SK284281B6 - Vírusom podobné častice, spôsob ich výroby, izolované a purifikované HPV 18 L1 a L2 DNA a farmaceutické prostriedky s ich obsahom - Google Patents
Vírusom podobné častice, spôsob ich výroby, izolované a purifikované HPV 18 L1 a L2 DNA a farmaceutické prostriedky s ich obsahom Download PDFInfo
- Publication number
- SK284281B6 SK284281B6 SK1278-97A SK127897A SK284281B6 SK 284281 B6 SK284281 B6 SK 284281B6 SK 127897 A SK127897 A SK 127897A SK 284281 B6 SK284281 B6 SK 284281B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hpv
- protein
- dna
- recombinant
- dna molecule
- Prior art date
Links
- 241000341657 Human papillomavirus type 18 Species 0.000 title claims abstract 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 39
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 101000803413 Human papillomavirus type 18 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 241000388169 Alphapapillomavirus 7 Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 157
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 39
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 8
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101150101314 PRB1 gene Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 3
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101100351811 Caenorhabditis elegans pgal-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 101100114742 Homo sapiens CPVL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100484716 Homo sapiens VHLL gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 201000007696 anal canal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- -1 elixirs Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150018420 kbp gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Sú opísané vírusom podobné častice pozostávajúce z rekombinantného L1 proteínu alebo rekombinantných L1 + L2 proteínov ľudského papilomavírusu 18, ktoré sú najmenej na 60 % čisté, pričom L1 proteín je znázornený na obrázku 1 a L2 proteín je znázornený na obrázku 3. Vynález opisuje aj spôsob výroby týchto vírusom podobných častíc, vakcíny a farmaceutické prostriedky s ich obsahom. Predmetom vynálezu je taktiež izolovaná a purifikovaná HPV18 L2 DNA molekula znázornená na obrázku 3.ŕ
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka vírusom podobných častíc pozostávajúcich z rekombinantného L1 proteínu alebo rekombinantných L1 + L2 proteínov ľudského papilomavírusu 18.
Doterajší stav techniky
Infekcie papilomavírusmi (PV) sa vyskytujú u rôznych živočíchov vrátane človeka, ovce, psa, mačky, králika, opíc, hadov a kráv. Papilomavírusy infikujú bunky epitelu a na mieste infekcie obvykle indukujú nezhubné epitelové alebo fibroepitelové nádory. Papilomavírusy sú druhovo špecifické infekčné faktory; ľudský papilomavírus neinfikuje iné živočíšne druhy.
Papilomavírusy možno podľa hostiteľa, ktorého infikujú, rozdeliť do samostatných skupín. Ľudské papilomavírusy (HPV) sa ďalej delia na viac ako 70 typov podľa homológie v sekvencií DNA. Zdá sa, že PV typy sú typovo špecifické imunogény, a to v tom zmysle, že neutralizačná imunita proti infekcii jedným typom papilomavírusu nevyvoláva imunitu proti inému typu papilomavírusu.
U človeka rôzne HPV typy vyvolávajú rôzne choroby. HPV typ 1,2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobujú nezhubné bradavice tak u normálnych jedincov, ako aj u osôb s oslabeným imunitným systémom. HPV typ 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 - 25, 36 a 46 - 50 spôsobujú u osôb s oslabeným imunitným systémom ploché lézie. HPV typ 6, 11, 34, 39, 41 - 44 a 51 až 55 spôsobujú nezhubné kondylómy sliznice pohlavných alebo dýchacích orgánov. HPV typ 16 a 18 spôsobujú epitelovú dyspláziu sliznice pohlavných orgánov a spájajú sa s väčšinou in situ a invazívnych karcinómov krčka maternice, pošvy, vonkajších ženských pohlavných orgánov a análneho kanálu.
Papilomavírusy sú malé (50 až 60 nm) bezobalované ikozahedrické DNA vírusy, ktoré kódujú až osem skorých a dva neskoré gény. Otvorené čítacie rámce (ORF) genómov vírusu sú označené EI až E7 a L1 a L2, kde „E“ označuje skoré a „L“ označuje neskoré. L1 a L2 kódujú vírusové kapsidové proteíny. Skoré (E) gény sú asociované s funkciami, ako je napríklad replikácia vírusu a bunková transformácia.
Proteín L1 je hlavný kapsidový proteín a má molekulovú hmotnosť 55 až 60 kDa. Proteín L2 je vedľajší kapsidový proteín, ktorého zdanlivá molekulová hmotnosť bola 55 až 60 kDa a zrejmá molekulová hmotnosť bola 75 až 100 kDa, ako to bolo stanovené polyakrylamidovou gélovou elektroforézou. Imunologické údaje naznačujú, že väčšina L2 proteínu je vnútri L1 proteínu v rámci kapsoméru vírusu. L1 ORF je vysoko konzervovaný medzi rôznymi typmi papilomavirusov. Proteíny L2 sú medzi rôznymi papilomavírusmi menej konzervované.
Zistilo sa,žc gény L1 a L2 sú dobrým cieľom pre imunoprofylaxiu. Štúdie v systémoch papilomavírusu amerických králikov (CRPV) a hovädzieho papilomavírusu (BPV) ukázali, že imunizácie proteínmi L1 a L2 exprimovanými v baktériách alebo pomocou vakcínových vektorov ochránili zvieratá pred vírusovou infekciou. Expresia L1 génov papilomavirusu v expresných bakulovírusových systémoch alebo pomocou vakcínových vektorov viedli ku skompletizovaniu vírusom podobných partikúl (VLP), ktoré boli použité na indukovanie protilátkovej odpovede neutralizujúcej vírusy vo vysokých titroch, ktoré korelujú s ochranou pred vírusovou infekciou.
Po HPV typ 16, je HPV typ 18 druhým najčastejším typom HPV vyskytujúcim sa v karcinómoch krčka maternice. HPV 18 bol zistený pri 5 - 20 % biopsiách cervikálnych nádorov pochádzajúcich z rôznych častí sveta (Ikenberg, H. 1990. Human papillomavirus DNA in invasive genital carcinomas. In Genital Papillomavirus Infections, G. Gross et al., eds. p. 85 - 112). Zdá sa, že existuje geografická závislosť infekcie s HPV 18, pretože v biopsiách nádorov u žien z Afriky a Južnej Ameriky sa HPV 18 vyskytoval častejšie ako v podobných biopsiách u žien z Európy a Severnej Ameriky. Dôvody pre tieto geografické rozdiely nie sú známe. Príprava vakcíny proti infekcii vyvolanej vírusom HPV 18 sa stáva mimoriadne dôležitou, pretože HPV 18 je spojený aj s agresívnejšie rastúcimi nádormi a zriedkakedy sa vyskytuje v miernejších prekurzorových léziách, CIN I-II.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka vírusom podobných častíc pozostávajúcich z rekombinantného L1 proteínu alebo rekombinantných L1 + L2 proteínov ľudského papilomavírusu 18, ktoré sú najmenej na 60 % čisté, pričom L1 proteín je znázornený na obrázku 1 a L2 proteín je znázornený na obrázku 3. Vynález opisuje aj spôsob výroby týchto vírusom podobných častíc, vakcíny a farmaceutické prostriedky s ich obsahom. Predmetom vynálezu je taktiež izolovaná a purifikovaná HPV 18 L1 DNA molekula znázornená na obrázku 1, ako aj HPV 18 L2 DNA molekula znázornená na obrázku 3.
Farmaceutický užitočné zmesi obsahujúce DNA alebo proteíny kódované touto DNA možno pripraviť podľa známych spôsobov, ako je napríklad primiešanie farmaceutický prijateľného nosiča. Príklady takýchto nosičov a spôsobov prípravy sú uvedené v Remington’s Pharmaceutical Sciences. Aby sa pripravila farmaceutický prijateľná zmes vhodná na účinné podávanie, takéto zmesi musia obsahovať účinné množstvo DNA alebo proteínu alebo VLP. Takéto zmesi môžu obsahovať DNA alebo proteíny alebo VLP odvodené z viac ako jedného typu HPV.
Terapeutické alebo diagnostické zmesi podľa vynálezu sa podávajú v množstvách, ktoré sú dostatočné na liečbu alebo diagnostikovanie infekcií papilomavírusmi (PV). Účinné množstvo môže byť rôzne, a to podľa množstva faktorov, ako je napríklad stav pacienta, jeho hmotnosť, pohlavie a vek. Iným faktorom jc spôsob podania. Vo všeobecnosti, zmesi sa podávajú v dávkach pohybujúcich sa približne medzi 1 pg a 1 mg.
Farmaceutické zmesi sa môžu podávať viacerými spôsobmi, ako je napríklad podanie podkožné, miestne, ústne, sliznicové, vnútrožilové a vnútrosvalové.
Vakcíny podľa vynálezu obsahujú DNA, RNA alebo proteíny kódované touto DNA, ktoré obsahujú antigénne determinanty potrebné na indukovanie tvorby neutralizačných protilátok u hostiteľa. Takéto vakcíny sú tiež dostatočne bezpečné na podávanie bez rizika klinickej infekcie; nemajú toxické vedľajšie účinky; možno ich podávať účinným spôsobom; sú stabilné; a sú zlúčiteľné s vakcínovými nosičmi.
Vakcíny možno podávať rôznymi spôsobmi, ako je spôsob ústny, parenterálny, podkožný, sliznicový, vnútrožilový alebo vnútrosvalový. Podávaná dávka môže byť rôzna v závislosti od stavu, pohlavia, hmotnosti a veku pacienta; od spôsobu podania; a od typu papilomavírusu vo vakcíne. Vakcína môže byť použitá v dávkových formách, ako sú napríklad kapsuly, suspenzie, elixíry, alebo roztoky kvapalín. Vakcína môže byť pripravená s imunologický prijateľným nosičom.
Vakcíny sa podávajú v terapeuticky účinných množstvách, t. j. v množstvách, ktoré sú dostatočné na vyvolanie imunologický ochrannej odpovede. Terapeuticky účinné množstvo môže byť rôzne, podľa typu papilomavírusu. Vakcína sa môže podávať ako jedna dávka alebo ako viacnásobné dávky.
