CZ293697A3 - Izolovaná a čištěná molekula DNA, vektor pro expresi a vakcína - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká molekul DNA kódujících čištěný lidský papilomavirus typu 18 a jeho deriváty, vektorů pro jeho expresi a vakcín, obsahujících tyto molekuly DNA, nebo molekuly, kódované těmito molekulami DNA.

Dosavadní stav techniky io Tato přihláška navazuje na projednávané US přihlášky No.

08/408,669 z 22. 3. 1995 a No. 08/409,122 z 22. 3. 1995.

Infekce papilomaviry (PV) se vyskytují u řady zvířat i člověka, u ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Papilomaviry infikují epiteliální buňky a obecně indukují v místě infekce benigní epiteliální nebo fibroepiteliální tumory. Infekce Ρ V je druhově specifická; lidský papilomavirus neinfikuje zvíře.

Papilomaviry je možno rozdělit do určitých skupin v závislosti na hostiteli, kterého infikují. Lidské papilomaviry (HPV) jsou dále tříděny do více než sedmdesáti typů, založených na sekvenční homologii

DNA. PV typy se zdají být typově specifické imunogeny, u kterých neutralizační imunita proti infekci jednoho typu papilomaviru nevyvolává imunitu proti jinému typu papilomaviru.

U člověka způsobují rozdílné typy HPV různá onemocnění. HPV typů 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují benigní bradavice jak u normálních jedinců, tak i u jedinců s oslabenou imunitou. HPV typů 5,

8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 způsobují u pacientů s oslabenou imunitou ploché léze. HPV typů 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 ······ · · ··· • · ·· · · ·· • · · · · · • · · · ····· • · · · ·

9 9 9 ··· ··· · ·

	až 55 způsobují benigní kondylomata genitální sliznice nebo sliznice respiračního traktu. HPV typů 16 a 18 způsobují epiteliální dysplasii genitální sliznice a jsou spojeny s většinou místních a invazívních karcinomů děložního hrdla, vagíny, vulvy a análného kanálu..
5	Papilomaviry jsou malé (50 až 60 nm), ikosahedrální viry DNA
t	bez pouzdra, které kódují až osm časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virových genomú jsou označovány E1 až E7 a L1 a L2, kde „E“ označuje časný a „L“ označuje pozdní. L1 a L2
10	kódují virové kapsidové proteiny. Časné (E) geny jsou spojeny s funkcemi jako je replikace viru a transformace buněk.
15	Hlavním proteinem kapsidy je protein L1, který má molekulovou hmotnost 55 až 60 kDa. Protein L2 je menší kapsidový protein, jehož předpovězená molekulová hmotnost je 55 až 60 kDa a elektrof orézou na polyakrylamidovém gelu určená zdánlivá molekulová hmotnost je 75 až 100 kDa. Imunologická data ukazují, že uvnitř virové kapsomery je většina proteinu L2 vzhledem k proteinu L1 vnitřní. ORF L1 je mezi rozdílnými papilomaviry vysoce konzervován. Proteiny L2 jsou mezi různými papilomaviry konzervovány méně.
20	Geny L1 a L2 byly identifikovány jako dobré cíle pro imunoprofylaxi. Studie v systémech papilomaviru amerického králíka (cottontail rabbit) (CRPV) a bovinního papilomaviru (BPV) ukázaly, že imunizace proteiny L1 a L2, exprimovanými v bakterii nebo s použitím vektorů vakcínie chránila zvířata od virové infekce. Expresí genů L1
25	papilomaviru v bakulovirových expresních systémech nebo s použitím vektorů vakcínie vznikaly uspořádané viru podobné částice (virus-like particles, VLP), kterých bylo použito pro indukci odpovědi virus neutralizujících protilátek s vysokým titrem, která koreluje s ochranou vyvolanou podáním viru.
30	Po HPV typu 16 je HPV 18 druhý nejvíce převládající typ HPV, nalézaný v cervikálních karcinomech. HPV 18 byl detekován v pěti až dvaceti procentech biopsií cervikálního karcinomu, shromážděných z

• · · ·

Q · · · · · “ υ ···· · ··· ··· ·· různých částí světa (lkenberg, H. 1990, Human papillomavirus DNA in invasive genital carcinomas, v: Genital Papillomavirus Infections, G. Gross a další, red., str. 85 - 112). Zdá se, že infekce HPV 18 má určitou geografickou závislost, protože tumorové biopsie z jihoafrických a jihoamerických žen nesou HPV 18 častěji, než podobné biopsie z evropských a severoamerických žen. Podložené důvody pro tyto zeměpisné rozdíly nejsou známy. Vývoj vakcíny proti infekci HPV 18 je extrémně důležitý, protože HPV 18 je také spojován s agresivněji rostoucími typy zhoubného bujení a občas se nalézá v mírných io prekurzorových změnách, CIN l-ll.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká molekul DNA, kódujících čištěný lidský papilomavirus typu 18 (HPV typ 18; HPV 18) a jeho deriváty.

Tyto deriváty zahrnují bez omezení peptidy a proteiny, kódované DNA, protilátky proti DNA nebo protilátky proti proteinům, kódovaným DNA, vakcíny obsahující DNA nebo vakcíny obsahující proteiny kódované DNA, imunologické prostředky obsahující DNA nebo proteiny kódované DNA, kíty obsahující DNA nebo RNA odvozenou od DNA

2o nebo proteiny kódované DNA.

Složení farmaceuticky použitelných prostředků obsahujících DNA nebo proteiny kódované DNA může být vytvořeno v oboru známými způsoby, například přídavkem farmaceuticky přijatelného nosiče. Příklady takových nosičů a způsobů pro vytváření prostředků je možno nalézt v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences.

Pro vytvoření farmaceuticky přijatelného prostředku, vhodného pro účinné podávání, budou takové prostředky obsahovat účinné množství

DNA nebo proteinu nebo VLP. Takové prostředky mohou obsahovat

DNA nebo proteiny nebo VLP, odvozené z více než jednoho typu HPV.

• · · ·

Terapeutické nebo diagnostické prostředky podle vynálezu se pacientům podávají v dostatečném množství pro léčení nebo diagnostiku infekcí papilomavirem. Účinné množství se může lišit podle řady faktorů, jako je stav jednotlivce, jeho hmotnost, pohlaví a s věk. Dalšími faktory jsou způsoby podávání. Obecně se prostředky budou podávat v dávkách od přibližně 1 pg do přibližně 1 mg.

Farmaceutické prostředky mohou být jednotlivci podávány různými cestami, jako subkutánně, místně, orálně, přes sliznici, intravenózně a intramuskulárně.

io Vakcíny podle vynálezu zahrnují DNA, RNA nebo proteiny, kódované DNA, která obsahuje antigenní determinanty, nutné pro indukci vytváření neutralizačních protilátek u hostitele. Tyto vakcíny jsou také dostatečně bezpečné pro podávání bez nebezpečí klinické infekce; nemají vedlejší toxické účinky; mohou být podávány cestou, která je účinná; jsou stabilní; a jsou kompatibilní s nosiči vakcín.

Vakcíny je možno podávat různými způsoby, jako orálně, parenterálně, subkutánně, přes sliznici, intravenózně nebo intramuskulárně. Podávaná dávka se může lišit podle stavu, pohlaví, hmotnosti a věku pacienta, způsobu podávání a způsobu papilomaviru vakcíny. Vakcínu je možno použít v dávkovačích formách jako jsou kapsle, suspenze, elixíry nebo kapalné roztoky. Vakcína může obsahovat imunologicky přijatelný nosič.

Vakcíny se podávají v terapeuticky účinných množstvích, tj. v množstvích dostatečných pro vytvoření imunologické ochranné odezvy. Terapeuticky účinné množství se může lišit podle typu papilomaviru. Vakcína může být podávána v jediné dávce nebo ve vícenásobných dávkách.

DNA a deriváty DNA podle předkládaného vynálezu je možno použít při sestavování imunogenních prostředků. Takové prostředky

3o při zavedení do vhodného hostitele jsou schopny indukovat v něm imunologickou odpověď.

• · ·

DNA nebo její deriváty mohou být použity pro vytváření protilátek. Termín „protilátka“, jak se zde používá, zahrnuje jak polyklonální, tak i monoklonální protilátky stejně jako jejich fragmenty, jako fragmenty Fv, Fab a F(ab)2, které jsou schopny vázat antigen nebo hapten.

DNA a deriváty DNA podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro určení sérotypu infekce HPV a screening HPV. Pro vytváření kitů pro detekci a určování sérotypů HPV je možno použít DNA, rekombinantní proteiny, VLP a protilátky. Takový kit by obsahoval soustavu nosných prvků, schopných pevně držet alespoň jednu nádobku. Nosná soustava by dále obsahovala reagencie, jako je HPV 18 DNA, rekombinantní HPV protein nebo VLP nebo anti-HPV protilátky, vhodné pro detekci různých typů HPV. Nosná soustava může dále obsahovat prostředky pro detekci, jako je značený antigen nebo enzymové substráty apod.

DNA a z nich odvozené proteiny mohou být také použity jako markéry molekulové hmotnosti a velikosti molekuly.

Protože genetický kód je degenerovaný, pro kódování konkrétní aminokyseliny je možno použít více než jednoho kodonu, a proto může

2o být aminokyselinová sekvence kódována některým z řady podobných DNA oligonukleotidů. Pouze jeden z této řady bude identický se sekvencí HPV 18, ale bude schopen za různých podmínek hybridizace s HPV 18 DNA i v přítomnosti oligonukleotidů DNA se změněnými nukleotidy. Za změněných podmínek mohou oligonukleotidy se změněnými nukleotidy stále ještě hybridizovat k HPV 18 DNA a dovolit tak identifikaci a izolaci DNA, kódující HPV 18.

