produktene ble ligert separat med plasmid pCRII (Invitrogen Corp.) ved anvendelse av reagensene og produktene anbefalt av produsenten. Plasmid-DNA ble isolert fra transformantene og de som inneholdt EcoRI-innsatser ble sekvensert.

Eksempel 5

Analyser av DNA og utledede aminosyresekvenser

Nukleotid- og utledede aminosyre(aa)-sekvenser til HPV18 LI, ifølge oppfinnelsen, er vist i Figur 1. DNA-sekvensen fra en konsensus fra klonene #187-1, pl91-6 og pl95-11. En sammenligning av HPV18 Ll-nukleotidsekvensen ifølge oppfinnelsen med den publiserte HPV18 Ll-sekvens (Genbank Accessionsnummer X05015) identifiserte forandringer i 20 bp av 1524 bp'er. Fem av nukleotidforandringene (C til G i posisjon 89, C til A i 263, C til G i 848, G til A i 967 og C til G i 1013) resulterte i aminosyresubstitusjoner. De fem rester som avviker fra det publiserte er P til R i aa-posisjonene 30, 283 og 338, T til N i aa 88 og V til I i aa 323 (Figur 2). Posisjoner 88 og 323 representerer konservative forandringer mens de tre P til R-forandringer kan i det vesentlige forandre de fysiske egenskaper til det uttrykte Ll-protein.

En sammenligning av aminosyresekvensene avledet fra kliniske isolater (nummer 354, 556, 755, 697, 795 og 23) med sekvensen ifølge oppfinnelsen og den publiserte sekvens vist i Figur 2. Det er fire lokasjoner hvor de kliniske isolatene og sekvensen ifølge oppfinnelsen avviker fra den publiserte sekvens. Posisjonene 30, 283 og 338 koder for arginin (R) i alle isolater funnet til dags dato, deriblant sekvensen ifølge

oppfinnelsen. Dette står i skarp kontrast til den publiserte

t

sekvens som har proliner (P) i hver av disse lokasjoner. Dessuten er posisjon 88 et asparagin (N) i isolatene og sekvensen ifølge oppfinnelsen, men er treonin (T) i den publiserte sekvens. Den siste forskjell (posisjon 323, ble funnet å være et valin (V) i mange av de kliniske isolater og den publiserte stamme i motsetning til et isoleucin (I) i sekvensen ifølge oppfinnelsen og én av isolatene (#23). Konklusjonen er at sekvensen ifølge oppfinnelsen gjengir de dominerende viralsekvenser som er forbundet med kliniske infeksjoner og fraværet av isolater inneholdende enhver av prolinene i posisjon 30, 283 eller 338 i den publiserte sekvens tyder på at den publiserte klon enten er en artefakt eller en tilfeldig undertype.

Nukleotid- og utledede aa-sekvenser av HPV18 L2 ble avledet fra en konsensussekvens fra klonene # 187-1 og pl95-ll og er vist i Figur 3. En sammenligning av L2-nukleotidsekvensen med den publiserte HPV18-sekvens (Genbank Aksesjonsnummer #X05015) viste forandringer i 40 bp av 1389 bp.. Bp-forand-ringene resulterte i 14 forandringer på aa-nivå: P til S i aa 29, P til N i aa 33, A til S i aa 177, D til E i aa 266, D til N i aa 270, D til G i aa 346, M til I i aa 355, V til M i aa 359, S til P i aa 365, F til S i aa 369, F til V i aa 371, F til S i aa 372, K til T i aa 373 og S til P i aa 409.

Eksempel 6

Generering av HPV18 L2- antiserum

HPV18 L2-spesifikke antistoffer ble fremstilt i geiter ved anvendelse av et trpE-HPV18 L2-fusjonsprotein uttrykt i E. coli. Fullengde L2 ORF ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av oligonukleotidprimere som ga Hindlll og BamHI-seter som flankerte henholdsvis 5'- og 3'-endene. L2-fragmentet ble innsatt i Hindlll-BamHI pATH23-ekspresjonsplasmid (Koerner et al., 1991, Meth. Enzymol. 194 .-477-490) . Fusjonsproteinet ble uttrykt i E. coli RR1-celler (Gibco BRL, Inc.) etter induksjon med 3-b-indolakrylsyre. Den uløselige fraksjon ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av farging med Coomassieblått. Trp-L2-fusjonsproteinet utgjorde hoveddelen av den uoppløselige E. coli- f raksjon. Geiter ble immunisert med trpE-L2-fusjonsproteinet ifølge den vanlige anvisning til Pocono Rabbit Farm and Laboratory, Inc. med hensyn til fusjonsproteinantigener (Protein Rabbit Farm, Canadensis, PA).

