JPH11502704A

JPH11502704A - ヒトパピローマウイルス１８型をコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH11502704A
Application number: JP8528535A
Authority: JP
Inventors: ホフマン，キヤスリン・ジエイ; ジヤンセン，キヤスリン・ユー; ニーパー，マイケル・ピー; ジヨイス，ジヨージフ・ジー; ジヨージ，ヒユー・エー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 1999-03-09
Also published as: WO1996029413A2; PT817851E; HU223761B1; AU714533B2; DE122007000030I1; DE122007000031I1; EP0817851B1; HUP9801334A2; IL117459A; CN1100876C; NO322254B1; WO1996029413A3; ATE259879T1; HUP9801334A3; CZ291242B6; DK0817851T3; NL300272I1; DE69631586D1; KR100430698B1; NZ305188A

Abstract

(57)【要約】本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス１８型をコードするＤＮＡ分子及びその誘導体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトパピローマウイルス１８型をコードするＤＮＡ発明の分野本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス１８型をコードするＤＮＡ分子及びその誘導体に関する。図面の簡単な説明図１は、ＨＰＶ１８Ｌ１ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。図２は、ＨＰＶ１８のＬ１タンパク質内のアミノ酸変異のリストである。図３は、ＨＰＶ１８Ｌ２ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。図４は、酵母で発現されたＨＰＶ１８Ｌ１タンパク質のイムノブロットを示す。図５は、酵母で発現されたＨＰＶ１８Ｌ２タンパク質のイムノブロットを示す。図６は、酵母で発現されたＨＰＶ１８Ｌ１タンパク質によって形成されるウイルス様粒子の電気顕微鏡写真である。発明の背景パピローマウイルス（ＰＶ）感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ、ウシを含む多数の動物で起こる。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般的に感染部位に良性上皮腫瘍又は良性線維上皮腫瘍を誘起する。ＰＶは種特異的感染因子であり、ヒトパピローマウイルスは非ヒト動物に感染しない。パピローマウイルスは感染する宿主に基づき異なる群に分類できる。更に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列相同性に基づき７０より多くの型に分類される。パピローマウイルスの一つの型の感染に対する中和免疫は別の型のパピローマウイルスに対して免疫を与えないという点で、ＰＶ型は型特異的免疫原であると考えられる。ヒトにおいて、異なるＨＰＶ型は別の病気を引起こす。ＨＰＶ１、２、３、４、７、１０、２６〜２９型は、正常のヒト及び免疫低下ヒトの両方に良性イボを引起こす。ＨＰＶ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６、４６〜５０型は、免疫低下のヒトに偏平病変を引起こす。ＨＰＶ６、１１、３４、３９、４１〜４４、５１〜５５型は、性器粘膜又は呼吸器粘膜の良性コンジローマを引起こす。ＨＰＶ１６、１８型は性器粘膜の上皮異形成を引起こし、その場所での侵入性の子宮癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、肛門管癌腫の大部分に関連している。パピローマウイルスは小さく（５０−６０ｎｍ）、エンベロープを有せず、正二十面体のＤＮＡウイルスであって、８個までの初期遺伝子と２個の後期遺伝子をコードする。このウイルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２と命名されている（“Ｅ”は初期(early)、“Ｌ”は後期(late)を指す）。Ｌ１とＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルス複製と細胞の形質転換などの機能に関連している。Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、分子量５５−６０ｋＤａを有する。Ｌ２タンパク質は少量のカプシドタンパク質であり、予測分子量５５− ６０ｋＤａを有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された見掛けの分子量７５−１００ｋＤａを有する。免疫学的データによると、ウイルスキャプソメア内でＬ２タンパク質の大部分はＬ１タンパク質より内側にあることが示唆される。Ｌ１のＯＲＦは異なるパピローマウイルスの間で高度に保存されている。Ｌ２タンパク質では、異なるパピローマウイルスの間での保存はより少ない。Ｌ１遺伝子とＬ２遺伝子は免疫予防のための良好な標的として同定されている。綿尾ウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）とウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）系での研究により、細菌で、又はワタシニアベクターを使用して発現されたＬ１及びＬ２タンパク質による免疫化はウイルス感染から動物を防御することが知見された。バキュロウイルス発現系で、又はワクシニアベクターを使用してのパピローマウイルスＬ１遺伝子の発現により、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のアッセンブリーが起り、それを使用して、ウイルス攻撃からの防御と関連する高力価のウイルス中和抗体反応を誘起できた。ＨＰＶ１６型に続いて、ＨＰＶ１８は子宮頚癌腫で第２の最も流行しているＨＰＶ型である。ＨＰＶ１８は、世界の種々の所から集められた子宮頚癌生検の５ −２０％で検出された（Ikenberg,H.1990．Human Papillomavirus DNA in invas ivegenital carcinomas．In Genital Papillomavirus Infections,G.Gross ら編、p.85-112）。ＨＰＶ１８感染の地理的依存性があるように考えられる。何故ならば、アフリカ及び南米女性からの腫瘍生検では、欧州及び北米女性からの同様の生検よりもＨＰＶ１８が頻度高く検出されるからである。地理的差異の基礎的理由は不明である。ＨＰＶ１８感染に対するワクチンの開発は非常に当をえたものとなっている。何故ならば、ＨＰＶ１８はまたより悪性の成長癌と関連し、より穏やかな前癌病巣であるＣＩＮ I-IIではまれにしか検出されないからである。発明の概要本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ１８型；ＨＰＶ１８）をコードするＤＮＡ分子及びそのＤＮＡ分子の使用に関する。発明の詳細な説明本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ１８型；ＨＰＶ１８）をコードするＤＮＡ分子及びその誘導体に関する。このような誘導体には、該ＤＮＡによってコードされたペブチド及びタンパク質、該ＤＮＡに対する抗体又は該ＤＮＡによってコードされたタンパク質に対する抗体、該ＤＮＡを含むワクチン又は該ＤＮＡによってコードされたタンパク質を含むワクチン、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡによってコードされたタンパク質を含む免疫的組成物、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡ由来のＲＮＡ又は該ＤＮＡによってコードされたタンパク質を含むキットがあるが、これらに限定されない。上記ＤＮＡ又は上記ＤＮＡによってコードされるタンパク質を含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容可能な担体と混合することによるなどの公知の方法で製造できる。このような担体と製造方法は Remington 著の Pharmaceu tical Sciences に記載されている。効果的な投与に適切な医薬として許容可能な組成物を製造するために、このような組成物は有効量の上記ＤＮＡ又はタンパク質又はＶＬＰを含む。このような組成物はＨＰＶの複数の型由来のＤＮＡ又はタンパク質又はＶＬＰを含んでもよい。本発明の治療用組成物又は診断用組成物を、ＰＶ感染の治療又は診断に十分な量をヒトに投与する。有効量は各個人の状態、体重、性、年齢などの多数の因子により異なる。他の因子には投与方法がある。一般的には、組成物を約１μｇ〜約１ｍｇの範囲で投与する。医薬組成物を、皮下、局所、経口、経粘膜、静脈内、筋肉内などの種々の経路で各個体に投与する。本発明のワクチンは、宿主において中和抗体の形成を誘起するのに必要な抗原決定基を含む、ＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡ又はタンパク質を含む。このようなワクチンはまた、十分安全で臨床感染の危険がなく投与され、毒性の副作用を有せず、効果的な経路で投与されうるし、安定であり、ワクチン担体と適合性がある。ワクチンは経口、非経口、皮下、経粘膜、静脈内、又は筋肉内などの種々の経路で投与されうる。投与される投与量は各個体の状態、性、体重、年齢；投与経路；ワクチンのＰＶ型によって変わる。ワクチンは、カプセル、懸濁液、エリキシル剤、液体溶液などの投与形態で使用されうる。ワクチンは、免疫学的に許容できる担体と一緒に処方されうる。ワクチンは治療上有効量、即ち免疫防御反応を生じさせるのに十分な量投与される。治療上有効量はＰＶ型により変わりうる。ワクチンを１回又は多数回投与できる。本発明のＤＮＡ及びＤＮＡ誘導体は、免疫原組成物の製造に使用できる。このような組成物は適切な宿主に導入されると、宿主に免疫反応を誘起できる。ＤＮＡ又はその誘導体を使用して抗体を産生できる。本明細書で使用する“抗体”という用語はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方並びに抗原又はハプテンに結合できるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂フラグメントなどの前記ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のフラグメントを含む。本発明のＤＮＡ及びＤＮＡ誘導体を使用してＨＰＶ感染及びＨＰＶスクリーニングの血清型が分類できる。ＤＮＡ、組換えタンパク質、ＶＬＰ、及び抗体は、ＨＰＶの検出とＨＰＶ血清型分類に適切なキットの製造に適する。