HU223761B1 - A 18-as típusú humán papillomavírust kódoló DNS - Google Patents

A 18-as típusú humán papillomavírust kódoló DNS Download PDF

Info

Publication number
HU223761B1
HU223761B1 HU9801334A HUP9801334A HU223761B1 HU 223761 B1 HU223761 B1 HU 223761B1 HU 9801334 A HU9801334 A HU 9801334A HU P9801334 A HUP9801334 A HU P9801334A HU 223761 B1 HU223761 B1 HU 223761B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hpv18
dna
protein
recombinant
cells
Prior art date
Application number
HU9801334A
Other languages
English (en)
Inventor
Kathrin U. Jansen
Kathryn J. Hofmann
Joseph G. Joyce
Hugh A. George
Michael P. Neeper
Original Assignee
Merck & Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27020342&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU223761(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/408,669 external-priority patent/US5840306A/en
Priority claimed from US08/409,122 external-priority patent/US5820870A/en
Application filed by Merck & Co., Inc. filed Critical Merck & Co., Inc.
Publication of HUP9801334A2 publication Critical patent/HUP9801334A2/hu
Publication of HUP9801334A3 publication Critical patent/HUP9801334A3/hu
Publication of HU223761B1 publication Critical patent/HU223761B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát a 18-as típusú humán papillomavírus (HPV18)proteinjeit és azok származékait kódoló DNS-- molekulák képezik. Atalálmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-molekulákexpresszáltatására alkalmas expressziós vektorok; rekombinánspapillomavírus-proteinek; vírusszerű részecskék; a találmány szerintiDNS által kódolt peptidek és proteinek; a találmány szerinti DNS-tvagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó vakcinák; a találmányszerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazóimmunológiai készítmények; továbbá eljárások a 18-as típusú humánpapillomavírus proteinjeinek expresszáltatására, vírusszerű részecskékelőállítására és immunreakciók indukálására. A találmány szerintitisztított HPV18-DNS vagy annak fragmensei felhasználhatók a HPV18homológjainak vagy fragmenseinek egyéb forrásokból történő izolálásáraés tisztítására. Ezen túlmenően, a találmány szerinti készítmények éseljárások alkalmasak HPV18-fertőzéssel összefüggő betegségek ésállapotok kezelésére és megelőzésére. ŕ

