PL184022B1 - Izolowany kwas nukleinowy kodujący białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18, wektor obejmujący ten kwas nukleinowy oraz sposób wyrażania białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18 w komórce gospodarza przy użyciu tego wektora - Google Patents

Abstract

1. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, ze koduje sekwencje aminokwasowa pokazana na fig. 1 . PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy kodujący białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18, wektor obejmujący ten kwas nukleinowy oraz sposób wyrażania białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18 w komórce gospodarza przy użyciu tego wektora. Białka i ich pochodne obejmują, choć nie są ograniczone do peptydów i białek kodowanych przez DNA, przeciwciał wobec DNA albo przeciwciał wobec białek kodowanych przez DNA, szczepionek obejmujących DNA albo szczepionek obejmujących białka kodowane przez DNA, kompozycji immunologicznych obejmujących DNA albo białek kodowanych przez Dna, zestawów zawierających DNA albo RNA pochodzące z DNA albo białka kodowane przez DNA.

184 022

Kompozycje przydatne farmaceutycznie, obejmujące DNA albo białka kodowane przez DNA mogą być wytwarzane według znanych metod, takich jak mieszanie z nośnikami dopuszczalnymi farmaceutycznie. Przykłady takich nośników oraz sposobów wytwarzania można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences. W celu wytworzenia kompozycji dopuszczalnej farmaceutycznie, odpowiedniej do skutecznego podawania, kompozycja taka powinna zawierać skuteczną ilość DNA albo białka albo VLP. Kompozycja taka może zawierać DNA albo białka albo VLP pochodzące z więcej niż jednego typu HPV.

Kompozycje terapeutyczne albo diagnostyczne według wynalazku są podawane osobnikowi w ilościach odpowiednich do leczenia albo diagnozowania zakażeń PV. Skuteczna ilość może być różna w zależności od różnych czynników takich jak stan ogólny osobnika, ciężar ciała, płeć i wiek. Inne czynniki obejmują sposób podawania. Ogólnie, kompozycje można podawać w dawkach zawierających się od około 1 pg do około 1 mg.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczone osobnikowi różnymi drogami takimi jak podskórna, miejscowa, doustna, śluzówkowa, dożylna i domięśniowa.

Szczepionki według wynalazku obejmują DNA, RNA albo białka kodowane przez DNA, które zawierają determinanty antygenowe konieczne do wywołania tworzenia się przeciwciał neutralizujących w organizmie gospodarza. Szczepionki takie są również wystarczająco bezpieczne by je podawać bez zagrożenia zakażenia klinicznego; nie wykazują ubocznych efektów toksycznych; mogą być podawane skuteczną drogą; są stabilne i kompatybilne z nośnikami szczepionek.

Szczepionki mogą być podawane różnymi drogami, takimi jak doustna, pozajelitowa, podskórna, śluzówkowa, dożylna albo domięśniowa. Dawkowanie może zmieniać się w zależności od stanu, płci, ciężaru i wieku osobnika; drogi podania i rodzaju PV. Szczepionki mogą być stosowane w postaciach użytkowych takich jak kapsułki, zawiesiny, eliksiry albo roztwory wodne. Szczepionki mogą być łączone z immunologicznie dopuszczalnym nośnikiem.

Szczepionki są podawane w ilościach efektywnych terapeutycznie, tzn. w ilościach odpowiednich do wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej. Efektywna terapeutycznie ilość może być zmienna w zależności od rodzaju PV. Szczepionka może być podawana w dawce pojedynczej albo wielokrotnej.

DNA i pochodne DNA według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane w wytwarzaniu kompozycji immunogennych. Kompozycje takie, po wprowadzeniu do organizmu odpowiedniego gospodarza, są zdolne do wywołania odpowiedzi odpornościowej u gospodarza.

DNA i jego pochodne mogą być zastosowane do wywoływania przeciwciał. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zarówno przeciwciało poliklonalne jak i monoklonalne, jak również ich fragmenty jak Fv, Fab i F(ab)2, które są zdolne do wiązania antygenu bądź haptenu.

DNA i pochodne DNA według wynalazku mogą być zastosowane do serotypowania zakażenia HPV i badań przesiewowych na HPV. DNA, rekombinowane białka, VLP i przeciwciała nadają się same do wytworzenia zestawów odpowiednich do wykrywania i serotypowania HPV. Zestaw taki powinien obejmować podzielone opakowanie odpowiednie do przechowywania w bezpośrednim sąsiedztwie przynajmniej jednego pojemnika. Opakowanie powinno dalej zawierać odczynniki takie jak DNA HPV18, rekombinowane białko HPV albo VLP albo przeciwciała przeciwko HPV odpowiednie do wykrywania różnych typów HPV. Opakowanie może również zawierać środki do wykrywania takie jak znakowane antygeny albo substraty enzymów itp.

DNA i pochodzące z nich białka według wynalazku są również przydatne jako znaczniki ciężaru cząsteczkowego oraz wielkości cząsteczkowej.

Z powodu degeneracji kodu genetycznego, więcej niż jeden kodon może kodować konkretny aminokwas, a więc sekwencja aminokwasowa może być kodowana przez dowolny z zestawów podobnych oligonukleotydów DNA. Tylko jeden spośród zawartych w zestawie będzie identyczny z sekwencją HPV18, ale będzie zdolny do hybrydyzacji z DNA HPV18 w odpowiednich warunkach, nawet w obecności oligonukleotydów DNA z błędnie sparowanymi zasadami. W alternatywnych warunkach, oligonukleotydy DNA z błędnie sparowanymi zasadami mogą wciąż hybrydyzować z DNA HPV18 umożliwiając identyfikację i izolację DNA kodującego HPV18.

184 022

Oczyszczony DNA HPV 18 według wynalazku albo jego fragmenty mogą być zastosowane do izolacji i oczyszczania homologów i fragmentów HPV18 z innych źródeł. W tym celu, pierwszy DNA HPV18 może być zmieszany z próbką zawierającą DNA kodujący homologii HPV18 w odpowiednich warunkach hybrydyzacji. Hybrydyzowany kompleks DNA może być izolowany, zaś z niego może być izolowany DNA kodujący homologiczny DNA.

Wiadomo, że istnieje znaczna redundancja (nadmiarowość) różnych kodonów kodujących konkretne aminokwasy. Stąd, wynalazek dotyczy również tych sekwencji DNA, które zawierają alternatywne kodony, które kodują ewentualną translację identycznych aminokwasów. Dla niniejszego opisu, sekwencje zawierające jeden lub wiele zastąpionych kodonów określa się jako odmiany zdegenerowane. Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również mutacje sekwencji DNA albo translowanego białka, które nie zmieniają istotnie zasadniczych właściwości ekspresjonowanego białka. Przykładowo, zastąpienie leucyny waliną, lizyny argininą albo glutaminy asparaginą może nie spowodować zmiany czynności polipeptydu.

Wiadomo, że sekwencje DNA kodujące peptyd mogą być zmienione w taki sposób, że kodują peptyd wykazujący właściwości różne od peptydu występującego naturalnie. Metody zmieniania sekwencji DNA obejmują, choć nie są ograniczone do ukierunkowanej mutagenezy.

W znaczeniu tu użytym „pochodna funkcjonalna” HPV18 oznacza związek wykazujący właściwość biologiczną (funkcjonalną albo strukturalną), która jest zasadniczo podobna do aktywności biologicznej HPV18. W znaczeniu tu użytym „pochodna funkcjonalna” oznacza w założeniach „fragmenty”, „odmiany”, „zdegenerowane odmiany”, „analogi” i „homologii” albo „chemiczne pochodne” HPV18. Określenie „fragment” oznacza dowolny podtyp polipeptydu HPV18. Określenie „odmiana” oznacza cząsteczkę zasadniczo podobną w budowie i funkcji do całej cząsteczki HPV18 albo do jej fragmentu. Cząsteczka jest „zasadniczo podobna” do HPV18 jeżeli obie cząsteczki mają zasadniczo podobną budowę lub wykazują podobną aktywność biologiczną. Stąd, jeżeli dwie cząsteczki wykazują zasadniczo podobną aktywność, uważane są za odmiany nawet gdy budowa jednej z cząsteczek nie jest spotykana w drugiej albo nawet gdy sekwencje aminokwasowe nie są identyczne.

Określenie „analog” dotyczy cząsteczki zasadniczo podobnej w funkcji do całej cząsteczki HPV18 albo do jej fragmentu.

W celu klonowania molekularnego DNA HPV18 mogą być zastosowane różne procedury. Metody te obejmują choć nie są ograniczone do kierowania funkcjonalnego ekspresji genów HPV18 po skonstruowaniu odpowiedniego układu ekspresyjnego cDNA zawierającego HPV18 albo genomowej biblioteki. Innym sposobem jest przesiewanie biblioteki cDNA albo genomowego DNA zawierającej HPV18 skonstruowanej w bakteriofagu albo w plazmidowym wektorze wahadłowym ze znakowaną sondą oligonukleotydową opracowaną na podstawie sekwencji aminokwasowej HPV18. Dodatkowy sposób obejmuje przesiewanie biblioteki cDNA albo genomowego dNa zawierającej HPV18 skonstruowanej w bakteriofagu albo w plazmidowym wektorze wahadłowym częściowym DNA kodującym HPV18. Ten częściowy DNA jest uzyskiwany w swoistej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przez amplifikację fragmentów DNA HPV18 przez opracowanie zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych na podstawie sekwencji aminokwasowej oczyszczonego HPV18. Inną metodą jest izolowanie RNA z komórek wytwarzających HPV18 i translowanie RNA na białko w układzie translacji in vitro albo in vivo. Translacja RNA do białka albo peptydu spowoduje wytwarzanie przynajmniej części białka HPV18, które może być zidentyfikowane przez, przykładowo, aktywność białka HPV18 albo reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciwko HPV18. W tej metodzie, pule RNA izolowanego z komórek wytwarzających HPV18 mogą być analizowane na obecność RNA, który koduje przynajmniej część HPV18. Dalsze frakcjonowanie puli RNA może być wykonywane w celu oczyszczania RNA HPV18 z pozostałego RNA. Peptyd albo białko wytwarzane tym sposobem może być analizowane dostarczając sekwencji aminokwasowych, które z kolei mogą być zastosowane do opracowania starterów do wytwarzania cDNA HPV18 albo RNA zastosowane do translacji może być analizowane w celu dostarczenia sekwencji nukleotydowych kodujących HPV18 i wytwarzania sond do przesiewania bibliotek cDNA HPV18. Te sposoby znane są w stanie techniki i mogą być znalezione, przykładowo w Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning:

184 022

A Laboratory Manuał, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Oczywiste jest, że inne rodzaje bibliotek, jak również biblioteki skonstruowane z innych komórek albo rodzajów komórek mogą być przydatne do izolowania DNA kodującego HPV18. Inne rodzaje bibliotek obejmują, choć nie są ograniczone do bibliotek cDNA uzyskanych z innych komórek albo linii komórkowych zawierających HPV typu 18 oraz bibliotek genomowego DNA.