このようなキットは、少なくとも一つの容器内に密封するのに適した区画された担体を含む。担体は更に、種々のＨＰＶ型を検出するのに適したＨＰＶ１８ＤＮＡ、組換えＨＰＶタンパク質もしくはＶＬＰ、又は抗ＨＰＶ抗体のような試薬を含む。担体はまた標識された抗原又は酵素基質などの検出手段を含みうる。ＤＮＡ及びそれ由来のタンパク質はまた分子量マーカー及び分子サイズのマーカーとして有用である。遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされうる。そのセットの唯一のメンバーだけがＨＰＶ１８配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ適切な条件下でＨＰＶ１８ＤＮＡにハイブリダイズできるであろう。別の条件下で、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドはＨＰＶ１８ＤＮＡに依然としてハイブリダイズしＨＰＶ１８をコードするＤＮＡを同定、単離できる。本発明の精製されたＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントを使用し、他の起源からのＨＰＶ１８の同族体及びフラグメントを単離精製できる。これを達成するために、適切なハイブリダイゼーション条件下に最初のＨＰＶ１８ＤＮＡをＨＰＶ１８の同族体をコードするＤＮＡを含むサンプルと混合できる。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、同族体ＤＮＡをコードするＤＮＡをそこから精製できる。特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにある程度の冗長性があることが知られている。そのため本発明は同一のアミノ酸に最終的に翻訳することになる別のコドンを含むＤＮＡ配列に関する。本明細書の目的のために、一つ又は複数の置換されたコドンを有する配列は縮重変異体と定義される。発現されたタンパク質の最終的物理的性質を実質的に変えないＤＮＡ配列又は翻訳されたタンパク質の変異も本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともありうる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然のペプチドの性質とは異なる性質を有するペプチドをコードするように変更できることが知られている。ＤＮＡ配列を変更する方法には部位特異的変異誘発があるがそれに限定されない。本明細書で使用するＨＰＶ１８の“機能性誘導体”とは、ＨＰＶ１８の生物活性に実質的に類似の生物活性（機能的又は構造的）を有する化合物である。“機能性誘導体”という用語は、ＨＰＶ１８の“フラグメント”、“変異体”、“縮重変異体”、“アナログ”及び“同族体”、又は“化学的誘導体”を含むものとする。“フラグメント”という用語はＨＰＶ１８の任意のポリペプチドサブセットを指すものとする。“変異体”という用語は、完全なＨＰＶ１８分子又はそのフラグメントに構造及び機能の点で実質的に類似の分子を指すものとする。両方の分子が実質的に類似の構造を有するか、両方の分子が類似の生物活性を有するならば、その分子はＨＰＶ１８に“実質的に類似”している。そのため、その２つの分子が実質的に類似の活性を有するならば、それらの分子の一方の構造が他方に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が同一でなくとも、それらの分子は変異体と考えられる。 “アナログ”という用語は、完全なＨＰＶ１８分子又はそのフラグメントに機能の点で実質的に類似の分子を指す。種々の方法を使用してＨＰＶ１８ＤＮＡを分子的にクローン化できる。これらの方法には、適切な発現ベクターシステムにおけるＨＰＶ１８含有ｃＤＮＡライブラリー又はＨＰＶ１８含有ゲノムＤＮＡライブラリーの構築の後ＨＰＶ１８遺伝子の直接的機能的発現があるがそれに限定されない。別の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中に構築されたＨＰＶ１８含有ｃＤＮＡライブラリー又はＨＰＶ１８含有ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＨＰＶ１８のアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。更に別の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中に構築されたＨＰＶ１８含有ｃＤＮＡライブラリー又はＨＰＶ１８含有ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＨＰＶ１８をコードする部分的ＤＮＡでスクリーニングすることである。精製したＨＰＶ１８のアミノ酸配列から縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、ＨＰＶ１８ＤＮＡフラグメントの特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によりこの部分的ＤＮＡを得る。別の方法は、ＨＰＶ１８産生細胞からＲＮＡを単離し、そのＲＮＡをin vitro又はin vivo翻訳システムでタンパク質に翻訳することである。ＲＮＡのペプチド又はタンパク質への翻訳により、例えばＨＰＶ１８タンパク質の活性により又は抗ＨＰＶ１８抗体との免疫反応により同定できるＨＰＶ１８タンパク質の少なくとも一部を産生できる。この方法では、ＨＰＶ１８産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを分析して、ＨＰＶ１８の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在を明らかにすることができる。ＲＮＡプールを更に分画して非ＨＰＶ１８ＲＮＡからＨＰＶ１８ＲＮＡを精製できる。この方法により産生されるペプチド又はタンパク質を分析してアミノ酸配列を得て、次にこのアミノ酸配列を使用してＨＰＶ１８ｃＤＮＡの生産のためのプライマーを得ることができるし、又翻訳のために使用されるＲＮＡを分析してＨＰＶ１８をコードするヌクレオチド配列を得て、ＨＰＶ１８ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプローブを産生できる。これらの方法は当業界で公知であり、例えば Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.、Molecular Cloning:A Laborat ory Manual，２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY．1989に記載されている。ライブラリーの他の型並びに他の細胞又は他の細胞型から構築されるライブラリーがＨＰＶ１８をコードするＤＮＡを単離するのに有用でありうることは明白である。ライブラリーの他の型には、ＨＰＶ１８型を含む他の細胞又は他の細胞系列由来のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーがあるが、それに限定されない。ｃＤＮＡライブラリーの調製は種々の技術で行うことができる。ｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えば Sambrook,J.ら、上記、に記載されている。ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡは適切なゲノムライブラリーから単離することもできることは明白である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は種々の技術で行うことができる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築技術はSambrook,J.ら、上記、に記載されている。本明細書に記載された方法で得られたクローン化ＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントは、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素を含む発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現されることができ、原核宿主細胞又は真核宿主細胞に移入され組換えＨＰＶ１８を産生できる。このような操作の技術は Sambrook,J.ら、上記、に十分に記載され、当業界で公知である。発現ベクターは、適切な宿主での遺伝子のクローン化コピーの転写とそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列と本明細書では定義する。このようなベクターを使用して、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、動物細胞などの種々の宿主で真核遺伝子を発現させることができる。特別に設計されたベクターは、宿主間、例えば細菌−酵母、細菌−動物細胞、細菌−真菌細胞、細菌 −無脊椎動物細胞でＤＮＡのシャトリングをすることができる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞での自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、活性なプロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクターにはクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスがあるが、それらに限定されない。種々の哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞でＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントを発現させることができる。組換えＨＰＶ１８の発現に適切でありうる市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３），ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０），ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４），ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９），ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６），ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、λＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）があるが、それらに限定されない。種々の細菌の発現ベクターを使用して細菌細胞でＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）があるが、それらに限定されない。