Description

A találmány tárgyát a 18-as típusú humán papillomavírus (HPV18) proteinjeit és azok származékait kódoló DNS-molekulák képezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-molekulák expresszáltatására alkalmas expressziós vektorok; rekombináns papillomavírusproteinek; vírusszerű részecskék; a találmány szerinti DNS által kódolt peptidek és proteinek; a találmány szerinti DNS elleni antitestek, illetve a DNS által kódolt proteinek elleni antitestek; a találmány szerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó vakcinák; a találmány szerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó immunológiai készítmények; továbbá eljárások a 18-as típusú humán papillomavírus proteinjeinek expresszáltatására, vírusszerű részecskék előállítására és immunreakciók indukálására.
A találmány szerinti tisztított HPV18-DNS vagy annak fragmensei felhasználhatók a HPV18 homológjainak vagy fragmenseinek egyéb forrásokból történő izolálására és tisztítására. Ezen túlmenően, a találmány szerinti készítmények és eljárások előnyösen alkalmazhatók HPV18-fertőzéssel összefüggő betegségek és állapotok kezelésére és megelőzésére.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a HPV18-L1 -nukleotidszekvenciát és az abból leszármaztatott aminosavszekvenciát mutatjuk be.
A 2. ábrán a HPV18-vírus L1-proteinjének aminosavváltozatait mutatjuk be.
A 3. ábrán a HPV18-L2-nukleotidszekvenciát és az abból leszármaztatott aminosavszekvenciát mutatjuk be.
A 4. ábrán az élesztőben expresszáltatott
HPV18-L1-protein „immunblot”-analízisének eredményét mutatjuk be.
Az 5. ábrán az élesztőben expresszáltatott
HPV18-L2-protein „immunblof-analízisének eredményét mutatjuk be.
A 6. ábrán az élesztőben expresszáltatott
HPV18-L1-protein által képzett vírusszerű részecskék elektronmikroszkópos képét mutatjuk be.
A papillomavírusok (PV) számos különféle állatfajt megfertőzhetnek, így például embereket, juhokat, kutyákat, macskákat, nyulakat, majmokat, kígyókat és szarvasmarhákat. A papillomavírusok a hámsejteket fertőzik, s a fertőzés helyén általában jóindulatú epitheliális és fibroepitheliális tumorok kialakulását indukálják. A papillomavírusok fertőző anyagai fajspecifikusak; például, egy humán papillomavírus csak embereket képes megfertőzni.
A papillomavírusok gazdaszervezeteik alapján csoportosíthatók. Ezen túlmenően, a humán papillomavírusok (HPV) - DNS-szekvencia-homológiáik alapján több mint 70 típusba sorolhatók. A papillomavírus-típusok típusspecifikus immunogének, mivel egy adott típusba tartozó papillomavírus által okozott fertőzést semlegesítő immunitás nem biztosít védettséget egy másik típusú papillomavírussal szemben.
Emberekben a különböző HPV-típusok eltérő betegségeket okoznak. Az 1., 2., 3., 4., 7., 10., 26., 27., 28. és 29. HPV-típus az egészséges, illetve a legyengült immunrendszerű egyéneknél egyaránt jóindulatú szemölcsök kialakulását eredményezi. Az 5., 8., 9., 12., 14., 15., 17., 19-25., 36., 46., 47., 48., 49. és 50. HPV-típus a legyengült immunrendszerű embereknél felületi léziókatokoz; a 6., 11., 34., 39., 41., 42., 43., 44. és 51-55. HPV-típusok a nemi szervek és a iégzőrendszer nyálkahártyáján condyloma kialakulását okozza, míg a 16. és
18. HPV-típus a nemi szervek nyálkahártyáján epitheliális diszpláziát eredményez, és összefügg a méhnyak, a hüvely, a külső női nemi szervek és a végbél in situ és átterjedő karcinomáinak többségével.
A papillomavírusok kisméretű (50-60 nm), „envelope”-proteint nem tartalmazó, ikozaéderes DNS-vírusok, amelyek legfeljebb nyolc korai és két kései gént tartalmaznak. A vírusgenom nyitott leolvasási fázisait (ORF) E1-E7, illetve L1 és L2 jelöléssel azonosítjuk („E” a korai, „L” a kései génekre vonatkozik). Az L1- és L2-gén víruskapszidproteineket kódol, míg a korai gének a vírusreplikációért és a celluláris transzformációért felelősek.
A papillomavírusok fő kapszidproteinje az L1-protein, melynek molekulatömege 55-60 kD. A kisebb L2kapszidprotein megjósolt molekulatömege 55-60 kD, látszólagos molekulatömege - poliakrilamid-gélelektroforézises meghatározás alapján - 75-100 kD. Immunológiai adatok arra utalnak, hogy az L2-proteinmolekulák nagyobb része a víruskapszomerben az L1-proteinmolekuláknál beljebb helyezkedik el. Az L1 nyitott leolvasási fázisa a különböző papillomavírusokban nagymértékben konzervált (az L2-proteinek kevésbé konzerváltak).
Megállapították, hogy az L1- és L2-gén előnyösen alkalmazható a megelőzésszerű immunológiai védelem céljaira. A gyapotfarkúnyúl-papillomavírussal („cottontail rabbit papillomavírus”; CRPV) és a szarvasmarha-papillomavírussal (BPV) végzett kísérletekkel kimutatták, hogy - baktériumok által expresszált vagy vacciniavektorok alkalmazásával expresszáltatott - L1- és L2-proteinnel végzett immunizálás hatására a kezelt állatok védetté váltak a vírusfertőzéssel szemben. A papillomavírus-L1-gének baculovírus-expressziósrendszerben vagy vacciniavektorok alkalmazásával végzett expresszáltatása vírusszerű részecskék („virus-like particles”; VLP) kialakulását eredményezte, melyek a teljes vírussal végzett kezeléssel elérhetőhöz hasonló nagyságú, vírussemlegesítő hatású antitest-reakció kiváltására alkalmazhatók.
A HPV16 után a HPV18 a méhnyakrákos eseteknél megfigyelhető második legjelentősebb HPV-típus. A HPV18-at a világ különböző részeiről származó méhnyakrák-biopsziák 5-20%-ánál kimutatták [Ikenberg: „Humán papillomavírus DNA in invasive genital carcinomas” in: Genital Papillomavírus Infections”, szerk.: G. Gross és munkatársai, 85-112. old. (1990)]. A HPV18-fertőzés megoszlásában földrajzi különbségek figyelhetők meg, mivel az afrikai és dél-amerikai nők tumorbiopsziáiban gyakrabban mutatható ki a
HU 223 761 Β1
HPV18, mint az európai és észak-amerikai nőkből vett hasonló szövetmintákban. E földrajzi különbség alapvető okai nem ismeretesek.
A fentiek alapján látható, hogy a HPV18-fertőzéssel szembeni vakcina kifejlesztése igen nagy jelentőségű, mivel a HPV18 agresszívabb rákokkal is, és ritkán az enyhébb CIN-I és CIN—II prekurzor léziók kialakulásában is szerepet játszik.
A találmány tárgyát tisztított 18-as típusú humán papillomavírus (HPV18)-proteint, valamint annak származékait kódoló DNS-molekulák képezik. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti DNS által kódolt peptidek és proteinek; a találmány szerinti DNS elleni antitestek, illetve a DNS által kódolt proteinek elleni antitestek; a találmány szerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó vakcinák; a találmány szerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó immunológiai készítmények; továbbá a találmány szerinti DNS-t, az abból származó RNS-t vagy a DNS által kódolt proteint tartalmazó reagenskészletek.
A találmány szerinti DNS-t vagy a DNS által kódolt proteineket tartalmazó gyógyászati készítmények ismert eljárások alkalmazásával, például gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval készített keverékként állíthatók elő. Az alkalmazható hordozók és előállítási eljárások leírását illetően Id.: „Remingtons’s Pharmaceutical Sciences”. A gyógyászati szempontból elfogadható, hatékonyan alkalmazható készítmények a találmány szerinti DNS, protein vagy vírusszerű részecske hatásos mennyiségét tartalmazzák. Az ilyen készítmények különböző HPV-típusokból származó DNS-eket, proteineket vagy vírusszerű részecskéket is tartalmazhatnak.
A találmány szerinti terápiás és diagnosztikai készítmények a papillomavírus-fertőzések kezelésére, illetve diagnosztizálására elégséges mennyiségben adhatók be a pácienseknek. A hatásos mennyiség különféle tényezőktől függően változhat; ilyen tényező, például, a páciens állapota, testtömege, neme és kora, valamint az adagolás módja. A találmány szerinti készítmények körülbelül 1 pg és körülbelül 1 mg közötti dózisban alkalmazhatók.
A találmány szerinti készítmények többféle módon, például szubkután, helyileg, szájon át, nyálkahártyán keresztül, intravénásán vagy intramuszkulárisan adhatók be.
A találmány szerinti vakcinák olyan DNS-t, RNS-t vagy proteint tartalmaznak, amelyek a gazdaszervezetben semlegesítő hatású antitestek képződésének indukálásához szükséges antigéndeterminánsokat hordoznak. A találmány szerinti vakcinák kellőképpen biztonságosak ahhoz, hogy klinikai fertőzés veszélye nélkül legyenek alkalmazhatók; nincsenek toxikus mellékhatásaik; hatékony módon adagolhatok; stabilak; továbbá vakcinák előállítására alkalmas hordozókkal kompatíbilisak.
A találmány szerinti vakcinák többféle módon beadhatók, így például szájon át, parenterálisan, szubkután, nyálkahártyán keresztül, intravénásán vagy intramuszkulárisan. A találmány szerinti vakcinák dózisa a páciens állapotától, nemétől, testtömegétől és korától; a beadás módjától; valamint a vakcinában alkalmazott papillomavírus típusától függően változó lehet. A vakcinák kapszulák, szuszpenziók, elixírek vagy folyékony oldatok formájában alkalmazhatók. A találmány szerinti vakcinák immunológiai szempontból elfogadható hordozó felhasználásával állíthatók elő.
A találmány szerinti vakcinákat terápiás szempontból hatásos - vagyis védő hatású immunreakció kiváltására alkalmas - mennyiségben adagoljuk. A terápiás szempontból hatásos mennyiség az alkalmazott papillomavírus típusától függően változhat. A vakcinát egy vagy több dózisban adhatjuk be.
A találmány szerinti DNS vagy DNS-származékok immunogén készítmények előállítására is alkalmazhatók; az ilyen készítmények megfelelő gazdába juttatva immunreakció indukálására alkalmasak.
A találmány szerinti DNS vagy DNS-származékok antitestek előállítására is alkalmazhatók. Ahogy itt alkalmazzuk, az „antitest” kifejezés poliklonális és monoklonális antitestekre, valamint azok - antigénhez vagy hapténhez kötődni képes - fragmenseire [pl. az Fv-, Fab- és F(ab)2-fragmensekre] vonatkozik.
A találmány szerinti DNS és DNS-származékok humán papillomavírus-fertőzés szerotipizálására és HPV-szűrésre is alkalmazhatók. Ezenfelül, a találmány szerinti DNS-ek, rekombináns proteinek, vírusszerű részecskék, valamint antitestek humán papillomavírusfertőzés detektálására és szerotipizálására alkalmas reagenskészletek előállítására is felhasználhatók. Az ilyen reagenskészletek részét képezheti egy olyan rekeszes tároló, amelynek rekeszei egymástól elkülönítve legalább egy tartály befogadására alkalmasak. A tárolórekeszekben helyezhetők el a különböző HPV-típusok detektálására alkalmas reagensek (például HPV18-DNS, rekombináns HPV-protein, vírusszerű részecske, illetve anti-HPV-antitestek).
A találmány szerinti DNS-ek és az általuk kódolt proteinek molekulatömeg- és molekulaméret-markerként is alkalmazhatók.
A genetikai kód degeneráltsága miatt egy adott aminosavat több kodon kódolhat, így egy bizonyos aminosavszekvenciát több hasonló DNS-oligonukleotid is kódolhat, melyek közül csak egy azonos a HPV18-DNS-szekvenciával, ugyanakkor, ezek a hasonló oligonukleotidok - megfelelő körülmények között - akkor is képesek a HPV18-DNS-hez hibridizálódni, ha a HPV18-DNS-hez képest hibás bázispárosodásokat („mismatch”) is tartalmaznak. Változó körülmények között a hibás bázispárosodású oligonukleotidok továbbra is hibridizálódhatnak a HPV18-DNS-hez, s ezáltal lehetővé teszik a HPV18-at kódoló DNS azonosítását és izolálását.
A találmány szerinti tisztított HPV18-DNS vagy annak fragmensei felhasználhatók a HPV18 homológjainak és fragmenseinek egyéb forrásokból történő izolálására és tisztítására. Ennek végrehajtása céljából az első HPV18-DNS-t - megfelelő hibridizációs feltételek mellett - a HPV18 homológjait kódoló DNS-t tartalma3
HU 223 761 Β1 zó mintával keverjük össze. Ezután a hibridizálódott DNS-komplex izolálható, és a DNS-komplexből tisztítható a HPV18-homológót kódoló DNS.
Ismeretes, hogy az egyes aminosavakat többféle kodonok kódolhatják, így a találmány tárgyát képezik azok a DNS-szekvenciák is, amelyek olyan kodonokat tartalmaznak, amelyek végül ugyanazon aminosav transzlálódását eredményezik. A találmány szerinti megoldás leírásában az egy vagy több helyettesített kodont tartalmazó szekvenciákat degenerált változatnak nevezzük. Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan mutációkat tartalmazó DNS-szekvenciák vagy proteinek, amely mutációk lényegében nem változtatják meg az expresszálódott protein fizikai tulajdonságait.
Jól ismert az a tény, hogy egy bizonyos peptidet kódoló DNS-szekvencia úgy módosítható, hogy a természetben előforduló peptidétől eltérő tulajdonságú peptidet kódoljon. A DNS-szekvenciák módosítási eljárásai közé tartozik, többek között, a helyspecifikus mutagenezis.