Eksempel 7

Fremstilling av gjærstamme U9

Saccharomyces cerevisiae-stamme 2150-2-3 ( MATalpha, leu2- 04, adel, cir°) ble erholdt fra dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Celler fra stamme 2150-2-3 ble dyrket over natten ved 30 °C i 5 ml YEHD-medium (Carty et al., J. Ind. Micro 2 (1987) 117-121). Cellene ble vasket tre ganger i sterilt, destillert vann, resuspendert i 2 ml sterilt destillert vann og 0,1 ml av cellesuspensjonen ble platet på hver av seks 5-fluororotsyre (FOA)-plater for å selektere for ura3-mutanter (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Platene ble inkubert ved 30 °C. Pr. 250 ml destillert vann inneholdt mediet 3,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat: 0,5 g 5-fluororotsyre; 25 mg Uracil; og 10,0 g Dextrose.

Mediet ble sterilisert ved filtrering gjennom 0,2 um-membraner for så å blandes med 250 ml 4 % Bacto-Agar (Difco) opprettholdt ved 50 °C, 10 ml av en adeninoppløsning på 1,2 mg/ml og 5 ml L-leucinoppløsning (180 mg/50 ml). Det resulterende medium ble fordelt i 20 ml pr. petriskål.

Etter 5 dagers inkubering var mange kolonier dannet. Enkelte kolonier ble isolert ved nyutstrykning av kolonier fra de opprinnelige FOA-skåler til ferske FOA-skåler som så ble inkubert ved 30 °C. Flere kolonier fra det andre sett av FOA-skåler ble testet med hensyn til nærvær ura3-mutasjon ved hjelp av "replica"-utplating på både YEHD-skåler og skåler som manglet uracil. Resultatet viste god vekst på YEHD-mediet og ingen vekst på medium som manglet uracil. Én isolering (U9) ble erholdt som viste disse egenskaper. Denne ble lagret i form av en frossen glyserolstamløsning (stamme # 325) ved -70 °C for senere anvendelse.

Eksempel 8

Fremstilling av en vektor for ødeleggelse av MNN9 - qenet i gjær

For å fremstille en vektor for ødeleggelse av MNN9-genet var det nødvendig først å klone MNN9- genet fra S. cerevisiae-genomisk DNA. Dette ble gjennomført ved hjelp av vanlig polymerasekjedereaksjons-(PCR)teknologi. En 5' sensprimer og 3' antisensprimer for PCR av fullengde MNN9-kodende sekvens ble angitt på grunnlag av den publiserte sekvens av MNA73-genet fra gjær (Zymogenetics; EPO patentsøknad nr. 88117834.7, publikasjonsnr. 0-314-096-A2). De følgende oligodeoksynukleotidprimere, inneholdende flankerende Hindlll-seter (understreket) ble anvendt:

Det innledningsvise metioninkodon for MNN9-genet er uthevet i bold skrifttype. PCR ble utført ved anvendelse av genomisk DNA fra S. eerevi sia e-stamme JRY188 som templat. Taq DNA-polymerase (Perkin Eimer) og amplifisering i 25 sykluser (94 °C 1 min, 37 °C 2 min, 72 °C 3 min). Det resulterende PCR-fragment på 1,2 kbp ble fordøyd med Hindlll, gelrenset og ligert med HindIII-fordøyd, alkalisk fosfatasebehandlet pUC13 (Pharmacia). Det resulterende plasmid ble kalt pll83.

For å ødelegge MNN9-genet i C7J?A3-genet fra gjær ble pBR322-URA3-plasmidet (som inneholder HindIII-fragmentet på 1,1 Kbp som koder for C7i?A3-genet fra S. cerevisiae som var subklonet inn i Hindlll-setet i pBR322) fordøyd med Hindlll og DNA-fragmentet på 1,1 kbp inneholdende det funksjonelle URA3-genet ble gelrenset, tillaget med butte.ender med T4 DNA-polymerase for så å ligeres med Pmll-fordøyd pll83-plasmid (Pmll-kutt innen den MNN9-kodende sekvens). Det resulterende pll99-plasmid inneholder en ødeleggelse av MNN9-genet med funksjonelt URA3-gen.