Čištěná DNA HPV 18 podle vynálezu nebo její fragmenty může být použita pro izolaci a čištění homologú a fragmentů HPV 18 z jiných zdrojů. K tomu se za vhodných hybridizačních podmínek první DNA

HPV 18 může smísit se vzorkem obsahujícím DNA, kódující homologní

Ο · · 0 · · * Ό “ 0000 · ··· «·0 ··

HPV 18. Hybridizovaný komplex DNA může být izolován a může být z něj vyčištěna DNA, kódující homologní DNA.

Je známo, že u různých kodonů, kódujících specifické aminokyseliny, je podstatná míra redundance. Proto je vynález rovněž zaměřen na takové sekvence DNA, které kódují alternativní kodony, kódující při eventuálním překladu stejnou aminokyselinu. Pro účely této specifikace bude definována sekvence, nesoucí jeden nebo více • nahrazených kodonů, jako degenerovaná varianta. V rámci vynálezu jsou rovněž zahrnuty mutace buď v sekvenci DNA nebo překládaném io proteinu, které v podstatné míře nezmění konečné fyzikální vlastnosti exprimovaného proteinu. Například substituce valinu za leucin, argininu za lyzin nebo asparaginu na glutamin nemusí způsobit změnu funkce polypeptidu.

Je známo, že sekvence DNA kódující peptid mohou být ís změněny, aby kódovaly peptid s jinými vlastnostmi než má v přírodě se vyskytující peptid. Metody změny sekvencí DNA zahrnují bez omezení místně specifickou mutagenezi.

Jak se zde používá, „funkční derivát“ HPV 18 je sloučenina, která má biologickou aktivitu (buď funkční nebo strukturální), která je

2o v podstatné míře podobná biologické aktivitě HPV 18. Termín „funkční deriváty“ má zahrnovat „fragmenty“, „varianty“, „degenerované varianty“, „analogy“, „homology“ nebo „chemické deriváty“ HPV 18. Termín „fragment“ má označovat jakýkoliv polypeptid, který je částí molekuly HPV 18. Termín „varianta“ má označovat molekulu v podstatě podobnou co se týče struktury a funkce buď celé molekule HPV 18 nebo jejímu fragmentu. Molekula je „v podstatě podobná“ HPV 18, jestliže obě molekuly mají v podstatě podobné struktury nebo jestliže obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Proto jestliže dvě molekuly mají v podstatě podobnou aktivitu, jsou pokládány za

3o varianty, i když struktura jedno z molekul se nenalézá v druhé

A · A A

-7A · AAA • A ·

A · · A » · ·

I · · A AAA·

A A A fl fl

A · * molekule nebo i když nejsou identické jejich aminokyselinové sekvence.

Termín „analog“ označuje molekulu s v podstatě podobnou funkcí celé molekule HPV 18 nebo jejímu fragmentu.

Pro molekulární klonování HPV 18 DNA může být použita řada postupů. Tyto metody bez omezení zahrnují přímou funkční expresi genů HPV 18 následující po konstrukci HPV 18, obsahující cDNA nebo knihovnu genomové DNA ve vhodném expresním vektorovém systému. Další způsob je screening cDNA obsahující HPV 18 nebo io genomické knihovny DNA, konstruované v bakteriofágu nebo plazmidovém kyvadlovém (shuttle) vektoru, značenou oligonukleotidovou sondou, navrženou podle aminokyselinové sekvence HPV 18. Další metoda se skládá ze screeningu cDNA obsahující HPV 18 nebo genomické knihovny DNA, konstruované v bakteriofágu nebo plazmidovém kyvadlovém vektoru částí DNA, kódující HPV 18. Tato část DNA se získá specifickou polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) amplifikací fragmentů HPV 18 DNA pomocí navržených degenerovaných oligonukleotidových primerů z aminokyselinové sekvence čištěného HPV 18. Další způsob je možno uskutečnit izolací RNA z buněk produkujících HPV 18 a překlad RNA na protein in vitro nebo in vivo translačním systémem. Translací RNA na peptid nebo protein se dosáhne produkce alespoň části proteinu HPV 18, který může být například identifikován aktivitou HPV 18 proteinu nebo imunologickou reaktivitou s protilátkou proti HPV 18. Při tomto způsobu mohou být analyzovány vzorky RNA, izolované z buněk produkujících HPV 18, na přítomnost RNA, kódující alespoň část HPV 18. Další frakcionace zásobního vzorku RNA může být provedena pro dosažení vyčištění HPV 18 RNA od RNA, která HPV 18 nepřísluší. Tímto způsobem vyprodukovaný peptid nebo protein může být

3o analyzován pro získání sekvencí aminokyselin, kterých se naopak použije pro získání primerů pro produkci HPV 18 cDNA, nebo může

- 8 být pro poskytnutí nukleotidových sekvencí, kódujících HPV 18, a pro produkci sond pro screening knihovny HPV 18 cDNA, použita RNA. Tyto metody jsou v oboru známy a mohou být například nalezeny v: Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. v Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Je zřejmé, že pro izolaci DNA kódující HPV 18 je možno použít jiných typů knihoven stejně jako knihoven, zkonstruovaných z jiných buněk nebo typů buněk. Jiné typy knihoven bez omezení zahrnují io knihovny cDNA, odvozené z jiných buněk nebo buněčných linií, které obsahují HPV typ 18, a knihovny genomové DNA.

Příprava knihoven cDNA může být prováděna řadou způsobů. Způsoby konstrukce knihovny cDNA je možno nalézt v Sambrook, J. a další, výše. Je zřejmé, že DNA kódující HPV 18 může být také izolována z vhodné knihovny genomové DNA. Konstrukce knihoven genomové DNA může být prováděna různými technikami. Způsoby konstrukce knihoven genomové DNA je možno nalézt v Sambrook, J. a další, výše.

Klonovaná DNA HPV 18 nebo její fragmenty, získané výše popisovanými způsoby, mohou být rekombinantním způsobem molekulárním klonováním do expresního vektoru obsahujícího vhodný promotor a jiné vhodné prvky pro regulaci transkripce a převedením vektoru do prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky exprimovány za vzniku rekombinantní HPV 18. Způsoby těchto manipulací jsou úplně popsány v Sambrook, J. a další, výše a jsou v oboru známy.

Expresní vektory jsou zde definovány jako sekvence DNA, požadované pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNA ve vhodném hostiteli. Tyto vektory mohou být použity pro

3o expresi eukaryotických genů v řadě hostitelů, jako jsou bakterie, modrozelené řasy, rostlinné buňky, hmyzí buňky, houbové buňky a

- 9 zvířecí buňky. Specifickým způsobem navržené vektory dovolují přesun DNA mezi hostiteli jako například bakterie-kvasinka nebo bakterie-zvířecí buňky nebo bakterie-buňky hub nebo bakterie-buňky bezobratlých. Vhodně vytvořený expresní vektor by měl obsahovat:

počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, volitelné markéry, omezené množství využitelných míst pro štěpení restrikčními enzymy, schopnost reprodukovat se ve vysokém počtu kopií a aktivní promotory. Promotor je definován jako sekvence DNA, která navede RNA polymerázu k vazbě na DNA a zahájení syntézy io RNA. Silný promotor je ten, který způsobí iniciaci transkripce mRNA s vysokou frekvencí. Expresní vektory mohou bez omezení zahrnovat klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky navržené plazmidy nebo viry.

Pro expresi HPV18 DNA nebo jejích fragmentů v savčích is buňkách je možno použít různé savčí expresní vektory. Komerčně dostupné savčí expresní vektory, které mohou být vhodné pro expresi HPV18, zahrnují bez omezení pcDNA3 (invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), a λ ZD35 (ATCC 37565).

Pro expresi HPV18 DNA nebo jejích fragmentů v bakteriálních buňkách je možno použít řady bakteriálních expresních vektorů.

Možné vhodné komerčně dostupné bakteriální expresní vektory jsou bez omezení pET11a (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Pro expresi HPV18 nebo jejích fragmentů v buňkách hub je možno použít řady houbových expresních vektorů. Možné vhodné

3o komerčně dostupné expresní vektory houbových buněk jsou bez omezení pYES2 (Invitrogen), expresní vektor Pichia (Invitrogen), a expresní vektor Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Německo).

Pro expresi HPV18 DNA nebo jejích fragmentů v hmyzích buňkách je možno použít řady expresních vektorů hmyzích buněk.

Možné vhodné komerčně dostupné expresní vektory hmyzích buněk jsou bez omezení pBlue Bac III (Invitrogen) a pAcUW51 (PharMingen, lne.).

Expresní vektor obsahující DNA kódující HPV 18 nebo jeho fragmenty je možno použít pro expresi HPV 18 proteinů nebo io fragmentů HPV 18 proteinů v buňkách, tkáních, orgánech nebo zvířatech (včetně lidí). Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, včetně, bez omezení, bakterií jako je E. coli, houbových buněk jako jsou kvasinky, savčích buněk bez omezení na buněčné linie lidského, hovězího, vepřového, opičího nebo hlodavčího původu, včetně bez omezení buněčných linií odvozených z drozofil a larev bource morušového. Buněčné linie, odvozené ze savčích druhů, které mohou být vhodné a které jsou komerčně dostupné, zahrnují bez omezení L buňky L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Ráji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL

70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61 ), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171 ).