種々の真菌細胞発現ベクターを使用して真菌細胞でＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び Hansenula発現（ＲｈｅｉｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，独国）があるが、それらに限定されない。種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫細胞でＨＰＶ１８ＤＮＡ又はそのフラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃ III（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＡｃＵＷ５１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｔｎｃ．）があるが、それらに限定されない。ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡ又はそのフラグメントを含む発現ベクターを使用して、ＨＰＶ１８タンパク質又はＨＰＶ１８タンパク質のフラグメントを、細胞、組織、器官、又は動物（ヒトを含む）で発現させることができる。宿主細胞は原核又は真核でありえ、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、サル起源、ゲッ歯類起源の細胞系列を含むがそれらに限定されない哺乳動物細胞、ショウジョウバエ由来細胞系列及びカイコ由来細胞系列を含むがそれらに限定されない昆虫細胞が挙げられるがそれらに限定されない。適切でありえ、市販の哺乳動物種由来の細胞系列には、ＬｃｅｌｌｓＬ−Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、ＬｃｅｌｌｓＬ−Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ −１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ− ５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）があるが、それらに限定されない。形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーションを含むがそれらに限定されない多数の技術のいずれかにより、発現ベクターを宿主細胞に導入できる。発現ベクター含有細胞をクローン化により殖やし、それらがＨＰＶ１８タンパク質を産生するかを決定するためにそれらを個々に分析する。抗ＨＰＶ１８抗体による免疫反応性、及びＨＰＶ１８特異的リガンド結合又は発現されたＨＰＶ１８タンパク質とＨＰＶ１８特異的リガンドの相互作用により仲介される反応と規定されるＨＰＶ１８特異的リガンド結合又はシグナル伝達などの宿主細胞関連ＨＰＶ１８活性の存在を含むがそれらに限定されない幾つかの手段で、ＨＰＶ１８発現宿主細胞クローンの同定を行うことができる。ＨＰＶＤＮＡフラグメントの発現を、in vitro産生合成ｍＲＮＡ又は天然のｍＲＮＡを使用しても行うことができる。合成ｍＲＮＡ又はＨＰＶ１８産生細胞から単離されたｍＲＮＡを種々の無細胞システム、並びに細胞をベースとしたシステムで効率的に翻訳できる。無細胞システムには、コムギ胚芽抽出物と網状赤血球抽出物があるがそれに限定されない。細胞をベースとしたシステムにはカエル卵母細胞へのミクロインジェクションがあるがそれに限定されない。カエル卵母細胞へのミクロインジェクションが好ましい。宿主細胞でのＨＰＶ１８タンパク質（単数及び複数）の発現の後、ＨＰＶ１８タンパク質を回収してＨＰＶ１８を精製型で得ることができる。幾つかのＨＰＶ１８精製方法が利用でき、使用に適切である。ここで記載するが、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ、又は個々の適用により、細胞溶解液及び細胞抽出液から、組換えＨＰＶ１８タンパク質を精製できる。更に、完全長のできたばかりのＨＰＶ１８又はＨＰＶ１８のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体で製造した免疫親和性カラムを使用して、組換えＨＰＶ１８を他の細胞タンパク質から分離できる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、当業界で公知の種々の方法により調製できる。本明細書で使用するモノクローナル抗体又は単一特異性抗体は、ＨＰＶ１８に対して均質の結合特徴を有する単一種の抗体又は多数種の抗体と定義される。本明細書で使用する均質の結合は、ある特定の抗原又はエピトープに結合できる抗体種の能力を指す。単一特異性抗体の生産方法を使用して、ＨＰＶ１８ポリペプチドフラグメント又は完全長のできたばかりのＨＰＶ１８ポリペプチドに対する特異性抗体を産生できることは明白である。特に、十分に機能あるＨＰＶ１８又はそのフラグメントに特異的な単一特異性抗体を産生できることは明白である。本発明はまた、ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、並びにＨＰＶ１８タンパク質の機能をin vivoで調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は非タンパク性有機分子でありうる。化合物は、ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、あるいはＨＰＶ１８タンパク質の機能を増加させ、又は減少させて調節しうる。ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、あるいはＨＰＶ１８タンパク質の機能を調節する化合物を、種々のアッセイで検出できる。発現又は機能に変化があるかを決定するために、アッセイは単純な “ｙｅｓ／ｎｏ”アッセイでありうる。標準サンプルでの発現又は機能のレベルを、試験サンプルの発現又は機能と比較して、アッセイを定量的にすることができる。ＨＰＶ１８ＤＮＡ、ＨＰＶ１８ＤＮＡのフラグメント、ＨＰＶ１８又はＨＰＶ１８タンパク質に対する抗体、ＨＰＶ１８ＲＮＡ又はＨＰＶ１８タンパク質を含むキットを調製できる。このようなキットを使用して、サンプル中のＨＰＶ１８ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、又はＨＰＶ１８タンパク質もしくはＨＰＶ１８ペプチドフラグメントの存在を検出する。このようなキャラクタリゼーションは、法医学解析と疫学研究を含むがそれらに限定されない種々の目的に有用である。ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を、アンチセンス治療用に合成できる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートなどの安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２´−Ｏ− アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、あるいは他のＨＰＶ１８アンチセンスオリゴヌクレオチド類似物でありうる。ＨＰＶ１８アンチセンス分子を、ミクロインジェクション、リポソームカプセル化により、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現により、細胞に導入できる。ＨＰＶ１８アンチセンス療法は、ＨＰＶ１８活性を減少させることが有用な病気の治療のために特に有用である。 “化学的誘導体”という用語は、通常はベースとなる分子の一部ではない付加的な化学部分を含む分子を指す。このような部分は、ベース分子の溶解性、半減期、吸収などを改善しうる。あるいは、部分はベース分子の望ましくない副作用を減弱させうるか、又はベース分子の毒性を減少させうる。このような部分の例は、Reming tonのPharmaceutical Sciencesなどの種々の書物に記載されている。本明細書で開示した方法によって同定された化合物を単独で、ルーチンな試験で定められる適切な投与量使用して、ＨＰＶ１８又はその活性の最適の阻害を達成し、可能性のある毒性を最小化できる。更に、他の薬剤との共投与又は他の薬剤との逐次的投与も望ましいこともありうる。本発明の化合物は１日１回投与できるし、１日投与量の合計を数回に分けて投与できるのも有利である。更に、本発明の化合物は、経鼻、経口、経皮、座薬を含むがそれらに限定されない種々の経路で投与できる。複数の活性な薬剤での組合せ治療の場合（複数の活性な薬剤が別の投与組成物形態であるとき）、活性薬剤は同時に投与できるし、各々を時間をずらして投与できる。本発明の化合物を使用する投与法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、医学的状態；治療する疾病のひどさ；投与経路；患者の腎肝機能；使用する特定の化合物を含む種々の因子に応じて選択される。通常の技術を有する医師ならば、病気の進行を防止し、反撃し、又は阻止するのに必要な有効量の薬剤を決定し、処方することが容易にできる。毒性がなく効果的な範囲の薬剤濃度を達成することを最適に決定するには、標的部位への薬剤利用性のキネチックスに基づいた投与法が必要である。このことには、薬剤の分布、平衡、除去を考慮することが必要である。本発明の方法において、本明細書で詳細に記載した化合物は活性成分を形成でき、投与の意図した形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ、座薬、ゲルなどに関し適切に選択され、通常の製剤実務と一致する適切な医薬希釈剤、賦形剤、又は担体（本明細書では集合的に“担体”物質という）と混和して投与されるのが典型的である。例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与の場合、活性薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などの経口、非毒性の医薬として許容可能な不活性の担体と一緒にできる。更に、所望又は必要ならば、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、及び着色剤も混合物に導入できる。適切な結合剤には澱粉、ゼラチン、グルコース又はβ−ラクトースなどの天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア・トラガカント・アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどがあるがそれらに限定されない。これらの投与形態で使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがあるがそれらに限定されない。崩壊剤には澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどがあるがそれらに限定されない。