Eksempel 9

Konstruksjon av U9-avledet stamme 1372 inneholdende ødeleggelse av MNN9 - qen

For ødeleggelse av MNN9- genet i stamme U9 (# 325) ble 30 ug av pll99-plasmid fordøyd med Hindlll for å danne en lineær mnn9:: C7RA3-ødelagt kassett. Celler fra stamme 325 ble transformert med HindIII-fordøyd pll99-DNA ved hjelp av sferoplastmetoden (Hinnen et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929-1933) og transformanter ble utvalgt på et syntetisk agarmedium som manglet uracil og inneholdt 1,0 M sorbitol. Det syntetiske medium inneholdt, pr. liter destillert vann: 20 g agar; 6,7 g gjærnitrogenbase "w/o" aminosyrer; 0,04 g adenin; 0,05 g L-tyrosin; 182 g sorbitol;

20 g glukose: og 10 ml leucin minus oppløsning #2. Leucin minus oppløsning # 2 inneholder pr. liter destillert vann: 2 g L-arginin; 1 g L-histidin; 6 g L-leucin; 6 g L-isoleucin: 4 g L-lysin; 1 g L-metionin; 6 g L-fenylalanin; 6 g L-treonin; 4 g

L-tryptofan.

Skålene ble inkubert ved 30 °C i fem dager hvoretter flere kolonier var dannet. Kromosomale DNA-preparater ble fremstilt fra 10 kolonier og så fordøyd med EcoRI sammen med Hindlll. DNA-fordøyelsene ble undersøkt ved hjelp av Southernblot (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ved anvendelse av HindIII-fragmenter på 1,2 kbp med MNN9- qenet (isolert fra pll99-plasmidet) som en probe. Et isolat ble identifisert (stamme #1372) som viste de forventede DNA-båndskiftene på Southernblotet i tillegg til den ekstreme klumpethet som vanligvis kommer til syne hos mnn9-mutanter.

Eksempel 10

Konstruksjon av en vektor for ødeleggelse av HIS3 - qen i gjær

For å konstruere en ødeleggelseskasett der HIS3-genet fra S. cerevisiae var ødelagt med URA3- qenet ble YEp6-plasmidet (K. Struhl et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 76:1035) fordøyd med BamHI og BamHI-fragmentet på en 1,7 kbp inneholdende HIS3-genet ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA polymerase og ligert med pUC18 som på forhånd var fordøyd med BamHI og behandlet med T4 DNA-polymerase. Det resulterende plasmid (kalt pl501 eller pUC18-HIS3) ble fordøyd med Nhel (som kutter i den HIS-kodende sekvens) og vektorfragmentet ble gelrenset, tillaget med butte ender med T4 DNA-polymerase og så behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm. C7RA3-genet ble isolert fra pBR322-URA3-plasmidet ved hjelp av fordøyelse med Hindlll og fragmentet på 1,1 kbp inneholdende C7i?A?-genet ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med ovennevnte pUC18-HIS3 Nhel-fragment. Det resulterende plasmid (kalt pUC18-HIS3::URA3 eller pl501) inneholdt en ødelagt kassett hvorved JfIS3-genet fra gjær var ødelagt av det funksjonelle URA3- qenet.

Eksempel 11

Konstruksjon av vektor for ødeleggelse av PPBi-genet fra gjær med HIS3- genet

FP8AH-plasmid inneholdende PRBl-genet fra S. cerevisiae ble tilveiebragt av dr. E. Jones fra Carnegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263). Det var fordøyd med Hindlll og Xhol og DNA-fragmentet på 3,2 kbp inneholdende PRBl-genet ble gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. pUC18-plasmidet ble fordøyd med BamHI, gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA polymerase. Det resulterende vektorfragment ble legert med ovennevnte PRBl-genfragment for å gi plasmidet pUC18-PRBl. YEp6-plasmid, som inneholder HIS3-genet, ble kuttet med BamHI. Det resulterende BamHI-fragment på 1,7 kbp inneholdende det funksjonelle HIS3- gen ble gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA polymerase. pUC18-PRBl-plasmid ble fordøyd med EcoRV og Ncol som kutter i PRBI-kodende sekvens og fjernet det protease B-aktive sete og flankerende sekvens. Det EcoRV-NcoI-fragment på 5,7 kbp inneholdende 5'- og 3'-rester av den PRBI-kodende sekvens i pUC18 ble gelrenset, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm og ligert med det buttendede HIS3-fragmentet beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid (kalt pUC18-prbl::HIS3, stamløsning #1245) inneholdt det funksjonelle HIS3- gen istedenfor delen av PRBl- genet som var fjernet ovenfor.