Expresní vektory mohou být do hostitelských buněk zavedeny jakýmkoliv z velkého množství způsobů včetně bez omezení transformace, transfekce, lipofekce, fúze protoplastů a elektroporace. Buňky obsahující expresní vektor jsou jako jednotlivé klony pomnožovány a individuálně analyzovány na produkci proteinu HPV 18. Identifikace klonů hostitelských buněk, exprimující HPV 18, může

3o být provedena několika způsoby, včetně bez omezení pomocí imunologické reaktivity s protilátkami anti-HPV 18, a přítomností • · · ·

- 11 • · · ·· ·· ·· · aktivity HPV 18 spojené s hostitelskou buňkou, jako je vazba specifického ligandu vůči HPV 18 nebo přenos signálu, definovaný jako odezva, způsobená interakcí ligandů specifických vůči HPV 18 s exprimovanými proteiny HPV 18. Exprese fragmentů HPV DNA může být také provedena s použitím syntetické mRNA nebo nativní mRNA, produkovaných in vitro. Syntetická mRNA nebo mRNA, izolovaná z buněk produkujících HPV 18 může být účinně překládána v různých bezbuněčných systémech, včetně bez omezení v extraktech z pšeničných klíčků a retikulocytárních extraktech, stejně jako může být io účinně překládána v buněčných systémech, včetně bez omezení mikroinjekcí do žabích oocytů, přičemž mikroinjekci do žabích oocytů se dává přednost.

Po expresi proteinu (proteinů) HPV 18 v hostitelské buňce může být protein HPV 18 oddělen, aby byl získán ve vyčištěné formě.

Dostupných a vhodných pro použití je několik purifikačních postupů pro HPV 18. Jak se zde popisuje, rekombinantní protein HPV 18 může být purifikován z buněčných lyzátů a extraktů různými kombinacemi nebo použitím jednotlivých způsobů izolace jako je frakcionace pomocí soli, iontoměničová chromatografie, gelová (size exclusion) chromatografie, chromatografie s adsorpci na hydroxylapatit a chromatografie založená na hydrofobních interakcích.

Rekombinantní HPV 18 může být dále oddělen od jiných buněčných proteinů použitím imunoafinitní kolony, vyrobené s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, specifických pro nascentní HPV 18 s plnou délkou nebo pro polypeptidové fragmenty HPV 18. Monoklonální a polyklonální protilátky mohou být připraveny řadou v oboru známých způsobů. Monoklonální nebo monospecifická protilátka se zde definuje jako jediný druh protilátky nebo protilátka složená z více druhů protilátek s homogenními

3o vazebnými charakteristikami pro HPV 18. Homogenní vazba zde

- 12 označuje schopnost druhu protilátky vázat se na specifický antigen nebo epitop.

Je zřejmé, že způsoby produkce monospecifických protilátek mohou být použity pro výrobu protilátek specifických proti polypeptidovým fragmentům HPV 18 nebo nascentnímu polypeptidu HPV 18 s plnou délkou. Zvláště je zřejmé, že mohou být vytvořeny monospecifické protilátky, které jsou specifické proti plně funkčnímu HPV 18 nebo jeho fragmentům.

Předkládaný vynález je také zaměřen na způsoby screeningu na w sloučeniny, které modulují expresi DNA nebo RNA, kódující HPV 18 stejně jako funkci (funkce) proteinu (proteinů) HPV 18 in vivo. Sloučeniny modulující tyto aktivity mohou být DNA, RNA, peptidy, proteiny nebo neproteinové organické molekuly. Sloučeniny mohou modulovat zvýšením nebo snížením exprese DNA nebo RNA kódující ís HPV 18 nebo funkce proteinu HPV 18. Sloučeniny modulující expresi DNA nebo RNA kódující HPV 18 nebo funkci proteinu HPV 18 mohou být detekovány pomocí různých testů. Test může být jednoduchý test „ano/ne“ pro určení, zda nastává změna v expresi nebo funkci. Test může být proveden kvantitativně porovnáním exprese nebo funkce testovaného vzorku s úrovněmi exprese nebo funkce ve standardním vzorku.

Mohou být připraveny kity, obsahující DNA HPV 18, fragmenty DNA HPV 18, protilátky proti HPV 18 DNA nebo proteinu HPV 18, HPV 18 RNA nebo protein HPV 18. Takové kity se používají pro detekci

DNA, která hybridizuje s HPV 18 DNA, nebo pro detekci přítomnosti proteinu (proteinů) nebo peptidových fragmentů HPV 18 ve vzorku. Tato charakterizace je užitečná pro mnoho účelů včetně bez omezení forenzní analýzy a epidemiologických studií.

Je možno syntetizovat nukleotidové sekvence komplementární k

3o DNA sekvenci kódující HPV 18 pro terapii antimolekulami (antisense therapy). Těmito antimolekulami mohou být DNA, stabilní deriváty

- 13 • · · · ·

DNA jako fosforothioáty nebo methylfosfonáty, RNA, stabilní deriváty RNA jako 2'-0-alkylRNA nebo jiné antioligonukleotidy, napodobující HPV 18. Antimolekuly HPV 18 mohou být zavedeny do buněk mikroinjekcí, enkapsulací lipozomů nebo expresí z vektorů, nesoucích antimediátorové sekvence. Terapie antimolekulami HPV 18 může být zvláště užitečná pro léčení onemocnění, při kterém je prospěšné snížit aktivitu HPV 18.

Termín „chemický derivát“ popisuje molekulu, obsahující další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí základní molekuly, io Tyto skupiny mohou zlepšit rozpustnost, poločas životnosti molekuly, absorpci apod. základní molekuly. Tyto skupiny mohou také alternativně zeslabit nežádoucí vedlejší účinky základní molekuly nebo snížit toxicitu základní molekuly. Příklady takových skupin se popisují v řadě textů, jako například Remingtonů Pharmaceutical Sciences.

Popisovanými metodami identifikované sloučeniny mohou být použity samostatně ve vhodných dávkách, které se určují rutinním testováním s cílem dosáhnout optimální inhibici HPV 18 nebo jeho aktivity s minimalizací možné toxicity. Navíc může být žádoucí současné nebo následné podávání jiných prostředků.

S výhodou mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávány v jediné denní dávce, nebo může být celková denní dávka podána v několika dílčích dávkách. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být navíc podávány řadou cest včetně bez omezení cesty intranazální, orální, transdermální nebo použitím čípků.

Pro kombinační léčení více než jedním aktivním prostředkem, kde se aktivní složky nacházejí v oddělených dávkovačích prostředcích, mohou být aktivní složky podávány současně nebo zvlášť v odděleně uspořádaných časech.

Dávkovači režim použití sloučenin podle předkládaného

3o vynálezu se volí podle řady faktorů včetně typu, druhu, věku, hmotnosti, pohlaví a klinického stavu pacienta; vážnosti léčeného ······ · · ······ ·· · ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · ·····« • · · · · · _ 14 - ..... .........

stavu; cesty podávání; jaterní a ledvinové funkce pacienta; a konkrétní použité sloučeniny. Lékař s běžnými znalostmi v oboru může snadno určit a předepsat účinné množství léčiva, vyžadovaného pro prevenci, odvrácení nebo zamezení postupu léčeného onemocnění. Optimální přesnost v dosahování koncentrací léčiva uvnitř mezí, kdy je léčivo účinné a netoxické vyžaduje režim, založený na kinetice, dostupnosti léčiva cílovým místům. K tomu je nutno vzít v úvahu rozdělení, rovnováhu a vylučování léčiva.

Při způsobech podle předkládaného vynálezu mohou tvořit zde podrobně popisované sloučeniny aktivní složku a typicky se podávají ve směsi s vhodnými farmaceutickými diluenty, pomocnými látkami nebo nosiči (souhrnně zde označovanými jako „nosné“ materiály), vhodně zvolenými s ohledem na zamýšlenou formu podávání, tj. orální tablety, kapsle, elixíry, sirupy, čípky, gely apod. v souladu s běžnou farmaceutickou praxí.

Například pro orální podávání ve formě tablety nebo kapsle může být aktivní složka léčiva kombinována s orálním netoxickým farmaceuticky přijatelným inertním nosičem, jako je ethanol, glycerol, voda apod. Kde je to žádoucí nebo nutné, mohou být navíc také do

2o směsi zahrnuty vhodné vazné látky, kluzné látky, látky usnadňující rozpadávání a barviva. Vhodnými vaznými látkami jsou bez omezení škrob, želatina, přírodní cukry jako glukóza nebo beta-laktóza, obilná sladidla (corn sweeteners), přírodní a syntetické gumy jako je akácie, tragakant nebo alginát sodný, karboxymethylceluloza, polyethylenglykol, vosky apod. Kluzné látky, používané v těchto dávkovačích formách, zahrnují bez omezení oleát sodný, stearát sodný, stearát hořečnatý, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný apod. Látky pro usnadnění rozpadávání zahrnují bez omezení škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xantanovou gumu apod.

3o Pro kapalné formy může být aktivní složka léčiva kombinována ve vhodně ochucených suspendujících nebo dispergujících

- 15 ·· · · · • ··· I» 9 prostředcích, jako jsou syntetické a přírodní gumy, například tragakant, akácie, methylceiulóza apod. Další dispergující prostředky, které mohou být použity, zahrnují glycerin apod. Pro parenterální podávání se vyžadují sterilní suspenze a roztoky. Když se vyžaduje s intravenózní podávání, používají se izotonické přípravky, které obsahují obvykle vhodné ochranné látky.