液体形態の場合、活性薬剤成分を、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの合成ゴム及び天然ゴムのような適切にフレーバーのある懸濁剤又は分散剤と一緒にできる。使用できる他の分散剤にはグリセリンなどがある。非経口投与の場合、滅菌葱濁液及び滅菌溶液が望ましい。静脈注射が望まれるときには、一般的に適切な保存剤を含む等張の製剤が望ましい。活性薬剤成分を含む局所用製剤は、当業界で周知の種々の担体物質、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどと混和され、例えばアルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリーム組成物又はゲル組成物中のシャンプーを形成できる。本発明の化合物はまた、リポソームデリバリーシステムの形態で、例えば小さな単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞などの形態で投与されうる。リポソームは種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンから形成できる。本発明の化合物分子が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体を使用することにより、本発明の化合物を送達することもできる。本発明の化合物はまた、標的に向けられる薬剤担体として可溶性ポリマーと結合できる。このようなポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる。更に、本発明の化合物は、薬剤の徐放を達成するのに有用な生分解性ポリマーの一群、例えばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋性又は両親媒性ブロックコポリマーと結合できる。以下の実施例で本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されない。実施例１ＨＰＶ１８ゲノムのクローニング全ゲノムＤＮＡを標準的技術によりヒト子宮頚がん腫由来細胞系列ＳＷ７５６から調製した（Freedman,R.S.ら、1982，In Vitro，Vol 18，719-726頁）。該ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％低融点アガロース分取ゲルで電気泳動を行った。約１２ｋｂｐの長さのＤＮＡフラグメントに対応するゲルスライスを切出した。アガロースをAgarase^TM酵素(BoehringerMannheim,Inc.)で消化し、サイズ分画されたＤＮＡを沈殿させ、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩ消化ラムダ EMBL4アーム（Stratagene,Inc.）と連結させた。ラムダライブラリーをGigapacl II Goldp ackaging extract（Stratagene，Inc.）を用いてパックした。鋳型としてのＳＷ７５６ＤＮＡ及び公表されたＨＰＶ１８Ｌ１ＤＮＡ配列（Cole と Danos,1987,J ．Mol．Biol.,Vol.193;599- 608：Genbank Accessin #X05015）に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生された７００ｂｐのＨＰＶ１８Ｌ１ＤＮＡプローブを使用して、ＨＰＶ１８−陽性クローンを同定した。１２ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント挿入配列を含み、#１８７−１と命名したＨＰＶ１８−陽性ラムダクローンを単離した。実施例２酵母発現ベクターの構築鋳型としてのクローン＃１８７−１、Vent ポリメラーゼ^TM（New England Bio labs，Inc.）、増幅１０サイクル（９４℃，１分；５０℃，１分；７２℃，２分）及びフランキングするＢｇｌII部位（下線）を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＰＶ１８Ｌ１読取り枠（ＯＲＦ）をＰＣＲ増幅させた：センスプライマー，５′−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＴＧ−３′，アンチセンスプライマー，５′− ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＣ −３′。センスプライマーにより、ＨＰＶ１８Ｌ１開始メチオニンコドン（太字体で強調してある）のすぐ上流に酵母非翻訳リーダー配列が導入される。１．５ｋｂｐのＬ１ＰＣＲ産物をＢｇｌIIで消化し、ゲル精製した。プラスミドｐＢＭ２７２（Mark Johhnston，ワシントン大学、st.Louis，MO により提供された）からのSaccharomycescerevisiae ダイバージェントＧＡＬ１ −ＧＡＬ１０プロモーターを含むｐＵＣ１８／二方向性ＧＡＬプロモータープラスミドから１．４ｋｂｐのＳｐｈＩフラグメントを単離してｐＧＡＬ１−１０酵母発現ベクターを構築した。そのダイバージェントプロモーターの各側には、酵母ＡＤＨ１転写ターミネーターのコピー、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第１コピーの間に位置するＢａｍＨＩクローニング部位、及びＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターモネーターの第２コピーの間に位置するＳｍａＩクローニング部位が隣接されている。ｐＢＲ３２２、酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子、及び酵母２μプラスミドからなる酵母シャトルベクター（Benjamin H all、ワシントン大学、Seattle,WAから贈与）をＳｐｈＩで消化し、１．４ｋｂｐのＳｐｈＩダイバージェントＧＡＬプロモーターフラグメントと連結させ、ｐＧＡＬ１−１０を得た。ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの間を切断するＢａｍＨＩで、ｐＧＡＬ１−１０を線状化した。ＢａｍＨＩ消化ベクターとＢｇｌ II消化ＨＰＶ１８Ｌ１ＰＣＲフラグメントを連結し、それを用いて E.coli ＤＨ５細胞（Gibco BRL,Inc.）を形質転換した。ＨＰＶ１８Ｌ１遺伝子を含み、ｐ１９１−６と命名したｐＧＡＬ１−１０プラスミドを単離した。ＨＰＶ１８Ｌ１及びＬ２遺伝子の両方を共発現する酵母発現ベクターを構築した。プラスミドｐ１９１−６（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ１８Ｌ１）を、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの間を切断するＳｍａＩで消化した。１．４ｋｂｐのＨＰＶ１８Ｌ２遺伝子を、フランキングするＳｍａＩ部位（下線）を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて上記のようにＰＣＲ増幅させた：センスプライマー，５′−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣ−３′，アンチセンスプライマー，５′−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴＧＣ−３′ センスプライマーにより、ＨＰＶ１８Ｌ２開始メチオニンコドン（太字体で強調）のすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列（Kniskernら、1986，上記）が導入される。ＰＣＲフラグメントをＳｍａＩで消化し、ゲル精製し、ＳｍａＩ消化ｐ１９１−６プラスミドに連結させた。ＨＰＶ１８Ｌ１及びＬ２遺伝子の両方を含むｐＧＡＬ１−１０プラスミドを単離し、ｐ１９５−１１と命名した。実施例３臨床サンプルの型分類子宮頚部生検サンプルをインジアナ州インジアナポリスのVeterans Administr ation Medical Center（Dr.Darron Brownの好意）とペンシルバニア州フィラデルフィアのAlbert Einstein Medical Center（Dr.Joan Adlerの好意）で集め、 −２０℃で凍結した。ＤＮＡをBrownら，1993の方法（Brown,D.ら、1993，Ｊ.Cl in.Microbial.,Vol.31:2667-2673）により単離した。要約すると、臨床標本をBr aun mikro-dismembrator II（B.Braun Instruments，Melsungen，独国）で処理し、１０ｍＭＥＤＴＡと０．６％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液に可溶化させた。サンプルを２０ｍＭ TrisｐＨ7.4に調整し、タンパク質を０．１ｍｃｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡの存在下５０ｍｃｇ／ｍＬプロテイナーゼＫで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、分光光度法で定量した。ＤＮＡサンプルのＨＰＶ１８の存在をＰＣＲ及びサザンブロット解析でスクリーニングした。ＨＰＶ１８Ｌ１のＯＲＦの２５６ｂｐセグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた：センスプライマー，５′−ＣＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＴＧ−３′，アンチセンスプライマー，５′−ＣＡＴＣＡＴＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧ−３′。ＰＣＲ条件は、AmpliTaq^TMＤＮＡポリメラーゼ／ＧｅｎｅＡｍｐ^TMキット（Pe rkin Elmer Corp.）を使用する場合の製造業者の推奨によったが、但し、鋳型として臨床サンプルＤＮＡ０．５μＬを用い、最終反応混合液中に各プライマー１０ｐｍｏｌ、２ｍＭｄＮＴＰ、及び２．０ｍＭＭｇＣｌ₂を存在させた。９４℃の変性ステップ２分の後、増幅（９４℃、１分；４５℃、１分；７２℃、１分）を４０サイクル行った。ＰＣＲ産物を３．０％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜にブロットし、³²Ｐ−標識ＨＰＶ１８Ｌ１−特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。実施例４Ｌ１及びＬ２遺伝子のＤＮＡ配列決定クローン#１８７−１、ｐ１９１−６及びｐ１９５−１１中のＨＰＶ１８Ｌ１及びＬ２遺伝子の配列を、ＰＲＩＺＭシークエンシングキットと自動ＤＮＡＡＢＩシークエンサー＃３７３Ａ（Applied Biosystems）を用い決定した。コンセンサスＨＰＶ１８配列を得るために、Ｌ１遺伝子ＤＮＡの部分を、ヒト臨床単離株からＰＣＲ増幅させ、配列決定し、クレームした配列及び公表された配列と比較した。