Eksempel 12

Konstruksjon av et U9-relatert gjærstamme inneholdende ødeleggelser av både MNN9 - og PRBl- genene

Den U9 relaterte stamme 1372 inneholdende MNN9- gen ble beskrevet i Eksempel 9. Klonale isolater av stamme 1372 ble overført til FOA-skåler (som beskrevet i Eksempel 7) for seleksjon av ura3-mutanter. Flere ura3-isolater av stamme 1372 ble erholdt og ett spesielt isolat (stamme 12930-190-S1-1) ble utvalgt for senere ødeleggelse av HIS3-genet. pUC18-his3: :URA3-genødeleggelsesvektoren (pl505) ble fordøyd med Xbal og EcoRI for å lage en lineær his3::URA3-ødeleggelseskasett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-190-S1-1 ved hjelp av litiumacetatfremgangsmåten (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). Ura<+->transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium som manglet uracil, utstrøket på nytt for klonale isoleringer på samme medium og så "replica'*-utstrøket på medium som manglet enten uracil eller histidin for screening av de isolater som var både Ura<+ >og His". Ett isolat (stamme 12930-230-1) ble utvalgt for senere ødeleggelse av PRBl-genet. PRBI-genødeleggelsevektoren (pOC18-prbl::HIS3, stamløsning #1245) ble fordøyd med SacI og Xbal for å lage en lineær prbl:;flTS3-ødeleggelseskasett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-230-1 ved hjelp av litiumacetatfremgangsmåten. HIS<+->transformanter ble valgt på agarmedium som manglet histidin og utstrøket på nytt på samme medium for å oppnå klonale isolater. Genomisk DNA ble fremstilt fra flere av de resulterende His<+->isolater, fordøyd med EcoRI for så å elektroforeseundersøkes på 0,8 % agarosegel. Southernblotanalyser ble så utført ved anvendelse av en radioaktivt merket probe på 617 bp for PRBl-genet fremstilt ved PCR ved anvendelse av følgende

oligodeoksynukleotidprimere:

Elleve isolater ble erholdt som viste den forventede hybridisering av proben med et pr£>2; :HIS3-DNA-fragment på 2,44 kbp. Dette sto i kontrast til hybridiseringen av proben med fragmenter på 1,59 kbp til villtype PRBl-genet. Én av disse isolater inneholdende den ønskede PRB1::HIS3-ødeleggelse ble utvalgt for ytterligere anvendelse og ble kalt stamme #1558.

Eksempel 13

Uttrykk av HPV18 LI og L2 i gjær

Plasmiderne pl91-6(pGALl-10+HPV18 LI) og pl95-ll (pGALl-10+HPV18 LI + L2) ble brukt for å transformere

S.cerevisiae-stamme #1558 ( MATa, leu2- 04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, eir<0>). Klonale isolater ble dyrket ved 30 °C i YEHD-medium inneholdende 2 % galaktose i 88 timer. Etter innhøsting av cellene, ble cellepelletene brutt med glassperler og cellelysater analysert for ekspresjon av HPV18 Li og/eller HPV18 L2-protein ved immunoblotanalyse. Prøver inneholdende 25 ug av totalt cellulært protein ble undersøkt ved elektroforese og 10 % tris-glysindeler (Novex, Inc.) under denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltere. Ll-protein ble immundetektert ved anvendelse av kaninantiserum mot et trp£-HPVll Ll-protein som primært antistoff Brown et al., 1994, Virology 201:4 6-54) og pepperrotperoksidase (HRP)-bundet eselantikanin IgG (Amersham Inc.) som sekundært antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av det kjemiluminescerende ECL deteksjonssettet (Amersham, Inc.). Et Ll-proteinbånd på 50-55 KDa påvist i både LI og LI pluss L2 koekspressorgjærklonene (henholdsvis stammene 1725 og 1727) og ikke i den negative kontroll (pGAL-10 uten LI eller L2-gener) (Figur 4).