Místní přípravky obsahující aktivní složku léčiva mohou být připraveny smísením s řadou nosných materiálů, které jsou v oboru dobře známy, jako jsou například alkoholy, gel aloe vera, alantoin, glycerin, vitamíny A a E, oleje, minerální oleje, PPG2 myristyl přopionát apod. za vytvoření například alkoholických roztoků, místních čisticích roztoků, čisticích krémů, kožních gelů, kožních omývacích roztoků a šamponů ve formě krémů nebo gelu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány ve formě lipozomových dodávacích systémů, jako jsou malé jednomembránové (unilamellar) váčky, velké jednomembránové váčky a vícemembránové váčky. Lipozomy je možno vytvořit z řady fosfolipidú, jako je cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylchofiny.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také

2o dodávány s použitím monoklonálních protilátek jako individuálních nosičů, na které jsou molekuly sloučenin podle vynálezu navázány. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také navázány na vhodné polymery ve funkci cílených nosičů léčiv. Tyto polymery mohou zahrnovat polyvinylpyrrolidon, pyranový kopolymer, polyhydroxypropylmetakrylamidfenol, polyhydroxyethylaspartamidfenol nebo polyethylenoxidpolylyzin, substituovaný palmitoylovými zbytky. Navíc mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu navázány na látky třídy biodegradovatelných polymerů, použitelných pro získání léčiva s řízeným uvolňováním

3o účinné látky, například na kyselinu polymléčnou, polyepsiionkaprolakton, kyselinu polyhydroxymáselnou, polyortoestery, • ·

- 16 • · polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a zesítěné nebo amfipatické blokové kopoloymery hydrogelů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje nukleotid HPV 18 L1 a odvozené sekvence aminokyselin.

Obr. 2 ukazuje seznam aminokyselinových variací uvnitř proteinu L1 HPV 18.

io Obr. 3 ukazuje nukleotid HPV 18 L2 a odvozené aminokyselinové sekvence.

Obr. 4 ukazuje imunoblot proteinu HPV 18 L1, exprimovaného v kvasinkách.

Obr. 5 ukazuje imunoblot proteinu HPV 18 L2, exprimovaného v 15 kvasinkách.

Obr. 6 ukazuje elektronovou mikrofotografii viru podobných částic, vytvořených proteinem HPV 18 L1, exprimovaných v kvasinkách.

2o Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, aniž by jej však měly nějak omezovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování genomu HPV 18

Celková genomová DNA byla připravena z buněčné linie

SW756, odvozené z lidského cervikálního karcinomu (Freedman, R.

• · · ·

S., a další, 1982, In Vitro, díl 18, str. 719 - 726) standardními způsoby.

DNA byla štěpena EcoRI a byla provedena její elektroforéza na 0,8 procentním preparativním gelu agarózy s nízkou teplotou tání. Byl vyříznut proužek gelu, odpovídající fragmentům DNA s přibližnou délkou 12 kbp. Agaróza byla štěpena s použitím enzymu Agarase™ (Boehringer Mannheim lne.) a DNA rozdělená podle velikostí byla srážena, defosforylována a ligována s EcoR11 štěpenými úseky lambda EMBL4 (Stratagene, lne.). Knihovna lambda byla sbalena s použitím prostředku Gigapack II Gold packaging extract (Stratagene, io lne.). Klony HPV 18 - pozitivní byly identifikovány s použitím 700 bp sondy HPV 18 L1 DNA, která byla vytvořena s použitím PCR s řetězcem SW 756 DNA jako templátem a oligonukleotidovými primery, navrženými podle publikované sekvence HPV 18 L1 DNA (Cole and Danos, 1987, J. Mol. Biol., díl 193: 599 - 608: Genbank Accession #

X05015). Byl izolován HPV 18 - pozitivní klon lambda, který obsahoval inzert 12 kbp fragmentu EcoRI, který byl označen jako #187-1.

Příklad 2

Konstrukce kvasinkových expresních vektorů

Otevřený čtecí rámec (ORF) HPV 18 L1 byl amplifikován pomocí PCR s použitím klonu #187-1 jako templátu, polymerázou Vent polymerase™ (New England Biolabs, lne.), 10 cyklů amplifikace (94 °C, 1 min; 50 ’C, 1 min; 72 °C, 2 min) a následujících oligonukleotidových primerů, obsahujících lemovací místa Bglll (podtržena):

negativní primer 5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGG CGGCCTAGTG-3', pozitivní primer 5'-GAA^T£TTTACTTCCTGGCACGTAC ACGCACACGC-3'.

Negativní primer (sense primer) zavádí bezprostředně proti směru translace (upstream) vůči iniciačnímu methioninovému kodonu HPV 18 L1 (zvýrazněný tučně) kvasničnou nepřekládanou úvodní sekvenci (Kniskern a další, 1986, Gene, díl 46: 135 - 141). PCR produkt L1 o velikosti 1,5 kbp byl štěpen Bglll a čištěn na gelu.

Kvasničný expresní vektor pGAL1-10 byl zkonstruován izolováním fragmentu Sphl o délce 1,4 kbp z plazmidu pUC18 s obousměrným GAL promotorem, který obsahuje divergentní GAL1GAL10 promotory Saccharomyces cerevisiae plazmidu pBM272 io (poskytnutého od: Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Divergentní promotory jsou na obou stranách obklopeny kopií kvasničného terminátoru transkripce ADHI, klonovacím místem BamHI, umístěným mezi promotorem GAL1 a první kopií terminátoru transkripce ADHI a klonovacím místem Smál, umístěným mezi is promotorem GAL10 a druhou kopií terminátoru transkripce ADHI. Kvasničný kyvadlový vektor, sestávající z pBR322, kvasničného genu LEU2d a kvasničného plazmidu 2u (dar od: Benjamin Halí, University of Washington, Seattle, WA). Byl štěpen Sphl a ligován s fragmentem divergentního GAL promotoru Sphl o délce 1,4 kbp, čímž byl získán plazmid pGAL1-10·. pGAL-10 byl linearizován BamHI, který štěpí mezi promotorem GAL1 a terminátorem transkripce ADHI. Vektor štěpený BamHI a PCR fragment HPV 18 L1 štěpený Bglll byly ligovány a použity pro transformaci buněk E. coli DH5 (Gibco BRL, Inc.). Byl izolován plazmid pGAL1-10, který obsahuje gen HPV 18 L1 a který byl označen p191-6.

Byl zkonstruován kvasničný expresní vektor, který spolu exprimuje oba geny HPV 18 L1 a L2. Plazmid p191-6 (pGAL1-10 + HPV 18 L1) byl štěpen Smál, který štěpí mezi promotorem GAL10 a terminátorem transkripce ADHI. Gen HPV 18 L2 o velikosti 1,4 kbp byl amplifikován PCR jak je popsáno výše s použitím oligonukleotidových primerů, které obsahují obklopující místa Smál (podtrženo):

- 19 ···· · negativní primer 5-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATG

GTATCCCACCGTGCCGC ACG AC-3 pozitivní primer

5'-TCC££££££CTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3'.

s Negativní primer zahrnuje kvasničnou nepřekládanou úvodní sekvenci (Kniskern a další, 1986, výše) bezprostředně proti směru překladu vůči iniciačnímu methioninovému kodonu HPV 18 L2 (zdůrazněn tučně). Fragment PCR byl štěpen Smál, purifikován na gelu a ligován s plazmidem p191-6, štěpeným Smál. Byl izolován io plazmid pGAL1-10, obsahující oba geny HPV 18 L1 a L2, který byl označen p195-11.

Příklad 3

Určování typů (typing) klinických vzorků

Vzorky cervikální biopsie byly shromažďovány v Veterans

Administration Medical Center in Indianapolis, IN (laskavostí Dr. Darron Brown) a v Albert Einstein Medical Center in Philadelphia, PA (laskavostí Dr. Joan Adler) a byly zmrazený při - 20 °C. Byla izolována DNA, jak bylo popsáno u Brown a další, 1993 (Brown, D. a další,

1993, J. Clin. Microbiol., díl 31: 2667 - 2673). Stručně, klinický materiál byl zpracován v homogenizátoru Braun mikro-dismembrator II (B. Braun Instuments, Melsungen, Německo) a solubilizován v pufru obsahujícím 10 mM EDTA a 0,6 % (hmotnost/objem) dodecylsulfátu sodného (SDS). Vzorky byly nastaveny na 20 mM Tris pH 7,4 a protein byl štěpen 50 pg/ml Proteinázy K v přítomnosti 0,1 pg/ml RNázy A a extrahován extrakcí fenol/chloroform/izoamylalkoholem. DNA byla vysrážena ethanolem a její množství bylo stanoveno spektrofotometricky. Vzorky DNA byly testovány na přítomnost HPV 18 pomocí PCR a analýzou Southernovým blotem. Úsek čtecího rámce ·· ···· • · · ♦· ·· · · • ·> · · « · • · · · ·»·«·« • · · · 9 ·

- 20 - .....

HPV 18 L1 o délce 256 bp byl amplifikován pomocí PCR s použitím následujících oligonukleotidových příměrů:

negativní primer

5-CAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATG-3'.

pozitivní přiměř

5’-CATCATATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTG-3'.

Podmínky PCR byly použity podle doporučení výrobce pro kit AmpliTaq™ DNA Polymarase/GeneAmp™ kit (Perkin Elmer Corp.) s výjimkou toho, že jako templátu bylo použito 0,5 μΙ klinického vzorku io DNA a v konečné reakční směsi bylo 10 pmol každého z primerů, 2 mM dinukleotidfosfátů a 2,0 mM MgCI₂. Denaturační krok 2 min při 94 ’C byl následován 40 cykly amplifikace (94 °C, 1 min; 45 °C, 1 min; 72 °C, 1 min). S produkty PCR byla provedena elektroforéza na 3,0 % agarózovém gelu, který byl blotován na nylonové membrány a is hybridizován s oligonukleotidovou sondou specifickou proti HPV 18

L1, značenou ³²P.