Wytwarzanie bibliotek cDNA może być wykonywane różnymi technikami. Konstruowanie biblioteki cDNA można znaleźć w Sambrook i in., wyżej. Oczywiste jest, że DNA kodujący HPV18 może być także izolowany z odpowiedniej biblioteki genomowego DNA. Konstruowanie bibliotek genomowego DNA może być wykonywane różnymi technikami. Techniki konstruowania biblioteki genomowego DNA można znaleźć Sambrook i in., wyżej.

Klonowany DNA HPV18 albo jego fragmenty uzyskane opisanymi tu metodami, mogą być ekspresjonowane rekombinacyjnie klonowaniem molekularnym do wektora ekspresyjnego zawierającego odpowiedni promotor i inne odpowiednie elementy regulujące transkrypcję, i przenoszony do komórek gospodarzy prokariotycznych albo eukariotycznych w celu wytwarzania rekombinowanego HPV18. Techniki takich manipulacji są w pełni opisane w Sambrook i in., wyżej, i znane w stanie techniki.

Wektory ekspresyjne są określone tu jako sekwencje DNA konieczne do transkrypcji klonowanych kopii genów i translacji ich mRNA w odpowiednim gospodarzu. Wektory takie mogąbyć stosowane do ekspresji genów eukariotycznych w różnych organizmach gospodarza takich jak bakterie, algi zielono-niebieskie, komórki roślinne, komórki owadzie, komórki grzybów i komórki zwierzęce. Szczególnie zaprojektowane wektory umożliwiają przemieszczanie DNA pomiędzy gospodarzami takimi jak bakterie-drożdże albo bakterie-komórki zwierzęce albo bakterie-komórki grzybów albo bakterie-komórki bezkręgowców. Odpowiednio skonstruowane wektory ekspresyjne powinny zawierać: początek replikacji dla autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, znaczniki umożliwiające selekcję, ograniczoną liczbę przydatnych miejsc enzymów restrykcyjnych, potencjał tworzenia licznych kopii i aktywny promotor. Promotor określony jest jako sekwencja DNA, która kieruje polimerazę DNA w kierunku wiązania z DNA i zapoczątkowuje syntezę RNA. Silnym promotorem jest taki, który powoduje inicjację mRNA z dużą częstotliwością. Wektory ekspresyjne mogą obejmować, choć nie są ograniczone do wektorów klonowania, zmodyfikowanych wektorów klonowania, specjalnie zaprojektowanych plazmidów albo wirusów.

Różne ssacze wektory ekspresyjne mogą być zastosowane w celu ekspresji DNA HPV18 albo jego fragmentów w komórkach ssaczych. Dostępne w handlu ssacze wektory ekspresyjne, które mogąbyć odpowiednie do rekombinacyjnej ekspresji HPV18 obejmują, choć nie są ograniczone do pCDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-l (8-2) (ATCC 37110), pdBPVMMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (37460) i ZZD35 (ATCC 37565).

Różne bakteryjne wektory ekspresyjne mogą być zastosowane do ekspres jonowania DNA HPV18 albo ich fragmentów w komórkach bakteryjnych. Dostępne w handlu bakteryjne wektory ekspresyjne które mogą być przydatne obejmują, choć nie są ograniczone do pETlla (Novagen), lambda gtl 1 (Invitrogen), pcDNA-II (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Różne wektory ekspresyjne komórek grzybów mogąbyć zastosowane w celu ekspresjonowania HPV18 albo jego fragmentów w komórkach grzybów. Dostępne w handlu wektory ekspresyjne komórek grzybów, które mogą być przydatne obejmują, choć nie są ograniczone do pYES2 (Invitrogen), wektory ekspresyjne Pienia (Invitrogen) i wektory Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Niemcy).

Różne wektory ekspresyjne komórek owadów mogąbyć zastosowane w celu ekspresjonowania HPV18 albo jego fragmentów w komórkach owadów. Dostępne w handlu wektory ekspresyjne komórek owadów, które mogą być przydatne obejmują, choć nie są ograniczone do pBlue Bac III (Invitrogen) i pAcUW51 (PharMingen, Inc.).

Wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący HPV18 albo jego fragmenty może być

184 022 zastosowany do ekspresji białek HPV 18 albo fragmentów białek HPV 18 w komórkach, tkankach, narządach albo zwierzętach (w tym ludzi). Komórki gospodarza mogą być prokariotyczne albo eukariotyczne, obejmując, choć nie wyłącznie bakterie takie jak E. coli, komórki grzybów takie jak drożdże, komórki ssaków takie jak linie komórkowe ludzkie, bydlęce, świńskie, małpie i gryzoni oraz komórki owadów obejmujące, choć nie ograniczone do linii komórkowych pochodzących od Drosophila i jedwabników. Linie komórkowe pochodzące od gatunków ssaków, które mogą być przydatne i które są dostępne w handlu obejmują choć nie są ograniczone do komórek L L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), komórek L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) i MRC-5 (ATCC CCL 171).

Wektory ekspresyjne mogą być wprowadzone do komórek gospodarza dowolną spośród licznych technik, obejmujących choć nie ograniczonych do transformacji, transfekcji, lipofekcji, ftizji protoplastu i elektroporacji. Komórki zawierające wektor ekspresyjny sąnamnażane klonalnie i analizowane indywidualnie w celu określenia czy wytwarzają białko HPV18. Identyfikacja klonów komórek gospodarza ekspresjonujących HPV18 może być dokonana kilkoma sposobami, obejmującymi choć nie ograniczonymi do reakcji z przeciwciałami przeciwko HPV18 i obecności aktywności HPV18 związanej z komórką, gospodarza, takiej jak swoiste dla HPV18 wiązanie ligandów albo przekazywanie sygnałów określone jako reakcja spowodowana oddziaływaniem ligandów swoistych wobec HPV18 z ekspres jonowanym białkiem HPV18.

Ekspresja fragmentów DNA HPV może być również wykonana przy użyciu wytworzonego in vitro syntetycznego mRNA albo natywnego mRNA. Syntetyczny mRNA albo mRNA izolowany z komórek wytwarzających HPV18 może być wydajnie poddawany translacji w różnych układach bezkomórkowych, obejmujących choć nie ograniczonych do ekstraktów zarodków pszenicy i ekstraktów retikulocytów, jak również mogą ulegać efektywnej translacji w układach komórkowych, obejmujących choć nie ograniczonych do mikroiniekcji do oocytów żaby, która to metoda jest korzystna.

Po ekspresji białka (białek) HPV18 w komórce gospodarza, białko HPV18 może być odzyskiwane dostarczając HPV18 w postaci czystej. Kilka procedur oczyszczania HPV18 jest dostępnych i odpowiednich do zastosowania. Jak to tu opisano, rekombinowane białko HPV18 może być oczyszczone z lizatów komórkowych i ekstraktów przez różne kombinacje albo pojedyncze zastosowanie frakcjonowania solą chromatografii anionowymiennej, chromatografii żelowej, chromatografii adsorpcji na hydroksyapatycie i chromatografii oddziaływań hydrofobowych.

Oprócz tego, rekombinowany HPV 18 może być oddzielany od innych białek komórkowych przez zastosowanie kolumny powinowactwa immunologicznego, wytworzonej z przeciwciał monoklonalnych albo polikłonalnych swoistych wobec powstających HPV18 pełnej długości albo fragmentów polipeptydów HPV18. Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być wytwarzane według różnych znanych sposobów. Przeciwciało monoklonalne albo posiadające pojedynczą swoistość w znaczeniu tu użytym oznacza pojedynczy gatunek przeciwciała albo liczne gatunki przeciwciała o homogennej charakterystyce wiązania z HPV18. Wiązanie homogenne w znaczeniu tu użytym dotyczy zdolności gatunku przeciwciała do wiązania swoistego antygenu albo epitopu.

Jest oczywiste, że sposoby wytwarzania przeciwciał o pojedynczej swoistości mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec fragmentów polipeptydowych HPV18, albo powstającego polipeptydu HPV18 pełnej długości. W szczególności, oczywiste jest, że mogą być wytwarzane przeciwciała o pojedynczej swoistości, swoiste wobec w pełni funkcjonalnego HPV18 albo jego fragmentów.

W niniejszym wynalazku opisano również sposoby badania przesiewowego związków modulujących ekspresję DNA albo RNA kodującego HPV18, jak również funkcję białka (białek) HPV18 in vivo. Związki, które modulują te aktywności mogą być DNA, RNA, peptydami, białkami albo organicznymi cząsteczkami nie białkowymi. Związki mogą modulować

184 022 przez zwiększenie albo osłabienie ekspresji DNA albo RNA kodującego HPV18, albo funkcji białka HPV18. Związki, które modulują ekspresję DNA albo RNA kodującego HPV18 albo funkcję białka HPV18 mogą być wykryte różnymi testami. Test może być prostym testem typu „tak/nie”, określającym czy występuje zmiana ekspresji albo funkcji. Test może się stać ilościowy przez porównanie ekspresji albo funkcji próbki testowej z poziomami ekspresji albo funkcji w próbce odniesienia.

Mogą być wytworzone zestawy zawierające DNA HPV18, fragmenty DNA HPV18, przeciwciała przeciwko DNA HPV18 albo białku HPV18, RNA HPV18 albo białko HPV18. Zestawy takie są stosowane do wykrywania DNA, który hybrydyzuje z DNA HPV18 albo w celu wykrywania obecności białka (białek) albo fragmentów peptydów HPV18 w próbce. Charakterystyka taka jest przydatna dla wielu zastosowań obejmujących, choć nie ograniczonych do badań kryminalistycznych i epidemiologicznych.

Sekwencje nukleotydowe komplementarne do sekwencji DNA kodującej HPV18 mogą być zsyntetyzowane do terapii anty sensownej. Takie cząsteczki antysensowne mogą być DNA, stabilnymi pochodnymi DNA takimi jak tiofosforany albo metylofosfoniany, RnA, stabilnymi pochodnymi RNA takimi jak 2'-0-alkilo RNA, albo innymi mimetykami oligonukleotydów anty sensownych HPV18. Cząsteczki antysensowne HPV18 mogą być wprowadzane do komórek przez mikroiniekcję, kapsułkowanie w liposomach albo przez ekspresję z wektorów niosących sekwencję antysensowną. Terapia antysensowną HPV18 może być szczególnie przydatna do leczenia chorób, gdzie korzystne jest zmniejszenie aktywności HPV18.

Określenie „pochodna chemiczna” opisuje cząsteczkę, która zawiera dodatkowe reszty chemiczne, które nie są normalnie częścią cząsteczki podstawowej. Reszty takie mogą poprawiać rozpuszczalność, półokres trwania, wchłanianie itp. cząsteczki podstawowej. Alternatywnie, reszty mogą osłabiać niepożądane efekty uboczne cząsteczki podstawowej albo zmniejszać toksyczność cząsteczki podstawowej. Przykłady takich cząsteczek opisane są w różnych tekstach takich jak Remington's Pharmaceutical Sciences.