この目的のために、実施例３に記載のオリゴヌクレオチドと加熱サイクルを用い、各臨床ＤＮＡ単離体から２５６ｂｐのフラグメント（ヌクレオチド８１７−１０７２）を増幅させた。以下のプライマー５′−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＴＧ−３′及び５′−ＣＣＴＡＡＣＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＴＴＡＧＡＣ−３′を用い、実施例３に記載の加熱サイクルを使用してＬ１ＤＮＡのアミノ末端４３２ｂｐ部分（ヌクレオチド１−４３１）を増幅させた。製造業者推奨の試薬と方法を用いて、両方のＰＣＲ産物を別々にプラスミドｐＣＲII（Invitrogen Corp.）に連結させた。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ＥｃｏＲＩ挿入体を含むＤＮＡの配列決定を行った。実施例５ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列の解析クレームしたＨＰＶ１８Ｌ１のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸（ａａ）配列を図１に示す。ＤＮＡ配列をクローン＃１８７−１、ｐ１９１−６及びｐ１９５−１１のコンセンサスから得た。クレームしたＨＰＶ１８Ｌ１ヌクレオチド配列と公表されているＨＰＶ１８Ｌ１配列（Genbank 受託番号＃X05015）との比較により、１５２４ｂｐのうち２０ｂｐの変化が同定された。５個のヌクレオチド変化（８９位のＣ→Ｇ、２６３位のＣ→Ａ、８４８位のＣ→Ｇ、９６７位のＧ→ Ａ、１０１３位のＣ→Ｇ）によりアミノ酸置換が起った。公表されているものと５個の残基の差異はａａ位置３０、２８３及び３３８でＰ→Ｒ、ａａ８８でＴ→ Ｎ、並びにａａ３２３でＶ→Ｉである（図２）。位置８８と３２３は保存性の変化を示すが、３個のＰ→Ｒ変化は発現されたＬ１タンパク質の物理的性質を実質的に変更する可能性がある。臨床単離株から得られたアミノ酸配列（＃３５４、５５６、７５５、６９７、７９５及び２３）とクレームした配列及び公表されている配列の比較を図２に示す。臨床単離株及びクレームした配列が公表されている配列とは異なる位置が４個ある。位置３０、２８３、及び３３８は、クレームした配列を含めて、現在までに発見された全ての単離株でアルギニン（Ｒ）をコードする。これらの位置の各々でプロリン（Ｐ）を有する公表された配列に対し、上記の事項は鋭い対照をなす。更に、位置８８は単離株及びクレームした配列でアスパラギン（Ｎ）であるが、公表された配列でスレオニン（Ｔ）である。位置３２３の最後の差異は、臨床単離株の多くと公表されている株ではバリン（Ｖ）に対し、クレームした配列及び単離株の一つ（＃２３）ではイソロイシン（Ｉ）であることが知見された。クレームした配列は、臨床感染と関連する主要ウイルス配列を反映していることが結論され、公表されている配列の位置３０、２８３又は３３８のプロリンのいずれかを含む単離株が無いことから、公表されているクローンはアーティファクトであるか重要でないサブタイプであることが示唆される。ＨＰＶ１８Ｌ２のヌクレオチド配列と推定ａａ配列はクローン＃１８７−１とｐ１９５−１１のコンセンサス配列から得られるが、それを図３に示す。Ｌ２ヌクレオチド配列と公表されているＨＰＶ１８配列（Genbank受託番号＃Ｘ０５０１５）の比較により、１３８９ｂｐのうち４０ｂｐの変化が同定された。塩基対の差異によりａａレベルで１４個の変化が起る：ａａ２９でのＰ→Ｓ、ａａ３３でのＰ→Ｎ、ａａ１７７でのＡ→Ｓ、ａａ２６６でのＤ→Ｅ、ａａ２７０でのＤ→Ｎ、ａａ３４６でのＤ→Ｇ、ａａ３５５でのＭ→Ｉ、ａａ３５９でのＶ→Ｍ、ａａ３６５でのＳ→Ｐ、ａａ３６９でのＦ→Ｓ、ａａ３７１でのＦ→Ｖ、ａａ３７２でのＦ→Ｓ、ａａ３７３でのＫ→Ｔ、及びａａ４０９でのＳ→Ｐ。実施例６ＨＰＶ１８Ｌ２抗血清の作製ＨＰＶ１８Ｌ２特異的抗体を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させたｔｒｐＥ−ＨＰＶ１８Ｌ２融合タンパク質を用いヤギで作製した。５′−末端及び３′末端にそれぞれフランキングするＨｉｎｄIII部位及びＢａｍＨＩ部位を与えるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、完全長Ｌ２ＯＲＦをＰＣＲ増幅させた。Ｌ２フラグメントを、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＴＨ２３発現プラスミド（Koernerら、1991,Meth.Enzymol.Vol.194:477-490）に挿入した。融合タンパク質を、３−ｂ−インドールアクリル酸による誘導後、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１細胞（GibcoBRL,Inc.）で発現させた。不溶画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルーでの染色により解析した。ｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉ不溶画分の主要部分であった。融合タンパク質抗原のための Pocono Rabbit Farm and Laboratory，Inc．（Protein Rabbit Farm．Ca nadensis，PA）の標準的プロトコルに従い、ｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパク質でヤギを免疫化した。実施例７酵母Ｕ９株の調製 Saccharomyces cerevisiae株２１５０−２−３（ＭＡＴα，ｌｅｕ２−０４, ａｄｅ１,ｃｉｒ°）を、Dr.Leland Hartwell（ワシントン大学、シアトル、ＷＡ）から得た。株２１５０−２−３の細胞を、ＹＥＨＤ培地（Cartyら、J.IndMi cro2(1987)117-121）５ｍＬ中、３０℃で一晩増殖させた。細胞を滅菌蒸留水で３回洗浄し、滅菌蒸留水２ｍＬに再懸濁させ、細胞懸濁液０．１ｍＬを６個の５ −フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）プレートの各々にプレーティングし、ｕｒａ３突然変異株を選別した（酵母遺伝学用 C old Spring Harbor Laboratory マニュアル）。プレートを３０℃でインキュベートした。培地は蒸留水２５０ｍＬ当たり、アミノ酸と硫酸アンモニウム無しの Difco Yeast Nitrogen Base ３．５ｇ、５−フルオロ−オロト酸０．５ｇ、ウラシル２５ｍｇ、及びデキストロース１０．０ｇを含んだ。０．２μｍ膜による濾過で培地を滅菌し、次に５０℃に維持した４％Bacto-Ag ar(Difco)２５０ｍＬ、アデニン１．２ｍｇ／ｍＬ溶液１０ｍＬ、及びＬ−ロイシン溶液（１８０ｍｇ／５０ｍＬ）５ｍＬと混合した。得られた培地をディッシュ当たり２０ｍＬ分配した。インキュベーション５日後、多数のコロニーが出現した。コロニーを最初のＦＯＡプレートから新鮮ＦＯＡプレートに再画線し、次に新鮮ＦＯＡプレートを３０℃でインキュベートして単一コロニーを単離した。ＦＯＡプレートの第２セットからの多数のコロニーのｕｒａ３突然変異の存在を、ＹＥＨＤプレートとウラシルを含まないプレートの両方にレプリカ−プレーティングすることにより試験した。ＹＥＨＤ培地で良好に生育し、ウラシルを含まない培地で生育しないことが所望の結果であった。これらの性質を示す一つの単離株（Ｕ９）を得た。後で使用するまで、凍結グリセロールストック（株＃３２５）としてそれを保存した。実施例８酵母ＭＮＮ９遺伝子破壊用ベクターの調製ＭＮＮ９遺伝子の破壊用ベクター調製のために、S.cerevisiaeゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子を最初にクローン化することが必要であった。標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によりこのことを達成した。完全長ＭＮＮ９コード配列のＰＣＲ用の５′センスプライマーと３′アンチセンスプライマーを、公表されている酵母ＭＮＮ９遺伝子配列（Zymogenetics: ＥＰＯ特許出願第 881178 34.7 号、公開第 0-314-096-A2 号）に基づき設計した。フランキングするＨｉｎｄIII部位（下線）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用した。センスプライマー：５′−ＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＴＣＧ−３′，アンチセンスプライマー：５′−ＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣ− ３′。ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンは太字体で強調してある。鋳型として S.cerevisiae 株ＪＲＹ１８８からのゲノムＤＮＡ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）及び増幅２５サイクル（９４℃１分、３７℃２分、７２℃３分）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた１．２ｋｂｐのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄIIIで消化し、ゲル精製し、ＨｉｎｄIIIで消化しアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１３（Pharmacia）と連結させた。得られたプラスミドをｐ１１８３と命名した。酵母ＵＲＡ３遺伝子を用いてＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、プラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３（ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII部位にサブクローン化された S.cerevisiae ＵＲＡ３遺伝子をコードする１．１ｋｂｐのＨｉｎｄIIIフラグメントを含む）をＨｉｎｄIIIで消化し、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、次にＰｍｌＩ消化プラスミドｐ１１８３（ＰｍｌＩはＭＮＮ９コード配列内で切断する）に連結させた。得られたプラスミドｐ１１９９では、機能性ＵＲＡ３遺伝子によってＭＮＮ９遺伝子が破壊されている。実施例９破壊されたＭＮＮ９遺伝子を含むＵ９誘導株１３７２の構築株Ｕ９（＃３２５）のＭＮＮ９遺伝子の破壊のために、プラスミドｐ１１９９３０μｇをＨｉｎｄIIIで消化し、線状ｍｎｎ９::ＵＲＡ３破壊カセットを作製した。株３２５の細胞を、スフェロプラスト法（Hinnenら、1978,Proc.Natl.A cad.Sci.USA75:1929-1933）を用いＨｉｎｄIII消化ｐ１１９９ＤＮＡで形質転換し、ウラシルを欠き、１．０Ｍソルビトールを含む合成寒天培地上で形質転換体を選別した。