DNA a deriváty DNA podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť pri príprave imunogénnych zmesí. Takéto zmesi, ak sa zavedú do vhodného hostiteľa, sú schopné v ňom indukovať imunitnú odpoveď.
DNA a deriváty DNA podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť pri serotypizácii infekcie HPV a HPV skríningu. DNA, rekombinované proteíny, VLP a protilátky sa dajú použiť pri zostavovaní súprav vhodných na detekciu a serotypizáciu HPV. Takáto súprava by obsahovala rozškatuľkovaný nosič vhodný na pevné udržanie aspoň jednej nádobky. Nosič by ďalej obsahoval reagencie, ako je napríklad HPV 18 DNA, rekombinovaný HPV proteín alebo VLP alebo anti-HPV protilátky vhodné na zisťovanie množstva HPV typov. Nosič môže obsahovať aj prostriedok na zisťovanie napríklad značeného antigénu alebo enzýmových substrátov a podobne.
DNA a od nej odvodené proteíny sú užitočné aj ako markery molekulovej hmotnosti a veľkosti molekúl.
Pretože genetický kód je degenerovaný, na kódovanie jednotlivých aminokyselín možno použiť viac ako jeden kodón, a preto sekvencia aminokyselín môže byť kódovaná ktorýmkoľvek zo skupiny podobných DNA oligonukleotidov. Iba jeden člen skupiny bude totožný so sekvenciou HPV 18, ale bude schopný hybridizovať za vhodných podmienok s HPV 18 DNA dokonca aj v prítomnosti chybných DNA oligonukleotidov. Za zmenených podmienok chybné DNA oligonukleotidy môžu ešte stále hybridizovať s HPV 18 DNA, aby sa umožnilo identifikovanie a izolovanie DNA kódujúcej HPV18.
Izolovanú HPV 18 DNA podľa predkladaného vynálezu alebo jej fragmenty možno preto použiť na odizolovanie homológov a fragmentov HPV 18 z iných zdrojov. Aby sa toto dalo urobiť, prvá HPV 18 DNA sa môže zmiešať so vzorkou obsahujúcou DNA kódujúcou homológy HPV 18 za vhodných hybridizačných podmienok. Hybridizovaný DNA komplex sa môže vyizolovať a DNA kódujúca homologickú DNA sa môže z neho purifikovať.
Na molekulárne klonovanie DNA HPV 18 sa môže použiť viacero spôsobov. Tieto spôsoby zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na priame funkčné exprimovanie génov HPV 18 po zostavení knižnice cDNA alebo genómovej DNA obsahujúcej HPV 18 vo vhodnom expresnom vektorovom systéme. Iným spôsobom je skríning cDNA knižnice alebo genómovej DNA knižnice obsahujúcu HPV 18, skonštruovanú v bakteriofágovom alebo v plazmidovom striedavom vektore, so značeným oligonuklcotidovým primcrom navrhnutým pre aminokyselinovú sekvenciu vírusu HPV 18. Ďalší spôsob pozostáva zo skrínovania cDNA knižnice alebo genómovej DNA knižnice obsahujúcu HPV 18, skonštruovanú v bakteriofágovom alebo v plazmidovom striedavom vektore, s parciálnou DNA kódujúcou HPV 18. Táto parciálna DNA sa získava amplifikáciou, prostredníctvom špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), fragmentov HPV 18 DNA prostredníctvom návrhu degenerovaných oligonukleotidových prímerov z aminokyselinovej sekvencie purifikovaného HPV 18. Ďalším spôsobom je izolácia RNA z buniek produkujúcich HPV 18 a translácia RNA do proteínu pomocou translačného systému in vitro alebo in vivo. Výsledkom translácie
RNA do peptidu alebo proteínu je produkcia aspoň časti HPV 18 proteínu, ktorý sa dá identifikovať napríklad aktivitou HPV 18 proteínu alebo imunologickou reaktivitou s anti-HPV 18 protilátkou. V tomto spôsobe zásoby RNA izolovaných z buniek produkujúcich HPV 18 možno analyzovať na prítomnosť RNA, ktorá kóduje aspoň časť HPV 18. Ďalšie frakcionovanie zásoby RNA sa môže uskutočniť na purifikovanie HPV 18 RNA z RNA inej než HPV 18. Peptid alebo proteín produkovaný týmto spôsobom možno analyzovať, čím sa získajú aminokyselinové sekvencie, ktoré sa zase použijú ako priméry na prípravu HPV 18 cDNA, alebo RNA použitá na transláciu sa môže analyzovať s cieľom získať sekvencie nukleotidov kódujúce HPV 18 a pripraviť prímery na skrínovanie cDNA knižnice HPV 18. Tieto spôsoby sú v tejto problematike známe a sú opísané napríklad v publikácii Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Je zrejmé, že iné typy knižníc, ako aj knižnice zostavené z iných buniek alebo bunkových typov, môžu byť užitočné na izolovanie DNA kódujúcej HPV 18. Iné typy knižníc zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na cDNA knižnice odvodené z iných buniek alebo bunkových línií obsahujúcich knižnice vírusu HPV typ 18 a genómovej DNA.
Príprava cDNA knižníc sa môže urobiť viacerými spôsobmi. Spôsoby na zostavovanie cDNA knižníc sú opísané v publikácii Sambrook, J., et al., uvedené dielo. Je zrejmé, že DNA kódujúcu HPV 18 možno izolovať z vhodnej genómovej DNA knižnice. Zostavenie genómových DNA knižníc sa môže urobiť viacerými spôsobmi. Spôsoby zostavovania genómových DNA knižníc sú opísané v publikácii Sambrook, J., et al., uvedené dielo.
Klonovaná HPV 18 DNA alebo jej fragmenty získané tu opísanými spôsobmi môžu byť rekombinantne exprimované molekulárnym klonovaním do expresného vektora obsahujúceho vhodný promótor a iné vhodné transkripčné regulačné prvky, a môžu sa preniesť do prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, aby produkovali rekombinovaný HPV 18. Spôsoby takýchto manipulácií sú do detailov opísané v publikácii Sambrook, J., et al., uvedené dielo, a sú v tejto problematike dobre známe.
Expresné vektory sú tu definované ako sekvencie DNA, ktoré sú potrebné na transkripciu klonovaných kópií génov a na transláciu ich mRNA vo vhodnom hostiteľovi. Takéto vektory môžu byť použité na expresiu eukaryotických génov v rôznych hostiteľoch, ako sú napríklad baktérie, modrozelené riasy, rastlinné bunky, hmyzie bunky, bunky plesní a zvieracie bunky. Špecificky zostrojené vektory umožňujú striedanie DNA medzi hostiteľmi, ako sú napríklad baktérie-kvasinky alebo baktérie-zvieracie bunky alebo baktérie-plesne alebo baktérie-bunky bezstavovcov. Vhodne zostavený expresný vektor by mal obsahovať: počiatok replikácie na autonómnu replikáciu v hostiteľských bunkách, selektovateľné markery, obmedzený počet užitočných miest pre reštrikčné enzýmy, potenciál pre vysoký počet kópií, a aktívne promótory. Promótor je definovaný ako sekvencia DNA, ktorá riadi RNA polymerázu, aby sa naviazala na DNA a iniciovala syntézu RNA. Silný promótor je taký, ktorý spôsobuje, aby sa mRNA iniciovali s vysokou frekvenciou. Expresné vektory môžu zahrnovať, no nie sú obmedzené iba na klonovacie vektory, modifikované klonovacie vektory, špecificky zostavené plazmidy alebo vírusy.
Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v cicavčích bunkách možno použiť rôzne cicavčie expresné vektory. Komerčne dostupné cicavčie expresné vektory, ktoré môžu byť vhodné na rekombinovanú expresiu HPV 18, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) a Ž.ZD35 (ATCC 37565).
Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v bakteriálnych bunkách možno použiť rôzne bakteriálne expresné vektory. Komerčne dostupné bakteriálne expresné vektory, ktoré môžu byť na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pETlla (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v bunkách plesní možno použiť rôzne plesňové expresné vektory. Komerčne dostupné plesňové expresné vektory, ktoré môžu byť na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pYES2 (Invitrogen), expresný vektor Pichia (Invitrogen), a expresný vektor Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Nemecko).
Na expresiu HPV 18 DNA alebo jej fragmentov v bunkách hmyzích buniek možno použiť rôzne hmyzie expresné vektory. Komerčne dostupné hmyzie expresné vektory, ktoré môžu byť na tento účel vhodné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na pBlue Bac III (Invitrogen) a pAcUW51 (PharMingen, Inc.).
Expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu HPV 18 alebo jej fragmenty môže byť použitý na expresiu proteínov HPV 18 alebo fragmentov HPV 18 proteínov v bunke, tkanivách, orgánoch, alebo živočíchoch (vrátane ľudí). Hostiteľské bunky môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické, zahŕňajúce, no neobmedzujúc sa iba na baktérie, ako je napríklad E. coli, plesňové bunky, ako sú napríklad kvasinky, cicavčie bunky zahŕňajúce, no neobmedzujúce sa iba na bunkové línie ľudského, hovädzieho, prasacieho, opičieho a hlodavčieho pôvodu, a hmyzie bunky zahŕňajúce, no neobmedzujúce sa iba na bunkové línie odvodené z octomilky a z priadky morušovej. Bunkové línie odvodené z cicavčích buniek, ktoré môžu byť vhodné, a ktoré sú komerčne dostupné, zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na L bunky L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), L bunky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171).