Związki zidentyfikowane w oparciu o ujawnione tu sposoby mogą być stosowane same w odpowiednich dawkach określonych w rutynowych badaniach, w celu uzyskania optymalnego zahamowania HPV18 albo jego aktywności, przy minimalizacji jakiejkolwiek potencjalnej toksyczności. Oprócz tego, może być pożądane równoczesne albo kolejne podawanie innych czynników.

Korzystnie, związki według niniejszego wynalazku mogą być podawane w pojedynczej dawce dziennej, albo całkowita dawka dzienna może być podawana w kilku dawkach podzielonych. Ponadto, związki według niniejszego wynalazku mogą być podawane różnymi drogami obejmującymi choć nie ograniczonymi do podawania donosowego, doustnego, przezskórnego albo w czopkach.

Do leczenia skojarzonego z więcej niż jednym składnikiem czynnym, gdzie składniki czynne są w osobnych postaciach dawkowania, składniki czynne mogą być podawane równocześnie albo każdy z nich może być podawany osobno.

Schemat dawkowania wykorzystujący związki według niniejszego wynalazku może być wybrany w zależności od różnych czynników takich jak rodzaj, gatunek, wiek, ciężar, płeć i stan kliniczny pacjenta; ciężkość leczonego stanu; drogę podania; czynność nerek i wątroby pacjenta oraz konkretny zastosowany związek. Lekarz o przeciętnych umiejętnościach może łatwo określić i przepisać skuteczną ilość leku niezbędną do zapobiegania, przeciwdziałania albo zahamowania postępu choroby. Optymalna precyzja w osiąganiu stężenia leku w zakresie zapewniającym skuteczność bez toksyczności wymaga schematu opartego na kinetyce dostępności leku w miejscach docelowych. Obejmuje to wzięcie pod uwagę rozmieszczenia, równowagi i eliminacji leku.

W sposobach opisanych w wynalazku, opisane tu związki mogą tworzyć składnik czynny i są zwykle podawane w mieszaninie z dopuszczalnymi farmaceutycznie rozcieńczalnikami, zarobkami albo nośnikami (określanymi tu łącznie jako substancje „nośnikowe”) wybranymi odpowiednio w zalezności od zamierzonej postaci do podawania, tj. doustnych tabletek, kapsułek, eliksirów, syropów, czopków, żeli itp., oraz zgodnie z konwencjonalną praktyką farmaceutyczną.

184 022

Przykładowo, do podawania doustnego w postaci tabletki albo kapsułki, składnik czynny może być połączony z doustnym, nie toksycznym dopuszczalnym farmaceutycznie obojętnym nośnikiem takim jak etanol, gliceryna, woda itp. Ponadto, jeżeli to pożądane albo konieczne, do mieszaniny mogą być włączone odpowiednie środki wiążące, smarujące, ułatwiające rozpadanie i barwiące. Odpowiednie substancje wiążące obejmują, bez ograniczania, skrobię, żelatynę, naturalne cukry takie jak glukoza albo beta-laktoza, słodziki kukurydziane, naturalne i syntetyczne gumy takie jak guma arabska, , tragakanta albo alginian sodu, karboksymetyloceluloza, poliglikol etylenowy, woski itp. Środki smarujące zastosowane w tych postaciach dawkowania obejmują, bez ograniczania oleinian sodu, stearynian sodu, stearynian magnezu, benzoesan sodu, octan sodu, chlorek sodu itp. Środki ułatwiające rozpadanie obejmują bez ograniczania skrobię, metylocelulozę, agar, bentonit, gumę ksantanową itp.

Do postaci płynnych składnik czynny może być łączony w odpowiednio aromatyzowanych środkach zawieszających albo rozpraszających takich jak gumy naturalne albo syntetyczne, przykładowo tragakanta, guma arabska, metyloceluloza itp. Inne środki rozpraszające, które mogą być zastosowane obejmują glicerynę itp. Do podawania pozajelitowego, pożądane są sterylne zawiesiny i roztwory. Gdy pożądane jest podawanie dożylne, stosuje się ogólnie preparaty izotoniczne, które zawierają, odpowiednie środki konserwujące.

Preparaty miejscowe zawierające składnik czynny mogą być podawane z różnymi substancjami nośnikowymi znanymi w technice, takimi jak alkohole, żel aloe vera, alantoina, gliceryna, oleje z witaminą A i E, oleje mineralne, propionian mirystylowy PPG2 itp., w postaci np. roztworów alkoholowych, miejscowych zmywaczy, kremów czyszczących, żeli na skórę, toników na skórę i szamponów w postaci kremu albo żelu.

Związki opisane w wynalazku mogą być również podawane w postaci układów liposomów, takich jak małe pęcherzyki jednobłonowe, wielkie pęcherzyki jednobłonowe i pęcherzyki wieloczłonowe. Liposomy mogą być wytwarzane z różnych fosfolipidów, takich jak cholesterol, stearyloaminy albo fosfatydylocholiny.

Związki według niniejszego wynalazku mogą być również dostarczane przez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych jako pojedynczych nośników, z którymi sprzęgane są cząsteczki związku. Związki według niniejszego wynalazku mogą być również sprzęgane z rozpuszczalnymi polimerami jako nośnikami leku z możliwością kierowania. Polimery takie mogą obejmować poliwinylopirolidon, kopolimer piranu, polihydroksypropylometakryloamidofenol, polihydroksyetyloaspartamidofenol albo polietoksylowana polilizyna podstawiona resztami palmitoilowymi. Ponadto, związki według niniejszego wynalazku mogą być sprzęgnięte z klasą polimerów ulegających biodegradacji, przydatnymi do uzyskiwania kontrolowanego uwalniania leku, przykładowo, polikwasem mlekowym, poli-e-kaprolaktonem, polikwasem hydroksymasłowym, poliortoestrami, poliacetalami, polidihydropiranami, policyj anoakrylanami i sieciowanymi albo amfipatycznymi kopolimerami blokowymi hydrożeli.

Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek bez ograniczania go.

Przykład 1

Klonowanie genomu HP VI8

Całkowity genomowy DNA wytworzono z linii komórkowej otrzymanej z ludzkiego raka szyjki macicy SW756 (Freedman R.S., i in., 1982, In Vitro, tom 18, str. 719-726) techniką standardową. DNA trawiono EcoRI i poddano elekroforezie na preparatywnym 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia. Wycięto skrawek żelu odpowiadający fragmentom DNA wielkości około 12 kbp. Agarozę trawiono stosując enzym Agaraze™ (Boehringer Mannheim, Inc.j, zaś frakcjonowany DNA precypitowano, defosforylowano i poddano ligacji z ramionami lambda EMBL4 trawionymi EcoRl (Stratagene Inc.j. Bibliotekę lambda upakowano stosując ekstrakt pakujący Gigapack II Gold (Stratagene Inc.j. Klony pozytywne HPV18 identyfikowano stosując sondę DNA L1 HPV18 wielkości około 700 bp, którą wytworzono przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCRj stosując DNA SW756 jako matrycę i startery zaprojektowane w oparciu o opublikowaną sekwencję DNA L1 HPV18 (Cole i Danos, 1987, J. Mol. Biol., 193:599-608; nr GeneBank #X05015j. Wyizolowano HPV18pozytywny klon lambda zawierający wstawkę wielkości 12 kbp, będącą fragmentem EcoRI, i oznaczono ją #187-1.

184 022

Przykład 2

Konstruowanie drozdzowych wektorów ekspresyjnych

Otwartą ramkę odczytu (ORF) L1 HPV18 amplifikowano przez PCR stosując klon #187-1 jako matrycę, polimerazę Vent™ (New England Biolabs, Inc. ), 10 cykli amplifikacji (94°C, 1 min; 50°C, 1 min; 72°C, 2 min) i parę starterów oligonukleotydowych z flankującymi sekwencjami Bglll (podkreślone):

starter sensowny

5'-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3' starter antysensowny

5'-GAAGATCTTTACTTCCTGGCACGTACACGCACACGC-3'

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji w drożdżach sekwencję liderową (Kniskem i in., 1986, Gene, 46:135-141) bezpośrednio powyżej rozpoczynającego kodonu metioniny LI HPV18 (wyróżnionej jako wytłuszczona czcionka). Produkt PCR L1 wielkości

1,5 kbp trawiono Bglll i oczyszczano na żelu.

Wektor ekspresyjny pGALl-10 skonstruowano przez izolowanie fragmentu SphI wielkości 1,4 kbp, z plazmidu pUC18 o dwukierunkowym promotorze GAL, który zawierał rozbieżne promotory Saccharomyces cerevisiae GALI-GAL 10 z plazmidu pBM272 (dostarczony przez Marka Johnstona, Washington University, St. Louis, MO). Promotory rozbieżne są flankowane z każdej strony przez kopie drożdżowego terminatora transkrypcji ADH1, miejsca klonowania BamHI położone pomiędzy promotorem GALI i pierwszą kopią terminatora transkrypcji ADH1 i miejsce klonowania Smal położone pomiędzy promotorem GALIO i drugą kopią terminatora transkrypcji ADH1. Drożdżowy wektor wahadłowy zbudowany z pBR322, drożdżowego genu LEU2d i drożdżowego plazmidu 2u (dar Benjamina Halla, University of Washington, Seattle,WA) trawiono SphI i poddano ligacji z fragmentem SphI rozbieżnych promotorów GAL wielkości 1,4 kbp powodując powstanie pGALl-10. pGALl-10 linearyzowano BamHI, który ciął pomiędzy promotorem GALI i terminatorem transkrypcji ADH1. Wektor trawiony BamHI i fragment PCR L1 HPV18 trawiony Bglll poddano ligacji i zastosowano do transformacji E. coli DH5a (Gibco BRL, Inc.). Izolowano plazmid pGALl-10, który zawierał gen L1 HPV18, i oznaczono go pl91-6.

Skonstruowano drożdżowy wektor ekspresyjny, który równocześnie ekspresjonował geny L1 i L2. Plazmid pl91-6 (pGALl-10 + L1 HPV18) trawiono Smal, który ciął pomiędzy promotorem GALIO i terminatorem transkrypcji ADH1. Gen L2 HPV18 wielkości 1,4 kbp amplifikowano przez PCR jak to opisano wyżej stosując poniższe startery oligonukleotydowe, które zawierały flankujące miejsca Smal (podkreślone).

starter sensowny

5'-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3' starter antysensowny

5'-TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3'

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji drozdżową sekwencję liderową (Kniskem i in., 1986, wyżej) bezpośrednio powyżej kodonu start L2 HPV18 (wytłuszczona czcionka). Fragment PCR trawiono Smal, oczyszczono na żelu i poddano ligacji z plazmidem 191-6 trawionym Smal. Wyizolowano plazmid pGALl-10 zawierający geny L1 i L2 HPV18 i oznaczono p195-11.