Příklad 4

Sekvenování DNA genů L1 a L2

Geny HPV 18 L1 a L2 klonů #187-1, p191-6 a p195-11 byly sekvenovány s použitím kitu PRIZM Sequencing kit a automatického sekvenátoru DNA ABI Sequencer #373A (Applied Biosystems). Pro získání konvenční (consensus) sekvence HPV 18 byly z lidských klinických izolátů amplifikovány PCR části DNA genu L1, sekvenovány a porovnány s nárokovanými a publikovanými sekvencemi. Pro tento účel byl z každého klinického izolátu DNA amplifikován fragment o délce 256 bp (nukleotidy 817 - 1072) s použitím oligonukleotidů a cyklů zahřívání, popsaných v příkladu 3.

«· <··*

-21 99 9 · 9

Pro amplifikaci aminokoncové části L1 DNA o délce 432 bp (nukleotidy 1 - 431) bylo použito následujících primerů

5-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG3’ a 5’- CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3' s použitím cyklů zahřívání, popsaných v příkladu 3. Oba produkty PCR byly odděleně ligovány s plazmidem pCRII (Invitrogen Corp.) s použitím reagencií a postupů doporučených výrobcem. Z transformantů byla izolována plazmidová DNA a transformanty obsahující inzerty EcoRI byly sekvenovány.

Příklad 5

Analýza DNA a odvozených aminokyselinových sekvencí

Nukleotidové a odvozené aminokyselinové (aa) sekvence nárokovaného HPV 18 L1 jsou ukázány v obr. 1. Sekvence DNA byla odvozena z konvenčních klonů #187-1, p191-6 a p195-11. Srovnání nárokované nukleotidové sekvence HPV 18 L1 s publikovanou sekvencí HPV 18 L1 (Genbank Accession #X05015) identifikovalo z 1524 párů bází změny ve 20 párech bází. Pět ze změn nukleotidů (C na G v poloze 89, C na A v poloze 263, C na G v poloze 848, G na A v poloze 967 a C na G v poloze 1013) má za následek substituce aminokyselin. Odlišnosti pěti zbytků od publikovaných jsou P na R v polohách aminokyselin 30, 283 a 338, T na N v poloze aminokyselin 88 a V na I v poloze 323 (obr. 2). Polohy 88 a 323 představují konzervativní změny, zatímco tři změny P na R mohou podstatně změnit fyzikální vlastností exprimovaného proteinu L1. Porovnání sekvence aminokyselin, odvozené z klinických izolátů (čísla 354, 556, 755, 697, 795 a 23) s nárokovanou sekvencí a publikovanou sekvencí je ukázáno v obr. 2. Existují čtyři polohy, ve kterých se klinické izoláty a nárokovaná sekvence odlišuje od publikované sekvence. Polohy 30,

3o 283 a 338 kódují arginin (R) ve všech dosud nalezených izolátech • ·

- 22 - ····· ······ .

včetně nárokované sekvence. To je v ostrém kontrastu s publikovanou sekvencí, která má na každé z těchto poloh proliny (P). Dále v poloze 88 izolátů a nárokované sekvence se nalézá asparagín (N), zatímco u publikované sekvence threonin (T). Poslední rozdíl v poloze 323 je v mnoha klinických izolátech a publikovaném řetězci valin (V), zatímco v nárokované sekvenci a jednom z izolátů (#23) je přítomen izoleucin (I). Závěr je, že nárokovaná sekvence odráží převažující virální sekvence, spojené s klinickými infekcemi, a nepřítomnost izolátů obsahujících na některé z poloh 30, 328 nebo 338 proliny podle io publikované sekvence patrně znamená, že publikovaný klon je buď artefakt nebo subtyp bez pokračování.

Nukleotidové a odvozené konvenční sekvence HPV 18 L2 byly odvozeny ze správných sekvencí klonů #187-1 a p195-11 a jsou ukázány v obr. 3. Porovnání nukleotidové sekvence L2 s publikovanou ís sekvencí HPV 18 (Genbank Accession #X05015) identifikovalo změny 40 párů bází z 1389 párů bází. Rozdíly v párech bází mají za následek 14 změn na úrovni aminokyselin; P na S v poloze aminokyselin 29, P na N v poloze 33, A na S v poloze 177, D na E v poloze 266, D na N v poloze 270, D na G v poloze 346, M na I v poloze 355, V na M v poloze 359, S na ’P v poloze 365, F na S v poloze 369, F na V v poloze 371, F na S v poloze 372, K na T v poloze 373 a S na P v poloze 409.

Příklad 6

Vytváření antiséra HPV 18 L2

Specifické protilátky proti HPV 18 L2 byly připraveny v kozách s použitím fúzního proteinu řrpE-HPV 18 L2, exprimovaného v E. coli. Otevřený čtecí rámec s úplnou délkou L2 byl amplifikován PCR s použitím oligonukleotidových primerú, poskytujících štěpící místa

3o Hindlll a BamHI, obklopující 5’- a 3’- konce. Fragment L2 byl vložen do expresního plazmidu pATH23, štěpeného HindlII-BamHI (Koerner a

-23 další, 1991, Meth. Enzymol., díl 194: 477 až 490). Fúzní protein byl exprimován v buňkách E. coli RRI (Gibco BRL, lne.) po indukci kyselinou 3-b-indolakrylovou. Nerozpustná frakce byla analyzována pomocí SDS-PAGE, následovanou barvením Coomassie Blue. Fúzní protein trpE-L2 odpovídal za větší část nerozpustné frakce E. coli. Kozy byly imunizovány fúzním proteinem trpE-L2 podle standardního protokolu pro fúzní proteinové antigeny firmy Pocono Rabbit Farm and Laboratory, lne., Protein Rabbit Farm, Canadensis, PA).

io Příklad 7

Příprava kvasinkového kmene U9

Byl získán kmen Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3 (MATa/pňa, Ieu2-O4, ade1, cir°) od: Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Buňky kmene 2150-2-3 byly přes noc pomnoženy při 30 °C v 5 ml média YEHD (Carty a další, J. Ind. Micro 2 (1987) 117 - 121). Buňky byly třikrát promyty sterilní destilovanou vodou, resuspendovány ve 2 ml sterilní destilované vody a 0,1 ml buněčné suspenze bylo vyseto na každou z šesti ploten s kyselinou 5fluoroorotovou (FOA), aby byly vyselektovány mutanty ura3 (Cold

Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Plotny byly inkubovány při 30 °C. Médium obsahovalo na 250 ml destilované vody: 3,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokyselin a síranu amonného; 0,5 g kyseliny 5-fluoroorotové; 25 mg uracilu a 10,0 g dextrózy.

Médium bylo sterilizováno filtrací přes membrány 0,2 pm a potom smícháno s 250 ml 0,4 % Bacto-Agaru (Difco), udržovaného při 50 °C, 10 ml roztoku adeninu 1,2 mg/ml a 5 ml roztoku L-leucinu (180 mg/50 ml). Výsledné médium bylo rozpínáno do 20 ml Petriho misek.

Po pěti dnech inkubace se objevily četné kolonie. Jednotlivé

3o kolonie byly izolovány rozetřením kolonií z počátečních ploten FOA na

čerstvé plotny FOA, které byly potom inkubovány při 30 °C. Větší počet kolonií z druhé sady ploten FOA byl testován na přítomnost mutace ura3 replikačním vysetím na jak plotny YEHD, tak plotny uracil-minus. Žádaným výsledkem byl dobrý růst na plotnách YEHD a žádný růst na médiu uracil-minus. Byl získán jeden izolát (U9), který měl tyto vlastnosti. Byl uložen ve formě zmrazeného glycerolového zásobního roztoku ( kmen #325) při - 70 °C pro pozdější použití.

Příklad 8 io Příprava vektoru pro přerušení kvasničného genu MNN9

Pro přípravu vektoru pro přerušení genu MNN9 bylo nejprve nutné klonovat gen MNN9 z genomové DNA S. cerevisiae. To bylo uskutečněno standardní technologií polymerázové řetězové reakce (PCR). 5’ negativní primer a 3’ pozitivní primer pro PCR kódující sekvence MNN9 s úplnou délkou byly navrženy podle publikované sekvence kvasničného genu MNN9 (Zymogenetics: Evropská patentová přihláška No. 88117834.7, č. zveřejnění 0-314-096-A2). Bylo použito následujících oligodeoxynukleotidových primerů, obsahujících obklopující štěpící místa Hindlll (podtržená):

2o negativní primer

5’-CTT AAA GCTTAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’ pozitivní primer

5’-TGA TAAGCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’.

Iniciační methioninový kodon genu MNN9 je zvýrazněn tučně.

PCR byla prováděna s použitím genomové DNA S. cerevisiae kmene

JRY188 jako templátu, TaqDNA poiymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklů ampiifikace (94 °C, 1 min; 37 °C, 2 min; 72 °C, 3 min). Výsledný fragment PCR o délce 1,2 kbp byl štěpen Hindlll, čištěn na gelu a _ 25 - ..... .......

ligován s plazmidem pUC13 (Pharmacia), štěpeným Hindlll a alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid byl označen p1183.

Aby bylo možno přerušit gen MNN9 kvasničným genem URA3, byl plazmid pBR322-URA3 (který obsahuje fragment Hindlll o délce

1,1 kbp, kódující gen S. cerevisiae URA3, subklonovaný do místa

Hindlll plazmidu pBR322) štěpen Hindlll a fragment DNA o velikosti 1,1 kbp, nesoucí funkční gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupým koncem a potom ligován s plazmidem p1183, štěpeným Pmll (enzym Pmll štěpí uvnitř kódující io sekvence MNN9).

Výsledný plazmid p1199 obsahuje přerušení genu MNN9 funkčním genem URA3.

Příklad 9

Konstrukce derivátu U9 kmene 1372, obsahující přerušeny gen MNN9

Pro přerušení genu MNN9 v kmenu U9 (#325) bylo štěpeno 30 pg plazmidu p1199 enzymem Hindlll pro vytvoření lineární přerušující kazety mnn9::URA3. Buňky kmene 325 byly transformovány sféroplastovou metodou (Hinnen a další, 1978, Proč.