Expresný vektor môže byť do hostiteľských buniek zavedený ktorýmkoľvek z množstva spôsobov, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na transformáciu, transfekciu, lipofekciu, fúziu protoplastov a elektroporáciu. Bunky obsahujúce expresný vektor sa rozklonujú a jednotlivo sa analyzujú, či produkujú proteín HPV 18. Identifikácia klonov hostiteľských buniek exprimujúcich HPV 18 sa môže uskutočniť niekoľkými spôsobmi, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na imunologickú reaktivitu s anti-HPV 18 protilátkami, a prítomnosť HPV 18 aktivity asociovanú s hostiteľskými bunkami, ako je napríklad väzba HPV 18-špecifického ligandu alebo signálna transdukcia definovaná ako odpoveď sprostredkovaná interakciou HPV 18-špecifických ligandov s exprimovanými HPV 18 proteínmi.
Expresia HPV DNA fragmentov sa môže tiež uskutočniť in vitro vytvorenou syntetickou mRNA alebo natívnou mRNA. Syntetická mRNA alebo mRNA izolovaná z buniek produkujúcich HPV 18 môže byť účinne translatovaná v rôznych bezbunkových systémoch, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na extrakty z pšeničných klíčkov a na extrakty z retikulocytov, a môžu byť účinné translatované aj v bunkových systémoch, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na mikroinjekcie do žabích oocytov, pričom mikroinjekcie do žabích oocytov sú výhodné.
Po expresii HPV 18 proteínu (proteínov) v hostiteľskej bunke, HPB 18 proteín sa môže získať s cieľom dostať HPV 18 v čistenej podobe. K dispozícii je niekoľko vhodných purifikačných postupov. Ako je to tu opísané, rekombinovaný HPV 18 proteín môže byť čistený z bunkových lyzátov a extraktov rôznymi kombináciami alebo samostatným použitím soľnej frakcionalizácie, ionexovej chromatografie, exklúznej chromatografie, hydroxylapatitovej adsorpčnej chromatografie a hydrofóbnej interakčnej chromatografie.
Okrem toho, rekombinovaný HPV 18 možno od iných bunkových proteínov odseparovať imunoafinitnou kolónou pripravenou s monoklonálnymi alebo polyklonálnymi protilátkami špecifickými pre vznikajúci HPV 18, alebo pre polypeptidové fragmenty HPV 18.
Možno pripraviť súpravy obsahujúce HPV 18 DNA, fragmenty HPV 18 DNA, protilátky proti HPV 18 DNA alebo proti HPV 18 proteínu, HPV 18 RNA alebo HPV 18 proteín. Takéto súpravy sa používajú na zisťovanie DNA, ktorá hybridizuje s HPV 18 DNA, alebo na zisťovanie prítomnosti HPV 18 proteínu (proteínov) alebo peptidových fragmentov vo vzorke. Taká charakterizácia je užitočná na rôzne účely, ktoré zahŕňajú, no neobmedzujú sa iba na súdne analýzy a epidemiologické štúdie.
V prípade kombinovanej liečby s viac ako jedným aktívnou látkou, kde aktívne látky sú v rôznych dávkových zloženiach, aktívne látky možno podávať súbežne, alebo každá z nich môže byť podaná v oddelenom čase.
Dávkový režim využívajúci zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je volený v súlade s množstvom faktorov, ako sú typ, druh, vek, hmotnosť, pohlavie a medicínsky stav pacienta; závažnosť stavu, ktorý sa má liečiť; spôsob podania; obličkové a pečeňové funkcie pacienta; a daná zlúčenina, ktorá sa má použiť. Lekár s bežnými skúsenosťami môže ľahko určiť a predpísať účinné množstvo liečiva požadovaného na prevenciu, spomalenie alebo zastavenie progresie tohto stavu. Optimálna presnosť pri dosahovaní koncentrácií liečiva v rámci rozpätia, ktoré je účinné bez toxicity, vyžaduje režim založený na kinetike dostupnosti liečiva na cieľových miestach. Toto zahŕňa aj zváženie distribúcie, rovnováhy a vylučovania liečiva.
Nasledujúce príklady ilustrujú predložený vynález, ale bez jeho akéhokoľvek obmedzovania.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je nukleotidová sekvencia a od nej odvodená aminokyselinová sekvencia proteínu Ll vírusu HPV 18.
Na obr. 2 je zoznam aminokyselinových variantov v rámci proteínu Ll vírusu HPV 18.
Na obr. 3 je nukleotidová sekvencia a od nej odvodená aminokyselinová sekvencia proteínu L2 vírusu HPV 18.
Na obr. 4 je imunoblot proteínu Ll vírusu HPV 18 exprimovaného v kvasinkách.
Na obr. 5 je imunoblot proteínu L2 vírusu HPV 18 exprimovaného v kvasinkách.
Na obr. 6 je mikrofotografia z elektrónového mikroskopu ukazujúca vírusom podobné partikuly vytvorené proteínom Ll vírusu HPV 18 exprimovanom v kvasinkách.
SK 284281 Β6
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie genómu HPV 18
Celková genómová DNA bola pripravená z bunkovej línie odvodenej z ľudského karcinómu krčka maternice, SW756 (Freedman, R. S., et al.. 1982, In vitro, 18: 719 726) s použitím štandardných postupov. DNA bola poštiepená enzýmom EcoRI a podrobila sa elektroforéze cez 0,8 % agarózový preparatívny gél s nízkou teplotou topenia. Vyrezal sa prúžok gélu, ktorý zodpovedal fragmentom DNA s dĺžkou približne 12 kbp. Agaróza bola poštiepená enzýmom Agarase™ (Boehringer Mannheim, Inc.) a DNA fŕakcionovaná podľa veľkosti bola precipitovaná, defosforylovaná a pospájaná s ramenami lambda EMBL4 poštiepenými enzýmom EcoRI (Stratagene, Inc.). Lambda knižnica bola zbalená baliacim extraktom Gigapack II Gold (Stratagene, Inc.). HPV 18 pozitívne klony boli zisťované pomocou HPV 18 Ll DNA priméru s dĺžkou 700 bp, ktorý bol generovaný polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím SW756 DNA ako templátu a oligonukleotidových printerov, ktoré boli zostavené na základe publikovanej sekvencie HPV 18 Ll DNA (Cóle a Danos, 1987, J. Mol. Biol., 193: 599 - 608, Genbank, položka číslo #X05015). Izoloval sa HPV 18 pozitívny lambda kloň, ktorý obsahoval EcoRI fragment dlhý 12 kbp a bol označený #187 -1.
Príklad 2
Zostavenie kvasinkových expresných vektorov
Otvorený čítací rámec (ORF) HPV 18 Ll bol amplifikovaný pomocou PCR použitím klonu #187-1 ako templátu, Vent polymerázy™ (New England Biolabs, Inc.), 10 cyklov amplifikácie (94 °C, 1 min.; 50 °C, 1 min.; 72 °C, 2 min.) a nasledovných oligonukleotidových primerov, ktoré obsahujú priľahlé BglII miesta (podčiarknuté): sense primér, 5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3’, antisense primér, 5’-GAAGATClTľACTTCCTGGCACGTACACGCACACGC-3’.
Sense primér zavádza kvasinkovú netranslatovanú leader sekvenciu (Kniskem, et al., 1986, Gene, 46: 135 - 141) ihneď smerom k HPV 18 Ll iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené polotučné). 1,5 kbp Ll PCE produkt bol poštiepený enzýmom BglII a čistený na géli.
Kvasinkový expresný vektor pGALl-10 bol zostavený izoláciou 1,4 kbp Sphl fragmentu z pUC18/obojsmemého promótorového plazmidu GAL, ktorý obsahuje divergentné promótory GAL1-GAL10 kvasinky Saccharomyces cerevisiae z plazmidu pBM272 (získaný od Marka Johnstona, Washington University, St. Louis, MO). Divergentné promótory susedia na každej strane s kópiou kvasinkového terminátora transkripcie ADH1, s klonovacím miestom BamHI umiestneným medzi GALI promótorom a prvou kópiou terminátora transkripcie ADH1 a s klonovacím miestom Smal umiestneným medzi promótorom GAL 10 a druhou kópiou terminátora transkripcie ADHI. Kvasinkový striedavý vektor pozostávajúci z pBR322, kvasinkového LEU2d génu, a z kvasinkového 2μ plazmidu (dar od Benjamína Halia, University of Washington, Seattle, WA) bol poštiepený enzýmom Sphl a spojený s 1,4 kbp Sphl divergentným GAL promótorovým fragmentom, z čoho vznikol pGALl-10. pGALl-10 bol linearizovaný enzýmom BamHI, ktorý štiepi medzi promótorom GALI a terminátorom transkripcie ADHI. Vektor poštiepený enzýmom BamHI a HPV 18 Ll PCR fragment poštiepený enzýmom BglII boli spojené a použité na transformáciu E. coli DH5 buniek (Gibco BRL, Inc.). Vyizoloval sa plazmid pGALl-10, ktorý obsahuje gén HPV 18 Ll a bol označený pl 91-6.
Zostavil sa kvasinkový expresný vektor, ktorý exprimuje spolu gén HPV 18 Ll a L2. Plazmid pl91-6 (pGALl10 + HPV 18 Ll) bol poštiepený enzýmom Smal, ktorý štiepi medzi promótorom GALI0 a terminátorom transkripcie ADHI. Gén 1,4 kbp HPV 18 L2 bol amplifikovaný pomocou PCR, ako to bolo opísané s použitím nasledovných oligonukleotidových primerov, ktoré obsahujú priľahlé Smal miesta (podčiarknuté): sense primér, 5’-TCCCCCGGGCAC.N\AACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3’, antisense primér, 5’-TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3’.
Sense primér zavádza kvasinkovú netranslatovanú leader sekvenciu (Kniskem et al., 1986, citovaná práca) ihneď smerom k HPV 18 L2 iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené polotučné). PCR fragment bol poštiepený enzýmom Smal, čistený na géli a spojený s plazmidom pl 91-6, ktorý sa poštiepil enzýmom Smal. Vyizoloval sa plazmid pGALl-10 obsahujúci oba gény, HPV 18 Ll a L2, a bol označený p 19511.