Przykład 3

Typowanie próbek klinicznych

Próbki biopsji szyjki macicy pobrano w Veterans Administration Medical Center w Indianapolis, IN (dzięki uprzejmości dra Darrona Browna) oraz w Albert Einstein Medical Center w Filadelfii, PA (dzięki uprzejmości dr Joan Adler) i zamrożono w -20°C. DNA izolowano jak to opisano w Brown i in., 1993 (Brown i in., 1993, J. Clin. Microbiol., 31:2667-2673). Pokrótce, próbki kliniczne obrabiano w urządzeniu Braun micro-dismembrator ll (B. Braun Instruments, Melsungen, Niemcy) i rozpuszczano w buforze zawierającym 10 mM EDTA i 0,6% (wag./obj.) siarczanu dodecylosodowego (SDS). Próbki doprowadzono do 20 mM Tris pH 7,4 i trawiono białko 50 pg/ml Proteinazy K w obecności 0,1 pg/ml RNazy A, a następnie ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy. DNA precypitowano etanolem

184 022 i oznaczano ilościowo spektrofotometrycznie.

Próbki DNA badano przesiewowo przez PCR i analizę metodą Southern biot na obecność HPV18. Segment ORF L1 HPV18 wielkości 256 bp amplifikowano przez PCR stosując poniższe startery oligonukleotydowe:

starter sensowny

5' -CAATCCTTATATATTTAAAGGCACAGGTATG-3’ starter antysensowny

5'-CATCATATTGCCCAGGTACACAGGAGACTGTG-3'

Warunki PCR były jak w zaleceniach producenta AmplTaq™ DNA Polymerase/GeneAmp™ (Perkin Elmer Corp.) z takim wyjątkiem, że stosowano 0,5 pl DNA próbki klinicznej jako matrycę i 10 pmoli każdego ze starterów, 2 mM dNTP i 2 mM MgCl₂ w mieszaninie reakcyjnej. Po etapie denaturacji przez 2 min w 94°C następowało 40 cykli amplifikacji (94°C, 1 min; 45°C, 1 min; 72°C, 1 min.).

Produkty PCR poddano elektroforezie na 3% żelu agarozowym, przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z sondą oligonukleotydową swoistą wobec L1, znakowaną ³²P.

Przykład 4

Sekwencjonowanie DNA genów L1 i L2

Geny L1 i L2 HPV18 w klonach #187-1, pl91-l i pl95-ll sekwencjonowano stosując zestaw do sekwencjonowania PRIZM oraz automatyczny sekwenator DNA ABI Sequencer #373A (Applied Biosystems). W celu uzyskania sekwencji zgodności HPV18, DNA części genu LI amplifikowano przez PCR z ludzkich izolatów klinicznych, sekwencjonowano i porównywano z zastrzeganymi i opublikowanymi sekwencjami. Fragment wielkości 256 bp (nukleotydy 817-1072) amplifikowano z każdego DNA izolatów stosując w tym celu oligonukleotydy i cykle amplifikacji opisane w przykładzie 3. W celu amplifikacji części aminowej genu LI wielkości 432 bp (nukleotydy 1-431) zastosowano następujące startery

5^l-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3'

5'-CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3', stosując cykle amplifikacji opisane w przykładzie 3. Oba produkty PCR poddano osobno ligacji z plazmidem pCRII (Invitrogen Corp.) stosując odczynniki i procedury zalecane przez producenta. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów i sekwencjonowano zawierający wstawki EcoRI.

Przykład 5

Analiza DNA i wywnioskowanych sekwencji aminokwasowych

Sekwencje nukleotydowej i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe (aa) zastrzeganego L1 HPV18 pokazano na figurze 1. Sekwencję DNA uzyskano z sekwencji zgodności klonów #187-1, pl91-l i pl95-ll. Porównanie sekwencji nukleotydowej zastrzeganego L1 HPV18 z opublikowaną sekwencją L1 HPV18 (GeneBank nr #X05015) zidentyfikowało 20 bp zmian wśród 1524 bp. Pięć spośród zmian nukleotydowych (C do G w pozycji 89, C do A w pozycji 263, C do G w pozycji 848, G do A w pozycji 967 i C do G w 1013) powodowało zastąpienia aminokwasów. Pięć różnic w resztach w stosunku do opublikowanej sekwencji P do R w pozycji 30, 283 i 338, T do N w aminokwasie 88 i V do I w pozycji aa 323 (figura 2). Pozycje 88 i 323 stanowiły zmiany konserwatywne, podczas gdy trzy zmiany P do R mogą zasadniczo zmieniać właściwości fizyczne ekspresjonowanego białka L1.

Porównanie sekwencji aminokwasowych pochodzących z izolatów klinicznych (numery 354, 556, 755, 697, 795 i 23) z sekwencją zastrzeganą i sekwencją opublikowaną pokazano na figurze 2. Istnieją cztery położenia, w których izolaty kliniczne i sekwencja zastrzegana różnią się od sekwencji opublikowanej. Pozycje 30, 283 i 338 kodują argininę (R) we wszystkich stwierdzonych do tej pory izolatach, w tym w sekwencji zastrzeganej. Stoi to w jawnej sprzeczności z opublikowaną sekwencją, w której we wszystkich tych położeniach znajdują się proliny (P). Ponadto, w położeniu 88 w izolatach i zastrzeganej sekwencji znajduje się asparagina (N), podczas gdy w sekwencji opublikowanej jest tam treonina (T). Ostatnią różnicą w położeniu 323 była stwierdzona walina (V) w wielu klinicznych izolatach oraz opublikowanym szczepie, podczas gdy w sekwencji zastrzeganej i jednym z izolatów (#23) znajdowała się tam izoleucyna (I). Wnioskiem jest, że sekwencja zastrzegana odzwierciedla główne sekwencje wirusowe, które są związane z zakażeniem klinicznym, zaś brak izolatów zawie12

184 022 rających proliny w którymkolwiek z miejsc 30, 283 czy 338 sekwencji opublikowanej wskazuje, że opublikowany klon jest bądź artefaktem albo podtypem niekonsekwentnym.

Sekwencje nukleotydowe i wywnioskowane aminokwasowe L2 HPV18 uzyskano z sekwencji zgodności klonów #187-1 i pl95-ll i pokazano na figurze 3. Porównanie sekwencji nukleotydowej z opublikowaną sekwencją HPV18 (GeneBank nr #X05015) zidentyfikowało 40 bp różnic pośród 1389 bp. Różnice bp powodowały 14 zmian na poziomie aminokwasowym: P do S w 29, P do N w 33, A do S w 177, D do E w 266, D do N w 270, D do G w 346, M do I w 355, V do M w 359, S do P w 365, F do S w 369, F do V w 371, F do S w 372, K do T w 373 i S do P w 409.

Przykład 6

Wytwarzanie surowic odpornościowych przeciwko L2 HP V18

Przeciwciała swoiste wobec L2 HPV18 wytworzono w organizmach kóz stosując białko fuzyjne trpE-L2 HPV18 ekspresj onowane w E. coli. ORF L2 pełnej długości amplifikowano przez PCR stosując startery oligonukleotydowe wprowadzające miejsca Hindlll i BamHI flankujące, odpowiednio, końce 5' i 3'. Fragment L2 wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pATH23 trawionego HindlH-BamHI (Koemer i in., 1991, Meth. Enzymol., 194:477-490). Białko fuzyjne ekspresjonowano w E. coli RR1 (Gibco BRL, Inc.) po indukcji kwasem 3-bindoloakrylowym. Frakcję nierozpuszczalną analizowano przez SDS-PAGE a następnie barwienie błękitem Coomassie. Białko fuzyjne trpE-V2 HPV18 stanowiło główną część nierozpuszczalnej frakcji E. coli. Kozy immunizowano białkiem fuzyjnym trpE-L2 HPV18 według standardowego protokołu Pocono Rabbit Farm and Laboratory, Inc., dla antygenów fuzyjnych (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA).

Przykład 7

Wytwarzanie szczepu drożdży U9

Szczep Saccharomyces cere visiae 2150-2-3 (MATalpha, Leu2-04, adel, cir°) otrzymano od dr Leland Hartwell (University of Washington, Seattie, WA). Komórki szczepu 2150-23 namnażano przez noc w 30°C w 5 ml pożywki YEHD (Carty i in., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-121). Komórki płukano trzykrotnie w sterylnej, destylowanej wodzie, zawieszono w 2 ml sterylnej wody destylowanej po czym 0,1 ml zawiesiny komórek wysiano na sześć płytek z kwasem 5-fluoro-orotowym (FOA) w celu wyselekcjonowania mutantów ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manuał for Yeast Genetics). Płytki inkubowano w 30°C. Pożywka zawierała 3,5 g Difco Yeast Nitrogen Base, bez aminokwasów i siarczanu amonu; 0,5 g kwasu 5fluoro-orotowego; 25 g uracylu i 10 g dekstrozy na 250 ml wody destylowanej.

Pożywkę steiylizowano przez przefiltrowanie przez membranę 0,2 pm, anastępnie zmieszano z 250 ml 4% Bacto-Agar (Difco) utrzymywanego w 50°C, 10 ml roztworu 1,2 mg/ml adeniny i 5 ml roztworu 180 mg/50 ml L-leucyny. Powstałe podłoże rozporcjowano na 20 ml szalki Petri'ego.

Po 5 dniach inkubacji, pojawiły się liczne kolonie. Wyizolowano pojedyncze kolonie przez rozmazanie kolonii z początkowych płytek FOA na świeże płytki, które inkubowano w 30°C. Liczne kolonie z drugiego zestawu płytek FOA badano na obecność mutacji ura3 przez odbitki posiewów na płytkach YEHD i płytkach bez uracylu. Pożądanym rezultatem był wzrost na płytkach YEHD i brak wzrostu na podłożu bez uracylu. Uzyskano jeden izolat (U9) wykazujący te właściwości. Przechowywano go jako zamrożony roztwór glicerynowy (szczep #325) w -70°C do późniejszego użycia.

Przy kład 8

Wytwarzanie wektora do zniszczenia genu MNN9 drożdży

W celu wytworzenia wektora do zniszczenia genu MNN9, konieczne było sklonowanie genu MNN9 z genomowego DNA Saccharomyces cerevisiae. Uzyskano to przez standardową technologię reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Starter sensowny 5' i antysensowny 3' do PCR sekwencji kodującej MNN9 pełnej długości zaprojektowano w oparciu o opublikowaną sekwencję dla tego genu (Zymogenetics: patent EPO zgłoszenie nr 88117834.7, publikacjη nr 0-314-096-A2). Zastosowano poniższe startery oligodezoksynukleotydowe, zawierające flankujące miejsca Hindlll (podkreślone):

184 022 starter sensowny

5'-CTTAAAGCTTATCTCACTTTCTCTTGTATCG-3' starter antysensowny ^,-TGATAAGCTTGCTCAATGGTTCTCTTCCTC-3'.