HPV18 L2-proteinet ble påvist ved hjelp av Westernanalyse ved anvendelse av geitepolyklonalt antiserum mot en trp£-HPV18 L2-fusjonsprotein som er et antistoff etterfulgt av HRP-konjugert kaninantigeit IgG (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Filtrene ble bearbeidet som beskrevet ovenfor. L2-proteinet ble påvist som et proteinbånd på 75 kDa i LI pluss L2-koekspressorgjærklonen (stamme 1727) men ikke i den negative kontroll eller LI ekspressorklonen (Figur 5).

Eksempel 14

Fermentering av HPV18 LI (stamme 1725) og

18 L1+ AL2 ( stamme 1727).

Overflatevekst av en skålkultur av stammene 1725 og 1727 ble transformert aseptisk til et leucinfritt flytende medium inneholdende (per L): 8,5 Difcogjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; 40 g glukose; 0,25 g L-tyrosin; 0,1 g L-arginin; 0,3 g L-isoleucin; 0,05 g L-metionin; 0,2 g L-tryptofan; 0,05 g L-histidin; 0,2 g L-lysin; 0,3 g L-fenylalanin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter vekst ved 28 °C, 250 rpm på en rotasjonsrister, ble frosne kulturampuller fremstilt ved tilsetning av steril glyserol til en endelig konsentrasjon på 17 % (vekt/volum) før lagring ved -70 °C (1 ml pr. fryseampulle). Inokulum ble utviklet i samme medium (500 ml pr. 2 liters kolbe) og ble startet ved overføring av det tinede innhold av en frossen kulturampulle og inkubering ved 28 °C, 250 rpm på en rotasjonsrister i 29 timer. Fermenteringer av hver stamme ved anvendelse av en New Brunswick SF-116-fermentor med et arbeidsvolum på 10 1 etter inokulering. Produksjonsmediet inneholdt (pr. 1): 20 g Difcogjærekstrakt; 10 g Sheffield HySoy-pepton; 20 g glykose; 20 g galaktose; 0,3 ml Union Carbide UCON LB-625 antiskum; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Hele innholdet {500 ml) av 2-L-inokuleringskolben ble overført til en fermentor som var inkubert ved 28 °C, 5 1 luft pr. minutt, 400 rpm, 3,5 psi trykk. Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde nivåer av oppløst nitrogen større enn 40 % av metning. Fermenteringsforløpet ble overvåket ved hjelp av frakoblede glukosemålinger (Beckman glykose 2 analyserer) og tilkoblet massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter inkubering i 66 timer var celletettheter på 9,5 til 9,7 tørr cellevekt pr. 1 oppnådd. Kulturene ble konsentrert ved hulfiberfiltrering (Amicon H5MP01-43 kassett i et Amicon DC-10-filtreringssystem) til ca. 2 1, gjennomfiltrert med 2 1 fosfatbufret saltløsning og ytterligere konsentrert (til ca. 1 1) før overføring til 500 ml sentrifugekolber. Cellepelleter ble erholdt ved sentrifugering ved 800 rpm {Sorval GS-3-rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 191 til 208 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil anvendelse.

Eksempel 15

Rensing av rekombinante HPV type 18 LI kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler ble lagret frossent ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 126 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 70 ml "Breaking Buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaseinhitorene PMSF og pepstatin A ble innsatt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble separert ved et trykk på ca. 16000 psi i 4 omganger i en M110 Y-mikrofluidiserer (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den separerte celleoppslemming ble sentrifugert ved 12000 x g i 40 min for å fjerne cellerester. Supernatantvæsken inneholdende Ll-antigen ble utvunnet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og tilført til en anionbytteinnfangingskolonne (9,0 cm ID x 3,9 cm) med Fractogel EMD TMAE-650 (M)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vasking med buffer A ble antigenet eluert med en gradient på 0-1,0 M NaCl i buffer A. Kolonnefraksjoner ble analysert med hensyn til totalprotein ved hjelp av Bradfordmetoden. Fraksjoner ble så analysert med like tilføringer av totalt protein ved hjelp av Westernblotting og SDS-PAGE med sølvfargepåvisning.

TMAE-fraksjoner med sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein ble slått sammen. Antigenet ble konsentrert ved hjelp av ammoniumsulfatfraksjonering. Oppløsningen ble justert til 35 % mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i løpet av 10 minutter. Prøven ble plassert på is og utfelling ble utført over 4 timer, prøven ble sentrifugert ved 6000 x g i 45 minutter. Pelleten ble suspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl) .