Príklad 3
Typizácia klinických vzoriek
Bioptické vzorky z krčka maternice sa získali vo Veterans Administration Medical Center v Indianapolise, IN (Dr. Darron Brown) a v Albert Einstein Medical Center vo Philadelphii, PA (Dr. Joan Adler) a zmrazili sa na -20 °C. DNA bola izolovaná, ako to bolo opísané autormi Brown et al., 1993 (Brown, D. et al., 1993, J. Clin. Microbiol., 31: 2667 - 2673). V stručnosti, klinické vzorky sa spracovali pomocou mikrodismembrátora II firmy Braun (B. Braun Instraments, Melsungen, Nemecko) a solubilizovali sa v tlmivom roztoku obsahujúcom 10 mM EDTA a 0,6 % (hmotnosť/objem) dodecylsulfátu sodného (SDS). Vzorky sa nastavili na 20 mM Tris pH 7,4 a proteíny sa poštiepili pomocou 50 pg/ml proteinázy K v prítomnosti 0,1 pg/ml RNázy A a potom sa extrahovali zmesou fenol/chloroform/izoamylalkohol. DNA sa precipitovala etanolom a kvantifikovala sa spektrofotometricky.
Vzorky DNA sa skrínovali na prítomnosť HPV 18 pomocou PCR a analýzou Southem blote. 256 bp segment HPV 18 Ll ORF sa amplifikoval pomocou PCR s použitím nasledovných oligonukleotidových primerov: sense primér, ’-CAATCCTTATATATTAAAGGCAC AGGTATG-3 ’, antisense primér, ’-CATCATATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTG-3 ’.
PCR podmienky boli v súlade s odporúčaniami výrobcu pre súpravu AmpliTaq™ DNA Polymerase/GeneAmp™ (výrobca Perkin Elmer Corp.) s výnimkou, že ako templát sa použilo 0,5 μΐ klinickej vzorky DNA a v konečnej reakčnej zmesi bolo 10 pmol z každého priméru, 2 mM dNTPs a 2,0 mM MgCl2. Denaturovalo sa 2 min. pri 94 °C, potom nasledovalo 40 cyklov amplifikácie (94 °C, 1 min.; 45 °C, 1 min.; 72 °C, 1 min.).
PCR produkty boli podrobené elektroforéze cez 3,0 % agarózový gél, naniesli sa na nylonové membrány a hybridizovali sa s HPV 18 Ll-špecifickým oligonukleotidovým primerom značeným s 32P.
Príklad 4
Sekvenovanie DNA génov Ll a L2
Gény HPV 18 Ll a L2 v klonoch #187-1, pl91-6 a pl95-11 sa sekvenovali sekvenovacou súpravou PRIZM a auto matickým sekvenovacím zariadením na DNA ABI Sequencer #373A (Applied Biosystems). Na získanie súhlasnej HPV 18 sekvencie sa časti DNA génu Ll amplifíkovali pomocou PCR z ľudských klinických izolátov, sekvenovali sa a porovnali sa s deklarovanými a publikovanými sekvenciami. 256bp fragment (nukleotidy 817 - 1072) sa amplifikoval z každého klinického DNA izolátu, na tento účel použijúc oligonukleotidy a zahrievacie cykly opísané v príklade 3.
Nasledovné primery: 5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3’ a 5’-CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3’ sa použili na ampliftkáciu aminokoncovej 432bp časti Ll DNA (nukleotidy 1 - 431) s použitím zahrievacích cyklov opísaných v príklade 3. Oba PCR produkty boli samostatne spojené s plazmidom pCRII (Invitrogen Corp.) s použitím činidiel a postupov odporúčaných výrobcom. Z transformantov sa vyizolovala plazmidová DNA a transformanty obsahujúce EcoRI inzerty boli sekvenované.
Príklad 5
Analýza DNA a odvodené aminokyselinové sekvencie
Nukleotidová sekvencie a od nich odvodené aminokyselinové (aa) sekvencie deklarovaného HPV 18 Ll sú uvedené na obr. 1. Sekvencia DNA bola odvodená z konsenzu klonov #187-1, pl91-6 a pl95-11. Porovnanie deklarovanej sekvencie nukleotidov HPV 18 Ll s publikovanou sekvenciou HPV 18 Ll (Genbank, položka číslo #X05015) ukázalo zmeny v 20 bp z celkového počtu 1524 bp. Päť zmien v nukleotidoch (C na G v polohe 89, C na A v polohe 263, C na G v polohe 848, G na A v polohe 967 a C na G v polohe 1013) viedlo k substitúciám aminokyselín. Päť rozdielov vo zvyškoch v porovnaní s publikovanými sekvenciami je P na R v aminokyselinovej (aa) polohe 30, 283 a 338, T na N v aa polohe 88, a V na I v aa polohe 323 (obr. 2). Poloha 88 a 323 predstavuje konzervatívne zmeny, kým tri zmeny P na R môžu významne zmeniť fyzikálne vlastnosti exprimovaného Ll proteínu.
Porovnanie aminokyselinových sekvencii odvodených z klinických izolátov (číslo 354, 556, 755, 697, 795 a 23) s deklarovanou sekvenciou a s publikovanou sekvenciou je znázornené na obr. 2. Sú štyri miesta, v ktorých sa klinické izoláty a deklarovaná sekvencia odlišujú od publikovanej sekvencie. Polohy 30, 283 a 338 kódujú arginín (R) vo všetkých doteraz nájdených izolátoch vrátane deklarovanej sekvencie. Toto je v ostrom protiklade s publikovanou sekvenciou, v ktorej je v každej z týchto polôh prolín (P). Okrem toho v izolátoch a v deklarovanej sekvencii je v polohe 88 asparagín (N), no v publikovanej sekvencii je treonín (T). Posledným rozdielom je, že v mnohých klinických izolátoch a v publikovanom kmeni v polohe 323 je valín (V), kým v deklarovanej sekvencii a v jednom z izolátov (#23) je v tejto polohe izoleucin (I). Záver je taký, že deklarovaná sekvencia odráža prevládajúce vírusové sekvencie, ktoré sú asociované s klinickými infekciami a neprítomnosť izolátov obsahujúcich ktorýkoľvek prolín v polohe 30, 283 alebo 338 v publikovanej sekvencii naznačuje, že publikovaný kloň je buď artefakt alebo bezvýznamný podtyp.
Sekvencie nukleotidov a odvodené aminokyselinové sekvencie HPV 18 L2 boli odvodené z konsenznej sekvencie klonov #187-1 apl95-l 1 asú znázornené na obr. 3. Porovnanie sekvencie nukleotidov L2 s publikovanou sekvenciou HPV 18 (Genbank, položka číslo #X05015) ukázalo zmeny v 40 bp z celkového počtu 1389 bp. Rozdiely v bp vedú k 14 zmenám na úrovni aminokyselín: P na S v polohe 29, P na N v polohe 33, A na S v polohe 177, D na E v polohe 266, D na N v polohe 270, D na G v polohe 346, M na I v polohe 355, V na M v polohe 359m S na P v polohe 365, F na S v polohe 369, F na V v polohe 371, F na S v polohe 372, K na T v polohe 373 a S na P v polohe 409.
Príklad 6
Príprava antiséra proti HPV 18 L2
HPV 18 L2-špecifické protilátky boli pripravené v kozách s použitím fúzneho proteínu trpE-WV 18 L2 exprimovaného v E. coli. L2 ORF s plnou dĺžkou bol amplifikovaný pomocou PCR s použitím oligonukleotidových primerov poskytujúcich miesta pre HindlII a BamHI susediace s 5’- a s 3’- koncom. L2 fragment bol vsunutý do expresného plazmidu pATH23 poštiepeného enzýmami HindlII-BamHI (Koemer et al., 1991, Meth. Enzymol. 194:477 - 490). Fúzny protein sa exprimoval v E. coli RR1 bunkách (Gibco BRL, Inc.) po indukovaní kyselinou 3-b-indolakrylovou. Nerozpustná frakcia sa analyzovala pomocou SDS-PAGE, potom sa farbila s farbivom Coomassie Blue. Fúzny protein trpE-L2 tvorí hlavnú časť nerozpustnej frakcie E. coli. Kozy boli imunizované fúznym proteínom trpE-L2 podľa štandardného protokolu firmy Pocono Rabbit Farm and Laboratory, Inc. pre antigény fúzneho proteínu (Protein Rabbit Farm, Canadensis, PA).
Príklad 7
Príprava kvasinkového kmeňa U9
Kmeň 2150-2-3 kvasiniek Saccharomyces cerevisiae (MATalpha, leu2-04, adel, cir°) sa získal od Dr. Lelanda Hertwella (University of Washington, Seattle, WA). Bunky kmeňa 2150-2-3 boli cez noc rozmnožené pri 30 °C v 5 ml média YEHD (Carty et al., J. Ind Micro 2 (1987) 117 až 121). Bunky sa premyli trikrát v sterilnej destilovanej vode, resuspendovali sa v 2 ml sterilnej destilovanej vody, a 0,1 ml bunkovej suspenzie sa nanieslo na šesť platní s kyselinou 5-fluoro-orotickou (FOA), aby sa vyselektovali ura3 mutanty (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Plame sa inkubovali pri 30 °C. Médium obsahovalo - na 250 ml destilovanej vody - 3,5 g kvasinkovú dusíkovú bázu (Difco) bez aminokyselín a síranu amónneho; 0,5 g kyseliny 5-fluoro-orotickej; 25 mg uracilu; a 10,0 g dextrózy.
Médium bolo sterilizované filtrovaním cez 0,2 pm membrány a potom sa zmiešalo s 250 ml 4 % Bacto-Agaru (Difco) udržiavaného pri 50 °C, 10 ml 1,2 mg/ml roztoku adenínu, a 5 ml roztoku L-leucínu (180 mg/50 ml). Výsledné médium sa rozdelilo po 20 ml na Petriho misku.