Ahogy a találmány leírásában alkalmazzuk, a HPV18 „funkcionális származéka” kifejezés olyan vegyületre vonatkozik, amely a HPV18 biológiai aktivitásával lényegében azonos - funkcionális vagy strukturális - biológiai aktivitást fejt ki. A „funkcionális származékok” közé tartoznak a HPV18 fragmensei, változatai, degenerált változatai, homológjai, illetve kémiai származékai. A „fragmens” kifejezésen a HPV18-protein bármely polipeptid-alegységét értjük. A „változat” kifejezés olyan molekulára vonatkozik, amely - szerkezetileg és funkcionális szempontból - lényegében hasonló a teljes HPV18-molekulához vagy annak egy fragmenséhez. Egy molekula akkor „lényegében hasonló” a HPV18-molekulához, ha azzal lényegében hasonló szerkezetű, illetve, ha a két molekula lényegében hasonló biológiai aktivitású. Ilyenformán, ha a két molekula lényegében hasonló aktivitású, változatoknak tekinthetők, még akkor is, ha az egyik molekula szerkezete nem ismerhető fel a másikban, illetve, ha a két molekula aminosavszekvenciája nem azonos.
Az „analóg” kifejezés olyan molekulára vonatkozik, amely funkcionális szempontból lényegében hasonló a teljes HPV18-molekulához vagy annak egy fragmenséhez.
A HPV18-DNS klónozására számos különböző eljárás alkalmazható. Az ilyen eljárások közé tartozik, többek között, a HPV18-gének közvetlen expresszáltatása (amit megfelelő expressziós vektorrendszerben létrehozott, HPV18-gént tartalmazó cDNS- vagy genomi DNS-könyvtár alkalmazásával végzünk). Egy másik eljárás szerint bakteriofág vagy plazmid ingázóvektorban létrehozott, HPV18-gént tartalmazó cDNS- vagy genomi DNS-könyvtárat (a HPV18 aminosavszekvenciája alapján előállított) jelölt oligonukleotidpróbával szkrínelünk. Egy további eljárás értelmében bakteriofág vagy plazmid ingázóvektorban létrehozott, HPV18-gént tartalmazó cDNS- vagy genomi DNSkönyvtárat a HPV18-at kódoló DNS egy részével szkríneljük. Ezt a DNS-szakaszt HPV18-DNS-fragmensek - tisztított HPV18 aminosavszekvenciája alapján tervezett degenerált láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett - specifikus polimeráz-láncreakciós (PCR) amplifikációjával állítjuk elő. Egy másik alkalmas klónozási eljárás szerint HPV18-at termelő sejtekből RNS-t izolálunk, és az RNS-ből - in vitro vagy in vivő transzlációs rendszer alkalmazásával - proteint állítunk elő. Az RNS pepiiddé vagy proteinné történő transzlációja a HPV18-protein legalább egy részének termelődését eredményezi, amely, például, a HPV18protein aktivitása vagy HPV18 elleni antitesttel mutatott immunológiai reaktivitása alapján azonosítható. Ezzel az eljárással a HPV18-at termelő sejtekből izolált RNS-állományt olyan RNS jelenlétére vizsgáljuk, amely a HPV18 legalább egy részét kódolja. Az RNSállományt tovább szelektálhatjuk annak érdekében, hogy a HPV18-RNS-t elkülönítsük a nem HPV18RNS-ektől. Az ezen eljárással előállított peptid vagy protein szekvenálásával kapott aminosavszekvenciát HPV18-cDNS létrehozására alkalmas láncindítók alapjául alkalmazhatjuk. A transzlációra alkalmazott RNS szekvenálásával HPV18-at kódoló nukleotidszekvenciákat kapunk, amelyek alapján HPV18-cDNS-könyvtár szkrínelésére alkalmas próbák állíthatók elő. A fenti eljárások szakember számára ismertek, s leírásuk megtalálható, pl.: Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, második kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
HPV18-at kódoló DNS izolálására egyéb könyvtártípusok, illetve egyéb sejtekből és sejttípusokból létrehozott könyvtárak is alkalmazhatók. Az egyéb könyvtártípusok közé tartoznak, többek között, a HPV18-as típust tartalmazó egyéb sejtekből vagy sejttípusokból származó cDNS-könyvtárak és genomi DNS-könyvtárak.
A cDNS-könyvtárak különböző eljárásokkal állíthatók elő, melyek leírását Id.: Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, második kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Szakemberszámára kézenfekvő, hogy HPV18-proteint kódoló DNS megfelelő genomi DNS-könyvtárból is izolálható. A genomi könyvtárak előállítási eljárásait szintén Sambrook és munkatársai írták le (Id. fentebb).
A fentebb említett eljárásokkal előállított, klónozott HPV18-DNS vagy DNS-fragmensek - megfelelő promotert és transzkripciós szabályozóelemeket tartalmazó - expressziós vektorba klónozva és prokarióta vagy eukarióta gazdasejtbe juttatva rekombináns HPV18 termelése céljából expresszáltathatók. Az ilyen rekombináns manipulációs technikák leírását Id. Sambrook és munkatársai (Id. fentebb).
Az expressziós vektorok olyan DNS-szekvenciák, amelyek - megfelelő gazdasejtekben - a klónozott génkópiák transzkripciójához, illetve mRNS-eik transzlációjához szükségesek. Az ilyen vektorok az eukarióta gének különféle gazdasejtekben (így például baktériumokban, kékeszöld algákban, növényi sejtekben, rovarsejtekben, gombasejtekben és állati sejtekben) történő expresszáltatására alkalmasak. A speciálisan megter4
HU 223 761 Β1 vezett vektorok lehetővé teszik, hogy a DNS különböző sejtek között (így például baktérium- és élesztősejtek, baktériumsejtek és állati sejtek, baktérium- és gombasejtek, vagy baktériumsejtek és gerinctelen állatok sejtjei között) „ingázzon”. A megfelelően kialakított expressziós vektorok általában a következő komponenseket tartalmazzák: replikációs kezdőhely (a gazdasejtekben lejátszódó önálló replikációhoz); szelektálható markerek, korlátozott számú restrikciós felismerési hely (ami nagy kópiaszámot tesz lehetővé); és aktív promoterek. A promoter olyan DNS-szekvencia, amely az RNS-polimeráz DNS-hez történő kötődését és az RNS-szintézis beindítását szabályozza. Az úgynevezett erős promoterek az mRNS-szintézis beindítását nagy gyakorisággal eredményezik. Az expressziós vektorok lehetnek klónozóvektorok, módosított klónozóvektorok, speciálisan kialakított plazmidok, illetve vírusok.
A HPV18-DNS vagy annak fragmensei emlőssejtekben történő expresszáltatására számos különféle emlős-expressziósvektor alkalmazható. A rekombináns HPV18-expresszióra alkalmas - kereskedelmi forgalomban beszerezhető - emlős-expressziósvektorok között említhető, többek között, a következők: pcDNA3 (Invitrogen); pMCIneo (Stratagene); pXT1 (Stratagene); pSG5 (Stratagene); EBO-pSV2-neo (ATCC 37 583); pBPV-1(8-2) (ATCC 37 110); pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37 224); pRSVgpt (ATCC 37 199); pRSVneo (ATCC 37 179); pSV2-dhfr (ATCC 37146); pUCTag (ATCC 37 460) és XZD35 (ATCC 37 565).
A HPV18-DNS vagy annak fragmensei baktériumsejtekben történő expresszáltatására számos különféle bakteriális expressziós vektor alkalmazható. Az ilyen célra alkalmas - kereskedelmi forgalomban beszerezhető - bakteriális vektorok közé tartoznak, többek között, a következők: pET11a (Novagen); λ-gtH (Invitrogen); pcDNAII (Invitrogen); PKK223-3 (Pharmacia).
A HPV18-DNS vagy annak fragmensei gombasejtekben történő expresszáltatására számos különféle gombasejtekben működőképes - expressziós vektor alkalmazható. Az ilyen vektorok közé tartoznak, többek között, a következő - kereskedelmi forgalomban beszerezhető - vektorok: pYES2 (Invitrogen); Pichia-expressziósvektor (Invitrogen); Hansenu/a-expressziósvektor(Rhein Biotech., Düsseldorf, Németország).
A HPV18-DNS vagy annak fragmensei rovarsejtekben történő expresszáltatására számos különféle - rovarsejtekben működőképes - expressziós vektor alkalmazható. Az ilyen célra alkalmas vektorok közé tartoznak, többek között, a következő - kereskedelmi forgalomban beszerezhető - vektorok: pBlueBaclll (Invitrogen); és pAcUW51 (PharMingen, Inc.).
A HPV18-proteinek vagy HPV18-proteinszakaszok sejtekben, szövetekben, szervekben vagy állatokban (beleértve az embert is) történő expresszáltatására HPV18-proteint vagy HPV18-proteinszakaszokat kódoló DNS-t tartalmazó expressziós vektor alkalmazható. Gazdasejtként prokarióta és eukarióta sejtek, így baktériumsejtek (E. co/í-sejtek), gombasejtek (például élesztősejtek), emlőssejtek (például emberi, szarvasmarha-, sertés-, majom- és rágcsálóeredetű sejtek), valamint rovarsejtek (például Drosophila-sejtek és selyemhernyósejtek) egyaránt alkalmazhatók. Az ilyen célra alkalmas, kereskedelmi forgalomban beszerezhető emlőssejtek közé tartoznak, többek között, az L-M(TK-) L-sejtek (ATCC CCL 1.3); az L-M L-sejtek (ATCC CCL 1.2), a 293-as sejtek (ATCC CRL 1573); Raji-sejtek (ATCC CCL 86); CV-1-sejtek (ATCC CCL 70); COS-1-sejtek (ATCC CRL 1650); COS-7-sejtek (ATCC CRL 1651); CHO-K1-sejtek (ATCC CCL 61); 3T3-sejtek (ATCC CCL 92); NIH/3T3-sejtek (ATCC CRL 1658); HeLa-sejtek (ATCC CCL 2); C127l-sejtek (ATCC CRL 1616); BS-C-1-sejtek (ATCC CCL 26); és MRC-5-sejtek (ATCC CCL 171).
Az expressziós vektorok különböző eljárások (például transzformáció, transzfekció, lipofekció, protoplasztfúzió, elektroporáció) alkalmazásával juttathatók be a gazdasejtekbe. Az expressziós vektort tartalmazó sejteket klonálisan szaporítjuk, s a kapott sejtekben külön-külön azt vizsgáljuk, hogy termelnek-e HPV18-proteint. A HPV18-at expresszáló gazdasejtklónok különböző eljárásokkal azonosíthatók, így például, többek között, HPV18-protein elleni antitestekkel mutatott immunológiai reaktivitás vagy a gazdasejt HPV18-aktivitása alapján (utóbbira példa a HPV18-specifikus ligandumkötés vagy szignáltranszdukció, amelyet a HPV18-specifikus ligandumok expresszált HPV18-proteinnel lévő interakciója közvetít).
A HPV-DNS-szakaszok expressziója természetes eredetű mRNS, illetve in vitro előállított, szintetikus mRNS segítségével egyaránt megvalósítható. A szintetikus mRNS, illetve a HPV18-at termelő sejtekből izolált mRNS hatékonyan transzlálható különböző sejtmentes rendszerekben (például, többek között, búzacsíra- vagy retikulocytakivonatban), továbbá sejtalapú rendszerekben, elsősorban békaoocytákba történő mikroinjektálással.
Gazdasejtben megvalósított expressziójukat követően a HPV18-proteinek tisztított formában nyerhetők ki. A HPV18-protein tisztítására számos hatékony eljárás áll rendelkezésre. Amint azt a leírásban ismertetjük, a rekombináns HPV18-protein sejtlizátumokból és sejtkivonatokból történő tisztítására sófrakcionálást, ioncserélő kromatográfiát, méretkizárásos kromatográfiát, hidroxilapatit-adszorpciós kromatográfiát, hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiát, valamint a felsorolt módszerek különböző kombinációit alkalmazhatjuk.
A rekombináns HPV18-protein egyéb celluláris proteinektől történő elkülönítésére - a teljes hosszúságú HPV18-molekulára vagy annak polipeptidfragmenseire specifikus - monoklonális vagy poliklonális antitesteket tartalmazó immunaffinitási oszlop is alkalmazható. A monoklonális és poliklonális antitestek számos jól ismert eljárással előállíthatok. A találmány leírásában monoklonális vagy monospecifikus antitesteken a HPV18proteinhez homogén módon kötődő, egyféle vagy többféle antitestet értünk. Homogén kötődésen az adott antitest egy meghatározott antigénhez vagy epitóphoz való kötődési képességét értjük.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a monospecifikus antitestek előállítási eljárásai felhasználhatók a
HU 223 761 Β1
HPV-polipeptid-fragmensekre vagy a teljes hosszúságú HPV-polipeptidekre specifikus antitestek előállítására. Nyilvánvaló tehát, hogy előállíthatok olyan monospecifikus antitestek, amelyek a működőképes HPV18-proteinekre vagy azok fragmenseire specifikusak.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a HPV18-at kódoló DNS vagy RNS expresszióját, illetve a HPV18-protein(ek) működését in vivő módosító vegyületek azonosítására. Ilyen módosító hatása DNSnek, RNS-nek, peptideknek, proteineknek vagy nem protein természetű szerves molekuláknak egyaránt lehet. Az ilyen vegyületek a HPV18-at kódoló DNS vagy RNS expressziójának, illetve a HPV18-protein működésének erősítésével vagy gyengítésével fejtik ki hatásukat. Az ilyen módosító hatású vegyületek számos eljárással kimutathatók. Az eljárás lehet egyszerű „igen/nem” vizsgálat, ami arra ad választ, hogy van-e változás az expresszióban vagy a protein működésében. A vizsgálati eljárás kvantitatívvá tehető oly módon, hogy a tesztelni kívánt mintában és egy standard mintában mért expresszió vagy proteinműködés nagyságát összehasonlítjuk egymással.
Előállíthatok olyan reagenskészletek, melyek HPV18-DNS-t, annak fragmenseit, HPV18-DNS vagy HPV18-protein elleni antitesteket, illetve HPV18-RNS-t vagy HPV18-proteint tartalmaznak. Az ilyen reagenskészletek HPV18-DNS-sel hibridizáló DNS, illetve HPV18-proteinek vagy peptidfragmensek jelenlétének adott mintában történő detektálására alkalmazhatók. Ez a kimutatási eljárás számos területen, többek között igazságügyi orvostani és epidemiológiai vizsgálatokban használható eredményesen.