合成培地は蒸留水１Ｌ当たり寒天２０ｇ、Yeast nitrogen base w /o アミノ酸６．７ｇ、アデニン０．０４ｇ、Ｌ−チロシン０．０５ｇ、ソルビトール１８２ｇ、グルコース２０ｇ、及びロイシンマイナス溶液＃２１０ｍＬを含んでいた。ロイシンマイナス溶液＃２は蒸留水１Ｌ当たりＬ−アルギニン２ｇ、Ｌ−ヒスチジン１ｇ、Ｌ−ロイシン６ｇ、Ｌ−イソロイシン６ｇ、Ｌ−リシン４ｇ、Ｌ−メチオニン１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン６ｇ、Ｌ−スレオニン６ｇ、Ｌ−トリプトファン４ｇを含む。プレートを５日間３０℃でインキュベートしたが、その時には多数のコロニーが出現していた。染色体ＤＮＡ調製物を１０コロニーから作製し、次にＥｃｏＲＩプラスＨｉｎｄIIIで消化した。次にＤＮＡ消化物を、プローブとしてＭＮＮ９遺伝子を有する１．２ｋｂｐのＨｉｎｄII Iフラグメント（プラスミドｐ１１９９から単離）を用いるサザンブロット（J.S ambrookら、Molecular Cloninng:A Laboratory Manual，２版、ColdSpring Harb or Laboratory Press,1989）によって評価した。サザンブロットで、期待されたＤＮＡバンドシフト及びｍｎｎ９突然変異体によって典型的に示される非常な塊状を示す単離株（株＃１３７２）を同定した。実施例１０酵母ＨＩＳ３遺伝子の破壊用ベクターの構築 S.cerevisiaeＨＩＳ３遺伝子がＵＲＡ３遺伝子によって破壊されている破壊カセットの構築のために、プラスミドＹＥｐ６（K.Struhlら、1979,Proc.Natl.Aca d.Sci.,USA,76:1035）をＢａｍＨＩで消化し、ＨＩＳ３遺伝子を有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を作製し、前もってＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したｐＵＣ１８と連結させた。得られたプラスミド（ｐ１５０１又はｐＵＣ１８−ＨＩＳ３と命名）をＮｈｅＩ（ＨＩＳコーディング配列内で切断する）で消化し、ベクターフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、次に仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。ＨｉｎｄIIIでの消化によって、プラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３からＵＲＡ３遺伝子を単離し、ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐのフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、上記ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３ＮｈｅＩフラグメントと連結させた。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３::ＵＲＡ３又はｐ１５０５と命名）は、酵母ＨＩＳ３遺伝子が機能性ＵＲＡ３遺伝子によって破壊されている破壊カセットを含む。実施例１１ＨＩＳ３遺伝子による酵母ＰＲＢＩ遺伝子の破壊用ベクターの構築 S.cerevisiaeＰＲＢ１遺伝子を有するプラスミドＦＰ８ΔＨをカーネギー−メロン大学のDr.E.Jonesから得た（C.M.Moehleら、1987,Genetics 115:255-263）。ＨｉｎｄIIIプラスＸｈｏＩでそれを消化し、ＰＲＢＩ遺伝子を有する３．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端にした。プラスミドｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした。得られたベクターフラグメントを上記ＰＲＢ１遺伝子フラグメントと連結させてプラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を得た。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドＹＥｐ６をＢａｍＨＩで消化した。機能性ＨＩＳ３遺伝子を有する、得られた１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端にした。プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を、ＰＲＢ１コード配列内で切断し、プロテアーゼＢ活性部位及びフランキング配列を除去するＥｃｏＲＶプラスＮｃｏＩで消化した。ｐＵＣ１８内のＰＲＢ１コード配列の残りの５′及び３′部分を有する５．７ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端にし、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、上記の平滑末端化ＨＩＳ３フラグメントと連結させた。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１::ＨＩＳ３、ストック＃１２４５と命名）は、上記のように欠失されたＰＲＢ１遺伝子の部分の代わりに機能性ＨＩＳ３遺伝子を有する。実施例１２破壊されたＭＮＮ９遺伝及びＰＲＢ１遺伝子の両方を有するＵ９関連酵母株の構築破壊されたＭＮＮ９遺伝子を有するＵ９関連株１３７２は実施例９に記載した。１３７２株のクローン化された単離株をＦＯＡプレート上で継代し（実施例７に記載）、ｕｒａ３突然変異株を選別した。１３７２株の多数のｕｒａ３単離株を得、一つの特定の単離株（株１２９３０−１９０−Ｓ１−１）を次のＨＩＳ３遺伝子の破壊のために選別した。ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３::ＵＲＡ３遺伝子破壊ベクター（ｐ１５０５）をＸｂａＩプラスＥｃｏＲＩで消化し、線状ｈｉｓ３::ＵＲＡ３破壊カセットを作製し、それを用いて酢酸リチウム法（Methods in Enzym ology,194:290(1991)）により１２９３０−１９０−Ｓ１−１株の形質転換を行った。Ｕｒａ⁺形質転換体をウラシルを含まない合成寒天培地で選別し、同じ培地上にクローン化された単離株を再び画線し、次にウラシル又はヒスチジンを欠く培地上でレプリカプレーティングを行い、Ｕｒａ⁺及びＨｉｓ^-の両方である単離株をスクリーニングした。一つの単離株（１２９３０−２３０−１株）を選別し、続いてＰＲＢ１遺伝子破壊を行った。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１::ＨＩＳ３、ストック＃１２４５）をＳａｃＩプラスＸｂａＩで消化し、線状ｐｒｂ１::Ｈｉｓ３破壊カセットを作製し、それを使用して酢酸リチウム法で１２９３０−２３０ −１株の形質転換を行った。ヒスチジンを欠く寒天培地上でＨｉｓ⁺形質転換体を選別し、同じ培地上に再画線し、クローン化単離株を得た。多数の得られたＨｉｓ⁺単離株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、次に０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。次に、以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲによって予め調製したＰＲＢ１遺伝子用放射性標識６１７ｂｐプローブを使用して、サザンブロット解析を行った：５′ＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＡＡ３′、５′ＣＡＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＣＧＡ３′。２．４４ｋｂｐのｐｒｂ１::ＨＩＳ３ＤＮＡフラグメントと前記プローブとの期待されたハイブリダイゼーションを示す１１個の単離株を得た。このことは、野生型ＰＲＢ１遺伝子の１．５９ｋｂｐのフラグメントと前記プローブとのハイブリダイゼーションと対照的であった。所望のｐｒｂ１::ＨＩＳ３破壊を含むこれらの単離株の一つを、更なる使用のために選別したが、それを株＃１５５８と命名した。実施例１３酵母におけるＨＰＶ１８Ｌ１及びＬ２の発現プラスミドｐ１９１−６（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ１８Ｌ１）及びｐ１９５ −１１（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ１８Ｌ１＋Ｌ２）を用いてS.cerevisiae株＃１５５８（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ｐｒｂ１::ＨＩＳ３，ｍｎｎ９::ＵＲＡ３，ａｄｅｌ，ｃｉｒ⁰）を形質転換させた。クローン化単離株を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地中で３０℃で８８時間増殖した。細胞回収後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、イムノブロット分析によって細胞溶解液を、ＨＰＶ１８Ｌ１及び／又はＨＰＶ１８Ｌ２タンパク質発現があるかどうかを解析した。全細胞タンパク質２５μｇを含むサンプルを、変性条件下１０％Tris-グリシンゲル（Novex,Inc.）で電気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターに電気ブロットした。第一次抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク質に対するウサギ抗血清（Brown ら、1994，Virology 201:46-54）、第二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Amersham,Inc.）を用いて、Ｌ１タンパク質を免疫検出した。化学発光ＥＣＬ^TM検出キット（Amersham，In c.）を用いてフィルターの処理を行った。５０−５５ＫＤａのＬ１タンパク質バンドは、Ｌ１及びＬ１＋Ｌ２共発現酵母クローン（それぞれ１７２５株及び１７２７株）の両方で検出され、陰性対照（Ｌ１遺伝子もＬ２遺伝子も含まないｐＧＡＬ１−１０）では検出されなかった（図４）。第一抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１８Ｌ２融合タンパク質に対して作製されたヤギポリクローナル抗血清、次にＨＰＲ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Kirkegaard a nd Perry Laboratories,Gaithersburg,MD）を用いるウエスタン分析によって、ＨＰＶ１８Ｌ２タンパク質を検出した。フィルターを上記のように処理した。Ｌ１＋Ｌ２共発現酵母クローン（１７２７株）で７５ｋＤａタンパク質バンドとしてＬ２タンパク質は検出されたが、陰性対照でもＬ１発現クローンでも検出されなかった（図５）。