Po 5 dňoch inkubácie sa objavili početné kolónie. Jednotlivé kolónie sa vyizolovali preočkovaním z pôvodných platní s FOA na čerstvé FOA platne, ktoré sa potom inkubovali pri 30 “C. Mnohé kolónie z druhej súpravy FOA platní boli testované na prítomnosť mutácie ura3 odtlačkovým prepasážovaním tak na platne s YEHD, ako aj na platne bez uracilu. Požadovaným výsledkom bol dobrý rast na YEHD a žiaden rast v bezuracilovom médiu. Získal sa jeden izolát (U9) s takýmito vlastnosťami. Bol udržiavaný v zmrazenom stave ako glycerolová zásoba (kmeň #325) pri 70 °C na neskoršie použitie.
Príklad 8
Príprava vektora na rozrušenie kvasinkového génu MNN9
Na prípravu vektora na rozrušenie génu MNN9 bolo potrebné najprv naklonovať gén MNN9 z genómovej DNA kvasiniek S. cerevisiae. Toto bolo urobené použitím štandardného postupu PCR. Zostavil sa 5’ sense primér a 3’ antisense primér na PCR kompletnej kódujúcej sekvencie MNN9 na základe publikovanej sekvencie kvasinkového génu MNN9 (Zymogenetics: EPO, patentová prihláška číslo 88117834.7, publikácia číslo 0-314-096-A2). Použili sa nasledovné oligodezoxynukleotidové priméry obsahujúce priľahlé HindlII miesta (podčiarknuté): sense primér:
’ -CTTAAAGCTTATGTCACTTTCTCTTGTATCG-3 ’ antisense primér:
’ -TGATAAGCTTGCTC AATGGTTCTCTTCCTC-3 ’.
Iniciačný metionínový kodón pre gén MNN9 je zvýraznený polotučné. PCR sa urobila použitím genómovej DNA z kmeňa JRY188 kvasinky S. cerevisiae ako templátu, Taq DNA polymerázy (Perkin Elmer) a 25 amplifikačných cyklov (94 °C 1 min., 37 °C 2 min., 72 °C 3 min.). Výsledný 1,2 kbp PCR fragment bol poštiepený enzýmom HindlII, purifikoval sa na géli, a spojil sa s pUC13 (Pharmacia), ktorý bol poštiepený enzýmom HindlII a vystavený účinkom alkalickej fosfatázy. Výsledný plazmid bol označený pl 183.
Aby sa mohol gén MNN9 rozštiepiť kvasinkovým génom URA3, plazmid pBR322-URA3 (ktorý obsahuje 1,1 kbp HindlII fragment kódujúci gén URA3 kvasinky S. cerevisiae naklonovaný na miesto HindlII plazmidu pBR322), sa enzýmom HindlII poštiepil a 1,1 kbp DNA fragment nesúci funkčný URA3 gén sa čistil na géli, jeho konce sa zatupili T4 DNA polymerázou, a potom sa spojil s plazmidom pl 183 poštiepeným enzýmom PmlI (PmlI štiepi vnútri kódovacej sekvencie MNN9). Výsledný plazmid pl 199 obsahuje gén MNN9 rozrušený funkčným génom URA3.
Príklad 9
Skonštruovanie kmeňa 1372 odvodeného od U9 obsahujúceho rozrušenie génu MNN9
Na rozrušenie génu MNN9 v kmeni U9 (#325) sa 30 pg plazmidu pl 199 poštiepilo enzýmom HindlII, aby vznikla lineárna štiepiaca kazeta mnn9::URA3. Bunky kmeňa 325 boli transformované s pl 199 DNA poštiepeným enzýmom HindlII použitím metódy sféroplastov (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 - 1933) a transformanty sa vybrali na syntetickom agarovom médiu bez uracilu a s obsahom 1,0 M sorbitolu. Syntetické médium obsahovalo na liter destilovanej vody: agar, 20 g; kvasinkovú dusíkovú bázu w/o aminokyseliny, 6,7 g; adenín, 0,04 g; L-tyrozín, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukózu, 20 g; a bezleucínový roztok #2, 10 ml. Bezleucínový roztok #2 na liter destilovanej vody obsahuje: L-arginin, 2 g; L-histidín, 1 g; L-leucín, 6 g; L-izoleucín, 6 g; L-lyzín, 4 g; L-metionín, 1 g; L-fenylalanín, 6 g; L-treonín, 6 g; L-tryptofán, 4 g.
Platne sa inkubovali pri 30 °C päť dní, za tento čas vznikli početné kolónie. Preparáty chromozómovej DNA sa pripravili z 10 kolónií a boli potom poštiepené enzýmami EcoRI a HindlII. Poštiepená DNA bola potom vyhodnotená v Southem blote (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Maual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) pomocou 1,2 kbp HindlII fragmentu nesúceho gén ΜΝΝ9 (izolovaný z plazmidu pl 199) ako primeru. Našiel sa izolát (kmeň #1372), ktorý vykazoval očakávané posuny v DNA prúžkoch podľa Southem blote, ako aj extrémnu hrudkovitosť, ktorá je pre mnn9 mutanty typická.
Príklad 10
Skonštruovanie vektora na rozrušenie génu HIS3 kvasiniek
Na prípravu štiepnej kazety, v ktorej sa gén HIS3 kvasiniek 5. cerevisiae rozštiepi génom URA3, plazmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 1035) sa poštiepil enzýmom BamHI a 1,7kbp BamHI fragment nesúci gén HIS3 sa čistil na géli, jeho konce sa zatu pili T4 DNA polymerázou, a spojili sa s pUC 18, ktorý bol predtým poštiepený enzýmom BamHI a vystavený účinkom T4 DNA polymerázy. Výsledný plazmid (označený pl501 alebo pUC18-HIS3) sa poštiepil enzýmom NheI (ktorý štiepi v kódujúcej sekvencií HIS3), a vektorový fragment bol čistený na géli, jeho konce sa zatupili T4 DNA polymerázou, a potom sa vystavil účinkom alkalickej fosfatázy z teľacieho čreva. Gén URA3 sa vyizoloval z plazmidu pBR322-URA3 poštiepením enzýmom HindlII a 1,1 kbp fragment nesúci gén sa purifikoval na géli, jeho konce sa zatupili T4 DNA polymerázou, a spojil sa s uvedeným pUC18-HIS3 NheI fragmentom. Výsledný plazmid (označený pUC18-his3::URA3 alebo pl505) obsahuje štiepnu kazetu, v ktorej sa kvasinkový gén HIS3 poštiepi funkčným génom URA3.
Príklad 11
Skonštruovanie vektora na rozrušenie kvasinkového génu PRBI génom HIS3
Plazmid FP8AH obsahujúci gén PRB1 kvasiniek S. cerevisiae poskytol Dr. E. Jones z Camegie-Mellon University (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115:255 - 263). Poštiepil sa enzýmami HindlII a Xhol, a 3,2kbp DNA fragment obsahujúci gén PRB1 sa purifikoval na géli a jeho konce sa zatupili účinkami T4 DNA polymerázy. Plazmid pUC18 sa poštiepil enzýmom BamHI, čistil sa na géli, a jeho konce sa zatupili účinkami T4 DNA polymerázy. Výsledný vektorový fragment sa spojil s uvedeným fragmentom génu PRBI, aby sa získal plazmid pUC18-PRBl. Plazmid YEp6, ktorý obsahuje gén HIS3, sa poštiepil enzýmom BamHI. Výsledný l,7kbp BamHI fragment obsahujúci funkčný HIS3 gén sa čistil na géli, potom sa jeho konce zatupili účinkami T4 DNA polymerázy. Plazmid pUC18-PRBl sa poštiepil enzýmami EcoRI’ a Ncol, ktoré štiepia v rámci kódujúcej sekvencie PRBI a odstraňujú aktívne miesto proteázy B a priľahlú sekvenciu. 5,7kbp EcoRV-NcoI fragment obsahujúci reziduálne 5’ a 3’ časti kódujúce sekvenciu PRBI v pUC18 sa čistil na géli, jeho konce sa zatupili účinkami T4 DNA polymerázy, defosforyloval sa alkalickou fosfatäzou z teľacieho čreva, a spojil sa s otupeným HIS3 fragmentom opísaným skôr. Výsledný plazmid (označený pUC18-prbl::HIS3, zásoba #1245) obsahuje funkčný HIS3 gén na mieste časti génu PRBI, ktorý bol vynechaný, ako to je uvedené.
Príklad 12
Skonštruovanie kmeňa kvasiniek príbuzných s U9, ktorý obsahuje rozrušenia oboch génov, MNN9 aj PRBI
Kmeň 1372 príbuzný s U9, ktorý obsahuje rozrušenie génu MNN9, bol opísaný v príklade 9. Klonové izoláty kmeňa 1372 boli pasážované na platniach s FOA (ako je to opísané v príklade 7), aby sa vyselektovali ura3 mutanty. Získali sa početné ura3 izoláty kmeňa 1372 a jeden osobitný izolát (kmeň 12930-190-S1-1) bol vybraný na následné rozštiepenie HIS3 génu. Štiepny vektor (pl505) génu pUC18-his3::URA3 sa poštiepil enzýmami Xbal a EcoRI, aby sa získala lineárna štiepna kazeta his3::URA3 a použila sa na transformáciu kmeňa 12930-190-S1-1 spôsobom využívajúcim octan lítny [Methods in Enzymology, 194: 290 (1991)]. Ura+ transformanty sa vyselektovali na syntetickom agarovom médiu bez uracilu, preočkovali sa na klonové izoláty na takom istom médiu, a prepasážovali sa odtlačkovým spôsobom na médium buď bez uracilu alebo bez histidínu s cieľom nájsť izoláty, ktoré boli tak Ura+, ako aj His‘. Jeden izolát (kmeň 12930-230-1) bol vybratý na následné rozrušenie génu PRBI. Štiepny vektor (pUC18-prbl::H!S3, zásoba #1245) génu PRBI bol poštiepený en zýmami Sací a Xbal, aby sa získala lineárna štiepna kazeta prbl::HIS3 a použila sa na transformáciu kmeňa 12930230-1 spôsobom využívajúcim octan lítny. His+ transformanty sa vyselektovali na agarovom médiu bez histidinu a preočkovali sa na takom istom médiu s cieľom získať klonové izoláty. Z mnohých spomedzi výsledných His+ izolátov sa pripravila genómová DNA, poštiepila sa enzýmom EcoRI, a podrobila sa elektroforéze na 0.8 % agarózových géloch. Potom sa urobili analýzy Southem blotom pomocou izotopom značeného 617bp priméru génu PRB1, ktorý bol predtým pripravený pomocou PCR použitím nasledovných oligodezoxynukleotidových primérov: 5’ TGGTCATCCCAAATCTTGAAA 3’
5’ CACCGTAGTGTTTGGAAGCGA 3’
Získalo sa jedenásť izolátov, ktoré vykazovali očakávanú hybridizáciu sondy s 2,44kbp prbi::HIS3 DNA fragmentom. Toto sa odlišovalo od hybridizácie sondy s l,59kbp fragmentom pre PRB1 gén divého typu. Jeden z týchto izolátov obsahujúcich požadovane prbI::HIS3 rozrušenie bol vybraný na ďalšie použitie a bol označený ako kmeň #1558.