Det ble utført kromatografi for den resuspenderte pellet på en størrelsesekslusjonskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med Sephacryl 500 HR-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Forsøksbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved hjelp av Westernblotting og SDS-PAGE med sølvfargepåvisning. De reneste fraksjoner ble slått sammen. Den resulterende blanding ble konsentrert i en celle med omrøring på 50 ml ved anvendelse av 43 mm YM-100 "flat-sheet"-membraner (Amicon, Beverly, MA) i et N2-trykk på 4-6 psi.

Det endelige produkt ble analysert ved hjelp av Westernblotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Ll-proteinet ble estimert til å være 50-60 % homogen. Identiteten til Ll-proteinet ble bekreftet ved hjelp av Westernblotting. Det endelige produkt ble fordelt og lagret ved -70 °C. Denne prosess resulterte i en total mengde av protein på 12,5 mg.

Bradfordanalyse av totalprotein

Totalprotein ble analysert ved analysert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig Coomassieplussett (Pierce, Rockford, IL). Prøver ble fortynnet til egnede nivåer i Milli-Q-H20. Krevede volumer var 0,1 ml og 1,0 ml for henholdsvis standard og mikroanalysefremgangsmåte. Ved begge fremgangsmåter ble BSA (Pierce, Rockford, IL) anvendt for å generere standardkurven. Analyse ble utført ifølge produsentens anbefalinger. Standardkurver ble plottet ved anvendelse av dataprogrammet CricketGraph på en Macintosh Ilci-datamaskin.

SDS- PAGE og Westernblotanalyser

Alle geler, buffere og elektroforeseapparater ble erholdt fra Novex (San Diego, CA) og ble brukt ifølge produsentens anbefalinger. I korte trekk ble prøver fortynnet til like proteinkonsentrasjoner i Milli-Q-H20 og blandet 1:1 med prøveinkubasjonsbuffer inneholdende 200 mM DTT. Prøver ble inkubert i 15 min ved 100 °C og anbragt på på forhånd ferdigstøpte 12 % Tris-glysingeler. Prøvene ble analysert ved hjelp av elektroforese ved 125V i 1 time og 45 minutter. Gelene ble utviklet ved anvendelse av enten sølvfarving ved hjelp av en variasjon av fremgangsmåten til Heukeshoven og Dernick [ Electrophoresis, 6 ( 1985) 103- 112] eller kollodial Coomassiefarging ved anvendelse av et kommersielt erholdt sett (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

For Westernblot ble proteiner overført til PVDF-membraner ved 25V i 40 min. Membraner ble vasket med Milli-Q-H20 og lufttørket. Primært antistoff var polyklonalt kaninantiserum mot et TrpE-HPVll Ll-fusjonsprotein (gave fra dr. D. Brown). Tidligere forsøk viste at dette antiserum kryssreagerer med HPV type 18 LI på Westernblot. Antistoffoppløsningen ble fremstilt ved hjelp av fortynning antiserum i blottingbuffer (5 % melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0, 002 % NaN3) . Inkuberingen varte minst 1 time ved 20-23 °C. Blotet ble vasket i 1 min i tre omganger med PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffoppløsning ble fremstilt ved fortynning av geite-kanin IgG-alkalisk fosfatasebundet konjugatantiserum (Pierce, Rockford, IL) i blottingbuffer. Inkuberingen fortsatte under samme betingelser i minst 1 time. Blot ble vasket før og påvist ved anvendelse av et 1-trinns NBT/BCIP-substrat (Pierce, Rockford, IL).

Eksempel 16

Elektronmikroskopiske undersøkelser

For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en alikvot av hver prøve plassert på et 200-nettgitter-karbonbelagt kobberrist. En dråpe 2 % fosforwolframsyre (PTA), pH 7,2 ble passert på gitteret i 20 sekunder. Gitterne ble lufttørket før overføring for EM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et JEOL 100 CX-transmisjonsmikroskop (JOEL USA, Inc.) i en akselererende voltmengde på 1000 kV. Genererte mikrografer hadde en endelig forstørrelse på lOOOOOx. Viruslignende partikler ble observert med 50-55 nm diameters størrelse i gjærprøven inneholdende HPV18 Ll-ekspresjonsplasmidet (Figur 6) . Ingen VLP. ble observert i gjærkontrollprøvene.