Początkowy kodon metioniny dla genu MNN9 zaznaczono wytłuszczoną czcionką. PCR przeprowadzono stosując genomowy DNA ze szczepu JRY188 S. cerevisiae jako matrycę, polimerazę DNA Tag (Perkin Elmer) i 25 cykli amplifikacji (94°C 1 min; 37°C 2 min; 72°C 3 min). Powstały fragment PCR wielkości 1,2 kbp trawiono Hindlll, oczyszczano na żelu i poddano ligacji z trawionym Hindlll i traktowanym fosfatazą alkaliczną pUC 13 (Pharmacia). Powstały plazmid oznaczono j ako p 1183.

W celu zniszczenia genu MNN9 genem drożdży URA3, plazmid pBR322-URA3 (zawierający 1,1 kbp fragment Hindlll kodujący gen drożdży URA3 wklonowany w miejsce Hindlll pBR322) trawiono Hindlll i oczyszczano na zelu fragment DNA zawierający funkcjonalny gen URA3 wielkości 1,1 kbp, tępiono na końcach polimerazą DNA T4 i poddawano ligacji z plazmidem pl 183 trawionym Pmll (Pmll ciął w sekwencji kodującej MNN9). Powstały plazmid pl 199 zawierał gen MNN9 zniszczony funkcjonalnym genem URA3.

Przykład 9

Konstrukcja szczepu 1372 - pochodnej U9, zawierającej zniszczony gen MNN9

W celu zniszczenia genu MNN9 szczepu U9 (#325), 30 pg plazmidu pl 199 trawiono Hindlll tworząc liniową kasetę MNN9::URA3. Komórki szczepu 325 transformowano DNA pl 199 trawionym Hindlll metodąsferoplastu (Hinnen i in., 1987, PNAS USA 75:1929-1933), zaś transformanty selekcjonowano na syntetycznym podłożu agarowym pozbawionym uracylu i zawierającym 1,0 M sorbitol. Syntetyczne podłoże zawierało agar, 20 g; Yeast nitrogen Base bez aminokwasów, 6,7 g; adeninę, 0,04 g; L-tyrozynę, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukozę, 20 g i roztwór bez leucyny #2, 10 ml, na litr wody destylowanej. Roztwór bez leucyny #2 zawierał: L-argininę, 2g; L-histydynę, 1 g; L-leucynę, 6 g; L-izoleucynę, 6 g; L-lizynę, 4 g; Lmetioninę, 1 g; L-fenyloalaninę, 6 g; L-treoninę, 6 g; L-tryptofan, 4 g, na litr wody destylowanej.

Płytki inkubowano w 30°C przez pięć dni, po którym to czasie pojawiły się liczne kolonie. Z 10 kolonii wykonano preparaty DNA chromosomalnego, a następnie trawiono EcoRI i Hindlll. Produkty trawienia badano metodą Southern biot (J. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), stosując jako sondę fragment Hindlll wielkości 1,2 kbp, zawierający gen MNN9 (wyizolowany z plazmidu pil 99). Zidentyfikowano izolat (szczep #1327) wykazujący oczekiwane przesunięcie prążka DNA w badaniu Southern biot, jak również niezwykłą zdolność tworzenia skupisk, charakterystyczną, dla mutantów MNN9.

Przykład 10

Konstrukcja wektora do zniszczenia genu drożdży HIS3

W celu skonstruowania kasety niszczącej, w której gen HIS3 S. cerevisiae jest zniszczony genem URA3 plazmid YEp6 (K. Struhl i in., 1979, PNAS USA 76:1035) trawiono BamHI po czym oczyszczono na żelu fragment wielkości 1,7 kg niosący gen HIS3, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z pUC18, który trawiono uprzednio BamHI i traktowano polimerazą DNA T4. Powstały plazmid (oznaczony jako pl501 albo pUC18HIS3) trawiono Nhel (który ciął w sekwencji kodującej genu HIS3), po czym wektor oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i traktowano fosfatazą alkaliczną. Gen URA3 wyizolowano z plazmidu pBR322-URA3 przez trawienie Hindlll po czym fragment wielkości 1,1 kb niosący gen URA3 oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z powyższym fragmentem Nhel pUC18-/7AS3. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-HIS:URA3 albo 1505) zawierał kasetę niszczącą, w której drożdżowy gen HIS3 przerwano funkcjonalnym genem URA3.

Przykład 11

Konstrukcja wektora do zniszczenia drozdzowego genu PRB1 przez gen Hic 3

Plazmid FP8AH niosący gen PRB1 S. cerevisiae dostarczył dr E. Jones z CamegieMellon Univ. (C.M. Moehle i in., 1987, Genetics 115:255-263). Trawiono go Hindlll + XhoI, po czym oczyszczono na żelu fragment DNA wielkości 3,2 kb, zawierający i stępiono na koń14

184 022 cach polimerazą DNA T4. Następnie plazmid pUC18 trawiono BamHI, oczyszczano na żelu i stępiono na końcach przez działanie polimerazą DNA T4. Powstały fragment wektora poddano ligacji z powyższym fragmentem genu PRB1 dając plazmid pUCIS-pRBl. Plazmid YEp6, zawierający gen HIS3 trawiono BamHI. Powstały fragment BamHI wielkości 1,7 kb zawierający funkcjonalny gen HIS3 oczyszczono na żelu i stępiono na końcach przez działanie polimerazą DNA T4. Plazmid pUCIS-PRBl trawiono EcoRV + Ncol które cięły w sekwencji kodujące PRB1 i usuwały miejsce aktywne proteazy B i sekwencje flankujące. Fragment EcoRI-Ncol wielkości 5,7 kb niosący reszty 5' i 3' sekwencji kodującej PRB1 w pUC18, oczyszczono na zelu, stępiono działając polimerazą DNA T4, defosforylowano fosfatazą alkaliczną i poddawano ligacji z fragmentem HIS3 o tępych końcach, opisanym powyżej. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-prb1:HIS3, roztwór #1245) zawierał funkcjonalny gen HIS3 w miejscu części genu PRB1, który usunięto.

Przykład 12

Konstrukcja szczepu drożdży spokrewnionego z U9, zawierającego uszkodzenia genów MNN9 iPRB1

W przykładzie 9 opisano szczep 1372 spokrewniony z U9, który zawiera uszkodzenie genu MNN9. Izolaty klonalne szczepu 1372 pasażowano na płytkach FOA (jak to opisano w przykładzie 7) w celu selekcji mutantów ura3. Uzyskano wiele izolatów ura3 szczepu 1372, zaś jeden konkretny (szczep 12930-190-S1-1) wybrano do dalszego uszkodzenia genu HIS3. Wektor uszkadzający pUC18-his3::URA3 (pl505) trawiono Xbal i EcoRI w celu wytworzenia liniowej kasety uszkadzającej HIS3::URA3, i zastosowano do transformacji szczepu 12930-190-S1-1 metodą z octanem litu (Meth. Enzymol., 194:290 (1991)). Transformanty ura+ wyselekcjonowano na syntetycznym agarze bez uracylu, rozsiano w celu uzyskania izolatów klonalnych na tym samym podłożu a następnie wysiano w postaci odbitek na podłoże pozbawione uracylu albo histydyny, w celu poszukiwania izolatów, które byłyby Ura+ jak i His-. Jeden z izolatów (szczep 12930-230-1) wyselekcjonowano do dalszego uszkodzenia genu PRB1. Wektor uszkadzający gen PRB1 (p\JC\8-prbl:.HIS3, roztwór #1245) trawiono SacI i Xbal w celu wytworzenia liniowej kasety uszkadzającej prbl::HIS3 i zastosowano do transformacji szczepu 12930-230-1 metodą z octanem litu. Transformanty His+ wyselekcjonowano na podłożu agarowym pozbawionym histydyny i rozsiano na tym samym podłożu w celu izolacji klonów. Z licznych powstałych izolatów His+ wytworzono genomowy DNA, trawiono EcoRI i poddano elektroforezie na 0,8% zelu agarozowym. Analizy met. Southern biot wykonano stosując znakowaną radioaktywnie sondę długości 617 bp wytworzoną przez PCR z użyciem poniższych starterów oligonukleotydowych:

'-TGGTCATCCCAAATCTTGAAA3'

5'-CACCGTAGTGTTTGGAAGCGA3'

Uzyskano jedenaście izolatów wykazujących oczekiwaną hybrydyzację sondy fragmentu DNA prbl::HIS3 długości 2,44 bp. Stało to w jaskrawej sprzeczności z hybrydyzacją sondy z fragmentem 1,59 kb dla genu PRB1 typu dzikiego.

Jeden z izolatów zawierających pożądane uszkodzenie prbl:.HIS3 wyselekcjonowano do dalszego zastosowania i oznaczono go jako #1558.

Przykład 13

Ekspresja L1 i L2 HPV18 w drożdżach

Plazmidy pl91-6 (pGALl-10 + 1i HPV18) i pl95-11 (pGALl-10 + L1+L2 HPV18) zastosowano do transformowania szczepu #1558 S. cerevisiae (MATa, leu2-04, prbl:HIS3, MNN9\:URA3, adel, ci/^°) . Izolaty klonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHd zawierającej 2% galaktozę przez 88 godzin. Po zebraniu komórek, osad komórkowy zniszczono szklanymi perełkami i analizowano lizaty komórkowe w kierunku ekspresji L1 HPV18 i/lub L2 HPV18. Próbki zawierające 25 pg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na 10% żelach Tris-Glicine (Novex, Inc.) w warunkach denaturujących i przeniesiono elektrycznie na filtry nitrocelulozowe. Białko L1 badano immunologicznie stosując surowicę króliczą wywołana przeciwko białku fuzyjnemu trpE-LI HPV18 jako przeciwciało pierwotne (Brown i in., 1994, Virology 201:46-54) i koniugat oślego przeciwciała przeciwko króliczym IgG sprzęgnięty z peroksydazą chrzanową (Amersham Inc.) jako przeciwciało wtórne. Filtry

184 022 obrabiano stosując zestaw do wykrywania chemiluminescencją ECL™ Detection Kit (Amersham Inc.). Wykryto 50-55 kDa prążki białka zarówno dla klonów drożdży ekspresjonujących 1 jak i równocześnie L1+L2 (szczepu odpowiednio# 1725 i 1727, zaś nie w kontroli negatywnej (pGALl-10 bez genów L1 i L2) (figura 4).

Białko L2 HPV18 wykrywano metodą Western biot stosując kozie surowice poliklonalne wywołane przeciwko białku fuzyjnemu trpE-L2 HPV18 jako przeciwciało pierwotne i a następnie koniugat HRP z przeciwciałem króliczym (Kirkegard i Perry Laboratories, Gaithersburg, USA). Filtry obrabiano jak to opisano wcześniej. Białko L2 wykryto jako prążek białka 75 kDa w klonie równocześnie ekspresjonującym (szczep 1727) ale nie w kontroli negatywnej ani nie w klonie ekspresjonującym L1 (figura 5).