-2Ω Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929 - 1933) DNA p1199, štěpenou Hindlll a byla prováděna selekce transformantů na syntetickém agarovém médiu bez uracilu s obsahem 1,0 M sorbitolu. Syntetické médium obsahovalo na litr destilované vody: agar, 20 g; kvasničná dusíkatá báze bez aminokyselin, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrozin, 0,05 g;

sorbitol, 182 g; glukóza, 20 g; a bezleucinový roztok #2, 10 ml. Bezleucinový roztok #2 obsahuje na litr destilované vody: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-izoleucin, 6 g; L-lyzin, 4 g; Lmethionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-threonin, 6 g; a L-tryptofan, 4 g.

Plotny byly inkubovány 5 dnů při 30 °C, přičemž se objevily

3o početné kolonie. Preparáty chromozomální DNA byly připraveny z 10

-26 kolonií a potom byly štěpeny směsí EcoRI a HindlII. DNA štěpy byly potom vyhodnoceny Southernovým blotem (J. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) s použitím fragmentu HindlII o délce

1,2 kbp nesoucího gen MNN9 (izolovaný z plazmidu p1199) jako sondy. Byl identifikován izolát (kmen #1372), který vykazoval očekávaný posun pruhů DNA na Southernově blotu stejně jako extrémní shlukování, které typicky vykazují mutanty mnn9.

io Příklad 10

Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu HIS3

Aby bylo možno zkonstruovat přerušující kazetu, ve které je gen HIS3 S. cerevisiae přerušen genem URA3, plazmid YEp6 (K. Struhl a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76: 1035) byl štěpen BamHI a fragment BamHI o délce 1,7 kbp, nesoucí gen HIS3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy byl zakončen tupými konci a ligován s plazmidem pUC18, který byl předtím štěpen BamHI a poté T4 DNA polymerázou. Výsledný plazmid (označený p1501 nebo pUC18-HIS3) byl štěpen Nhel (který štěpí uvnitř kódující sekvence HIS3) a fragment

2o vektoru byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a potom štěpen telecí žaludeční alkalickou fosfatázou. Gen URA3 byl izolován z plazmidu pBR322-URA3 štěpením HindlII a fragment o délce 1,1 kbp, nesoucí gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a ligován s výše uvedeným Nhel fragmentem pUC18-HIS3. Výsledný plazmid (označený pUC18-his3::URA3 nebo p1505) obsahuje přerušující kazetu, ve které je kvasničný gen HIS3 přerušen funkčním genem URA3.

• · · · · ·

-27Příklad 11

Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu PRB1 genem

HIS3

Plazmid FP8ÁH nesoucí gen PRB1 S. cerevisiae byl poskytnut od: Dr. E. Jones , Carnegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle a další, 1987, Genetics 115: 255 - 263). Tento plazmid byl štěpen směsí Hindlll a Xhol a fragment DNA nesoucí gen PRB1 o délce 3,2 kbp byl čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18 byl štěpen BamHI, čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA io polymerázy tupými konci. Výsledný vektorový fragment byl ligován s výše uvedeným genovým fragmentem PRB1 za vzniku plazmidu pUC18-PRB1. Plazmid YEp6, který obsahuje gen HIS3, byl štěpen BamHI. Výsledný fragment BamHI o délce 1,7 kbp, nesoucí funkční gen HIS3 byl vyčištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18-PRB1 byl štěpen EcoRV a Ncol, které štěpí uvnitř kódující sekvence PRB1 a odstraňují aktivní místo proteázy B a obklopující sekvence. Fragment EcoRV-Ncol o délce 5,7 kbp nesoucí zbytkové části 5’ a 3’ kódující sekvence PRB1 v pUC18 byl vyčištěn na gelu, zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci, defosforylován telecí žaludeční alkalickou fosfatázou a ligován s výše popsaným fragmentem HIS3 s tupými konci. Výsledný plazmid (označený pUC18-prb1::HIS3, zásobní vzorek #1245) obsahuje na místě části genu PRB1, který byl výše odstraněn funkční gen HIS3.

Příklad 12

Konstrukce kvasničného kmene příbuzného U9, obsahujícího přerušení v genech MNN9 i PRB1

V příkladu 9 byl popsán kmen 1372 příbuzný U9, který obsahuje přerušení genu MNN9. Klonální izoláty kmene 1372 byly pasážovány na plotnách FOA flak bylo popsáno v příkladu 7) pro selekci mutantů • · · ·

- 28 ura3. Bylo získáno větší množství ura3 izolátů kmene 1372 a pro následné přerušení genu HIS3 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930-190-S1-1). Přerušující vektor (p1505) genu pUC18-his3::URA3 byl štěpen Xbal a EcoRI pro vytvoření lineární přerušující kazety his3::URA3 a použit pro transformaci kmene 12930-190-S1-1 lithiumacetátovou metodou (Methods in Enzvmology, 194: 290 (1991)). Na syntetickém agarovém médiu bez uracilu byla provedena selekce transformantů Ura⁺, které byly rozetřeny pro získání jednotlivých klonů na stejném médiu a potom replikačně vysety na médium buď bez io uracilu nebo bez histidinů pro získání izolátů, které byly jak Ura⁺ tak His'. Pro následné přerušení genu PRB1 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930-230-1). Vektor (pUC18-prb1::HIS3, zásobní vzorek #1245), přerušující gen PRB1, byl štěpen Sací a Xbal pro vytvoření lineární přerušující kazety prb1::HIS3 a použit pro transformaci kmene

12930-230-1 lithiumacetátovou metodou. Na agarovém médiu bez histidinů byly získány transformanty His*, které byly rozetřeny na stejném médiu pro získání jednotlivých kolonií. Z většího počtu His* izolátů byla připravena genomická DNA, štěpena EcoRI a potom provedena její elektroforéza na 0,8 % agarózových gelech. Potom byla

2o provedena analýza Southernovým blotem s použitím radioaktivně značené sondy o délce 617 bp na gen PRB1, která byla připravena pomocí PCR s použitím následujících oligodeoxynukleotidových primerů:

5’ TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3'

5’ CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3’

Bylo získáno 11 izolátů, které vykazovaly očekávanou hybridizaci sondy s fragmentem 2,44 kbp prb1::HIS3 DNA. To bylo v kontrastu s hybridizaci sondy s fragmentem o délce 1,59 kbp u genu

3o PRB1 standardního typu. Jeden z těchto izolátů obsahujících

-29 • « ttt požadované přerušení prb1::HIS3 byl vybrán pro další použití a byl označen jako kmen #1558.

Příklad 13

Exprese HPV18 L1 a L2 v kvasinkách

Pro transformaci kmene #1558 S. cerevisiae (MATa, Ieu2-O4, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, ciť) byly použity plazmidy p191-6 (pGAL1-10+HPV18 L1) a p195-11 (pGAL1-10+HPV18 L1 + L2). Izoiáty jednotlivých kolonií rostly na médiu YEHD obsahujícího 2 % galaktózy io při 30 °C 88 hodin. Po sklizení buněk byl buněčné centrifugáty rozbity skleněnými kuličkami a buněčné lyzáty analyzovány na expresi proteinu HPV18 L1 a/nebo HPV18 L2 analýzou pomocí imunoblotů. Byla provedena elektroforéza vzorků obsahujících 25 pg celkového buněčného proteinu na gelech 10 % Tris-Glycine (Novex, Inc.) za denaturačních podmínek a dále elektrobiotování na nitrocelulózové filtry. Pomocí králičího antiséra, vytvořeného proti fúznímu proteinu řrpE-HPV11 L1 jako primární protilátka (Brown a další, 1994, Virology 201: 46 - 54) a ke křenové peroxidáze (HRP) připojeného oslího protikráličího IgG' (Amersham, Inc.) jako sekundární protilátky byl

2o imunologicky detekován protein L1. Filtry byly zpracovány s použitím chemiluminiscenčního kitu ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). Proteinový pruh L1 o velikosti 50 - 55 kDa byl detekován jak v L1, tak i L1 + L2 koexprimujících kvasničných klonech (kmeny 1725, popřípadě 1727) a ne v negativní kontrole (pGAL1-10 bez genů L1 nebo L2) (obr. 4).

Protein HPV18 L2 byl detekován analýzou westernovými bloty s použitím kozího polyklonálního antiséra, vytvořeného proti fúznímu proteinu frpE-HPV18 L2 jako primární protilátky a králičího protikozího IgG konjugovaného s HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories,

3o Gaithersburg, MD). Filtry byly zpracovány výše popsaným způsobem. Protein L2 byl detekován jako pruh proteinu o velikosti 75 kDa v L1 +

- 30 L2 koexprimujícím kvasničném klonu (kmen 1727), ale ne jak v negativní kontrole, tak i v L1 exprimujícím klonu (obr. 5).