Eksempel 17

Subkloning av HPV18 cDNA inn i ekspresjonsvektorer

cDNA-koder for HPV18 ble subklonet i flere vektorer for uttrykk av HPV18-protein i infiserte vertsceller og for in vitro-transkripsjon/translasjon. Disse vektorer omfattet pBluescript II SK+(der uttrykk drives ved hjelp av T7- eller T3-promotorene) pcDNA I/Amp (hvor ekspresjon ble drevet av cytomegalovirus (CMV)-promoteren), pSZ9016-l (hvor ekspresjon ble drevet av HIV lang terminalrepetisjon (LTR)-promoteren) og

baculovirusoverføringsvektoren pAcUW51 (PharMingen, Inc.)

(hvor ekspresjon ble drevet av polyhedrin (PH)-promoteren) for fremstilling av rekombinante baculovirus inneholdende den HPVl8-kodende DNA-sekvens.

a) pBluescript II SK+ :HPV18. Fullengde HPV18 cDNA-klon ble gjenvunnet fra lambda-bakteriofag ved hjelp av

begrenset EcoRI-fordøying og ligering inni EcoRI-kuttet, CIP-behandlet pBluescript II SK+. Separate subkloner ble gjenvunnet hvorved sensorienteringen av HPV18 fulgte enten T7 eller T3-promoterene.

b) pcDNA I/ Amp:HPV18. For å fremme direksjonen kloning ble HPV18 tatt ut fra et renset plasmidpreparat av

pBluescript II SK+:HPV18 hvorved HPV18 DNA-sekvensen lå nedstrøms for T7-promoteren, ved anvendelse EcoRV og Xba I. Resulterende EcoRV, Xba I-HPVl8-fragmentet ble renset og ligert inn i EcoRV-kuttet. Xba I-kuttet, CIP-behandlet pcDNA I/Amp slik at det HPV18-kodede DNA var nedstrøms for CMV-promoteren.

c) pSZ9016- l:HPVl8. HPV18 ble tatt ut fra pBluescript II SK+:HPV18 ved hjelp av begrenset EcoRI-fordøying og senere

rensing av fragmentet på 1,3 Kb fra agarosegeler. Det resulterende EcoRI-HPV18-fragmentet ble ligert inn i EcoRV-kuttet, CIP-behandlet pSZ9016-l. Subkloner ble utvalgt hvorved sensorienteringen til HPV18 lå nedstrøms for HIV LTR-promoteren.

d) pAcUW51:HPV18 LI. Fullengde HPV18 L1-0RF ble amplifisert ved hjelp av PCR fra klon # 187-1 ved anvendelse

av oligonukleotidprimerne med flankerende Bglll-seter. Ll-genet ble satt inn i BamHI-setet til

baculovirusoverføringsvektoren, pAcUW51 (PharMingen, Inc.), under kontroll av polyhedrinpromoteren. Rekombinante baculovirus ble generert inneholdende HPV18 Ll-ekspresjonskassetten ifølge fremgangsmåtene beskrevet i Pharmingen Manual. Rekombinante kloner ble renset ved hjelp av begrenset fortynning og dotblothybridisering.

Eksempel 18

Uttrykk av HPV18-polypeptidet ved hjelp av in vitro-transkripsjon/translasjon og ved transfeksjon inn i vertsceller

Vektorer inneholdende HPV18 DNA-sekvenser ble anvendt for å drive translasjonen av HPV18-polypeptidet i kaninreticulocyttlysater, pattedyrvertsceller og i baculovirusinfiserte insektceller. De eksperimentell prosedyrer var i det vesentlige lik dem beskrevet i produsentens instruksjoner.

a) In vitro transkripsjon/ translasjon. pBluescript III SK+:HPV18 plasmid DNA {HPV18 i T7-orientering) ble

linearisert ved hjelp av Barn HI-fordøying nedstrøms for HPV18-innskuddet. Det lineariserte plasmid ble renset og anvendt som et templat for "run-off"-transkripsjon ved anvendelse av T7 RNA-polymerase i nærvær av m7G (5')ppp(51)G. De resulterende HPV18-transkriptene med "capped"-ende ble renset ved hjelp av LiCl-rensing og anvendt for å drive translasjonen av HPV18 i nukleaseforbehandlet kaninretikulocyttlysat i nærvær av L-[<35>S]metionin.