実施例１４ＨＰＶ１８Ｌ１（１７２５株）及び１８Ｌ１＋ΔＬ２（１７２７株）の発酵１７２５株及び１７２７株の平板培養の表面生育物を無菌的に以下のロイシンを含まない液体培地に移した。この培地は、１Ｌ当たり、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない Difcoyeast nitorogen base ８．５ｇ；アデニン０．２ｇ；ウラシル０．２ｇ；コハク酸１０ｇ；硫酸アンモニウム５ｇ；グルコース４０ｇ；Ｌ−チロシン０．２５ｇ；Ｌ−アルギニン０．１ｇ；Ｌ−イソロイシン０．３ｇ；Ｌ−メチオニン０．０５ｇ；Ｌ−トリプトファン０．２ｇ；Ｌ−ヒスチジン０．０５ｇ；Ｌ−リシン０．２ｇ；Ｌ−フェニルアラニン０．３ｇを含み、滅菌前にＮａＯＨでｐＨ５．０−５．３に調整された。ロータリーシェーカー上で２８℃、２５０ｒｐｍでの生育後、最終濃度１７％（ｗ／ｖ）で滅菌グリセロールを加え、−７０℃で保存（クリオバイアル当り１ｍＬ）することによって凍結培養物バイアルを調製した。植菌材料を同じ培地で調製した（２Ｌフラスコ当たり５００ｍＬ）。植菌材料調製を凍結培養物バイアルの融解内容物を移して開始させ、ロータリーシェーカー上、２８℃、２５０ｒｐｍ、２９時間インキュベートした。各株の発酵では、植菌後、作業容量１０Ｌを有する New Brunswick SF-116 発酵槽を使用した。生産培地は、１Ｌ当たり、Difco yeastextract２０ｇ；Sheffield HySoy ペプトン１０ｇ；グルコース２０ｇ；ガラクトース２０ｇ；Union Carbide UCON LB-625 消泡剤０．３ｍＬを含んだ。培地を滅菌前にｐＨ５．３に調整した。２Ｌ植菌フラスコの内容物全部（５００ｍＬ）を発酵槽に移し、２８℃、空気５Ｌ／分、４００ｒｐｍ、３．５ｐｓｉ圧力でインキュベートした。溶存酸素レベルを飽和の４０％以上に保つために必要なように攪拌を増加させた。発酵の進行をオフライングルコース測定（Beckman Glucose２分析計）及びオンライン質量分析器（Perkin-Elme r 1200）でモニターした。６６時間のインキュベーション後、１Ｌ当たり乾燥細胞重量９．５〜９．７ｇの細胞密度に到達した。培養物を約２Ｌまで中空ファイバー濾過（Amicon DC-10 濾過システム中のAmicon H5MP01-43 カートリッジ）で濃縮し、リン酸緩衝化生理食塩水２Ｌでダイアフィルトレーションを行い、更に約１Ｌまで濃縮し、５００ｍＬの遠心分離用ボトルに分配した。８，０００ｒｐｍ（Sorval GS-3 ローター）、２０分、４℃での遠心分離によって細胞ペレットを回収した。上清のデカント後、ペレット（総計１９１〜２０８ｇ湿潤細胞）を、使用するまで−７０℃で保存した。実施例１５組換えＨＰＶ１８型Ｌ１カプシドタンパク質の精製特に記載されていなければ、全てのステップを４℃で行った。細胞を−７０℃で凍結保存した。凍結細胞（湿潤重量＝１２６ｇ）を２０〜２３℃で融解し、“破壊緩衝液”（２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１００ｍＭＮａＣｌ）７０ｍＬに再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡをそれぞれ最終濃度２ｍＭ及び１．７μＭで加えた。細胞スラリーを、M110-Y Microfluidizer（Microfluidics Corp.,Newton,MA）に４回通して圧力約１６，０００ｐｓｉで破壊した。破壊細胞スラリーを１２，０００×ｇ、４０分間の遠心分離にかけ、細胞破片を除去した。Ｌ１抗原を含む上清液体を回収した。緩衝液Ａ（２０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）の添加により、上清液体を１：５に希釈し、緩衝液Ａで平衡化させたFractogel^TM ＥＭＤＴＭＡＥ−６５０（Ｍ）樹脂のアニオン交換捕捉カラム（９．０ｃｍＩＤ×３．９ｃｍ）に載せた。緩衝液Ａで洗浄後、緩衝液Ａ中の０−１．０ＭＮａＣｌ勾配で、抗原を溶出した。カラム画分の総タンパク量をブラッドフォード法でアッセイした。次に、ウエスタンブロット及び銀染色検出によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、全て等しい総タンパク量を負荷して各画分をアッセイした。Ｌ１タンパク質の同等の純度と富化量を示すＴＭＡＥ画分をプールした。硫酸アンモニウム分画によって抗原を濃縮した。１０分間にわたって緩やかに撹拌しながら、固体試薬を加えて溶液を３５％飽和硫酸アンモニウム濃度に調整した。サンプルを氷上に置き、４時間かけて沈殿を生成させた。サンプルを１６，０００×ｇ、４５分間で遠心分離した。ＰＢＳ（６．２５ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌ）２０．０ｍＬ中にペレットを再懸濁した。セファクリル５００ＨＲ樹脂（Pharmacia，Piscataway，NJ）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）で再懸濁ペレットのクロマトグラフィーを行った。溶出緩衝液はＰＢＳであった。ウエスタンブロットと銀染色検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥで各画分を分析した。最も純度の高い画分をプールした。４３ｍｍＹＭ−１００フラット−シート膜（Amicon,Beverly,MA）を用いて、Ｎ₂圧力４−６ｐｓｉで、５０ｍＬの攪拌セルで、得られたプールを濃縮した。ウエスタンブロットとコロイド性クーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、最終産物を分析した。Ｌ１タンパク質は５０−６０％均一であると評価した。Ｌ１タンパク質のアイデンティティはウエスタンブロットで確認した。最終産物を分注し、−７０℃で保存した。この方法により合計１２．５ｍｇのタンパク質を得た。総タンパク質のブラッドフォードアッセイ市販のクーマシープラス^TMキット（Pierce,Rockford,IL）を用いて、総タンパク質をアッセイした。サンプルを、ミリ−Ｑ−Ｈ₂Ｏで適当なレベルに希釈した。必要な体積は、標準的プロトコルとミクロアッセイプロトコルでそれぞれ０．１ｍＬと１．０ｍＬであった。両方のプロトコルで、標準曲線を作製するためにＢＳＡ（Pierce,Rockford,IL）を使用した。製造業者の推奨の通りアッセイを行った。Macintosh IIci コンピューターで CricketGraph^TMソフトウエアを用いて標準曲線をプロットした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析全てのゲル、緩衝液及び電気泳動装置を Novex（San Diego,CA）から得、製造業者の推奨の通り操作した。要約すると、ミリ−Ｑ−Ｈ₂Ｏを用いて全て等しいタンパク質濃度にサンプルを希釈し、２００ｍＭＤＴＴを含むサンプルインキュベーション緩衝液と１：１となるように混合した。１００℃で１５分サンプルをインキュベートし、pre-cast１２％Tris-グリシンゲルに負荷した。１２５Ｖで１時間４５分、サンプルの電気泳動を行った。Heukeshoven及びDernickの方法（Electrophoresis,6(1985)103-112）の変法による銀染色又は市販のキット（In tegrated Separation Systems，Natick,MA）を用いるコロイド性クーマシー染色によってゲルを発色させた。ウエスタンブロットの場合、２５Ｖで４０分間、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した。第一抗体は、ＴｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク質（Dr.D.Brownから得た）に対して作製されたポリクローナルウサギ抗血清であった。この抗血清はウエスタンブロットでＨＰＶ１８Ｌ１と交差反応することが前の実験で示されていた。ブロッティング緩衝液（６．２５ｍＭリン酸Ｎａ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％ＮａＮ₃中、５％脱脂ミルク）で抗血清を希釈して抗体溶液を調製した。インキュベーションは、２０−２３℃で少なくとも１時間であった。ＰＢＳ（６．２５ｍＭリン酸Ｎａ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌ）を３回交換して各々１分かけてブロットを洗浄した。ヤギ抗−ウサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ−結合複合体抗血清（Pierce,Rockford,IL）をブロッティング緩衝液で希釈して、第二抗体溶液を調製した。同一の条件下で少なくとも１時間インキュベーションを行った。前述のようにブロットを洗浄し、１工程ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Pierce,Rockford, IL）を用いて検出した。実施例１６電子顕微鏡研究ＥＭ分析のために（Structure Probe，West Chester,PA）、各サンプルのアリコートを２００メッシュの炭素被覆の銅グリッドの上に置いた。２％リンタングステン酸（ＰＴＡ），ｐＨ７．０の一滴をグリッド上に２０秒間置いた。グリッドを風乾し、次に透過型ＥＭ試験を行った。加速電圧１００ｋＶでＪＥＯＬＩ００ＣＸ透過型電子顕微鏡(JEOL USA，Inc.)を用いて、全ての顕微鏡観察を行った。顕微鏡写真の倍率は１００，０００倍である。ＨＰＶ１８Ｌ１発現プラスミドを有する酵母サンプルで直径５０− ５５ｎｍサイズ範囲のウイルス様粒子が観察された（図６）。ＶＬＰは、酵母対照サンプルでは観察されなかった。実施例１７発現ベクターへのＨＰＶ１８ｃＤＮＡのサブクローニングトランスフェクトされた宿主細胞でのＨＰＶ１８タンパク質の発現とin vitro 転写／翻訳のために、ＨＰＶ１８をコードするｃＤＮＡを幾つかのベクターにサブクローン化した。これらのベクターは、pBluescript II ＳＫ＋（発現はＴ７又はＴ３プロモーターによって指令される）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって指令される）、ｐＳＺ９０１６−１（発現はＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターによって指令される）、及びＨＰＶ１８コーディングＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスを産生させるためのバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＵＷ５１（PharMingen,Inc）（発現はポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターによって指令される）などである。ａ）pBluescript II ＳＫ＋：ＨＰＶ１８完全長のＨＰＶ１８ｃＤＮＡクローンを、制限的ＥｃｏＲＩ消化によりラムダバクテリオファージから回収し、ＥｃｏＲＩ切断しＣＩＰ処理したpBluescript II ＳＫ⁺に連結させる。