Przykład 14

Fermentacja L1 HPV18 (szczep 1725) i L1+AL2 HPV18 (szczep 1727)

Kulturę szczepów 1725 i 1727 rosnącą, na powierzchni płytki przeniesiono aseptycznie do płynnej pożywki bez leucyny zawierającej (na litr): 8,5 g Difco Veast Nitrogen Base bez aminokwasów i siarczanu amonu; 0,2 g adeniny; 0,2 g uracylu; 10 g kwasu sukcynylowego; 5 g siarczanu amonu; 40 g glukozy; 0,25 g L-tyrozyny; 0,1 g L-argininy; 0,3 g L-izoleucyny; 0,05 g L-metioniny; 0,2 g L-tryptofanu; 0,05 g L-histydyny; 0,2 g L-lizyny; 0,3 g L-fenyloalaniny; pożywkę tę doprowadzono do pH 5,0-5,3 przy użyciu NaOH po czym sterylizowano. Po hodowli w 28°C, przy 250 obr./min na wytrząsarce, przygotowano zamrożeniowe probówki przez dodanie sterylnej gliceryny do stężenia końcowego 17% (wag./obj.), po czym przechowywano w 70°C (1 ml na probówkę). Inokula przygotowywano w tej samej pożywce (500 ml na butelkę 2 1) rozpoczęto je przez przeniesienie rozmrożonej zawartości probówki mrożeniowej i inkubację w 28°C, przy 250 obr./min. na wytrząsarce przez 29 godzin. W fermentacji każdego szczepu wykorzystywano fermentator New Brunswick SF-116, o pojemności roboczej 10 1po inokulacji. Pożywka produkcyjna zawierała (na litr): 20 g ekstraktu drożdżowego Difco; 10 g peptony HySoy Sheffieid; 20 g glukozy; 20 g galaktozy; 0,3 ml środka przeciwpieniącego UCON LB-625 Union Carbide; pH pożywki ustalano przed sterylizacją na 5,3. Całą zawartość (500 ml) 2-litrowej butelki przenoszono do fermentatora, który inkubowano w 28°C, przy przepływie 5 1 powietrza na minutę, 400 obr/min, ciśnienie 3,5 psi. Wytrząsanie zwiększano jeżeli było konieczne utrzymanie wysycenia tlenu rozpuszczonego na poziomie powyżej 40%. Postęp fermentacji śledzono przez pomiar glukozy w trybie off-line (analizator Beckman Glucose 2 Analyzer) i spektrometrię masowa w trybie on-line (Perkin Elmer 1200). Po inkubacji przez 66 godzin, osiągnięto gęstości komórek 9,5-9,7 g suchej masy na litr. Hodowle zatęzono przez filtrację przez puste włókna (wkładka Amicon H5MP01-43 w układzie filtracyjnym Amicon DC-10) do około 2 litrów, diafiltrowano wobec 2 1 roztworu soli buforowanego fosforanem i dalej zatężano (do około 1 litra) po czym rozporcjowano do 500-ml butelek wirowniczych. Zebrano osad komórkowy przez odwirowanie przy 8000 obr/min (rotor Sorval GS-3) przez 20 minut w 4°C. Po dekantacji nadsączu, osad (od 191 do 208 g komórek) przechowywano w -70°C do momentu zużycia.

Przykład 15

Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1 HPV18

O ile nie zaznaczono inaczej wszystkie etapy prowadzono w 4°C.

Komórki przechowywano w zamrożeniu -70°C. Zamrożone komórki (wilgotna masa = 126 g) odmrożono w 20-23°C i zawieszono w 70 ml buforu (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl). Dodano inhibitory proteaz PMSF i pepstatynę A w stężeniu końcowym, odpowiednio, mM i 1,7 μΜ. Zawiesinę komórek zniszczono przez czterokrotne przepuszczenie przez urządzenie Ml 10-V Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) pod ciśnieniem 16000 psi. Zniszczone komórki odwirowano przy 12000 x g przez 40 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Zebrano nadsącz zawierający antygen L1.

Nadsącz rozcieńczono 1:5 przez dodanie buforu A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do wychwytującej kolumny anionowymiennej (9 cm ID x 3,9 cm) z żywicą Fractogel®EMD TMAE-65 (M) (EM Separations, Gibbstown, NJ) zrównoważoną buforem A. Po przemyciu buforem A, antygen LI eluowano gradientem NaCl od 0 do 1,0 M w buforze A. Frakcje kolumnowe badano na zawartość białka całkowitego metodą Bradforda. Następnie,

184 022 frakcje analizowano przy równej zawartości białka metodą Western blot i SDS-PAGE z wykrywaniem barwieniem srebrem.

Łączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen zatężano przez frakcjonowanie siarczanem amonu. Roztwory doprowadzano do 35% nasycenia siarczanem amonu przez dodanie odczynnika w postaci stałej podczas delikatnego mieszania w ciągu 10 minut. Próbkę umieszczano na lodzie i pozostawiano do precypitacji przez 4 godziny. Próbkę odwirowano przy 16000 x g przez 45 minut. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6,25 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl). Zawieszony osad poddano chromatografii na kolumnie żelowej (2,6 cm ID x 89 cm) na żywicy Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Buforem był PBS. Frakcje analizowano badaniem Western biot i SDSPAGE z wybarwianiem srebrem. Połączono najczystsze frakcje. Powstałą pulę zależano w 50 ml komorze mieszalnikowej stosując płaskie membrany YM-W0 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pod ciśnieniem N₂ 4-6 psi.

Produkt końcowy analizowano badaniem western biot i SDS-PAGE z wykrywaniem koloidem Coomassie. Oceniono, ze białko L1 jest w 50-60% homogenne. Tożsamość białka L1 potwierdzono badaniem western biot. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. W wyniku procesu otrzymano 12,5 mg białka.

Badanie metodą Bradforda na białko całkowite

Białko całkowite badano stosując dostępny w handlu zestaw Coomassie Plus@ (Pierce, Rockford, IL). Próbki rozcieńczano do odpowiedniego poziomu stosując wodę Milli-Q. Objętości wymagane do testu standardowego i mikrotestu wynosiły odpowiednio 0,1 ml i 1,0 ml. Dla obu protokołów zastosowano BSA (Pierce, Rockford, IL) w celu wykreślenia krzywych standardowych. Testy wykonywano stosując się do zaleceń producenta. Krzywe standardowe wykreślono stosując oprogramowanie CricketGraph@ na komputerze Mackintosh lici.

Analiza SDS-PAGE i western blot

Wszystkie żele, bufory i aparat do elektroforezy pochodziły z Novex (San Diego, CA) i stcosto^wane były według zaleceń producenta. Pokrótce, próbki rozcieńczano do równych stężeń białka w wodzie Milli-Q i mieszano 1:1 z buforem inkubacyjnym zawierającym 200 mM DTT. Próbki inkubowano 15 minut w 100°C i nakładano na odlany uprzednio 12% żel Trisglicyna. Próbki rozdzielano elektroforetycznie przy 125V przez godzinę i 45 minut. Żele wywoływano stosując barwienie srebrem w odmianie metody Heukeshoven i Dermick (Electrophoresis 6 (1985) 103-112) albo barwieniem koloidem Coomassie stosując dostępny w handlu zestaw (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Do badania metodą western biot, białka przenoszono na membrany PVDF przy 25V przez 40 min. Membrany płukano wodą Milli-Q i suszono na powietrzu. Przeciwciałem pierwotnym była królicza surowica poliklonalna wywołana przeciwko białku fuzyjnemu trpE-Ll HPV11 (dar od dr D. Brown). Poprzednie doświadczenia wykazały, że ta surowica odpornościowa reaguje krzyżowo z L1 HPV18 w badaniu western biot. Roztwór przeciwciał wykonano w surowicy odpornościowej w buforze do western biot (5% odtłuszczone mleko w 6,25 mM fosforanie sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Inkubację prowadzono przez godzinę w 20-23°C. Membrany płukano przez minutę w trzech zmianach PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztwór przeciwciała wtórnego wytworzono przez rozcieńczenie koziej surowicy odpornościowej przeciwkróliczej skoniugowanej z fosfatazą alkaliczną (Pierce, Rockford, IL). Inkubacja przebiegała w tych samych warunkach przez przynajmniej 1 godzinę. Membrany płukano jak wcześniej i wywoływano stosując jednoetapowy proces z substratem NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Przykład 16

Badania w mikroskopie elektronowym

Do analizy EM (Structure Probe, West Chester, PA) porcję każdej z próbek umieszczano na siateczkach miedzianych mesh 200 pokrytych węglem. Na siateczce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Siateczki pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu przed badaniem transmisyjną EM. Wszystkie badania wykonywano stosując transmisyjny mikroskop elektronowy JEOL 100CX (JeOl USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrofotografie miały powiększenie końcowe

184 022 równe 100000x. Cząsteczki wiroidalne obserwowano w zakresie 50-55 nm średnicy w próbce drożdży niosących plazmid ekspresyjny L1 HPV18 (figura 6). Nie obserwowano VLP w próbkach kontrolnych drożdży.

Przykład 17

Klonowanie cDNA HPV18 do wektorów ekspresyjnych cDNA kodujący HPV18 klonowano do kilku wektorów w celu ekspresji białka HPV18 w transfekowanych komórkach gospodarza i do transkrypcji/translacji in vitro. Wektory te obejmowały pBluescript ll SK+ (gdzie ekspresję napędzał promotor T7 albo T3), pCDNA l/Amp (gdzie ekspresję napędzał promotor wirusa cytomegalii (CMV)), pSZ9016-1 (gdzie ekspresję napędzał promotor długich końcowych powtórzeń (LTR) HlV) oraz bakulowirusowy wektor transferowy pAcUW51 (PharMingen, lnc.) (gdzie ekspresję napędzał promotor poliedryny (PH)) w celu wytwarzania rekombinowanego bakulowirusa zawierającego sekwencję kodującą DNA HPV18.

a) pBluescript ll . SK+:HPV18. Klon cDNA HPV18 odzyskano z bakteriofaga lambda ograniczonym trawieniem EcoRl i poddano ligacji z ciętym EcoRl, traktowanym ClP pBluescript ll SK+. Odzyskano osobne klony, w których orientacja sensowna HPV18 następowała po promotorze T7 albo T3.

b) pCDNA l/Amp:HPV18. W celu ułatwienia klonowania pozycyjnego, HPV18 wycięto z preparatu oczyszczonego plazmidu pBluescript ll SK+ : HPV18 w którym sekwencja dNa HPV18 położona jest poniżej promotora T7, przy użyciu EcoRl i Xbal. Powstały fragment EcoRI/Xbal HPV18 oczyszczono i poddano ligacji z ciętym EcoRI/Xbali, traktowanym ClP pCDNA l/Amp w taki sposób, że DNA kodujący HPV18 poniżej promotora CMV.

c) pSZ9016-l:HPV18. HPV18 wycięto z pBluescript ll SK+ : HPV18 przez trawienie EcoRl i oczyszczanie fragmentu 1,3 kb na żelu agarozowym. Powstały fragment EcoRl HPV18 poddano ligacji z ligacji z ciętym EcoRI/Xbali, traktowanym ClP pSZ9016-l. Wyselekcjonowano klony z orientacja, sensowną HPV18 poniżej promotora LTR HlV.

d) pAcUW51:Ll HPV18. ORF L1 HPV 18 pełnej długości amplifikowano przez PCR z klonu #187-1 stosując startery oligonukleotydowe wprowadzające flankujące miejsca Bglll. Gen Ll wprowadzono w miejsce BamHl bakulowirusowego wektora transferowego pAcUW51 (PharMingen, lnc.) pod kontrolą promotora poliedryny. Wytworzono rekombinowane bakulowirusy zawierające kasetę ekspresji L1 HPV18, według procedur opisanych w podręczniku PharMingen. Klony rekombinowane wyizolowano przez skrajne rozcieńczenia i hybrydyzację metodą dot blot.