„Antiszensz”-terápia céljából HPV18-at kódoló DNS-szekvenciával komplementer nukleotidszekvenciák szintetizálhatók. Ilyen antiszensz molekula lehet DNS, annak stabil származékai, így például foszfor-tioátok vagy metil-foszfonátok; RNS vagy annak stabil származékai, például a 2’-O-alkil-RNS vagy más antiszensz HPV18-oligonukleotidokat utánzó molekulák. Az antiszensz HPV18-molekulák mikroinjektálással, liposzómák közvetítésével vagy az antiszensz szekvenciát hordozó vektorok expressziójával juttathatók a célsejtekbe. A HPV18-antiszensz-terápia különösen olyan betegségek kezelésére előnyös, amelyek esetében a HPV18aktivitás csökkentésének kedvező hatása van.
A „kémiai származék” kifejezésen egy alapmolekulához képest új gyököket tartalmazó molekulát értünk. Az ilyen gyökök javíthatják az alapmolekula oldhatóságát, abszorpcióját, növelhetik felezési idejét, továbbá enyhíthetik nemkívánatos mellékhatásait vagy csökkenthetik toxicitását. Az ilyen molekularészekre számos forrásban találhatók példák (Id. például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”).
A találmány szerinti eljárásokkal azonosított vegyületek önmagukban is alkalmazhatók, olyan - szokványos vizsgálatokkal megállapított - adagolással, amely a HPV18-nak vagy aktivitásának optimális mértékű gátlása mellett minimálisra csökkenti a toxicitás veszélyét. Emellett esetenként kívánatos lehet egyéb hatóanyagok egyidejű vagy egymás utáni alkalmazása.
A találmány szerinti vegyületeket előnyösen napi egyszeri dózisban alkalmazzuk, vagy más módon, a napi adag több dózisra elosztva is beadható. A találmány szerinti vegyületeknek számos adagolási módja lehetséges, így többek között beadhatók intranazálisan, szájon át, transzdermálisan, kúp alakjában stb.
A több hatóanyag alkalmazásával végzett kombinált kezeléseknél (melyek esetében a különböző hatóanyagokat önálló dóziskészítmények alakjában alkalmazzuk) a hatóanyagokat egyidejűleg vagy külön-külön, megfelelő időközönként adhatjuk be.
A találmány szerinti vegyületek adagolását számos tényező figyelembe vételével határozzuk meg; ilyen tényező a páciens faja, kora, testtömege, neme és egészségi állapota; a kezelendő elváltozások súlyossága; a beadás módja; a beteg vese- és májműködése; valamint az alkalmazni kívánt vegyület. Szakember számára nem okoz gondot az adott megbetegedés megelőzéséhez, továbbfejlődésének megállításához vagy visszafordításához szükséges hatékony gyógyszermennyiség meghatározása és előírása. A hatékony, de nem toxikus hatóanyag-koncentráció eléréséhez ismerni kell a gyógyszer célszervekbe jutásának kinetikáját is. Ehhez a hatóanyag eloszlását, egyensúlyi állapotát és kiürülését egyaránt figyelembe kell venni.
A találmány szerinti eljárásokban a leírásban részletesen ismertetett vegyületek hatóanyagként alkalmazhatók, jellemzően megfelelő gyógyszerészeti oldószerekkel, kötőanyagokkal vagy hordozókkal (összefoglalóan: „hordozókkal”) elegyítve. A hordozókat az adagolás módjának megfelelően választjuk ki; így például alkalmazhatunk tablettákat, kapszulákat, elixíreket, szirupokat, végbélkúpokat, zseléket stb. Ezen túlmenően, a hordozóknak a hagyományos gyógyszerészeti eljárásokkal feldolgozhatóknak kell lenniük.
Például, a tabletta vagy kapszula formájában történő perorális beadás céljára a hatóanyagot szájon át adható, nem toxikus, gyógyászati szempontból elfogadható, közömbös hordozóval elegyítjük, például etilalkohollal, a glicerinnel, a vízzel stb. Szükség esetén e keverékhez megfelelő kötő-, síkosító-, szétoszlató- és színezőanyagok is adhatók. Az alkalmas kötőanyagok között említhetők például a keményítő, a zselatin, a természetes cukrok (glükóz, béta-laktóz), a kukoricaszirupok, a természetes és mesterséges gumik (akácia, tragantmézga vagy nátrium-alginát), a karboxi-metil-cellulóz, a polietilénglikol, a viaszok és hasonlók. Az dóziskészítményekben alkalmazható síkosítószerek közé tartozik, többek között a nátrium-oleát, a nátrium-sztearát, a magnézium-sztearát, a nátrium-benzoát, a nátrium-acetát, a nátrium-klorid és hasonlók. Az alkalmas szétoszlatóanyagok közé tartozik, többek között a keményítő, a metil-cellulóz, az agar-agar, a bentonit, a xantángumi és hasonlók.
Folyékony készítmények előállítása céljából a hatóanyag megfelelően ízesített szuszpendáló- vagy diszpergálószerrel elegyíthető; ilyenek például a természetes vagy mesterséges gumik (tragantmézga, akácmézga, metil-cellulóz stb.). Ezeken kívül diszpergálószerként glicerin és hasonló anyagok is alkalmazhatók. Pa6
HU 223 761 Β1 renterális adagolásra steril szuszpenziók vagy oldatok, míg intravénás adagolásra - általában megfelelő konzerválószert tartalmazó - izotóniás oldatok alkalmazhatók.
A felületi (helyi) kezelésre alkalmas készítmények- 5 ben a hatóanyagot szokványos vivőanyagokkal, például alkoholokkal, Aloe vera géllel, allantoinnal, glicerinnel, A- és E-vitaminok olajos oldatával, ásványi olajjal, PPG2-mirisztil-propionáttal elegyíthetjük, miáltal alkoholos oldatok, tisztítóoldatok, tisztítókrémek, bőrzse- 10 lék, bőrkezelő oldatok és krém- vagy gélállagú samponok állíthatók elő.
A találmány szerinti vegyületek liposzómák alkalmazásával is beadhatók, mely liposzómák lehetnek úgynevezett kis unilamelláris, nagy unilamelláris és muitila- 15 melláris vesiculumok. A liposzómák számos foszfolipidből előállíthatok, így például koleszterinből, sztearilaminból vagy foszfatidil-kolinokból.
A találmány szerinti vegyületek hordozóként monoklonális antitestekhez kapcsolva, továbbá a hatóanyag 20 irányított célbajuttatását lehetővé tevő oldható polimerekhez kapcsolva is beadhatók. Az ilyen polimerek közé tartozik, többek között, a poli(vinil-pirrolidon), a piránkopolimer, a polihidroxi-propil-metakril-amid-fenol, a polihidroxi-etil-aszpartamid-fenol, valamint a palmitoilgyö- 25 kökkel szubsztituált polietilén-oxid-polilizin. A találmány szerinti vegyületek a hatóanyagok kontrollált felszabadulását lehetővé tevő - a szervezetben biológiailag lebomló - polimerekhez, így politejsavhoz, poliepszilon-kaprolaktonhoz, polihidroxi-vajsavhoz, poliortoészterekhez, 30 poliacetálokhoz, polihidropiránokhoz, policiano-akrilátokhoz, illetve hidrogélek keresztkötött vagy amphipatikus blokk-kopolimereihez kapcsolva is alkalmazhatók.
A találmány szerinti megoldást a következőkben kísérleti példákon keresztül szemléltetjük. Szakember 35 számára kézenfekvő, hogy a találmány igényelt oltalmi köre nem korlátozódik csupán ezekre a megvalósítási módokra.
1. példa
A HPV18-genom klónozása
Emberi méhnyakrák-eredetű sejtvonalból [SW756; Freedman és munkatársai: In vitro 18, 719 (1982)] - hagyományos eljárással - teljes genomi DNS-t izoláltunk A DNS-t EcoRI-endonukleázzal emésztettük, majd a 0,8%-os, alacsony olvadáspontú preparatív agarózgélen végzett elektroforézist követően a körülbelül 12 kbos DNS-nek megfelelő sávot kivágtuk a gélből, és az agarózt Agarase™ enzimmel (Boehringer Mannheim, Inc.) emésztettük. A méret szerint szétválasztott DNS-t kicsaptuk, defoszforiláltuk és - EcoRI-gyel emésztett X-EMBL4-karokhoz (Stratagene, Inc.) ligáltuk. A lambda-könyvtárat „Gigapack II Gold” csomagolókivonat (Stratagene, Inc.) alkalmazásával csomagoltuk. A HPV18-pozitív kiónokat egy 700 bp-os HPV18-L1DNS-próba alkalmazásával azonosítottuk, mely DNSpróbát templátként az SW756-DNS, láncindító oligonukleotidokként pedig - a HPV18-L1 korábban közzétett DNS-szekvenciája [Colé és Dános: J. Mól. Bioi. 193, 599 (1987); Genbank azonosító szám: X05015] alapján kialakított - láncindítók alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakcióval állítottuk elő. Izoláltunk egy HPV18pozitív - 12 kb-os EcoRI-fragmenst tartalmazó - lambda-klónt, melyet 187-1-es kiónnak neveztünk el.
2. példa
Élesztőgombában alkalmazható expressziós vektorok előállítása
A HPV18-L1 nyitott leolvasási fázisát - templátként a 187-1-es klón alkalmazásával végzett - polimerázláncreakcióval amplifikáltuk. Az amplifikációt 10 amplifikációs ciklussal (ciklusonként 94 °C-on 1 percig, 50 °C-on 1 percig és 72 °C-on 2 percig), „Vent”-polimeráz (New England Biolabs Inc.) alkalmazásával végeztük. A polimeráz-láncreakció során a következő - szegélyező Bglll-helyeket (aláhúzott nukleotidok) tartalmazó - láncindító oligonukleotidokat használtuk:
szensz láncindító: 5'-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGG CC TAGTG-3' antiszensz láncindító: 5’-GAAGATCTTTACTTCCTGGCACGTACACGCACA CGC-3'
A szensz láncindító a PCR-termékbe - a HPV18L1 kezdő metioninkodonjától (vastag betűvel szedett nukleotidok) közvetlenül 5’-irányban - élesztőeredetű, 45 nem transzlálódó vezetőszekvencia [Kniskern és munkatársai: Gene 46, 135 (1986)] beépülését eredményezi. Az 1,5 kb-os L1-PCR-terméket Bglll-vel emésztettük és gélelektroforézissel tisztítottuk.
A pGAL1-10 élesztő-expressziósvektor előállítása 50 céljából a - pBM272-plazmidból [melyet Mark Johnston (Washington University, St. Louis, MO) bocsátott rendelkezésünkre] származó divergens Saccharomyces cerevisiae GAL1-GAL10 promotereket tartalmazó pUC18/kétirányú GAL-promoter plazmidból 1,4 kb-os 55 Sphl-fragmenst izoláltunk. A divergens promotereket mindkét oldalon élesztőeredetű ADH1 transzkripciós terminátor egy-egy kópiája szegélyezi. Ezenfelül, a szóban forgó plazmid a GAL1-promoter és az ADH1 transzkripciós terminátor első kópiája között BamHI-helyet, továb- 60 bá a GAL10-promoter és az ADH1 transzkripciós terminátor második kópiája között Smal-helyet tartalmaz. Egy - pBR322-plazmidból, élesztő-LEU2-d-génből és élesztő-2pm-plazmidból álló - élesztőeredetű ingázóvektort [Benjámin Hall (University of Washington, Seattle, WA) adománya] Sphl-gyel emésztettük, és az 1,4 kb-os Sphl/divergens-GAL promoter fragmenssel ligáltuk, miáltal a pGAL1-10-vektort kaptuk, melyet a GAL1-promoter és az ADH1 transzkripciós terminátor között hasító BamHI-gyel linearizáltunk. A BamHI-gyel emésztett pGALIO-vektort és a Bglll-vel emésztett HPV6a-L1PCR-fragmenst egymással ligáltuk, és az így kapott konstrukcióval E. coli DH5-sejteket (Gibco-BRL, Inc.) transzformáltunk. A transzformált sejtekből - HPV18L1-gént tartalmazó - pGAL1-10-plazmidot izoláltunk, s ezt a plazmidot p191-6-nak neveztük el.
Előállítottunk egy olyan élesztőeredetű expressziós vektort, amely a HPV18-L1- és HPV18-L2-gént együt7
HU 223 761 Β1 tesen expresszálja. A p191-6-plazmidot (pGAL1-10 + HPV18-L1) - a GAL10-promoter és az ADH1 transzkripciós terminátor között hasító - Smal-gyel emésztettük. Az 1,4 kb-os HPV18-L2-gént a fentebb leírtak szerint polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk, melynek során a következő - szegélyező Smal-helyeket (ld. aláhúzott nukleotidok) tartalmazó - láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:
szensz láncindító: 5' antiszensz láncindító: 5'
-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3' ; -TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3'.
A szensz láncindító a PCR-termékbe - a HPV18L2 kezdő metioninkodonjától (vastag betűvel szedett nukleotidok) közvetlenül 5'-irányban - élesztőeredetű, nem transzlálódó vezetőszekvencia [Kniskern és munkatársai: Gene 46, 135 (1986)] beépülését eredményezi. A PCR-fragmenst Bglll-vel emésztettük, gélelektroforézissel tisztítottuk, majd az - Smal-gyel emésztett p191-6-plazmiddal ligáltuk. Izoláltunk egy pGAL1-10plazmidot, amely mind a HPV18-L1-, mind a HPV18L2-gént tartalmazta. A kapott plazmidot p195-11-nek neveztük el.
3. példa
Klinikai minták tipizálása
A „Veterans Administration Medical Center”-ben (Indianapolis, IN; Dr. Darron Brown szívességéből) és az „Albert Einstein Medical Centerében (Philadelphia, PA; Dr. Joan Adler szívességéből) gyűjtött méhnyakbiopszia-mintákat -20 °C-on fagyasztottuk, és Brown és munkatársai leírása szerint [Brown és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 31, 2667 (1993)] DNS-t izoláltunk belőlük. Röviden; a klinikai mintákat „Braun mikro-dismembrator II” készülékkel (B. Braun Instruments, Melsungen, Németország) feldolgoztuk, és - 10 mM EDTA-t és 0,6 vegyes% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) tartalmazó - pufferben szolubilizáltuk. A mintákat 20 mM Tris-pufferrel (pH=7,4) kezeltük, s a proteint 0,1 pg/ml RN-áz-A jelenlétében - 50 pg/ml proteinázK-val emésztettük, majd fenol/kloroform/izoamil-alkohol elegyben extraháltuk. A DNS-t etanollal kicsaptuk és spektrofotometriával mennyiségi meghatározást végeztünk.
A DNS-mintákat polimeráz-láncreakcióval és „Southern-blot”-analízissel HPV18 jelenlétére szkríneltük. Polimeráz-láncreakcióval a HPV18-L1 nyitott leolvasási fázisának 256 bp-os szakaszát amplifikáltuk, melynek során a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:
szensz láncindító: 5'-CAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATG-3';
antiszensz láncindító: 5'-CATCATATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTG-3'.
A polimeráz-láncreakcióhoz „AmpliTaq™” DNS-polimerázt és „GeneAmp™” reagenskészletet (Perkin-Elmer Corp.) alkalmaztunk. Az amplifikációt a gyártó útmutatásai szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy 35 a reakcióelegyben templátként 0,5 pl klinikai DNS-mintát, a láncindítókból 10 pmol-t, a dNTP-kből 2 mM-t, illetve 2 mM MgCI2-oldatot alkalmaztunk. A reakciót 94 °C-on kétperces denaturálási lépéssel kezdtük, s az amplifikációt 40 ciklussal (ciklusonként 94 °C-on egy 40 percig; 45 °C-on egy percig és 72 °C-on egy percig) végeztük.
A PCR-termékeket 3,0%-os agarózgélen elektroforizáltuk, nejlonmembránokra lenyomatokat készítettünk, majd 32P-izotóppal jelölt HPV18-L1-specifikus öli- 45 gonukleotidpróbával hibridizáltuk.
4. példa
Az L1- és L2-gén szekvenálása
A 187-1-es, p191-6-os és p195-11-es kiónban lévő HPV18-L1 és -L2 gént „PRIZM szekvenáló reagenskészlet és automatizált, 373A típusú „DNA ABI Sequencer” (Applied Biosystems) alkalmazásával szekvenáltuk. Konszenzus HPV18-szekvencia előállítása céljából emberi klinikai izolátumokból polimeráz-láncreakcióval L1-génszakaszokat amplifikáltunk, a kapott fragmenseket szekvenáltuk, és a találmány igényelt oltalmi körébe tartozó, illetve közzétett szekvenciákkal hasonlítottuk össze. Erre a célra - a 3. példában bemutatott oligonukleotidok és amplifikálási ciklusok alkalmazásával - mindegyik klinikai DNS-izolátumból egy 256 bp-os fragmenst (817-1072. nukleotidok) amplifikáltunk.
Az L1-DNS 432 bp-os N-terminális szakaszának (1-431. nukleotidok) amplifikálására a következő két láncindítót:
5' -GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3' ;
és
5'-CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3', valamint a 3. példában leírt amplifikálási ciklusokat alkalmaztuk. Mindkét PCR-terméket (külön-külön) pCRII-plazmidba (Invitrogen) ligáltuk, amihez a gyártó által előírt reagenseket és eljárásokat alkalmaztuk.
A transzformánsokból plazmid-DNS-t izoláltunk, s az EcoRI-inszerteket tartalmazókat szekvenciaanalízisnek vetettük alá.
HU 223 761 Β1
5. példa
A HPV18-L1 és -L2 DNS-szekvenciájának és az abból leszármaztatott aminosavszekvenciák analízise
A HPV18-L1 nukleotidszekvenciáját és leszármaztatott aminosavszekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be. A DNS-szekvenciát a 187-1-es, p191-6-os és p195-11es kiónok konszenzusszekvenciája alapján kaptuk. A találmány igényelt oltalmi körébe tartozó HPV18-L1nukleotidszekvencia egy közzétett HPV18-L1-szekvenciával (Genbank; nyilvántartási szám: X05015) végzett összehasonlításával 1524 bp közül 20 bp eltérését állapítottuk meg. A nukleotidváltozások közül öt (a 89. citozin helyett guanin; a 263. citozin helyett adenin; a 848. citozin helyett guanin, a 967. guanin helyett adenin és az 1013. citozin helyett guanin) aminosavszubsztitúciót eredményezett. Ezek a szubsztitúciók a következők: a közzétett aminosavszekvencia 30., 283. és 338. helyén található prolin helyett arginin; a 88. helyen treonin helyett aszparagin; és a 323. helyen valin helyett izoleucin (Id. 2. ábra). A 88. és 323. aminosav szubsztitúciója konzervatív változást reprezentál, míg a három prolin -> arginin szubsztitúció jelentős mértékben módosíthatja az expresszálódott L1-protein fizikai tulajdonságait.
A klinikai izolátumokból (354., 556., 755., 697., 795. és 23. izolátum) származó aminosavszekvenciák találmány szerinti szekvenciával és a közzétett szekvenciával történő összehasonlítását a 2. ábrán mutatjuk be. Az aminosavszekvenciában négy olyan hely található, ahol a klinikai izolátumokból származó szekvenciák és a találmány szerinti szekvencia eltér a közzétett szekvenciától. Az eddig talált izolátumokból származó szekvenciák mindegyikében, továbbá a találmány szerinti szekvenciában a 30., 288. és 338. helyen arginin (R) található, ezzel szemben, a közzétett szekvenciában ezeken a helyeken prolin (P) van. Ezen túlmenően, az izolátumokból származó szekvenciákban és a találmány szerinti szekvenciában a 88. helyen aszparagin (N), a közzétett szekvenciában viszont treonin (T) található. A 323. helyen az izolátumokból származó szekvenciák többségében és a közzétett szekvenciában valin (V) található, a találmány szerinti szekvenciában, illetve a 23. izolátumból származó szekvenciában viszont izoleucin (I) van. Mindezekből azt a következtetést vontuk le, hogy a találmány szerinti szekvencia a klinikai fertőzésekkel összefüggő leggyakoribb vírusszekvenciákat tükrözi, és az a tény, hogy egyik izolátumban sem található olyan aminosavszekvencia, amely a 30., 283. vagy 338. helyen - a közzétett szekvenciához hasonlóan prolint tartalmazna, arra utal, hogy a közzétett klón egy mesterséges termék vagy egy jelentéktelen altípus.
A HPV18-L2 nukleotidszekvenciáját és leszármaztatott aminosavszekvenciáját a 187-1-es és p195-11es kiónok konszenzusszekvenciája alapján kaptuk. Az L2-nukleotidszekvencia közzétett HPV18-szekvenciával (Genbank; nyilvántartási szám: X05015) végzett összehasonlításával 1389 bp közül 40 bp eltérését állapítottuk meg, melyek aminosavszinten 14 változást eredményeznek. Az aminosavszubsztitúciók a következők: a 29. prolin helyett szerin; a 33. prolin helyett aszparagin; a 177. alanin helyett szerin; a 266. aszparaginsav helyett glutaminsav; a 270. aszparaginsav helyett aszparagin; a 346. aszparaginsav helyett glicin; a 355. metionin helyett izoleucin; a 359. valin helyett metionin; a 365. szerin helyett prolin; a 369. fenil-alanin helyett szerin; a 371. fenil-alanin helyett valin; a 372. fenil-alanin helyett szerin; a 373. lizin helyett treonin; és a 409. szerin helyett prolin.
6. példa
HPV18-L2-antiszérum előállítása
E. co//-ban expresszáltatott trpE/HPV18-L2 fúziós protein alkalmazásával kecskékben HPV18-L2-specifikus antitesteket állítottunk elő. Az L2-gén teljes hosszúságú nyitott leolvasási fázisát - az 5’-, illetve 3'-oldali végen Hindii!-, illetve BamHI-helyet biztosító láncindító oligonukleotidok alkalmazásával - polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk. Az L2-fragmenst - HindlII-mal és BamHI-gyel emésztett pATH23 expressziós plazmidba [Koemer és munkatársai: Meth. Enzymol. 194, 477 (1991)] inszertáltuk. A fúziós proteint - 3-b-indol-akrilsawal végzet indukciót követően - E. coli RR1-sejtekben (Gibco BRL, Inc.) expresszáltattuk.
Az oldhatatlan frakciót SDS-PAGE-analízissel „Coomassie Blue” festékkel végzett festés alkalmazásával - analizáltuk. Az oldhatatlan frakció döntő részét a trpE/L2 fúziós protein alkotta. A kecskéket a trpE/L2 fúziós proteinnel a Pocono Rabbit Farm and Laboratory Inc. fúziós protein antigénekre kifejlesztett standard eljárásának alkalmazásával immunizáltuk.
7. példa
U9-élesztőtörzs előállítása
A Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3-törzset (MATalpha, Ieu2-O4, adel, cir°) Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA) bocsátotta rendelkezésünkre. A 2150-2-3-törzs sejtjeit 5 ml YEHD-tápoldatban 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk [Carty és munkatársai: J. Ind. Micro. 2, 117 (1987)]. A sejteket steril desztillált vízben háromszor mostuk, 2 ml steril desztillált vízben újraszuszpendáltuk, majd a sejtszuszpenzió 0,1-0,1 ml-ével - ura3-mutánsok szelektálása céljából - hat 5-fluor-ortosavas (FOA) lemezt oltottunk be (Cold Spring Harbor Laboratory Manual fór Yeast Genetics). A lemezeket 30 °C-on inkubáltuk. A tápközeg 250 ml-e desztillált vízben oldva a következő összetevőket tartalmazta: 3,5 g (aminosav és ammónium-szulfát) nélküli „Difco Yeast Nitrogén Base”, 0,5 g
5-fluor-ortosav, 25 mg uracil, 10,0 g dextróz.
A tápközeget 0,2 pm-es membránokon átszűrve sterilizáltuk, majd 250 ml - 50 °C-on tartott - 4%-os „BactoAgar”-ral (Difco), 10 ml (1,2 mg/ml koncentrációjú) adeninoldattal és 5 ml (180 mg/50 ml koncentrációjú) L-leucin-oldattal elegyítettük. Az így nyert tápközeget 20 ml-es adagokban Petri-csészékbe öntöttük.
Ötnapos inkubálás után a táptalajokon számos kolónia volt megfigyelhető. Egyedülálló telepeket az első FOA-lemezekről friss FOA-lemezekre történő átoltással nyertünk, melyeket 30 °C-on inkubáltunk. A friss FOA-lemezekről számos telepet teszteltünk ura3-mu9
HU 223 761 Β1 táció jelenlétére, oly módon, hogy a telepeket replikatechnikával YEHD, illetve uracilmentes táptalajokra oltottuk át. A mutáció meglétére a YEHD-lemezeken megfigyelhető jó növekedés, illetve az uracilmentes lemezeken a növekedés hiánya utalt. Ezeket a tulajdon- 5 Ságokat egy izolátum (U9) esetében figyeltük meg, melyet későbbi felhasználás céljából glicerinben -70 °Con tároltunk (325-ös törzs).
8. példa 10
Az MNN9-es élesztőgén megszakítására szolgáló vektor előállítása
Az MNN9-es élesztőgén megszakítására szolgáló vektor létrehozása érdekében először az MNN9-es szensz lancindito: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' antiszensz láncindító: 5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' .
Az MNN9-gén kezdő metioninkodonját vastag betű- összetevőket tartalmazza: 2 g L-arginin, 1 g L-hisztidin, vei szedtük. A polimeráz-láncreakció során templátként 20 a 5. cerevisiae JRY188-törzs (Rine és munkatársai) genomi DNS-ét használtuk, s a reakciót Taq-DNS-polimerázzal (Perkin-Elmer) és 25 amplifikációs ciklussal (ciklusonként 94 °C-on 1 percig, 37 °C-on 2 percig és 72 °C-on 3 percig) végeztük. Az így kapott 1,2 kb-os 25 PCR-fragmenst Hindlll-mal emésztettük, gélelektroforézissel tisztítottuk, majd - Hindlll-mal emésztett, alkalikus-foszfatázzal kezelt - pUC13-vektorral (Pharmacia) ligáltuk. A kapott plazmidot p1183-nak neveztük el.
Az MNN9-gén élesztőeredetű URA3-génnel történő 30 megszakítása érdekében - a S. cerevisiae URA3-génjét kódoló 1,1 kb-os Hindlll-fragmenst a pBR322-plazmid HindiIl-helyén tartalmazó - pBR322-URA3-plazmidot Hindlll-mal emésztettük, és a kapott - működő URA3-gént tartalmazó - 1,1 kb-os fragmenst gélelekt- 35 roforézissel tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, majd Pmll-gyel emésztett p1183-as plazmiddal ligáltuk (a Pmll az MNN9-kódolószekvenciában hasít). Az így kapott p1199-plazmidban a működő URA3-gén megszakítja az MNN9-es gént. 40
9. példa
A MNN9-es gént megszakítva tartalmazó, U9-eredetű 1372-es törzs létrehozása
Az U9-es (325-ös) törzs MNN9-génjének megsza- 45 kítása érdekében - lineáris mnn::URA3 diszrupciós kazetta létrehozása céljából - 30 mg p1199-plazmidot Hindlll-mal emésztettünk. A 325-ös törzs sejtjeit Hindlll-mal emésztett p1199-DNS alkalmazásával, az úgynevezett szferoplaszt-eljárással transzformáltuk [Hin- 50 nen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,
1929 (1978)]. A transzformált sejteket uracilmentes és 1,0 M szorbitolt tartalmazó szintetikus agartáptalajon szelektáltuk. A szintetikus táptalaj 1 liter desztillált vízben 20 g agart, 6,7 g aminosavmentes élesztő nitro- 55 génalapot („Yeast nitrogén base”), 0,04 g adenint,
0,05 g L-tirozint, 182 g szorbitolt, 20 g glükózt, valamint 10 ml 2-es számú leucinmentes oldatot („Leucine Minus Solution #2”) tartalmazott. A 2-es számú leucinmentes oldat 1 liter desztillált vízben a következő 60 gén S. cerevisiae genomi DNS-ből történő klónozására volt szükség. Ezt standard polimeráz-láncreakció alkalmazásával valósítottuk meg. A teljes hosszúságú MNN9-kódolószekvencia polimerázláncreakciójához - az MNN9-es élesztőgén korábban publikált szekvenciája alapján (Zymogenetics: 881177834.7 számú európai szabadalmi bejelentés, közzétételi irat száma: 0-314-096-2) - 5’-oldali szensz és 3’-oldali antiszensz láncindítókat állítottunk elő. A polimeráz-láncreakció során a következő - szegélyező Hindlll-helyeket (ld. aláhúzott bázisok) tartalmazó - láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:
g L-leucin, 6 g L-izoleucin, 4 g L-lizin, 1 g L-metionin, 6 g L-fenil-alanin, 6 g L-treonin és 4 g L-triptofán.
A táptalajokat 30 °C-on, 5 napig inkubáltuk, s az inkubálás után számos telep jelent meg. 10 telepből kromoszomális DNS-preparátumot készítettünk, melyet EcoRI-gyel és Hindlll-mal emésztettünk. A DNSemésztményeket „Southern-blot-eljárással [J. Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] vizsgáltuk, amelyhez próbaként a p1199-plazmidból izolált, MNN9-gént hordozó, 1,2 kbos Hindlll-fragmenst használtuk. Egy olyan izolátumot (1372-es törzs) azonosítottunk, amely a „Southern”-lenyomatokon a várt DNS-sáveltolódást és az mnn9-mutánsokra jellemző extrém halmozódást mutatta.
10. példa