ＨＰＶ１８のセンス方向がＴ７又はＴ３プロモーターの後にある別々のサブクローンを回収する。ｂ）ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＨＰＶ１８正しい方向性のクローニングを容易にするために、ＨＰＶ１８ＤＮＡ配列がＴ７プロモーターの下流にあるpBluescript II ＳＫ＋：ＨＰＶ１８の精製プラスミド調製物から、ＨＰＶ１８をＥｃｏＲＶとＸｂａＩを用いて切出す。得られたＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩＨＰＶ１８フラグメントを精製し、ＨＰＶ１８コーディングＤＮＡがＣＭＶプロモーターの下流にあるように、ＥｃｏＲＶ切断しＸｂａＩ切断しＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに連結させる。ｃ）ｐＳＺ９０１６−１：ＨＰＶ１８ pBluescript II ＳＫ＋：ＨＰＶ１８から、制限的ＥｃｏＲＩ消化及び次のアガロースゲルからの１．３ｋｂフラグメントの精製によって、ＨＰＶ１８を切出す。得られたＥｃｏＲＩＨＰＶ１８フラグメントをＥｃｏＲＩ切断、ＣＩＰ処理したｐＳＺ９０１６−１に連結させる。ＨＰＶ１８のセンス方向がＨＩＶＬＴＲプロモーターの下流にあるサブクローンを選択する。ｄ）ｐＡｃＵＷ５１：ＨＰＶ１８Ｌ１隣接のＢｇｌII部位を与えるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、完全長ＨＰＶ１８Ｌ１ＯＲＦをクローン＃１８７−１からＰＣＲ増幅させた。ポリヘドリンプロモーターの制御下のバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＵＷ５１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のＢａｍＨＩ部位にＬ１遺伝子を挿入した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎマニュアルに記載の方法により、ＨＰＶ１８Ｌ１発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを産生させた。組換えクローンを限界希釈とドットブロットハイブリダイゼーションにより精製した。実施例１８ In Vitro 転写／翻訳及び宿主細胞へのトランスフェクションによるＨＰＶ１８ポリペプチドの発現ＨＰＶＤＮＡ配列を含むベクターを用いて、ウサギ網状赤血球溶解液、哺乳動物宿主細胞、及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でＨＰＶ１８ポリペプチドの翻訳をさせる。実験方法は、本質的に製造業者の説明書に記載のものである。ａ）In Vitro 転写／翻訳 pBluescript II ＳＫ＋：ＨＰＶ１８プラスミド（Ｔ７方向にＨＰＶ１８を有する）を、ＨＰＶ１８挿入体の下流でＢａｍＨＩ消化により線状化する。線状化プラスミドを精製し、それを鋳型として用いて、ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してラン−オフ転写を行わせる。得られたキャップ付きＨＰＶ１８転写体をＬｉＣｌ沈殿により精製し、それを用いて、Ｌ−［³⁵Ｓ］メチオニンの存在下、ヌクレアーゼ前処理ウサギ網状赤血球溶解液でＨＰＶ１８の翻訳を行わせる。ｂ）哺乳動物細胞での発現ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＨＰＶＩ８（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６−１：ＨＰＶ１８（ＨＩＶＬＴＲプロモーターの制御下）によるトランスフェクションの後、ＨＰＶ１８タンパク質を哺乳動物宿主細胞で発現させる。後者では（ｐＳＺ９０１６−１：ＨＰＶＩ８）、ＴＡＴ発現プラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴと共に細胞を共トランスフェクトする。両方のＨＰＶ１８発現プラスミドのために、ＤＥＡＥ −デキストラン又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）によるリポフェクションを用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトする。ｃ）昆虫細胞での発現ＨＰＶ１８Ｌ１含有バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＵＷ５１：ＨＰＶＩ８Ｌ１を用いて、in vivo 相同組換えによって組換えバキュロウイルス（Autographa californica）を産生させる。次に、ＨＰＶ１８含有組換えバキュロウイルスによる感染後、懸濁培養で生育させたＳｆ９（Spodoptera frugipe rda ）昆虫細胞でエピトープ付きＨＰＶ１８Ｌ１を発現させる。実施例１９ＨＰＶ１８活性に影響を与える化合物は、種々の方法により検出できる。ＨＰＶ１８に影響を与える化合物の同定方法は以下のものを含む：（ａ）試験化合物をＨＰＶ１８含有溶液と混合し、混合液を作製すること；（ｂ）混合液中のＨＰＶ１８活性を測定すること；及び（ｃ）混合液中のＨＰＶ１８を標準と比較すること。ＨＰＶ１８活性に影響を与える化合物によって、医薬組成物を製造できる。このような医薬組成物は、ＨＰＶ１８感染によって特徴付けられる疾患又は状態の治療に有用でありうる。実施例２０ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡに構造的に関連するＤＮＡは、プローブで検出する。適切なプローブは、図１又は図３のヌクレオチド配列の全部又は一部を有するＤＮＡ、図１又は図３のヌクレオチド配列の全部又は一部を有するＤＮＡによってコードされるＲＮＡ、あるいは図１又は図３の配列の一部由来の縮重オリゴヌクレオチドから得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジヤンセン，キヤスリン・ユーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ニーパー，マイケル・ピーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ジヨイス，ジヨージフ・ジーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ジヨージ，ヒユー・エーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトパピローマウイルス 18型をコードする単離精製されたＤＮＡ分子又はその機能性誘導体。２．図１に示されるヌクレオチド配列、図３に示されるヌクレオチド配列、図１に示されるヌクレオチド配列の機能性誘導体、及び図３に示されるヌクレオチド配列の機能性誘導体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の単離精製されたＤＮＡ分子。３．宿主における請求項１に記載のＤＮＡ分子の発現用発現ベクター。４．請求項１に記載のＤＮＡ分子によってコードされる実質的に精製されたタンパク質。５．請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、又は請求項１に記載のＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質から選択される化合物と免疫反応する抗体。６．宿主でヒトパピローマウイルス１８型タンパク質を発現させる方法であって、（ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主に移入させること；及び（ｂ）発現ベクターからヒトパピローマウイルス１８型タンパク質を発現させる条件下で工程（ａ）に記載の宿主を培養すること；を包含する方法。７．タンパク質が、ＨＰＶ１８Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８Ｌ２タンパク質、及びその組合せから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．治療される患者で免疫反応を誘起できる組成物であって、請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるペプチド、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、又はそれらの組合せから選択される化合物を含むことを特徴とする前記組成物。９．ヒトパピローマウイルス感染の予防用又は治療用ワクチンであって、請求項１に記載のＤＮＡ分子、、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるペプチド、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、又はそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含むことを特徴とする前記ワクチン。１０．ヒトパピローマウイルス１８型の組換えＬ１タンパク質、又は組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質からなるウイルス様粒子であって、その粒子の純度が少なくとも６０％であることを特徴とする上記粒子。１１．組換えＬ１タンパク質、又は組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質が酵母で産生されることを特徴とする請求項１０に記載のウイルス様粒子。１２．請求項１０に記載のウイルス様粒子の製造方法であって、（ａ）パピローマウイルスＬ１タンパク質又はパピローマウイルスＬ２タンパク質又はパピローマウイルスＬ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること；（ｂ）組換えＤＮＡ分子を発現させる条件下で形質転換酵母を培養し、組換えパピローマウイルスタンパク質を生産させること；及び（ｃ）組換えパピローマウイルスタンパク質を単離して、請求項１０に記載のウイルス様粒子を生産させること；を特徴とする上記方法。１３．請求項１２に記載の方法で生産された組換えパピローマウイルスタンパク質。１４．請求項１０に記載のウイルス様粒子を含むワクチン。１５．請求項１０に記載のウイルス様粒子を含む医薬組成物。１６．ウイルス様粒子に組み立てられた酵母由来組換えパピローマウイルスカプシドタンパク質の製造方法であって、（ａ）少なくとも一つのパピローマウイルスカプシドタンパク質をコードするパピローマウイルス遺伝子をベクターにクローニングすること；（ｂ）そのベクターを宿主細胞に移入させて、組換え宿主細胞を生産すること；（ｃ）パピローマウイルスカプシドタンパク質を産生させる条件下で組換え宿主細胞を培養すること；及び（ｄ）ウイルス様粒子を生成させる条件下でパピローマウイルスカプシドタンパク質を精製すること；を包含する上記方法。１７．請求項１６に記載の方法により生産されたウイルス様粒子。