Przy kład 18

Ekspresja polipeptydu HPV18 przez transkrypcją/translacją in vitro oraz przez transfekowanie komórek gospodarza

Wektory zawierające sekwencje DNA HPV18 zastosowano do napędzania translacji polipeptydu HPV 18 w lizacie retykulocytów królika, komórek ssaka i zakazonych bakulowirusem komórek owadzich. Procedury doświadczalne były zasadniczo jak to przedstawiono w instrukcji producenta.

a) Transkrypcja/translacja in vitro. Plazmidowy DNA pBluesript ll SK+ : HPV18 (z HPV18 w orientacji T7) linearyzowano trawieniem BamHl poniżej wstawki HPV18. Linearyzowany plazmid oczyszczano i zastosowano jako matryca do transkrypcji typu run-off stosując polimerazę RNA T7 w obecności m7G(5')ppp(5')G. powstałe czapeczkowane transkrypty HPV18 oczyszczano przez precypitację LiCl i zastosowano do napędzania translacji HPV18 w traktowanych nukleazą lizatach retykulocytów królika w obecności L-[³⁵S]metioniny.

b) Ekspresja w komórkach ssaków. Białko HPV18 poddano ekspresji w komórkach ssaka po transfekcji pCDNA l/Amp:HPV18 (pod kontrolą promotora CMV) albo pSZ9016-1 : HPV18 (pod kontrolą promotora LTR HlV). W ostatnim przypadku (pSZ9016-1 : HPV18) komórki równocześnie transfekowano plazmidem ekspresjonującym TAT pSZ90161 : TAT. Dla obu plazmidów ekspresjonujących HPV18, komórki COS-7 transfekowano stosując dekstran-DEAE albo lipofectamine (BR.L).

184 022 cj Ekspresja w komóiOach owadów. Baculowirusowu wektor transferowy pAcUW51:HPV18 L1 zastosowano do wytwarzania rekombinowanego baculowirusa (Autographa califomicaj przez rekombinację homologiczną co vivo. Znakowany epitopowo L1 HPV18 był następnie ekspresjonowany w komórkach owadzich Sf9 (Spodoptera fiugiperdaj rosnących w zawiesinie po zakażeniu rekombinówaoym baculowirusem zawierającym HPV18.

Przy kład 19

Związki, które wpływają na aktywność HPV18 mogą być wykrywane różnymi sposobami. Sposób wykrywania związków, które wpływają na HPV18 obejmuje:

aj zmieszanie związku badanego z roztworem zawierającym HpV18 z wytworzeniem mieszaniny;

bj pomiar aktywności HPV18 w mieszaninie; i cj porównanie HPV 18 w mieszaninie ze standardem.

Związki, które wpływają na aktywność HPV18 mogą być wytwarzane w postaci kompozycji farmaceutycznych. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być przydatne do leczenia chorób albo zaburzeń charakteryzujących się zakażeniem HPV18.

Przykład 20

DNA który jest strukturalnie spokrewniony z DNA kodującym HPV18 wykrywany jest soodą. Odpowiednia sonda może być uzyskana z DNA posiadającego wszystkie albo część sekwencji nukleotydówech z figury 1 albo figury 3, RNA kodowanego przez DNA posiadającego wszystkie albo część sekwencji nukleotydówych z figury 1 albo figury 3, albo zdegeoerowane oligonukleotydy pochodzące z części sekwencji nuklyotedowych z figury 1 albo figury 3.

184 022

184 022

20 30 40 50 60

ATGGCTTTGl^GGCGGCCTAGT&AC^TT^(^i^^TT^TT^CCTTi^C^/^(^(^TC^CTTCTGTGG(^/^AGA

MALWRPSDNTVYLPPPSVAR 20 70 80 90 100 110 120

GπGTCAATACTGATTAπATTTTACTCGCACAATCATATTΠATCATGCTTTCAGcTCT VVNTDDYVTRTSIFYHAGSS 40

100 144 150 160 1^0 180

CTAΠAΠMCT(^Π(TTMT(CTTATTHTTGΠ(XTCAGGT(TϊT<TCACTMGCCT

RLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ 60

100 200 220 220 230 240

GATAΠCCTAATTTπCTGCATACCAATATCGATTAπTCTTGTTCAGΠACCTTACCCA

DIPKVSAYQYRVFRVQLPDP 80

200 260 270 280 290 300

MTCAATΠTTTTCACCGATCATCGGAAπAAAATCCCG(ATACCACMCGπTAGTGTTT

NKFGLPDNSIYNPETQRLVW 100

010 320 330 340 350 300

TCCTGTTCTTGAGTGGAACTTGTCCGT(TTTCAGCCΓΓTAGTTTTTTGCCTTATTGTTCAT ACAGVEIGRGQPLGVGLSGH 110

070 380 390 440 400 420

CCATTTTATAATAAATTAGATGACACTTAACGTTCCCATTCCTCTACTTCTAATGTTTC T PFYNKLDDTESSHAATSNVS 110

400 440 450 440 440 400

TCGGCGΠATGGGATCTGTCTCTAGΠATAAGCAGWGATΓTATGTATΠTGGGC EDDRDNVSVDYKQTQLCILG 160

400 500 510 620 500 504)

TTTGCCCCTGCTAΠ(TTGMCTCTTTGCTAMTGTATCTTΠG(7CATTCGCGTCCTπA CAPAIGEHWAKGTACKSRPL 180

000 560 570 500 500 660

TCACAGTTC(TTTTGCCCCCCπTAGAACπAAGACCACAGπTΓGGAAGATGGTGATATT SQGDCPPLELKNTVLEDGDM 000

610 620 630 664 660 666

GTAGATACTGGATATGGTGCCATTGACTTTATTACATTTCAAGATACTAAATTTTAGTTA VDTGYGAMDFSTLGDTKCEV 220

670 680 690 770 7H 770

CCAπTGATATπTTCATTCTAπTTTAAATCTCCTTCπATπACAAATGTCTTCAGAT PLDICGSICKYPDYLOMSAD 240

700 740 750 776 777 770

CCπATTTT(GTπCCATGTπτmGCπACTACTTTAGCAGT^TπTTCTATTCAπTT PYGDSMFFCLRREGLFARHF 260

700 800 81^0 800 880 884

TGTAATAGGTCAGGTACTATGTGTITAc^CTGTGCCTCCACΓCCTTATATAΓΓTACGGCACA 5NRAGTMGDTVPGSLYIKGT 280

FIG. 1A

184 022

850 860 870 880 890 900

GGTT\T(^(^GT(^(^Tr(^y^(^CT(^^GCTGTGTGTATTCTCCCTC^T^CyMGT(G^CTCT^T^GTT

GMRASPGSCVYSPSPSGSIV 300 910 920 930 940 950 960

TCTTTTTTTTTCCTTTCCCCTTTTTTTTCTTTCC^CTCC^^^CTTTTCTTTTTTTCTTTTC TCDSQLFNKPYWLHKAQGHN 320

970 9130 990 1000 1010 1020

TTGTTTTGCTTCGTTCATTTTCGGπTCCACΠACTGTGCTTCTGGCCTCCCTGTCGTCC

NGICWHNQLFVTVVDCTRST 340

1030 1040 1050 1060 1070 1080

GATCGGGCGGGGGTGcCGTCTACACTcGcTCCTGTACCTGGTCGGΪTGTTCCCCTCCGGG

NGTICASTQSPVPGQYDATK 360

1090 1100 1110 1120 1130 1140

GTGGGCCGTTGTTTGTTGTGG^A(TGG5TTGGGTTGGA£TTTTGAA1GΓΓTGCGTTGGGTG

FKQYSRHVEEYDLQFIFQLC 380

1150 l^^O 1170 1180 1190 1120

TCTGTGGCGTTGTCGTCGCATTGTTGCCCCTGGGTCCTCTCCTGTTTGTTCGCCGGTGGG

TITLTADVMSYIHSMNSSIL 400

1210 l^^O 1230 1120 1150 1126

TAG(T\GG(TTG\CΓGGTGTCGGCCCCCCCCCCCGGCTTCGTTTAGCCCCCTCTCGCTCCTC

EDWNGFVPPPPTTSLVDTYR 420

1270 1280 1190 1100 HH 1120

GπCTACGGTCTGπGCTAπACCCCCGGTTTG(G\TGCTGCACCACCTTTTTGCGTCTTC FFQSVAITCYKDTTPAENKD 440

9300 1130 1130 1136 1137 1138

CCCGGCTGTGGCTCTGGTTCTGTT.GTCTTTίTGTGCGGGTίTGGV>,GCGTTcGGCCTACCCG·, PPYKLKFWNVOLKDKFSLDL 460

1390 1400 1140 1142 1143 1144

TTTCGTTTGCCCCGTCTGCTGGGTGCA^T(T(TTCA(TcCT(TTVTTcCGTCGCGGTΐCCCGCC I1QYYLGRKFLVYGTTRRKPT 480

1450 1160 1147 1148 1149 1100

GGTTcCCCTCTCGGGCGHCCTcCCCTCCCTCCTcCTCcCcΠCTGG^CCTCcCGGTccC

1GPRKRSTPSATTSSKPAKR 500

1510 1152

TCCCTCTCTCTCCCCTTTTGTCTT

V RVR A RK* 5d8

FIG. 1B

184 022

Zmiany aminokwasów w białku L1 HPV18

AMINO ACID VARIATIONS IN LI PROTEIN OF HPV18
		AMINO ACID POSITION	IN L1
			Pozycja aminokwasu	w L1
	J50_	88	283	323	338
HPV18 PUBLISHED	P	T	P	V	P
publikowany
HPV18 MERCK	R	N	R	I	R
#354 (CLINICAL INDIANA) dane kliniczne z Indiany	R	N	R	V	R
#556	R	N	R	V	R
#755	-	-	R	V	R
#697	-	-	R	V	R
#795	-	-	R	V	R
#23 (CLINICAL PENNSYLVANIA)	-	-	R	I	R