Příklad 14

Fermentace HPV18 L1 (kmen 1725) a 18 L1 + AL2 (kmen 1727)

Povrchová kultura kmenů 1725 a 1727 na plotnách byla asepticky převedena do bezleucinového kapalného média, obsahujícího (na 1 litr): 8,5 g kvasničné dusíkaté báze bez aminokyselin a síranu amonného Difco; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; io 10 g kyseliny jantarové; 5 g síranu amonného; 40 g glukózy; 0,25 g Ltyrozinu; 0,1 g L-argininu; 0,3 g L-izoleucinu; 0,05 g L-methioninu; 0,2 g L-tryptofanu; 0,05 g L-histidinu; 0,2 g L-lyzinu; 0,3 g L-fenylalaninu; v tomto médiu bylo pH před sterilizací nastaveno pomocí NaOH na 5,0 - 5,3. Po růstu při 28 °C na rotační třepačce při 250 ot/min byly připraveny přídavkem sterilního glycerolu na konečnou koncentraci 17 % (hmotnost/objem) před skladováním při - 70 °C (1 ml na zamražovací ampuli) ampule zamražené kultury. Inokula byla pomnožována ve stejném médiu (500 ml na 2 I baňku), přičemž kultivace byla započata převedením roztátého obsahu zmrazené

2o ampule s kulturou a inkubací při 28 °C a 250 ot/min na rotační třepačce po dobu 29 hodin. Fermentace pro každý kmen byly prováděny ve fermentoru New Brunswick SF-116 s pracovním objemem po inokulaci 10 I. Produkční médium obsahovalo v 1 I: 20 g kvasničného extraktu Difco; 10 g peptonu Sheffield HySoy; 20 g glukózy; 20 g galaktózy; 0,3 ml odpěňovadla Union Carbide UCON LB625; pH média bylo před sterilizací upraveno na 5,3. Do fermentoru byl převeden celý obsah (500 ml) 2 I inokulační baňky a inkubace probíhala při 28 °C, 400 ot/min a 5 I vzduchu za minutu při tlaku 24,1 kP. Podle potřeby bylo zvyšováno míchání pro zachování obsahu

3o rozpuštěného kyslíku většího než 40 % saturace. Postup fermentace byl monitorován měřením glukózy v odebraných vzorcích (Beckman ····

Glucose 2 Analyzer) a on-line hmotovou spektrometrií (Perkin-Elmer 1200). Po inkubaci po dobu 66 hodin bylo dosaženo hustoty buněk 9,5 až 9,7 g buněčné sušiny na litr. Kultury byly koncentrovány filtrem s dutými vlákny (patrona Amicon H5MP01-43 ve filtračním systému

Amicon DC-10) na přibližně 2 I, diafiltrovány 2 I roztoku soli s fosfátovým pufrem a před rozpínáním do 500 ml centrifugačních lahví dále koncentrovány (na přibližně 1 I). Zcentrifugované buňky (centrifugace při 8000 ot/min, rotor Sorval GS-3, 20 min, 4 °C) byly po odlití supernatantu skladovány při - 70 °C až do použití. Celkový io výtěžek byl 191 - 208 g mokré biomasy.

Příklad 15

Purifikace rekombinantních kapsidových proteinů HPV typ 18 L1

Všechny kroky byly prováděny při 4 °C, pokud není uvedeno jinak.

Buňky byly skladovány ve zmrazeném stavu při - 70 °C. Zmrazené buňky (mokrá hmotnost = 126 g) byly roztaveny při 20 23 °C a resuspendovány v 70 ml pufru „Breaking Buffer“ (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl). Byly přidány inhibitory

2o proteáz PMSF a pepstatin A na konečnou koncentraci 2 mM, popřípadě 1,7 μΜ. Buněčná kaše byla rozbita při tlaku přibližně 110 MPa čtyřmi průchody zařízením M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA). Kaše rozbitých buněk byla centrifugována pro odstranění rozdrcených buněk 40 min při 12 000 x g. Supernatant obsahující antigen L1 byl oddělen. Supernatant byl zředěn v poměru 1 : 5 přídavkem pufru A (20 mM MOPS, pH 7,0) a nanesen na zachytávací kolonu (9,0 cm vnitřní průměr x 3,9 cm) s aniontovým iontoměničem Fractogel® EMD TMAE-650 (M) (EM Separations, Gibbstown, NJ), ekvilibrovanou v pufru A. Po promytí pufrem A byl antigen eluován gradientem 0 - 1,0 M NaCl v pufru A. Frakce z kolony byly testovány Bradfordovou metodou na celkový obsah proteinů.

• ·

Frakce potom byly analyzovány při stejném množství nanášeného proteinu westernovým blotováním a SDS-PAGE s detekcí barvením stříbrem.

Byly shromážděny frakce TMAE, které měly srovnatelnou čistotu 5 a obohacení proteinem L1. Antigen byl koncentrován frakcionací síranem amonným. Roztok byl nastaven na obsah 35 % saturace síranem amonným přídavkem pevné chemikálie za mírného míchání v průběhu 10 minut. Vzorek byl uložen na led a srážení probíhalo 4 hodiny. Vzorek byl centrifugován 45 minut při 16 000 x g. Centrifugát io byl resuspendován ve 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH

7,2, 150 mM NaCl).

Resuspendovaný centrifugát byl chromatografován na gelové koloně (size exclusion) o rozměrech 2,6 cm vnitřní průměr x 89 cm s pryskyřicí Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluční pufr byl PBS. Frakce byly analyzovány westernovým blotováním a SDSPAGE s detekcí barvením stříbrem. Shromážděny byly nejčistší frakce. Výsledný roztok byl zakoncentrován v 50 ml míchané cele s použitím plochých membrán 43 mm YM-100 (Amicon, Beverly, MA) při tlaku dusíku 27,6 - 41,3 kPa.

Konečný produkt byl analyzován westernovým blotováním a

SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Bylo odhadnuto, že protein L1 je z 50 - 60 % homogenní. Identita proteinu L1 byla potvrzena westernovým blotováním. Konečný produkt byl rozdělen do alikvotů a skladován při - 70 °C. Tento postup poskytl celkem 12,5 mg proteinu.

Bradfordův test na celkový protein

Celkový protein byl stanoven s použitím komerčně dostupného kitu Coomassie Plus® kit (Pierce, Rockford, IL). Vzorky byly na potřebnou koncentraci zředěny vodou Milli-Q. Bylo zapotřebí objemů 0,1 ml a 1,0 ml pro standardizaci, popřípadě pro protokoly mikrostanovení. Pro oba protokoly byl použit pro vytvoření standardní křivky BSA (Pierce, Rockford, IL). Test byl prováděn podle doporučení

- 33 • · · · · ··» ··* výrobce. Standardní křivky byly vyneseny na počítači Macintosh líci s použitím software Cricket Graph®.

SDS-PAGE a westernové blotování

Všechny gely, pufry a elektroforetické přístroje byly získány od firmy Novex (San Diego, CA) a testy byly prováděny podle doporučení výrobce. Stručně, vzorky byly zředěny na stejné koncentrace proteinu vodou Milli-Q a smíseny v poměru 1 : 1 se vzorkovým inkubačním pufrem, obsahujícím 200 mM DTT. Vzorky byly inkubovány 15 min při 100 °C a naneseny na předem připravené 12 % Tris-glycinové gely. io Elektroforéza probíhala při 125 V 1 hodinu 45 min. Gely byly vyvinuty buď s použitím barvení stříbrem nebo obměnou metody podle Heukeshoven a Dernick (Electrophoresis, 6 (1985) 103 - 112) nebo koloidním barvením Coomassie s použitím komerčně získaného kitu (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Pro westernové blotování byly proteiny převedeny při 25 V po dobu 40 min na membrány PVDF. Membrány byly omyty vodou Milli-Q a usušeny na vzduchu. Primární protilátkou bylo polyklonální králičí antisérum vytvořené proti fúznímu proteinu TrpE-HPV11L1 (dar od Dr. D. Browna). Předchozí experimenty ukázaly, že toto antisérum křížově reaguje na westernových blotech s HPV typu 18 L1. Roztok protilátky byl připraven zředěním antiséra v blotovacím pufru (5 % odtučněné mléko v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu při 20 - 23 °C. Blot byl promýván třikrát vždy 1 min v čerstvém PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok druhé protilátky byl připraven zředěním kozího protikráličího IgG antiséra, konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v blotovacím pufru. Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu za stejných podmínek. Bloty byly promyty jako dříve a detekovány pomocí jednostupňového substrátu

3o NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

• 0

- 34 000 0 0

Příklad 16

Elektronmikroskopické studie

Pro elektronmikroskopickou analýzu (Structure Probe, West Chester, PA) byl alikvot každého vzorku umístěn na uhlíkem pokryté měděné mřížky 200 mesh. Po 20 s byla na mřížku umístěna kapka dvouprocentní kyseliny fosfowolframové (PTA), pH 7,0. Mřížky byly ponechány před vyšetřením transmisní elektronovou mikroskopií usušit na vzduchu. Veškerá mikroskopická pozorování byla prováděna s použitím transmisního elektronového mikroskopu JEOL 100CX io (JEOL USA, lne.) s urychlovacím napětím 100 kV. Vytvořené mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 000 x. Viru podobné částice v rozmezí velikostí 50 - 55 nm byly pozorovány ve vzorku kvasinek nesoucím expresní plazmid HPV 18 L1 (obr. 6). V kontrolních vzorcích kvasinek nebyly pozorovány žádné virům podobné částice.

Příklad 17

Subklonování HPV18 cDNA do expresních vektorů cDNA kódující HPV 18 je subklonována do několika vektorů pro expresi proteinu HPV 18 v transfekovaných hostitelských buňkách a pro transkripci/translaci in vitro. Těmito vektory jsou pBluescript II SK+ (když je exprese řízena promotory T7 nebo T3), pcDNA l/Amp (když je exprese řízena promotorem cytomegaloviru (CMV)), pSZ9016-1 (když je exprese řízena LTR promotorem (long terminál repeat) HIV) a bakulovirový transferový vektor pAcUW51 (PharMingen, lne.) (když je exprese řízena polyhedrinovým (PH) promotorem) pro produkci rekombinantního bakuloviru, obsahujícího DNA sekvenci, kódující HPV 18.

a) pBluescript II SK+:HPV18. Klon cDNA HPV 18 plné délky se získá z bakteriofága lambda omezeným štěpením EcoRI a

3o ligováním do EcoRI štěpeného, ClP-štěpeného plazmidu pBluescript II ·· ···· ·· ···· • · · +· ·· · · · • * · · · · · • · · · ··>*··· • · · · · ·

- 35 - ..............