Príklad 13
Expresia HPV 18 Ll a L2 v kvasinkách
Plazmidy pl91-6 (pGALl-10 + HPV 18 Ll) a pl95-11 (pGALl -10 + HPV 18 Ll + L2) sa použili na transformáciu kvasiniek 5' cerevisiae, kmeň #1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Klonové izoláty boli kultivované pri 30 °C v médiu YEHD, s obsahom 2 % galaktózy počas 88 hodín. Po pozbieraní buniek boli bunkové pelety rozdrvené sklenými guľôčkami a lyzáty buniek boli analyzované imunoblotom na expresiu proteínu HPV 18 Ll a/alebo HPV 18 L2. Vzorky obsahujúce 25 pg celkových bunkových proteínov boli podrobené elektroforéze cez 10 % gély Tris-glycín (Novex, Inc.) za denaturačných podmienok, a urobil sa elektroblot na nitrocelulózové filtre. Proteín Ll bol imunodetegovaný pomocou králičieho antiséra vyprodukovaného proti fuznemu proteínu /rp£-HPV 11 Ll, ako primárnej protilátky (Brown et al., 1994, Virology 201: 46 - 54), a chrenovou peroxidázou (HRP) naviazanou na oslí antikráličí IgG (Amersham, Inc.), ako sekundárnu protilátku. Filtre sa spracovali pomocou chemoluminiscenčnej ECL™ detekčnej súpravy (Amersham, Inc.). V oboch koexpresorových klonoch kvasiniek Ll aj Ll + L2 (kmene 1725 a 1727) bol zistený proteín s hmotnosťou 50 - 55 kDa, ktorý nebol zistený v negatívnej kontrole (pGALl-10 bez génov Ll alebo L2) (obr. 4).
Proteín HPV 18 L2 bol zistený Westem blotom pomocou kozieho polyklonálneho antiséra vyprodukovaného proti fúznemu proteínu /rp/ľ-HPV 18 L2, ako primárnej protilátky, potom proti HRP-konjugovanému králičiemu anti-koziemu IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Filtre boli spracované, ako to je opísané. Proteín L2 bol zistený ako 75kDa proteínový prúžok v kvasinkovom koexpresorovom klone Ll + L2 (kmeň 1727), no nezistil sa ani v negatívnej kontrole, ani v Ll expresorovom klone (obr. 5).
Príklad 14
Fermentácia HPV 18 Ll (kmeň 1725) a 18 Ll + AL2 (kmeň 1727).
Povrchová populácia kultúr kmeňov 1725 a 1727 na platni sa aseptický preniesla do bezleucinového tekutého média obsahujúceho (na liter): 8,5 g kvasinkovú dusíkovú bázu (Difco) bez aminokyselín a síranu amónneho; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantárovej; 5 g síranu amónneho; 40 g glukózy; 0,25 g L-tyrozínu; 0,1 g L-arginínu;
0,3 g L-izoleucínu; 0,05 g L-metionínu; 0,2 g L-tryptofánu; 0,05 g L-histidínu; 0,2 g L-lyzínu; 0,3 g L-fenylalaninu; toto médium bolo pred sterilizáciou upravené na pH 5,0 - 5,3 pomocou NaOH. Po kultivácii pri 28 °C pri 250 otáčok/minútu na rotačnej trepačke sa pripravili fľaštičky so zmrazenými kultúrami tak, že sa pridal sterilný glycerol v konečnej koncentrácii 17 % (hmotnosť/objem) a potom sa uložili na -70 °C (1 ml na jednu zmrazovaciu fľaštičku). Inokulá sa kultivovali v takom istom médiu (500 ml na dvojlitrovú fľašu) a začali sa prenesením rozmrazeného obsahu zmrazenej kultivačnej fľaštičky a inkubáciou pri 28 °C, 250 otáčok/minútu na rotačnej trepačke 29 hodín. Pri fermentovaní každého kmeňa sa použila fermentovacia nádoba New Brunswick SF-116 s efektívnym objemom 10 1 po inokulácii. Produkčné médium obsahovalo (na liter): 20 g kvasinkový extrakt (Difco); 10 g peptón (Sheffield HySoy); 20 g glukózy; 20 g galaktózy; 0,3 mL protipenový prostriedok (Union Carbide UCON LB-625); médium bolo pred sterilizáciou nastavené na pH 5,3. Celý obsah (500 ml) dvojlitrovej inokulačnej fľaše sa preniesol do fermentovacej nádoby, ktorá sa inkubovala pri 28 °C, 5 litrov vzduchu za minútu, 400 otáčok/minútu, tlak 3,5 psí. Miešanie sa podľa potreby zvyšovalo, aby hladina nasýtenosti rozpusteného kyslíka bola nad 40 %. Proces fermentácie bol monitorovaný meraním glukózy (analyzátor Glucose 2, Beckman) a priebežne hmotnostnou spektrometriou (Perkin-Elmer 1200). Po inkubácii počas 66 hodín hustota buniek dosiahla 9,5 až 9,7 g suchej hmotnosti buniek na liter. Kultúry sa skoncentrovali filtráciou cez buničinu (Amicon H5MP0M3 kartridž vo filtračnom systéme Amicon DC-10) asi na 2 litre, diafiltrovali sa 2 litrami fosfátmi tlmeným fyziologickým roztokom a ďalej sa koncentrovali (až asi na objem 1 1) a potom sa rozplnili do 500 ml centrifugačných fliaš. Bunkové pelety sa získali centrifugáciou pri 8000 otáčok/minútu (rotor Sorval GS-3) 20 minút pri 4 °C. Po zliatí supematantu sa pelety (celkove 191 až 208 g mokrých buniek) uložili pri -70 °C až do použitia.
Príklad 15
Purifikovanie rekombinovaných kapsidových proteínov HPV typ 18 Ll
Pokiaľ to nie je uvedené inak, všetky kroky boli urobené pri 4 °C.
Bunky boli držané v zmrazenom stave pri -70 °C. Zmrazené bunky (čerstvá hmotnosť = 126 g) boli rozmrazené pri 20 - 23 °C a resuspendované v 70 ml tlmivého roztoku (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl). Inhibítory proteáz PMSF a pepstatín A sa pridali v konečnej koncentrácii 2 mM a 1,7 μΜ. Bunková kaša bola rozdrvená pri tlaku približne 16 000 psí v štyroch cykloch pomocou mikrofluidizátora M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rozdrvená bunková kaša sa centrifugovala pri 12 000 X ot./min. 40 minút, aby sa odstránili úlomky buniek. Získal sa tekutý supematant obsahujúci antigén Ll.
Supematant sa nariedil v pomere 1 : 5 pridaním tlmivého roztoku A (20 mM MOPS, pH 7,0) a naniesol sa na aniónovú výmennú záchytnú kolónu (9,0 cm vnútorný priemer X 3,9 cm) naplnenú živicou Fractogel® EMD TMAE650 (M) (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrovanú v tlmivom roztoku A. Po premytí tlmivým roztokom A bol antigén eluovaný s gradientom 0 až 1,0 M NaCl v tlmivom roztoku A. Frakcie z kolóny sa otestovali na celkové proteíny pomocou postupu podľa Bradforda. Frakcie sa potom analyzovali pri rovnakom obsahu proteínov Westem blotom a pomocou SDS-PAGE s detekciou striebra.
Frakcie TMAE s porovnateľnou čistotou a obsahom proteínu Ll sa zmiešali. Antigén sa skoncentroval frakcionovaním pomocou síranu amónneho. Roztok sa nastavil na %-nú saturáciu síranu amónneho pridaním tuhého činidla za opatrného miešania počas 10 minút. Vzorka sa umiestnila na ľad a precipitácia prebiehala 4 hodiny. Vzorka sa centrifugovala pri 16 000 X ot./min. 45 minút. Pelet sa resuspcndoval v 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspendovaný pelet bol podrobený chromatografii na vylučovacej kolóne (2,6 cm vnútorný priemer 89 cm) naplnenej živicou Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Pracovným tlmivým roztokom bolo PBS. Frakcie boli analyzované Westem blotom a pomocou SDS-PAGE s detekciou striebra. Najčistejšie frakcie sa zmiešali. Výsledná zmes sa skoncentrovala za miešania do 50 ml nádobky pomocou plochých membrán YM-100 (Amicon, Beverly, MA) pri tlaku N2 27,6 až 41,3 kPa (4 až 6 psí).
Výsledný produkt sa analyzoval Westem blotom a pomocou SDS-PAGE s detekciou koloidálneho farbiva Coomassie. Homogenita proteínu L1 sa odhadla na 50 až 60 %. Totožnosť proteínu L1 bola potvrdená Westem blotom. Výsledný produkt sa rozplnil a zmrazil na -70 °C. Týmto postupom sa získalo 12,5 mg proteínu.