Az élesztőeredetű HIS3-gén megszakítására szolgáló vektor előállítása
Az URA3-gén által megszakított S. cerevisiae HIS3gént tartalmazó diszrupciós kazetta létrehozása céljából az YEp6-plazmidot (K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 1035 (1979)) BamHI-gyel emésztettük. A HIS3-gént hordozó 1,7 kb-os BamHIfragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, majd - előzetesen BamHI-gyel emésztett és T4-DNS-polimerázzal kezelt pUC18-plazmidhoz ligáltuk. Az így keletkezett (p1501 vagy pUC18-HIS3 elnevezésű) plazmidot Nhelgyel emésztettük (mely enzim a HIS3-kódolószekvenciában hasít), majd a vektorfragmenst géltisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és borjúbél-eredetű alkalikus foszfatázzal kezeltük. A pBR322-URA3-plazmidból az URA3-gént Hindlll-mal végzett emésztéssel izoláltuk, majd az URA3-gént tartalmazó 1,1 kb-os fragmenst géltisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és a pUC18-HIS3plazmid Nhel-fragmensével ligáltuk. Az így kapott (pUC18-his3::URA3 vagy p1505 elnevezésű) plazmid olyan diszrupciós kazettát tartalmaz, amelyben az élesztőeredetű HIS3-gént működő URA3-gén szakítja meg.
HU 223 761 Β1
11. példa
Az élesztőeredetű PRB1-gén HIS3-génnel történő megszakítására alkalmas vektor előállítása A S. cerevisiae PRB1-gént tartalmazó FP8AH-plazmidot Dr. E. Jones (Camegie-Mellon University) bocsátotta rendelkezésünkre [C. M. Moehle és munkatársai, Genetics 115, 255 (1987)]. Ezt a plazmidot Hindlll-mal és Xhol-gyel emésztettük, majd az így kapott - PRB1gént hordozó - 3,2 kb-os DNS-fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk és T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk. A pUC18-plazmidot BamHI-gyel emésztettük, géltisztítottuk és T4-DNS-polimerázzal végzett kezeléssel tompa végűvé alakítottuk. A keletkezett vektorfragmenst a fentebb leírt PRB1-génfragmenssel ligáivá a pUC18-PRB1-plazmidot kaptuk. Ezek után a HIS3-gént tartalmazó YEp6-plazmidot BamHI-gyel emésztettük, s az így kapott - működő HIS3-gént tartalmazó - 1,7 kb-os BamHI-fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, majd T4-DNS-polimerázzal végzett kezeléssel tompa végűvé alakítottuk. A pUC18-PRB1 plazmidot EcoRV-tel és Ncol-gyel hasítottuk. Ezek az endonukleázok a PRB1-kódolószekvenciában hasítanak, és eltávolítják a proteáz-B aktív helyet és a szegélyezőszekvenciát. A pUC18-plazmidban a PRB1-kódolószekvencia maradék 5’- és 3’-szakaszait tartalmazó - 5,7 kb-os EcoRV-Ncol-fragmenst géltisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal végzett kezeléssel tompa végűvé alakítottuk, majd borjúbél-eredetű alkalikus foszfatázzal defoszforiláltuk, és a fentebb leírt tompa végű HIS3-fragmenssel ligáltuk. Az így létrehozott (1245-ös) pUC18prb1 ::HIS3-plazmid - a korábban deletált PRB1-génszakasz helyén - a működő HIS3-gént hordozza.
72. példa
Az MNN9- és PRB1-géneket egyaránt megszakítva tartalmazó U9-eredetű élesztőtörzs létrehozása Az MNN9-es gént megszakítva tartalmazó, U9-eredetű 1372-es törzset a 9. példában mutattuk be. Az 1372-es törzs izolátumait ura3-mutánsok kinyerése céljából a 7. példában leírt módon FOA-lemezeken passzáltuk, aminek eredményeként több ura3-izolátumot kaptunk, melyek közül a HIS3-gén későbbi megszakítása céljából a 12 930-190-S1-1-es törzset választottuk ki. A pUC18-his3::URA3-vektort (p1505) Xbal-gyel és EcoRI-gyel emésztetve lineáris his3::URA3 diszrupciós kazettát hoztunk létre, amelyet a 12 930-190-S1-1-es törzs lítium-acetátos eljárással történő transzformálására alkalmaztunk [Methods in Enzymology, 794, 290 (1991)]. Uracilmentes, szintetikus agartáptalajon Ura+-transzformánsokat szelektáltunk, ugyanilyen táptalajra történt ismételt szélesztésükkel klonális izolátumokat nyertünk, majd ezeket egyszerre Ura* és His- fenotípusú törzsek szelektálása céljából - replikatechnikával uracil-, illetve hisztidinmentes táptalajokra másoltuk. A PRB1-gén későbbi megszakítása céljából egy izolátumot (12 930-230-1es törzs) választottunk ki. A PRB1-gén megszakítására alkalmas vektort (pUC18-prb1::HIS3, 1245-ös törzs) Sacl-gyel és Xbal-gyel emésztettük, miáltal lineáris prb1::HIS3 diszrupciós kazettát kaptunk; melyet lítium-acetátos eljárással a 12 930-230-1-es törzs transzformálására alkalmaztunk. Hisztidinmentes szintetikus agartáptalajon His+-transzformánsokat szelektáltunk, majd a kiválasztott transzformánsokat ugyanilyen táptalajra szélesztve klonális izolátumokat kaptunk. Több His+-izolátumból genomi DNS-t vontunk ki, melyet EcoRI-gyel emésztettünk, majd 0,8%-os agarózgélen elektroforizáltunk. Ezt követően a PRB1-gén
- polimeráz-láncreakcióval előállított, radionukliddal jelölt - 617 bp-os próbájának alkalmazásával „Southern-blot”-analíziseket végeztünk. Az említett próba polimeráz-láncreakciójához a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:
5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3'
5' CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' Tizenegy olyan izolátumot kaptunk, amelyek a várt módon hibridizálódtak a 2,44 kb-os prb1::HIS3-DNS-fragmenssel. Ez eltért a vad típusú PRB1-génből származó 1,59 kb-os fragmenssel történő hibridizációtól. A kívánt prb1::HIS3-megszakítást tartalmazó izolátumok közül további felhasználásra egyet (1558-as törzs) választottunk ki.
73. példa
A HPV18-L1 és HPV18-L2 expresszáltatása élesztőben
A S. cerevisiae 1558-as törzset [MATa, Ieu2-O4, prb1::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°] a p191-6-plazmiddal (pGAL1-10 + HPV18-L1) és a p195-11-plazmiddal (pGAL1-10 + HPV18-L1+L2) transzformáltuk. Az izolált kiónokat 30 °C-on 88 óra hosszat - 2% galaktózt tartalmazó - YEHD-tápközegben szaporítottuk. A sejtek betakarítása után a sejtüledéket üveggyöngyökkel feltártuk, és a sejtlizátumokban „immunblot”-analízissel vizsgáltuk a HPV18L1- és/vagy HPV18-L2-protein expresszióját. Az össz-cellulárisprotein 25 pg-ját tartalmazó mintákat 10%-os Tris-glicin-géleken (Novex, Inc.) denaturáló körülmények között elektroforizáltuk, majd elektromos biotolással nitrocellulóz szűrőlapokra másoltuk. Az L1-proteint - elsődleges antitestként trpE/HPV11-L1 fúziós protein elleni nyúlantiszérum [Brown és munkatársai: Virology 207, 46 (1994)], második antitestként pedig torma-peroxidázhoz kötött szamár-antinyúl IgG (Amersham, Inc.) alkalmazásával immunológiai módszerrel detektáltuk. A filterek előhívását a kemilumineszcens ECL™ detektáló reagenskészlet (Amersham, Inc.) alkalmazásával végeztük. Az L1-et, illetve az L1-et és L2-t együttesen expresszáló élesztőklón (1725-ös, illetve 1727-es klón) esetében egyaránt 50-55 kD-os L1-proteinsávot mutattunk ki. A negatív kontroll (L1- és L2-gén nélküli pGAL1-10) esetében ilyen sávot nem detektáltunk (Id. 4. ábra).
A HPV18-L2-proteint - elsődleges antitestként trpE/HPV18-L2 fúziós protein elleni poliklonális kecskeantiszérum, második antitestként pedig tormaperoxidázzal konjugált nyúl-antikecske IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) alkalmazásával
- „western-blot”-analízissel detektáltuk. A filtereket a fentebb leírt módon hívtuk elő. Az L2-proteint az L1-et és L2-t együttesen expresszáló élesztőkiónban (172711
HU 223 761 Β1 es törzs) 75 kD-os sávként detektáltuk; a negatív kontroliban és az L1-et expresszáló kiónban ilyen proteinsávot nem találtunk (ld. 5. ábra).
14. példa
HPV18-L1 (1725-ös törzs) és HPV18-L1+AL2 (1727-es törzs) fermentációja
Az 1725-ös és 1727-es törzs tenyészetének felületi szaporulatát sterilen leucinmentes folyékony tápközegbe juttattuk, amely literenként 8,5 g - aminosavak és ammónium-szulfát nélküli - „Difco” élesztő nitrogénalapot, 0,2 g adenint, 0,2 g uracilt, 10 g borostyánkősavat, 5 g ammónium-szulfátot, 40 g glükózt, 0,25 g L-lizint, 0,1 g L-arginint, 0,3 g L-izoleucint, 0,05 g L-metionint, 0,2 g L-triptofánt, 0,05 L-hisztidint, 0,2 g L-lizint és 0,3 g L-fenil-alanint tartalmazott. A tápközeg pH-ját sterilizálása előtt nátrium-hidroxiddal pH=5,0-5,3-re állítottuk be. A tenyészetet rázógépen 250 fordulat/perc fordulatszámmal, 28 °C-on inkubáltuk, majd a tenyészethez 17 vegyes% végkoncentrációban steril glicerint adtunk, majd fagyasztótégelyekben -70 °C-ra fagyasztottuk (fagyasztótégelyenként 1 ml össztérfogatban). Az inokulumot az említett tápközegben (500 ml/2 literes lombik) készítettük el, s egy kiolvasztott fagyasztótégely tartalmát kétliteres palackokba töltöttük, majd azokat 28 °C-on, 250 fordulat/perc fordulatszámmal működő rázógépen 29 óra hosszat inkubáltuk. A két törzs fermentációjához „New Brunswick SF-116” típusú fermentort használtunk, amelynek üzemi térfogata a beoltást követően 10 liter volt. A fermentációs tápközeg literenként 20 g „Difco” élesztőkivonatot, 10 g „Sheffield HySoy” peptont, 20 g glükózt, 20 g galaktózt, és 0,3 ml „Union Carbide UCON LB-625” habzáscsökkentőt tartalmazott. A tápközeg pH-ját sterilizálás előtt 5,3-re állítottuk be. A 2 literes oltólombik teljes tartalmát (500 ml) a fermentorba öntöttük, amelyet 28 °C-on, 5 liter/perc levegőbeáramoltatással, percenként 400-as fordulatszámmal és 242,6 kPa (3,5 psi) nyomáson üzemeltettünk. A 40% fölötti oxigéntelítettség fenntartása érdekében szükség szerint fokoztuk a keverést. A fermentáció folyamatát „offline” glükózkoncentráció-mérésekkel („Beckman Glucose 2 Analyzer”) és „online” tömegspektometriás mérésekkel („Perkin-Elmer 1200”) kísértük nyomon. 66 órás inkubációt követően literenként 9,5-9,7 g száraz sejttömeg sejtkoncentrációt értünk el. A tenyészetet üreges szálakból készített szűrőn („hollow fiber”; „Amicon DC-10” szűrőrendszerben Amicon H5MP01-43” töltettel) kb. 2 liter térfogatúra sűrítettük, 2 liter foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) diafiltráltuk, majd tovább töményítettük (kb. 1 literre), s végül 500 ml-es centrifugálóedényekbe töltöttük. A „Sorval GS3” centrifugával 4 °C-on, 8000-es percenkénti fordulat számmal 20 percig végzett centrifugálás után a felülúszót leöntöttük, és a sejtüledéket (összesen 225 g nedves sejt) további felhasználásig -70 °C-on tároltuk.
15. példa
Rekombináns HPV18-L1 kapszidproteinek tisztítása
A sejteket -70 °C-on tároltuk. A fagyasztott sejteket (126 g nedves tömeg) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 70 ml feltárópufferben („Breaking Buffer; 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mM nátrium-klorid) újraszuszpendáltuk. Az oldathoz 2 mM, illetve 1,7 μΜ végkoncentrációban PMSF, illetve pepsztatin-A proteázinhibitort adtunk. A sejtszuszpenziót „M110Y” típusú mikrofluidizátorban (Microfluidics Corp., Newton, MA) négyszer átbocsátva kb. 1,1*10® kPa (16 000 psi) nyomáson tártuk fel. A feltárt sejtszuszpenziót a sejttörmelék eltávolítása érdekében 10 percig 12 000*gvel centrifugáltuk, majd az L1-antigént tartalmazó felülúszót összegyűjtöttük.
A felülúszó folyadékot 1:5 arányban ,A”-pufferrel (20 mM MOPS, pH=7,0) hígítottuk, és „Α’’-pufferrel ekvilibrált „Fractogel® EMD TMAE-650 (Μ) (EM Separations, Gibbstown, NJ) gyantát tartalmazó anioncserélő oszlopra (9,0 cm belső átmérő*3,9 cm) töltöttük. ,Α’’pufferrel végzett mosást követően az antigént „A”-pufferben 0->1,0 M NaCI-gradienssel eluáltuk. Az oszlopon átfolyt frakciók összprotein-tartalmát a „Bradford”eljárással határoztuk meg. A frakciókat ezután azonos összprotein-tartalom mellett „western-blot”-analízissel és - ezüstfestéses detektálás alkalmazásával végzett - SDS-PAGE-analízissel vizsgáltuk.
A hasonló tisztaságú és L1-tartalmú TMAE-frakciókat összevontuk, s antigéntartalmukat ammónium-szulfátos frakcionálással töményítettük. Az oldat ammónium-szulfát-koncentrációját - szilárd ammónium-szulfát 10 percen keresztül, óvatos keverés mellett történő hozzáadásával - 35%-os telítettségnek megfelelő koncentrációra állítottuk be. Ezek után a mintát 30 percre jég közé helyeztük, és a kicsapódást 4 óra hosszat hagytuk lejátszódni. A mintát 16 000*g-vel 45 percig centrifugáltuk, és az üledéket 20 ml foszfátpufferelt sóoldatban (6,25 mM nátrium-foszfát; pH=7,2; 150 mM nátrium-klorid) újraszuszpendáltuk.
A újraszuszpendált üledéket „Sephacryl 500 HR” gyantát (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó méretkizárásos oszlopon (2,6 cm belső átmérő*89 cm) bocsátottuk át. A kromatografálást foszfátpufferelt sóoldattal, 20-23 °C-on végeztük. A frakciókat „westernblot”-analízissel és ezüstfestés alkalmazásával végzett SDS-PAGE-analízissel vizsgáltuk. A legnagyobb tisztaságú frakciókat összevontuk, majd az így kapott mintát - 43 mm-es YM-100 membránlap (Amicon, Beverly, MA) alkalmazásával, 2,75-4,13*103 Pa (4-6 psi) nitrogénnyomáson - 50 ml térfogatú keverőcellában betöményítettük.