Dane kliniczne z Pennsylvanii

FIG.2

184 022

20 30 40 50 60

CTGGTCTCATACCCTa(AMCAAW3CCMCGGCnC<CCT(CCCTGCATTATATACCCCA

MVSHRAARRKRASVTDLYKT 20 70 80 90 100 110 120

TGTCACTAATTTGGTCTCTGTCACTTTGCTGTTGTTMTAAGGTAGCGGGCATTATGTTA CKQSGTCPSDVVNKVEGTTL 40

130 11^0 150 160 170 180

GTAiyCTACMTAnGCMTGGTACAKCniGCTATATTTTOCTGGACTTGGCCTCGGT

ADKILOWSSLGIFLGGLGIG 60

190 200 210 220 230 240

CATGGCCGTGGTCCCCGKTCCTAGCGKTAMnAWTTCfiGTGGGCGTTATAATACA

TGSGTGGRTGYIPLGGRSNT 80

200 260 220 280 220 300 gttgtggatgttggttctccacgttctctcgtggttcttccatctgtgggcttcacagac

VVDVGPTRPPVV1EPVGPTD 100

310 320 330 340 330 360

CAATCTATTGrTACCTnCCTTACCAGGATTTACGTGTTGTTCTATTAGGTGTACCTAGGTCi

PSIVTLIEDSSVVTSGAPRP 112

370 380 360 400 410 442

ACTTTTC.CTGGTACGTTTG-GGTTTGCTCTCCTATTTGTTGGTCACATTACACCTGCAGTT TFTGTSGFDITSAGTTTPAV 140

430 440 440 4(30 407 480 nGGATCTCATCCCTTCGTTTACCTTTGTTTCTCTTTTCCTCACCCATTTTACCAATTTT LDITPSSTSVSISTTNFTNP 100

400 500 510 5H 503 504

GTCTTTTCT(ATCGTCAnTnCCAGTTCCACAMCG<CGGAGGTGTTAGGTCCTGTA AFSDPSIIEVPQTGEVSGNV 110

000 560 507 580 500 600

THGTTGGTACCCCTACCTTTC£ACTATCTGGGTCTGAAGCCVCACCTTTCACAACA'TTT FVVTPTSGTHGYEE1PLQTF 200

610 620 603 604 650 660

GCTTTTTTTGgTACGGGGGAGGGACCCCTCTTAGTAGTATTTTATTgTTTCATGTGTGGTGT

ASSSGGFEPISSTPLPTVRR 220

070 680 660 770 710 772 gtagtaggtttttgcttttacagtcgggtctattacccagtgtttgtggctcactttgag

VACGRLYSRAYQQVSVANPE 240

730 740 770 760 7^0 780

TTTCTTACCACGTCCATCCTCTTICTTAATTCTTCACAACCCGGCTITKAGCTTGTGGAC FLTRPSSLITYDNPAFEPVD 260

700 800 810 882 830 804

AATCTAnMTATITCAXXTAGTATMTGrTCCrcn<AWCnTTATG(CCTATTATC TTLTFEPRSNVPDSDFMDI( H0

FIG. 3A

184 022

850 860 870 880 890 900

C6TTTACATAG6CCTGCTTTAACATCCAGGCGTGGTACTGTGCGCTTTAGTAGATTAGGT

RLHRPALTSRRGTVRFSRL 300 910 920 99^0 940 950 960

CAA\GGGAAAClAlGlAAACTTGΓAATGGACTACTVAAAGGGAACACAGGAAACCπAAA QRLTMFTRSGTQIGARVHFY 320

970 980 990 1000 1010 1020

TATGATAAAAGACCAAATATATTTATCTTCACATClCπAAACTACAGCC’TTΓAATCATA

HDISPIAPSPEYIELQPLVS 340

1030 1000 1000 lC^^O 1070 1080

ATCACG(ACAAATCATAGAπGAAAGAAAACACAATAAAAGATAAAAACCTAATAAAGTTA AAEDNGLFDIYADDIDPAMP 360

1090 1100 HH 1020 1030 1M0 ffAAT(^T^CA^^CAAACTACCTCTACAGTA^TAAA^^A^T(A^CW(^TA^^rATCATTA

VVSRPTTSSAVSTYSPTISS 380

1150 1160 1107 1180 1100 1020

ATCACTACCTATAGTCATGTCΛTAAACTTAAAACTTATTATATGGAAAGAATCAAACACT ASSYSNVTVPLTSSWDVPVY 400

1210 102^ 1020 1020 1020 1020

CCGGG1CCAGAAATAACAAAATCCTTAATACTTATAAACAAATTTAATGACATCTTCATA TGPDITLPPTTSVWPIVSPT 420

1270 1280 1090 1030 1330 1330

GTTCCAACCATTACACAGAATAπAAAAACTCAAGTCA^CAπAπCAπAAGATTAπA ACSSTQYIGIHAAHYYLWPL 440

1330 1034 1030 1030 H37 H30

AAATATAAAATlCCWCWΛTGAAMCGTGAAATTCAπ3TAAAACAA\TAGCTAAGiA YYFIPKKLKLVPYFFADGFV 4(50

GCGGCCTAG

A A * 463

FIG. 3B

184 022

Ss
c e oj •r>		CM
	_J
□		+
a> >	U	Zj
OO	oo
*-	I
o σ»	>
α>	O-	o.
c		□Ξ

CM +

OO

I

97*69*46*30*-

► ►

•t

FIG.4

FIG.5

184 022

FIG.6

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 1.
2. 2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze jest DNA.
3. 3. Wektor obejmujący kwas nukleinowy kodujący sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 1.
4. 4. Komórka zawierająca wektor, obejmujący kwas nukleinowy kodujący sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 1.
5. 5. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 3.
6. 6. Kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że jest DNA.
7. 7. Wektor obejmujący kwas nukleinowy kodujący sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 3.
8. 8. Komórka zawierająca wektor, obejmujący kwas nukleinowy kodujący sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 3.
9. 9. Sposób wyrażania białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18 w komórce gospodarza, znamienny tym, że obejmuje:

   a) transformowanie komórki gospodarza wektorem obejmującym kwas nukleinowy kodujący sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig 1 albo 3;

   b) hodowanie komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję białka z wektora.

   Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego kwasu nukleinowego kodującego białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18, wektora obejmującego ten kwas nukleinowy oraz sposobu wyrażania białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18 w komórce gospodarza przy użyciu tego wektora.

   Figura 1 pokazuje sekwencję nukleotydową L1 HPV18 i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową.

   Figura 2 pokazuje listę zmian aminokwasów w białku L1 HPV18.

   Figura 3 pokazuje sekwencję nukleotydową L2 HPV18 i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową.

   Figura 4 pokazuje badanie metodą immunoblot białka L1 HPV18 ekspresjonowanego w drożdżach.

   Figura 5 pokazuje badanie metodą immunoblot białka L2 HPV18 ekspresjonowanego w drożdżach.

   Figura 6 pokazuje fotografię z mikroskopu elektronowego cząsteczek wiroidalnych utworzonych z białka L1 HPV18 ekspresjonowanego w drożdżach.

   Zakażenia wirusem brodawczaków następują u różnych zwierząt, w tym u ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i bydła. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonka, ogólnie, wywołując łagodne guzy nabłonkowe albo włóknistonabłonkowe w miejscu zakazenia. Wirusy brodawczaków stanowią gatunkowo swoisty czynnik zakaźny: ludzkie wirusy brodawczaków nie zakażają zwierząt nie będących ludźmi.

   184 022

   Wirusy brodawczaków mogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakazają. Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) są dalej dzielone na ponad 70 rodzajów, w oparciu o homologię sekwencji DNA. Rodzaje wirusa brodawczaków wydają się być immunogenami swoistymi dla rodzaju, i odporność neutralizującą jeden rodzaj wirusa brodawczaków nie zapewnia odporności w stosunku do innego rodzaju wirusa brodawczaków.

   U ludzi, różne rodzaje HPV powodują różne choroby. HPV typów 1, 2, 3, 4, 7, 10 i 2629 powodują łagodne brodawki u osobników zarówno normalnych jak i poddanych immunosupresji. HPV typów 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 i 46-50 powodują płytkie owrzodzenia u osobników poddanych immunosupresji. HPV typów 6, 11, 34, 39, 41-44 i 51-55 powodują niezłośliwe kłykciny na śluzówce narządów płciowych i układu oddechowego. HPV typów 16 i 18 powodują dysplazję nabłonkową na śluzówce narządów płciowych i są związane z większością raków - in situ i inwazyjnych szyjki macicy, pochwy, sromu i kanału odbytu.

   Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozaedralnymi wirusami DNA, kodującymi ponad osiem genów wczesnych i dwa późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od E1 do E7 i L1 oraz L2, gdzie „E” oznacza wczesny, zaś „L” oznacza późny L1 i L2 kodują białka kapsy du wirusa. Geny wczesne (E) związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa.

   Białko L1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym 55-60 kDa. Białko L2 jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym 5560 kDa i prawdopodobnym ciężarze cząsteczkowym 75-100 kDa, co stwierdzono przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Dane immunologiczne wskazują, że większość białka L2 stanowi wnętrze białka L1 w kapsomerze wirusa. ORF L1 jest silnie zakonserwowana wśród różnych wirusów brodawczaków. Białka L2 są mniej zakonserwowane wśród różnych wirusów brodawczaków.

   Stwierdzono, że geny L1 i L2 są dobrymi celami immunoprofilaktycznymi. Badania na wirusie brodawczaków królików amerykańskich (CRPV) i bydlęcych (BPV) pokazały, że immunizacja białkami L1 i L2 ekspresjonowanymi w bakteriach albo przy użyciu wektorów krowianki chronią zwierzęta przed zakażeniem wirusowym. Ekspresja genów Ll wirusa brodawczaków w układach ekspresyjnych bakulowirusa albo przy użyciu wektorów krowianki powodowała łączenie się cząstek wiroidalnych (VLP), które zastosowano do wywołania wysokich mian przeciwciał neutralizujących wirusa, co korelowało z ochroną podczas ekspozycji na wirusa.

   Po HPV typu 16, HPV18 jest najczęstszym typem HPV spotykanym w rakach szyjki macicy. HPV18 wykryto w 5-20% biopsji raka szyjki macicy zebranych z różnych części świata (Ikenberg, H., 1990, Human papilomavirus DNA in invasive genital carcinomas, w „Genital Papilomavirus Infections”, wyd. G. Gross i in., str. 85-112). Wydaje się, że istnieje zależność geograficzna zakażeń HPV18, ponieważ biopsje nowotworów kobiet afrykańskich i południowoamerykańskich zawierają HPV18 znacznie częściej niż podobne biopsje kobiet europejskich i północnoamerykańskich. Nie są znane przyczyny tych różnic geograficznych. Opracowanie szczepionki przeciwko HPV18 staje się niezwykle ważne ponieważ HPV18 jest często związany z agresywnie rosnącymi rakami i rzadko jest spotykany w zmianach łagodnych, CIN I-Ii.

   Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego kwasu nukleinowego kodującego białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18, wektora obejmującego ten kwas nukleinowy oraz sposobu wyrażania białka ludzkiego wirusa brodawczaków typu 18 w komórce gospodarza przy użyciu tego wektora.