Stanovenie celkového obsahu proteínov podľa Bradfordoveho testu
Celkový obsah proteínov sa stanovil pomocou komerčne dostupnej súpravy Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL). Vzorky sa nariedili na jednotlivé hladiny v Milli-Q-H2O. Požadované objemy boli 0,1 ml a 1,0 ml pre štandardy, resp. pre mikrotesty. Pre oba protokoly sa použil BSA (Pierce, Rockford, IL) na zostrojenie štandardnej krivky. Testy boli urobené podľa odporúčaní výrobcu. Štandardné krivky sa nanášali pomocou softvéru CricketGraph® s použitím počítača Macintosh líci.
SDS-PAGE a Westem blot
Všetky gély, tlmivé roztoky a elektroforetické zariadenie boli získané od firmy Novex (San Diego, CA) a boli použité podľa odporúčaní výrobcu. V stručnosti, vzorky sa nariedili na rovnakú koncentráciu proteínov v Milli-Q-H2O a zmiešali sa v pomere 1 : 1 s inkubačným tlmivým roztokom obsahujúcim 200 mM DTT. Vzorky sa inkubovali 15 minút pri 100 °C a naniesli sa na vopred naplnené 12 %-né Tris-glycínové gély. Vzorky sa podrobili elektroforéze pri 125 V počas 1 h 45 min. Gély boli vyvolávané buď striebrom s použitím modifikovaného postupu Heukeshovena a Demicka (Electrophoresis 6, 1985, 103 - 112), alebo farbivom Coomassie použitím komerčne dostupnej súpravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA).
Na analýzu Westem blotom sa proteíny preniesli na membrány PVDF pri 25 V na 40 min. Membrány sa premyli s Milli-Q-H2O a vysušili sa na vzduchu. Primárnou protilátkou bolo polyklonálne králičie antisérum vyvolané proti fúznemu proteínu TrpE-HPV 11 L1 (dar od Dr. D. Browna). Predchádzajúce experimenty ukázali, že toto antisérum vo Westem blote krížovo reaguje s HPV 18 Ll. Roztok protilátok sa pripravil nariedením antiséra v blotovacom tlmivom roztoku (5 % nízkotučného mlieka v 6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN3). Doba inkubácie bola aspoň 1 hodina pri 20 až 23 °C. Blot sa premýval v troch várkach PBS po 1 min. (6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárnej protilátky sa pripravil nariedením konjugátového antiséra obsahujúceho kozí antikráličí IgG viazaný alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v blotovacom tlmivom roztoku. Inkubácia prebiehala za rovnakých podmienok aspoň 1 hodinu. Bloty sa premyli, ako to je uve dené a analyzovali sa pomocou jednokrokového substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).
Príklad 16
Elektrónová mikroskopia
Na analýzu pod elektrónovým mikroskopom (Structure Próbe, West Chester, PA) sa alikvotná časť každej vzorky umiestnila na uhlíkom potiahnuté 200-mesh medené mriežky. Na mriežku sa umiestnila kvapka 2 %-nej kyseliny dodekavolframatofosforečnej (PTA), pH 7,0, na 20 sekúnd. Mriežky sa vysušili na vzduchu a potom sa preniesli na elektrónmikroskopickú analýzu. Elektrónmikroskopické vyšetrenia sa robili pomocou elektrónového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) pri urýchľovacom napätí 100 kV. Konečné zväčšenie vyhotovených mikrofotografií bolo lOOOOOx. Vírusom podobné partikuly boli pozorované s priemerom v rozpätí 50 - 55 nm vo vzorke kvasiniek nesúcej expresný plazmid HPV 18 Ll (obr. 6). V kontrolných vzorkách kvasiniek sa nenašli nijaké vírusom podobné partikuly.
Príklad 17
Subklonovanie HPV 18 cDNA do expresných vektorov cDNA kódujúca HPV 18 sa preklonuje do niekoľkých vektorov na expresiu proteínu HPV 18 v transfekovaných hostiteľských bunkách a na in vitro transkripciu/transláciu. Vektory obsahujú pBluescript II SK+ (kde expresiu riadia promótory T7 alebo T3), pcDNA I/Amp (kde expresiu riadi promótor cytomegalovírusu (CMV)), pSZ9016-l (kde expresiu riadi promótor dlhej terminálnej opakovanej sekvencie -„long terminál repeat“, LTR - vírusu HIV), a bakulovírusový transferový vektor pAcUW51 (PharMingen, Inc.) (kde expresiu riadi polyhedrínový (PH) promótor) na prípravu «kombinovaného bakulovírusu obsahujúceho sekvenciu DNA kódujúcu HPV 18.
pBluescript II SK+:HPV 18. Klonová HPV 18 cDNA s úplnou dĺžkou sa získava z bakteriofágu lambda obmedzených štiepením enzýmom Eco Rl a naviaže sa do pBluescript II SK+ poštiepený pomocou Eco Rl a vystavený účinkom CIP. Získavajú sa samostatné subklony, v ktorých sense orientácia HPV 18 nasledovala buď za promótorom T7, alebo T3.
pcDNA I/Amp:HPV 18. Na uľahčenie usmerneného klonovania sa HPV 18 vyreže z čisteného plazmidového prípravku pBluescript II SK+:HPV 18, v ktorom DNA sekvencia HPV 18 je za promótorom T7, použitím Eco RV a Xba I. Výsledný Eco RV, Xba I HPV 18 fragment sa čistí a naviaže sa do pcDNA I/Amp vyrezaného enzýmami Eco RV a Xba I, a vystaveného účinkom CIP tak, aby DNA kódujúca HPV 18 bola za CMV promótorom.
pSZ9016-l:HPV 18. HPV 18 sa vyreže z pBluescript II SK+:HPV 18 limitovaným štiepením pomocou Eco Rl a následnou purifikáciou 1,3 kb fragmentu z agarózových gélov. Výsledný Eco Rl HPV 18 fragment sa naviaže do pSZ9016-l poštiepeného pomocou Eco Rl a vystaveného účinkom CIP. Vyberú sa subklony, v ktorých sense orientácia HPV 18 je za promótorom HIV LTR.
pAcUW51:HPV 18 Ll. Otvorený čítací rámec (ORF) HPV 18 Ll v plnej dĺžke bol amplifikovaný pomocou PCR z klonu #187-1 s použitím oligonukleotidových primerov poskytujúcich priľahlé miesta BglII. Gén Ll sa vsunul na miesto BamHl bakulovírusového transferového vektora pAcUW51 (PharMingen, Inc.), pod kontrolou polyhcdrínového promótora. Získali sa rekombinované bakulovírusy obsahujúce expresnú kazetu HPV 18 Ll v súlade s postupmi opísanými vo Pharmingen Manual. Rekombinované klony sa čistili riedením a dot blot hybridizáciou.
Príklad 18
Expresia polypeptidu HPV 18 in vitro transkripciou/transláciou a transfekovaním do hostiteľských buniek
Vektory obsahujúce sekvencie HPV DNA sa používajú na riadenie translácie HPV 18 polypeptidu v lyzátoch z králičích retikulocytov, v cicavčích hostiteľských bunkách, a v hmyzích bunkách infikovaných bakulovírusom. Experimentálne postupy sú v podstate zhodné s návodom výrobcu.
In vitro transkripcia/translácia. Plazmidová DNA pBlueseript III SK+:HPV 18 (s HPV 18 v orientácii T7) sa linearizuje štiepením enzýmom Bam Hl v smere HPV 18 inzertu. Linearizovaný plazmid sa čistí a potom sa použije ako templát na spustenie transkripcie s použitím 17 RNA polymerázy v prítomnosti m7G(5’)ppp(5’)G. Výsledné HVP 18 transkripty sa purifikujú precipitáciou s LÍCI a sú použité na riadenie translácie HPV 18 v lyzáte králičích retikulocytov, ktoré boli predtým ošetrené nukleázou, v prítomnosti L-[35S]metionínu.
Expresia v cicavčích bunkách. Proteín HPV 18 sa exprimuje v cicavčích hostiteľských bunkách po transfekcii buď s pcDNA I/Amp:HPV 18 (pod kontrolou CMV promótora), alebo s pSZ9016-l:HPV 18 (pod kontrolou HIV LTR promótora). V prípade pSZ9016-l:HPV 18 sa bunky transfekujú spolu s plazmidom pSZ90161:TAT exprimujúcim TAT. Pre oba expresné plazmidy HPV 18 sa bunky COS-7 transfekujú buď s DEAE-dextránom, alebo lipofekciou s Lipofectaminom (BRL).
Expresia v hmyzích bunkách. Bakulovírusový transferový vektor pAcUW51 :HPV 18 L1 obsahujúci HPV 18 L1 sa používa na prípravu rekombinovaného bakulovírusu (Autographa californica) homologickou rekombináciou in vivo. Epitopom značený HPV 18 L1 sa potom exprimuje v hmyzích bunkách Sf9 (Spodoptera frugiperda) kultivovaných v suspenznej kultúre po infikovaní rekombinovaným bakulovírusom obsahujúcim HPV 18.
Príklad 19
Zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú aktivitu HPV 18, možno zisťovať viacerými spôsobmi. Spôsob na zisťovanie zlúčenín, ktoré ovplyvňujú HPV 18, zahŕňa:
a) zmiešanie testovanej zlúčeniny s roztokom obsahujúcim HPV 18, aby vznikla zmes;
b) meranie aktivity HPV 18 v zmesi; a
c) porovnanie HPV 18 v zmesi so štandardom.
Zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú aktivitu HPV 18, možno naformulovať do farmaceutických zmesí. Také farmaceutické zmesi môžu byť užitočné pri liečbe chorôb alebo stavov, ktoré sú charakterizované infekciou HPV 18.
Príklad 20
DNA, ktorá je svojou štruktúrou príbuzná s DNA kódujúcou HPV 18 sa zisťuje pomocou sondy. Vhodná sonda sa môže odvodiť z DNA obsahujúcej celú nukleotidovú sekvenciu alebo jej časť (obr. 1 alebo obr. 3), z RNA ktorú kóduje DNA obsahujúcu celú nukleotidovú sekvenciu alebo jej časť (obr. 1 alebo obr. 3) alebo z degenerovaných oligonukleotidov odvodených z časti sekvencie na obr. 1 alebo obr. 3.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vírusom podobné častice pozostávajúce z rekombinantného L1 proteínu alebo rekombinantných L1 + L2 proteínov ľudského papilomavírusu 18, ktoré sú najmenej na 60 % čisté, pričom L1 proteín je znázornený na obrázku 1 a L2 proteín je znázornený na obrázku 3.