A végterméket „western-blot”-analízissel és kolloidális „Coomassie”-festék alkalmazásával végzett SDS-PAGE-analízissel vizsgáltuk. Az L1-protein becslésünk szerint 50-60%-ban homogén volt. Az L1-proteint „western-blot”-eljárással azonosítottuk. A végterméket egyenlő adagokra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. Ezzel az eljárással összesen 12,5 mg proteint kaptunk.
Összproteintartalom meghatározása „Bradford-eljárással
Az összprotein-tartalmat kereskedelmi forgalomban beszerezhető „Coomassie Plus®” reagenskészlet (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával határoztuk meg.
HU 223 761 Β1
A minták kívánt arányú hígítására „Milli-Q”-vizet használtunk. A hagyományos léptékű vizsgálat, illetve a mikromeghatározás céljaira 0,1 ml, illetve 1,0 ml térfogatra volt szükség. A standard görbét mindkét eljárásban szarvasmarha-szérumalbumin („BSA”, Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával készítettük. A vizsgálati eljárást a gyártó előírásainak megfelelően végeztük. A standard görbéket Macintosh llci számítógépen „CricketGraph®” szoftver alkalmazásával ábrázoltuk.
SDS-PAGE-analizis és „westem-blot-eljárás
Az eljárásokban alkalmazott géleket, puffereket és az elektroforetikus készüléket a Novextől (San Diego, CA) szereztük be, és azokat a gyártó előírásainak megfelelően használtuk. Röviden összefoglalva; a mintákat „Milli-Q”-vízzel úgy hígítottuk, hogy proteinkoncentrációjuk azonos legyen, majd az így kapott mintákat 1:1 arányban - 200 mM DTT-t tartalmazó inkubálópufferrel elegyítettük. A mintákat 100 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd előre elkészített 12%-os Tris-glicin-gélekre vittük fel, és 125 V feszültséggel 1 óra 45 percig elektroforizáltuk. A géleket vagy Heukeshoven és Dernick ezüstfestéses eljárásának [Elektrophoresis, 6, 103, (1985)] egy változatával, vagy - kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenskészlet (Integrated Separation Systems, Natick, MA) alkalmazásával - kolloidális „Coomassie”-festéssel tettük láthatóvá.
A „western-blot”-eljárásban a proteineket 25 V feszültséggel 40 percig PVDF-membránokra másoltuk, majd a membránokat „Milli-Q”-vízzel mostuk és levegőn szárítottuk. Primer antitestként TrpE/HPV11-L1 fúziós protein ellen termelt poliklonális nyúlantiszérumot (melyet Dr. D. Brown adományaként kaptunk) alkalmaztunk. Az antitestoldatot az antiszérum „blotolópufferben” (6,25 mM nátrium-foszfát, pHt=t7,2, 150 mM nátrium-klorid és 0,02% NaN3 - 5% sovány tejet tartalmazó - elegye) végzett hígításával állítottuk elő. A mintákat 20-23 °C-on legalább 1 óra hosszat inkubáltuk. Ezt követően a lenyomatot („biot”) háromszor egy percig foszfátpufferelt sóoldattal (6,25 mM nátrium-foszfát, pH 7,2,150 mM nátrium-klorid) mostuk. A másodlagos antitestek oldatát a megfelelő (alkalikus foszfatázzal konjugált) antiszérum blotolópufferben végzett hígításával kaptuk. Az inkubálást az előbbivel azonos feltételekkel legalább egy óra hosszat végeztük. A lenyomatokat a fentebb leírt módon mostuk, majd „NBT/BCIP”szubsztrát (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával egy lépésben előhívtuk.
16. példa
Elektronmikroszkópos vizsgálatok
Elektronmikroszkópos (EM) vizsgálat (Structure Probe, West Chester, PA) céljára az egyes minták azonos mennyiségeit 200-as rácssűrűségű szénbevonatú rézgridekre helyeztük, majd a gridekre 20 másodpercre egy csepp 2%-os foszfor-volfrámsavat (pH=7) tettünk. A grideket a transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) vizsgálat előtt levegőn szárítottuk. A vizsgálatokat „JEOL 100CX” transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL USA Inc ), 100 kV gyorsítófeszültséggel végeztük. Az elkészített felvételek végső nagyítása 100 000-szeres volt. A HPV18-L1 expressziós plazmidot hordozó élesztőmintában 50-55 nm mérettartományba eső vírusszerű részecskék jelenlétét mutattuk ki (Id. 6. ábra). A kontroll-élesztőmintákban vírusszerű részecskéket nem találtunk.
11. példa
A HPV18-cDNS szubklónozása expressziós vektorokba
A HPV18-protein transzfektált gazdasejtekben történő expresszáItatása és in vitro transzkripció/transzláció megvalósítása céljából a HPV18-at kódoló cDNS-t több vektorba szubklónoztuk. Ezek a vektorok a következők: pBluescript-ll-SK+ (amelyben az expressziót T7- vagy T3-promoter vezérli); pcDNAI/Amp (amelyben az expressziót a citomegalovírus-promoter vezérli); pSZ9016-1 [amelyben az expressziót a HÍV hosszú terminális ismétlődés (LTR) promotere vezérli]; és a pAcUW51 baculovírus átvivővektor (PharMingen, Inc.), amelyben az expressziót a polihedrinpromoter vezérli. Ez utóbbi vektor HPV18-proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns baculovírus előállítására alkalmazható.
a) pBluescript-ll-SK+:HPV18
A teljes hosszúságú HPV18-cDNS-klónt korlátozott EcoRI-emésztéssel λ-bakteriofágból kivágtuk, majd EcoRI-gyel hasított, CIP-vel kezelt pBluescript-ll-SK+ vektorba ligáltuk. Önálló szubklónokat kaptunk, amelyek a HPV18-DNS-t a T7- vagy T3-promoter után szenszorientációban tartalmazzák.
b) pcDNAI/Amp:HPV18
Az irányított klónozás elősegítése céljából - a HPV18-DNS-szekvenciát a T7-promotertől 3’-irányban tartalmazó - tisztított pBluescript-ll-SK+:HPV18 konstrukcióból, EcoRV és Xbal alkalmazásával kivágtuk a HPV18-DNS-L A kapott EcoRV-Xbal-HPV18-fragmenst megtisztítottuk és - EcoRI-gyel és Xbal-gyel hasított, CIP-vel kezelt - pcDNAI/Amp vektorba ligáltuk, oly módon, hogy a HPV18-DNS a citomegalovírus-promotertől 3’-irányban helyezkedjen el.
c) pSZ9016-1:HPV18
A HPV18-DNS-t korlátozott EcoRI-emésztéssel a pBluescript-ll-SK+:HPV18 konstrukcióból vágtuk ki, s a kapott, 1,3 kb-os fragmenst agarózgélen végzett elektroforézissel tisztítottuk. Az EcoRI-HPV18-fragmenst EcoRI-gyel hasított, CIP-vel kezelt pZS9016-1-vektorba ligáltuk. Olyan szubklónokat szelektáltunk, amelyek a HPV18-DNS-t a HIV-LTR-promotertől 3’-irányban, szenszorientációban tartalmazták.
d) pAcUW51:HPV18-L1
A HPV18-L1 teljes hosszúságú nyitott leolvasási fázisát a 187-1-es klónból - szegélyező Bglll-helyek beépülését eredményező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett - polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk. Az L1-gént a pAcUW51 baculovírus átvivővektor (PharMingen, Inc.) BamHI-helyére, a polihedrinpromoter szabályozása alá inszertáltuk. A Pharmingen útmutatójában leírt eljárások alkalmazásával HPV18L1 expressziós kazettát tartalmazó rekombináns bacu13
HU 223 761 Β1 lovírusokat állítottuk elő. A rekombináns kiónokat korlátozó hígítással és „dot-blot”-hibridizációval tisztítottuk.
18. példa
A HPV18-polipeptid expresszáltatása in vitro transzkripcióval és transzlációval, valamint gazdasejtekbe történő transzfekcióval
A HPV-DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokat
- nyúl-retikulocitalizátumokban, emlősgazdasejtekben, valamint baculovírussal fertőzött rovarsejtekben
- a HPV18-polipeptid transzlációjának vezérlésére alkalmaztuk. Az alkalmazott kísérleti feltételek lényegében azonosak voltak a gyártó által előírtakkal.
a) In vitro transzkripció/transzláció
A HPV18-DNS-t a T7-promoter orientációjában tartalmazó pBluescript-ll-SK+:HPV18 plazmid-DNS-t a HPV18-inszerttől 3’-irányban BamHI-gyel végrehajtott emésztéssel linearizáltuk. A linearizált plazmidot megtisztítottuk, és az m7G(5’)ppp(5')G jelenlétében, T7-RNS-polimeráz alkalmazásával végzett transzkripció templátjaként alkalmaztuk. A sapka („cap”)-régióval ellátott HPV18-transzkriptumokat LiCI-os precipitációval tisztítottuk, és nukleázzal előkezelt nyúlretikulocitalizátumban - L-[35S]metionin jelenlétében
- a HPV18 transzlációjának vezérlésére alkalmaztuk.
b) Expresszió emlőssejtekben
A HPV18-proteint pcDNAI/Amp::HPV18 konstrukcióval (CMV-promoter) vagy pSZ9016-1:HPV18 konstrukcióval (HIV-LTR-promoter) végzett transzfekciót követően emlősgazdasejtekben expresszáltattuk. Az utóbbi esetben a sejteket a - TAT-t expresszáló pSZ90161:TAT-plazmiddal kotranszfektáltuk. Mindkét HPV18 expressziós plazmid esetében COS-7-sejteket DEAE-dextránnal vagy „Lipofectamine” (BRL) alkalmazásával végzett lipofekcióval transzfektáltunk.
c) Expresszió rovarsejtekben
A HPV18-L1-DNS-Í tartalmazó pAcUW51:HPV18 baculovírus átvivővektort - in vivő homológ rekombinációval - rekombináns baculovírus (Autographa californica) előállítására alkalmaztuk. Ezután az epitóppal ellátott HPV18-L1-proteint - HPV18-DNS-t tartalmazó rekombináns baculovírussal fertőzött és szuszpenziótenyészetben szaporított - Sf9 (Spodoptera frugiperda) rovarsejtekben expresszáltattuk.
19. példa
A HPV18-aktivitást befolyásoló vegyületek számos eljárással kimutathatók. Az egyik ilyen eljárás a következő lépésekből áll:
(i) a tesztelt vegyületet HPV18-proteint tartalmazó oldattal elegyítjük;
(ii) az elegyben megmérjük a HPV18-aktivitást; és (iii) az elegyben mért HPV18-aktivitást vonatkoztatási standarddal hasonlítjuk össze.
A HPV18-aktivitást befolyásoló vegyületek gyógyászati készítményekbe foglalható, s az ilyen készítmények HPV18-fertőzéssel összefüggő betegségek és állapotok kezelésére alkalmazhatók.
20. példa
A HPV18-at kódoló DNS-sel szerkezetileg rokon DNS-ek próba alkalmazásával detektálhatok. Az ilyen célra előnyösen alkalmazható próbák származhatnak az 1., illetve 3. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia egészét vagy egy részét tartalmazó DNS-ből; az 1., illetve 3. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia egészét vagy egy részét tartalmazó DNS által kódolt RNS-ből; valamint az 1., illetve 3. ábrán bemutatott szekvencia egy részéből származó degenerált oligonukleotidokból.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Vírusszerű részecskék, amelyek a 18-as típusú humán papillomavírus rekombináns L1-proteinjét vagy rekombináns L1- + L2-proteinjeit tartalmazzák, és amelyek tisztasága legalább 60%-os, és amely L1-pro- 45 tein szekvenciája az 1., az L2-proteiné pedig a 3. ábrán látható.
  2. 2. A 1. igénypont szerinti vírusszerű részecskék, amelyek élesztőgombában előállított rekombináns L1proteint vagy rekombináns L1- + L2-proteineket tártál- 50 maznak.
  3. 3. Eljárás 1. igénypont szerinti vírusszerű részecskék előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) élesztőgombát papillomavírus-L1-proteint vagy papillomavírus-L1- és -L2-proteint kódoló rekombináns 55 DNS-molekulával transzformálunk;
    (ii) a transzformált élesztőgombát a rekombináns
    DNS-molekula - rekombináns papillomavírus-protein termelődését eredményező - expresszióját elősegítő körülmények között tenyésztjük; és 60 (iii) a rekombináns papillomavírus-proteint izolálva 1. igénypont szerinti vírusszerű részecskéket állítunk elő.
  4. 4. Rekombináns papillomavírus-protein, amely 3. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.
  5. 5. Vakcina, amely 1. igénypont szerinti vírusszerű részecskéket tartalmaz.
  6. 6. Gyógyászati készítmény, amely 1. igénypont szerinti vírusszerű részecskéket és gyógyászatilag elfogadható excipienst tartalmaz.
  7. 7. Az 1. ábrán bemutatott szekvenciájú, izolált és tisztított HPV18-L1-DNS-molekula vagy a 3. ábrán bemutatott szekvenciájú, izolált és tisztított HPV18-L2DNS-molekula.
  8. 8. Expressziós vektor, amely 7. igénypont szerinti DNS-molekula gazdasejtben történő expresszáltatására alkalmas.
  9. 9. Lényegében tisztított protein, amelyet 7. igénypont szerinti DNS-molekula kódol.
    HU 223 761 Β1
  10. 10. Eljárás 18-as típusú humán papillomavírus proteinjének gazdasejtben történő expresszáltatására, azzal jellemezve, hogy (i) 8. igénypont szerinti expressziós vektort megfelelő gazdasejtbe juttatunk; 5 (ii) az (i) lépés szerinti gazdasejtet a 18-as típusú humán papillomavírus proteinjének expresszálódására alkalmas körülmények között tenyésztjük.
  11. 11. Gyógyászati készítmény, amely 7. igénypont szerinti DNS-molekulát; 7. igénypont szerinti DNS-molekula által kódolt peptidet; 7. igénypont szerinti DNSmolekulával komplementer RNS-t vagy ezek bármely kombinációját és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
HU9801334A 1995-03-22 1996-03-18 A 18-as típusú humán papillomavírust kódoló DNS HU223761B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/408,669 US5840306A (en) 1995-03-22 1995-03-22 DNA encoding human papillomavirus type 18
US08/409,122 US5820870A (en) 1995-03-22 1995-03-22 Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine
PCT/US1996/003649 WO1996029413A2 (en) 1995-03-22 1996-03-18 Dna encoding human papilloma virus type 18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9801334A2 HUP9801334A2 (hu) 1998-08-28
HUP9801334A3 HUP9801334A3 (en) 1999-04-28
HU223761B1 true HU223761B1 (hu) 2005-01-28