b) Uttrykk i pattedyrceller. HPV18-proteinet ble uttrykt i pattedyrvertsceller etter transfeksjon med enten

pcDNA I/Amp:HPV18 (under kontroll av CMV-promoteren) eller pSZ9016-l:HPV18 (under kontroll av HIV LTR-promoteren), I det siste tilfelle (pSZ9016-l:HPV18) ble celler kotransfektert med det TAT-uttrykkende plasmid pSZ90161:TAT. For begge HPV18-ekspresjonsplasmider ble COS-7 celler transfektert ved anvendelse av enten DEAE-dekstran eller lipofeksjon med Lipofectamin (BRL). c) Uttrykk i insektceller. HPV18 Ll-inneholdende baculovirusoverføringsvektor pAcUWSl:HPV18 LI ble anvendt for

å produsere rekombinante baculovirus ( Autographia california) ved hjelp av in vivo-homolog rekombinasjon.

Epitopeidentifisert HPV18 LI ble så uttrykt i Sf9 ( Spodoptera frugiperda) insektceller dyrket i suspensjonskultur etter infeksjon med HPV18-inneholdende rekombinant baculovirus.

Eksempel 19

Forbindelser som påvirker HPV18-aktivitet kan påvises ved hjelp av ulike fremgangsmåter. En metode for identifisering av forbindelser som påvirker HPV18 består av:

(a) blanding av en testforbindelse med

en oppløsning inneholdende HPV18

for å lage en blanding;

(b) måling av HPV18-aktivitet i

blandingen; og

(c) sammenligning av HPV18 i blandingen

med en standard.

Forbindelser som påvirker HPV18-aktivitet kan formuleres til farmasøytiske forbindelser, Slike farmasøytiske forbindelser kan være anvendbare for behandling av sykdommer eller tilstander som er karakterisert ved HPV18-infeksjon.

Eksempel 20

DNA som er strukturelt relatert til DNA som koder for HPV18 ble påvist med en probe. En egnet probe kan avledes fra DNA med hele eller en del av nukleotidsekvensen i Figur 1 eller Figur.3, RNA kodet av DNA med hele eller en del av nukleotidsekvensen i Figur 1 eller Figur 3 eller degenererte oligonukleotider avledet,fra et protein med sekvensen i Figur 1 eller Figur 3.

Claims (11)

1. Viruslignende partikler, karakterisert ved at de omfatter rekombinant Ll-protein eller rekombinante Ll+L2-proteiner fra humant papillomvirus 18, idet de viruslignende partikler har en renhet på minst 60 %, hvori Ll-proteinet er vist i figur 1 og L2-proteinet er vist i figur 3.

2. Viruslignende partikler ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante Ll-protein eller de rekombinante Ll+L2-proteiner fremstilles i gjær.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av viruslignende partikler ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: (a) transformering av gjær med et rekombinant DNA-molekyl som koder for papillomvirus Ll-protein eller papillomvirus L1+L2- proteiner; (b) dyrking av den transformerte gjær under betingelser som tillater uttrykk av det rekombinante DNA-molekylet for fremstilling av det rekombinante papillomvirusprotein; og (c) isolering av det rekombinante papillomvirus-protein for fremstilling av viruslignende partikler ifølge krav 1.

4. Rekombinant papillomvirusprotein, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge krav 3.

5. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter de viruslignende partikler ifølge krav 1.

6. Farmasøytiske preparater, karakterisert ved at de omfatter de viruslignende partikler ifølge krav 1 og en farmasøytisk aksepterbar eksipiens.

7. Isolert og renset HPV18Ll-DNA-molekyl som vist i figur 1, eller et HPV18L2-DNA-molekyl som vist i figur 3.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har evne til å uttrykke DNA-molekylet ifølge krav 7 i en vert.

9. I det vesentlige renset protein, karakterisert ved at det er kodet for av DNA-molekylet ifølge krav 7.

10. Fremgangsmåte for ekspresjon av et humant papillomvirus type 18-protein i en vert, karakterisert ved at den omfatter: (a) overføring av ekspresjonsvektoren ifølge krav 8 til en egnet vert; og (b) dyrking av verten ifølge trinn (a) under betingelser som tillater ekspresjon av det humane papillomvirus type 18-protein fra ekspresj onsvektoren.

11. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse utvalgt fra DNA-molekylet ifølge krav 7, peptider kodet for av DNA-molekylet ifølge krav 7, RNA som er komplementært til DNA-molekylet ifølge krav 7 eller kombinasjoner derav og en farmasøytisk akseptabel bærer.