- 2. Vírusom podobné častice podľa nároku 1, kde rekombinantný L1 proteín alebo rekombinantné L1 + L2 proteíny sú produkované v kvasinke.
- 3. Spôsob výroby vírusom podobných častíc podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa: transformovanie kvasinky s rekombinantnou DNA molekulou kódujúcou papilomavírusový L1 proteín alebo papilomavírusové L1+L2 proteíny, kultivovanie transformovanej kvasinky v podmienkach, ktoré umožňujú expresiu rekombinantej DNA molekuly, na produkovanie rekombinantného papilomavírusového proteinu, a izolovanie rekombinantného papilomavírusového proteínu na produkciu vírusom podobných častíc podľa nároku 1.
- 4. Rekombinantný papilomavírusový proteín vyrobený spôsobom podľa nároku 3.
- 5. Vakcína, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vírusom podobné častice podľa nároku 1.
- 6. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vírusom podobné častice podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný excipient.
- 7. Izolovaná a purifikovaná HPV18 L1 DNA molekula znázornená na obrázku 1 alebo HPV 18 L2 DNA molekula znázornená na obrázku 3.
- 8. Expresný vektor na expresiu DNA molekuly podľa nároku 7 v hostiteľovi.
- 9. Proteín kódovaný DNA molekulou podľa nároku 7.
- 10. Spôsob expresie ľudského papilomavírusového typu 18 proteínu v hostiteľovi, vyznačujúci sa tým, že zahŕňaa) transfer expresného vektora podľa nároku 8 do vhodného hostiteľa ab) kultivovanie hostiteľa z kroku a) v podmienkach, ktoré umožňujú expresiu ľudského papilomavírusového typu 18 proteínu z expresného vektora.
- 11. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu vybranú zo skupiny obsahujúcej DNA molekulu podľa nároku 7, peptidy kódované DNA molekulou podľa nároku 7, RNA komplementárnu s DNA molekulou podľa nároku 7 alebo ich kombinácie, a farmaceutický prijateľný nosič.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/409,122 US5820870A (en) | 1995-03-22 | 1995-03-22 | Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine |
| US08/408,669 US5840306A (en) | 1995-03-22 | 1995-03-22 | DNA encoding human papillomavirus type 18 |
| PCT/US1996/003649 WO1996029413A2 (en) | 1995-03-22 | 1996-03-18 | Dna encoding human papilloma virus type 18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK127897A3 SK127897A3 (en) | 1998-07-08 |
| SK284281B6 true SK284281B6 (sk) | 2004-12-01 |
Family
ID=27020342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1278-97A SK284281B6 (sk) | 1995-03-22 | 1996-03-18 | Vírusom podobné častice, spôsob ich výroby, izolované a purifikované HPV 18 L1 a L2 DNA a farmaceutické prostriedky s ich obsahom |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0817851B9 (sk) |
| JP (1) | JPH11502704A (sk) |
| KR (1) | KR100430698B1 (sk) |
| CN (1) | CN1100876C (sk) |
| AT (1) | ATE259879T1 (sk) |
| AU (1) | AU714533B2 (sk) |
| CA (1) | CA2215834C (sk) |
| CZ (1) | CZ291242B6 (sk) |
| DE (4) | DE69631586T9 (sk) |
| DK (1) | DK0817851T5 (sk) |
| EA (1) | EA001092B1 (sk) |
| ES (1) | ES2213772T3 (sk) |
| FR (1) | FR07C0023I2 (sk) |
| HU (1) | HU223761B1 (sk) |
| IL (1) | IL117459A (sk) |
| NL (3) | NL300271I1 (sk) |
| NO (1) | NO322254B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ305188A (sk) |
| PL (1) | PL184022B1 (sk) |
| PT (1) | PT817851E (sk) |
| SK (1) | SK284281B6 (sk) |
| WO (1) | WO1996029413A2 (sk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| EE9900612A (et) * | 1997-04-08 | 2000-08-15 | Merck & Co., Inc. | Inimese papilloomiviiruse stabiliseeritud preparaadid |
| ZA982950B (en) | 1997-04-08 | 1998-10-19 | Merck & Co Inc | Stabilized human papillomavirus formulations |
| CN1354787A (zh) * | 1998-08-14 | 2002-06-19 | 麦克公司 | 纯化人乳头瘤病毒样颗粒的方法 |
| AUPP765398A0 (en) | 1998-12-11 | 1999-01-14 | University Of Queensland, The | Treatment of papillomavirus infections |
| SI1150712T1 (sl) | 1999-02-05 | 2009-02-28 | Merck & Co Inc | Pripravek cepiva proti humanem papiloma virusu |
| FR2795074A1 (fr) * | 1999-05-21 | 2000-12-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Polypeptides transporteurs d'acides amines, et en particulier du glutamate, et procedes de criblage de composes inhibiteurs ou activateurs de l'activite de transport |
| MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| WO2008134935A1 (fr) * | 2007-04-29 | 2008-11-13 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Protéines 18 l1 de type papillomavirus humain tronqué |
| CN101293918B (zh) | 2007-04-29 | 2013-03-27 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 截短的人乳头瘤病毒16型l1蛋白 |
| CN101440373B (zh) * | 2007-11-23 | 2012-09-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | 一种截短型的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因 |
| EA022213B1 (ru) * | 2009-06-25 | 2015-11-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Новые конструкции белка вируса папилломы человека (hpv) и их применение в предупреждении заболевания, вызываемого hpv |
| EP2722389B1 (en) * | 2011-06-15 | 2018-03-07 | Hong Jin Kim | Method for enhancing the production yield of human papillomavirus l1 protein |
| WO2013139744A1 (en) | 2012-03-18 | 2013-09-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Method of vaccination against human papillomavirus |
| CN108276491B (zh) * | 2018-02-05 | 2021-01-12 | 南京薇熙生物医药科技有限公司 | 一种可特异性识别hpv18 l1蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
| DE4015044A1 (de) * | 1990-05-10 | 1991-11-14 | Behringwerke Ag | Seroreaktive epitope auf proteinen des menschlichen papillomavirus (hpv) 18 |
| DE122007000017I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffe gegen Papillomavirus |
| DE122007000099I1 (de) * | 1992-06-25 | 2008-03-27 | Papillomavirus vakzine | |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| EP1588713B1 (en) * | 1993-03-09 | 2010-12-22 | The University Of Rochester | Production of human papillomavirus HBV-11 capsid protein L1 and virus-like particles |
-
1996
- 1996-03-13 IL IL11745996A patent/IL117459A/xx active Protection Beyond IP Right Term
- 1996-03-18 CN CN96194121A patent/CN1100876C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 PL PL96322333A patent/PL184022B1/pl unknown
- 1996-03-18 CZ CZ19972936A patent/CZ291242B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 ES ES96909743T patent/ES2213772T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 JP JP8528535A patent/JPH11502704A/ja active Pending
- 1996-03-18 NZ NZ305188A patent/NZ305188A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 HU HU9801334A patent/HU223761B1/hu active IP Right Grant
- 1996-03-18 AU AU53141/96A patent/AU714533B2/en not_active Expired
- 1996-03-18 EA EA199700256A patent/EA001092B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 EP EP96909743A patent/EP0817851B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 DK DK96909743T patent/DK0817851T5/da active
- 1996-03-18 WO PCT/US1996/003649 patent/WO1996029413A2/en active IP Right Grant
- 1996-03-18 CA CA002215834A patent/CA2215834C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 SK SK1278-97A patent/SK284281B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 PT PT96909743T patent/PT817851E/pt unknown
- 1996-03-18 KR KR1019970706580A patent/KR100430698B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 DE DE69631586T patent/DE69631586T9/de active Active
- 1996-03-18 DE DE1996631586 patent/DE122007000025I1/de active Pending
- 1996-03-18 DE DE200712000031 patent/DE122007000031I1/de active Pending
- 1996-03-18 DE DE200712000030 patent/DE122007000030I1/de active Pending
- 1996-03-18 AT AT96909743T patent/ATE259879T1/de active
- 1996-03-18 EP EP04075256A patent/EP1422294A1/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-09-19 NO NO19974322A patent/NO322254B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-14 NL NL300271C patent/NL300271I1/nl unknown
- 2007-03-14 NL NL300273C patent/NL300273I1/nl unknown
- 2007-03-14 NL NL300272C patent/NL300272I1/nl unknown
- 2007-03-20 FR FR07C0023C patent/FR07C0023I2/fr active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0817852B1 (en) | Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein | |
| US5840306A (en) | DNA encoding human papillomavirus type 18 | |
| US5820870A (en) | Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine | |
| US5821087A (en) | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA | |
| EP0817851B9 (en) | Dna encoding human papilloma virus type 18 | |
| EP0973546B1 (en) | Stabilized human papillomavirus formulations | |
| RU2161651C2 (ru) | Очищенные белки вируса папилломы | |
| US6358744B1 (en) | Stabilized human papillomavirus formulations | |
| US6908615B1 (en) | DNA encoding human papilloma virus type 18 | |
| CA2216827C (en) | Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein | |
| CA2204266C (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| MXPA97007208A (en) | Desoxirribonucleico acid that codifies for human papilloma virus type 18 and use of my | |
| CZ356799A3 (cs) | Prostředek obsahující antigen lidského papilomaviru |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Change of owner's name |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., RAHWAY, NJ, US Effective date: 20100203 |
|
| PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: SCHERING CORPORATION, KENILWORTH, NEW JERSEY, US Free format text: FORMER OWNER: MERCK SHARP & DOHME CORP., RAHWAY, NJ, US Effective date: 20121122 |
|
| TC4A | Change of owner's name |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., RAHWAY, NJ, US Effective date: 20121122 |
|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20160318 |