SK+. Získají se oddělené subklony, ve kterých následuje vždy po T7 nebo T3 promotorech negativní orientace HPV 18.

b) pcDNA l/Amp:HPV18. Pro umožnění směrového klonování se HPV 18 vyřízne z čištěného plazmidového preparátu pBluescript II

SK+:HPV18, ve kterém je sekvence HPV 18 DNA umístěna po směru vzhledem k T7 promotoru, pomocí enzymů EcoRV a Xbal. Výsledný fragment EcoRV, Xbal HPV 18 je čištěn a ligován do plazmidu pcDNA l/Amp štěpeného EcoRV, Xbal a CIP tak, že DNA kódující HPV 18 je umístěna po směru vzhledem k promotoru CMV.

io c) pSZ9016-1:HPV18. HPV 18 se vyřízne z čištěného plazmidového preparátu pBluescript II SK+:HPV18 omezeným štěpením EcoRI a následným čištěním fragmentu 1,3 kb z agarózového gelu. Výsledný fragment EcoRI HPV 18 je ligován do plazmidu pSZ 9016-1, štěpeného EcoRI a CIP. Vyberou se subklony, ve kterých je negativní orientace HPV 18 po směru vzhledem k promotoru HIV LTR.

d) pAcUW51:HPV18 L1. Otevřeny čtecí rámec HPV 18 L1 s plnou délkou se zesílí pomocí PCR z klonu # 187-1 s použitím oligonukleotidových primerů, poskytujících obklopující místa Bglll. Gen

L1 byl vložen do místa BamHI bakulovirového transferového viru pAcUW51 (PharMingen, Inc.) pod kontrolou polyhedrinového promotoru. Byly vytvořeny rekombinantní bakuloviry, obsahující expresní kazetu HPV 18 L1 podle postupů, popsaných v manuálu Pharmingen. Rekombinantní klony byly čištěny omezeným ředěním a dot blot hybridizací.

• ·

- 36 Příklad 18

Exprese polypeptidu HPV 18 transkripcí/translací in vitro a transfekcí do hostitelských buněk

Vektory obsahující sekvence HPV DNA se používají pro řízení translace polypeptidu HPV 18 v lyzátech králičích retikulocytů, savčích hostitelských buňkách a v bakuloviry infikovaných hmyzích buňkách. Experimentální postupy jsou shodné s instrukcemi výrobce.

a) Transkripce/translace in vitro. Plazmidová DNA pBluescript lil SK+:HPV18 (s HPV18 v orientaci T7) se linearizuje io štěpením BamHI po směru vzhledem k inzertu HPV18. Linearizovaný plazmid se čistí a používá jako templát pro transkripci s použitím T7 RNA polymerázy v přítomnosti m7G(5’)ppp(5’)G. Výsledné čepičkou zakončené transkripty HPV18 se čistí srážením LiCI a používají pro řízení translace HPV18 v lyzátu králičích retikulocytů předem is ošetřených nukleázou v přítomnosti L-[³⁵S]methiotinu.

b) Exprese v savčích buňkách. Protein HPV18 se exprimuje v savčích hostitelských buňkách po transfekci buď pcDNA l/Amp:HPV18 (pod řízením promotoru CMV) nebo pSZ9016-1:HPV18 (pod řízení promotoru HIV LTR). Ve druhém případě (pSZ90162o 1:HPV18) jsou buňky kotransfekovány s TAT expresním plazmidem pSZ90161:TAT. Pro oba expresní plazmidy HPV18 se transfekují buňky COS-7 s použitím buď DEAE-dextranu nebo lipofektinu s Lipofectaminem (BRL).

c) Exprese ve hmyzích buňkách. Bakulovirový transferový vektor pAcUW51:HPV18L1, obsahující HPV18 L1 se použije pro produkci rekombinantního bakuloviru (Autographa caiifornica) homologní rekombinací in vivo. Epitop označený HPV18L1 je pak exprimován ve hmyzích buňkách Sf9 (Spodoptera frugiperda), rostoucích v suspenzní kultuře o infekci rekombinantním bakulovirem,

3o obsahujícím HPV18.

• · · ·

- 37 Příklad 19

Sloučeniny ovlivňující aktivitu HPV18 je možno detekovat řadou způsobů. Způsob identifikace sloučenin, které ovlivňují HPV 18, zahrnuje:

(a) smísení testované sloučeniny s roztokem obsahujícím HPV18 za vytvoření směsi;

(b) měření aktivity HPV18 ve směsi; a (c) srovnání HPV18 ve směsí se standardem.

io Sloučeniny, které ovlivňují aktivitu HPV18, mohou být součástí farmaceutických prostředků. Takové farmaceutické prostředky mohou být použitelné pro léčení onemocnění nebo stavů, charakterizovaných infekcí HPV18.

Příklad 20

Pomocí sondy se detekuje DNA, která je strukturou příbuzná k DNA kódující HPV18. Vhodnou sondu je možno odvodit od DNA, která má celou nebo část nukleotidové sekvence z obr. 1 nebo obr. 3, RNA kódované DNA, která má celou nebo část nukleotidové sekvence z

2o obr. 1 nebo obr. 3 nebo degenerovaných oligonukleotidú, odvozených od části sekvence obr. 1 nebo obr. 3.

Zastupuje:

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná a čištěná molekula DNA, kódující lidský

5 papilomavirus typ 18 nebo její funkční derivát.

2. Izolovaná a čištěná molekula DNA podle nároku 1, zvolená z nukleotidové sekvence uvedené v obr. 1, nukleotidové sekvence uvedené v obr. 3, funkčního derivátu nukleotidové io sekvence uvedené v obr. 1 a funkčního derivátuu nukleotidové sekvence, uvedené v obr. 3.

3. Expresní vektor pro expresi molekuly DNA podle nároku 1 v hostiteli.

4. V podstatě čištěný protein, kódovaný molekulou DNA podle nároku 1.

5. Protilátka, vyznačující se tím, že

2o imunologicky reaguje se sloučeninou, zvolenou z molekuly

DNA podle nároku 1, RNA komplementární s DNA molekulou podle nároku 1 nebo proteinu, kódovaného molekulou DNA podle nároku 1.

25

6. Způsob exprese proteinu lidského papilomaviru typu 18 v hostiteli, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) převedení expresního vektoru podle nároku 4 do vhodného hostitele; a (b) kultivaci hostitele z kroku (a) za podmínek, které dovolují expresi proteinu lidského papilomaviru typu 18 z expresního vektoru.

5

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e protein se volí z proteinu HPV 18 L1, proteinu HPV 18 L2 a jejich kombinací.

8. Prostředek schopný indukovat imunologickou odpověď u io subjektu léčeného tímto prostředkem, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu zvolenou z molekuly DNA podle nároku 1, peptidů kódovaných molekulou DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1 nebo jejich kombinací.

9. Vakcína pro prevenci nebo léčení infekce člověka papilomavirem, vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu zvolenou ze skupiny obsahující molekulu DNA podle nároku 1, peptidy kódované molekulou

20 DNA podle nároku 1, RNA komplementární k DNA molekule podle nároku 1 nebo jejich kombinace.

10. Způsob indukce imunologických odpovědí proti infekci nebo onemocnění, způsobenému lidským papilomavirem,

25 vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení molekuly DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1, proteinu kódovaného molekulou

DNA podle nároku 1 nebo jejich kombinace do zvířete nebo člověka.

• · · · • · · · · · • · · ···· · · · • · · · · · · • · · · ······ • · · · · ·

11. Virům podobné částice vyznačující se tím, ž e obsahují rekombinantní protein L1 nebo rekombinantní proteiny L1 + L2 lidského papilomaviru 18, přičemž uvedené

5 virům podobné částice mají čistotu alespoň 60 %.

12. Virům podobné částice podle nároku 11, vyznačující se tím, že rekombinantní protein L1 nebo rekombinantní proteiny L1 + L2 se produkují v kvasinkách.

13. Způsob výroby virům podobných částic podle nároku 11, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) transformaci kvasinek rekombinantní molekulou DNA, kódující protein L1 papilomaviru nebo protein L2 papilomaviru

15 nebo proteiny L1 + L2 papilomaviru;

(b) kultivaci transformovaných kvasinek za podmínek, které dovolí expresi rekombinantní molekuly DNA za vytvoření rekombinantního proteinu papilomaviru; a (c) izolaci rekombinantního proteinu papilomaviru pro produkci

2o virům podobných částic podle nároku 11.

14. Rekombinantní protein papilomaviru, vyznačující se tím, že je vyroben způsobem podle nároku 13.

• · · · • ·

15. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje virům podobné částice podle nároku 11.

16. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím,

5 že obsahuje virům podobné částice podle nároku 11.

17. Způsob prevence infekce papilomavirem, který zahrnuje podávání vakcíny podle nároku 15 hostiteli.

io

18. Způsob produkce z kvasinek odvozeného rekombinantního kapsidového proteinu papilomaviru, uspořádaného do virům podobných částic, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

(a) klonování genu papilomaviru, který kóduje alespoň jeden

15 protein kapsidy papilomaviru do vektoru;

(b) převedení vektoru do hostitelské buňky za vytvoření rekombinantní hostitelské buňky;

(c) kultivaci rekombinantní hostitelské buňky za podmínek, které dovolují produkci kapsidového proteinu papilomaviru; a

20 (d) čištění kapsidového proteinu papilomaviru za podmínek, které dovolí vytvoření virům podobné částice.

19. Virům podobné částice, vyznačující se tím, ž e jsou vyrobeny způsobem podle nároku 18.

• ·

-42 20. Způsob indukce imunologické odpovědi u člověka nebo zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání virům podobných částic podle nároku 11 zvířeti nebo

5 člověku.