Family

ID=27020342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9801334A HU223761B1 (hu) 1995-03-22 1996-03-18 A 18-as típusú humán papillomavírust kódoló DNS

Country Status (22)

Country Link
EP (2) EP0817851B9 (hu)
JP (1) JPH11502704A (hu)
KR (1) KR100430698B1 (hu)
CN (1) CN1100876C (hu)
AT (1) ATE259879T1 (hu)
AU (1) AU714533B2 (hu)
CA (1) CA2215834C (hu)
CZ (1) CZ291242B6 (hu)
DE (4) DE69631586T9 (hu)
DK (1) DK0817851T5 (hu)
EA (1) EA001092B1 (hu)
ES (1) ES2213772T3 (hu)
FR (1) FR07C0023I2 (hu)
HU (1) HU223761B1 (hu)
IL (1) IL117459A (hu)
NL (3) NL300273I1 (hu)
NO (1) NO322254B1 (hu)
NZ (1) NZ305188A (hu)
PL (1) PL184022B1 (hu)
PT (1) PT817851E (hu)
SK (1) SK284281B6 (hu)
WO (1) WO1996029413A2 (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ZA982950B (en) 1997-04-08 1998-10-19 Merck & Co Inc Stabilized human papillomavirus formulations
ES2216280T3 (es) * 1997-04-08 2004-10-16 MERCK & CO., INC. Formulaciones estabilizadas de papilomavirus humano.
SI1105466T1 (sl) * 1998-08-14 2006-08-31 Merck & Co Inc Postopek za ciscenje virusu podobnih delcev humanega papilomskega virusa
AUPP765398A0 (en) * 1998-12-11 1999-01-14 University Of Queensland, The Treatment of papillomavirus infections
SI1150712T1 (sl) 1999-02-05 2009-02-28 Merck & Co Inc Pripravek cepiva proti humanem papiloma virusu
FR2795074A1 (fr) * 1999-05-21 2000-12-22 Inst Nat Sante Rech Med Polypeptides transporteurs d'acides amines, et en particulier du glutamate, et procedes de criblage de composes inhibiteurs ou activateurs de l'activite de transport
MY140664A (en) * 2003-09-29 2010-01-15 Merck Sharp & Dohme Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
WO2008134935A1 (fr) * 2007-04-29 2008-11-13 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Protéines 18 l1 de type papillomavirus humain tronqué
BRPI0811016B1 (pt) 2007-04-29 2021-09-21 Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 16
CN101440373B (zh) * 2007-11-23 2012-09-05 上海泽润生物科技有限公司 一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因
CA2768172A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel compositions
CN103717741B (zh) * 2011-06-15 2016-04-13 中央大学校产学协力团 用于提高人乳头瘤病毒l1蛋白产量的方法
US20150110824A1 (en) 2012-03-18 2015-04-23 Glaxosmithkline Biologicals, Sa Method of vaccination against human papillomavirus
CN108276491B (zh) * 2018-02-05 2021-01-12 南京薇熙生物医药科技有限公司 一种可特异性识别hpv18 l1蛋白的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3625257A1 (de) * 1986-07-23 1988-02-04 Behringwerke Ag Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika
DE4015044A1 (de) * 1990-05-10 1991-11-14 Behringwerke Ag Seroreaktive epitope auf proteinen des menschlichen papillomavirus (hpv) 18
US7476389B1 (en) * 1991-07-19 2009-01-13 The University Of Queensland Papillomavirus vaccines
DE122007000095I1 (de) * 1992-06-25 2008-03-27 Papillomavirus vakzine
US5437951A (en) * 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
DE122007000014I1 (de) * 1993-03-09 2007-05-24 Univ Rochester Herstellung von menschlichem Papillomavirus Hüllprotein und virus-ähnlichen Teilchen

Also Published As

Publication number Publication date
FR07C0023I1 (hu) 2007-04-27
EP0817851B1 (en) 2004-02-18
DE122007000031I1 (de) 2007-07-19
WO1996029413A2 (en) 1996-09-26
DK0817851T3 (da) 2004-08-16
HUP9801334A2 (hu) 1998-08-28
NL300273I1 (nl) 2007-05-01
EP0817851A2 (en) 1998-01-14
SK284281B6 (sk) 2004-12-01
EP1422294A1 (en) 2004-05-26
CN1185176A (zh) 1998-06-17
AU5314196A (en) 1996-10-08
NO322254B1 (no) 2006-09-04
MX9707208A (es) 1997-11-29
DE69631586T2 (de) 2005-01-27
DE69631586D1 (de) 2004-03-25
PL322333A1 (en) 1998-01-19
ATE259879T1 (de) 2004-03-15
DE122007000025I1 (de) 2007-07-12
DE69631586T9 (de) 2005-06-16
CZ291242B6 (cs) 2003-01-15
DE122007000030I1 (de) 2007-07-19
KR100430698B1 (ko) 2004-07-15
NO974322L (no) 1997-11-24
IL117459A0 (en) 1996-07-23
FR07C0023I2 (fr) 2012-08-03
IL117459A (en) 2005-11-20
AU714533B2 (en) 2000-01-06
NL300271I1 (nl) 2007-05-01
HUP9801334A3 (en) 1999-04-28
JPH11502704A (ja) 1999-03-09
CA2215834C (en) 2007-06-12
EA199700256A1 (ru) 1999-06-24
SK127897A3 (en) 1998-07-08
WO1996029413A3 (en) 1996-11-28
CZ293697A3 (cs) 1998-02-18
DK0817851T5 (da) 2004-10-25
EP0817851B9 (en) 2004-08-18
NO974322D0 (no) 1997-09-19
ES2213772T3 (es) 2004-09-01
PT817851E (pt) 2004-06-30
NZ305188A (en) 1999-11-29
PL184022B1 (pl) 2002-08-30
EA001092B1 (ru) 2000-10-30
CN1100876C (zh) 2003-02-05
CA2215834A1 (en) 1996-09-26
NL300272I1 (nl) 2007-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5840306A (en) DNA encoding human papillomavirus type 18
US5820870A (en) Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine
JP3918877B2 (ja) ヒトパピローマウイルス１１型ｌ１タンパク質をコードする合成ｈｐｖ６／１１ハイブリッドｌ１ ｄｎａ
HU223761B1 (hu) A 18-as típusú humán papillomavírust kódoló DNS
RU2161651C2 (ru) Очищенные белки вируса папилломы
MXPA97003570A (en) Proteins of purify papiloma viruses
HUT77337A (hu) Humán papillomavírus 6A-típusát kódoló DNS
US6908615B1 (en) DNA encoding human papilloma virus type 18
CA2204266C (en) Purified papillomavirus proteins
CA2216827C (en) Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein
MXPA97007208A (en) Desoxirribonucleico acid that codifies for human papilloma virus type 18 and use of my

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20041122

GB9A Succession in title

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., US

Free format text: FORMER OWNER(S): MERCK & CO., INC., US

GB9A Succession in title

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., US

Free format text: FORMER OWNER(S): MERCK & CO., INC., US; MERCK SHARP & DOHME CORP., US