FR2795074A1 - Polypeptides transporteurs d'acides amines, et en particulier du glutamate, et procedes de criblage de composes inhibiteurs ou activateurs de l'activite de transport - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des polypeptides transporteurs d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate, et des fragments peptidiques de ces derniers, les séquences nucléotidiques codant pour de tels polypeptides ou fragments peptidiques et des vecteurs recombinants contenant ces séquences nucléotidiques. L'invention est également relative à des moyens de détection de ces polypeptides et acides nucléiques, tels que des amorces ou sondes nucléotidiques ou encore des anticorps, ainsi qu'à des procédés et des kits de détection mettant en oeuvre de tels moyens de détection. L'invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules candidates capables d'inhiber ou au contraire d'activer le transport d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate.
Description
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La présente invention concerne des polypeptides transporteurs d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate, et des fragments peptidiques de ces derniers, les séquences nucléotidiques codant pour de tels polypeptides ou fragments peptidiques et des vecteurs recombinants contenant ces séquences nucléotidiques. L'invention est également relative à des moyens de détection de ces polypeptides et acides nucléiques, tels que des amorces ou sondes nucléotidiques ou encore des anticorps, ainsi qu'à des procédés et des kits de détection mettant en #uvre de tels moyens de détection. L'invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules candidates capables d'inhiber ou au contraire d'activer le transport d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate.
Le glutamate, acide aminé dicarboxylique, est synthétisé par toutes les cellules à partir de : - l'a-cétoglutarate grâce à l'activité catalytique de la glutamate déshydrogénase ou de la glutamate oxaloacétate transaminase ; - de la glutamine grâce à l'activité catalytique de la glutaminase.
Outre son rôle métabolique ubiquitaire, le glutamate est également un neurotransmetteur excitateur dans le système nerveux central. Accumulé dans les vésicules synaptiques, il est libéré dans la synapse par un mécanisme d'exocytose calcium-dépendante et il interagit avec des récepteurs ionotropiques (iGluR) ou métabotropiques (mGluR).
L'arrêt de la transmission glutamatergique s'effectue essentiellement par une désensibilisation rapide des récepteurs (en environ 1 à 3 msec), mais également par un rétro-transport actif dans les cellules gliales et les neurones environnants. Cette recapture est assurée par des transporteurs localisés sur la surface de la membrane plasmique et dont l'activité dépend des ions Na+ et K+.
De nombreux travaux ont montré que des concentrations synaptiques élevées en glutamate entraînent une hyper-stimulation des récepteurs glutamatergiques conduisant à la destruction des neurones cibles. Afin d'éviter
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une telle cytotoxicité, il est donc primordial de maintenir dans l'espace extracellulaire de faibles concentrations de glutamate (environ 1 à 3 M).
De fait, des concentrations anormalement élevées de cet acide aminé excitateur ont pu être mises en évidence dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose amyotrophique latérale (SLA) ou la maladie de Huntington, ou encore dans la mort neuronale subséquente à une hypoxie.
La nécessité d'un contrôle strict de la transmission glutamatergique a été récemment illustrée par la caractérisation du gène impliqué dans la dégénérescence des motoneurones chez la souris lurcher. Il s'agit d'une mutation ponctuelle dans le troisième domaine transmembranaire du gène d'un récepteur glutamatergique (GluR#2), dont la conséquence est la production d'un récepteur constitutivement actif (Zuo et al., 1997). Chez ces souris, la stimulation chronique de la transmission glutamatergique a des effets délétères importants, telles qu'une ataxie provoquée par la dégénérescence par apoptose des cellules de Purkinje chez les souris hétérozygotes, et une mort post-natale due à une perte massive des neurones du cerveau moyen et du cerveau antérieur chez les homozygotes. Les effets délétères sont d'autant plus remarquables que la mutation lurcher est de type semi-dominante.
En outre, il apparaît de plus en plus clairement , depuis des années, que des dysfonctionnements dans la transmission glutamatergique sont responsables de pathologies psychiatriques variées. Cela peut être expliqué, du moins en partie, par les interrelations importantes existant entre les neurones dopaminergiques et glutamatergiques dans le cortex frontal et les noyaux gris centraux.
Très récemment, des agonistes glutamatergiques ayant des propriétés psychotropes on été caractérisés (Moghaddam et al., 1998).
Comme déjà évoqué précédemment, le glutamate est un neurotransmetteur majeur du système nerveux central (SNC) présent dans 40 à 50% des neurones. Des dysfonctionnements dans le transport de ce
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neurotransmetteur excitateur sont susceptibles d'induire diverses affections neurologiques ou neuro-psychiatriques.
Il existe donc actuellement un grand besoin d'identifier des molécules d'intérêt thérapeutique capables de moduler ou réguler le transport glutamatergique, en particulier le transport glutamatergique vésiculaire intracytoplasmique dans les neurones cibles, afin de traiter les diverses pathologies liées à une dérégulation du transport glutamatergique.
De plus, il n'existe à l'heure actuelle aucun marqueur, par exemple protéique, spécifique des neurones glutamatergiques qui permettrait de les visualiser aisément.
Ces besoins sont désormais comblés selon la présente invention par l'isolement et la caractérisation d'une famille de polypeptides ayant la structure générale d'un transporteur vésiculaire d'acides aminés, tels que les transporteurs vésiculaires d'acides aminés inhibiteurs comme le GABA ou la glycine (transporteurs VIAAT) décrits par Sagné et al. (1997).
Les polypeptides selon l'invention sont produits essentiellement au niveau des différents types de neurones glutamatergiques et possèdent en outre une forte affinité pour un inhibiteur du transport vésiculaire du glutamate, tel que le Bleu Trypan (Roseth et al., 1998).
Par forte affinité pour un inhibiteur du transport vésiculaire du glutamate, on entendra dans la présente description une affinité définie par une valeur de Km entre un polypeptide selon l'invention et un inhibiteur comprise préférentiellement entre 10-8 M. et 10-14 M., encore plus préférentiellement entre 10-9 M. et 10-13 M et de manière tout à fait préférée entre 10-10 M. et 10-12 M..
L'invention concerne donc en premier lieu un polypeptide transporteur du glutamate dans les cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il possède une forte affinité pour un inhibiteur du transport du glutamate tel que le Bleu Trypan, ou un fragment peptidique de ce dernier.
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Plus particulièrement, le demandeur a isolé et caractérisé des acides nucléiques codant pour une famille de polypeptides possédant les caractéristiques ci-dessus des polypeptides selon l'invention, à partir d'une banque d'ADNc d'hippocampe de rat.
Il a ainsi pu être mis en évidence que deux gènes étaient exprimés principalement dans les neurones glutamatergiques, ces deux gènes étant exprimés chacun sous la forme respectivement de deux produits de transcription (ARNm) résultant d'un évènement d'épissage alternatif. Les transcrits du premier gène ont été désignés par vg1 et vg3, alors que les transcrits du second gène ont été désignés par vg41 et vg51.
Il a été également montré que les deux isoformes de chacun des transcrits ci-dessus résultaient en la production de polypeptides distincts ayant tous la structure générale d'un transporteur vésiculaire d'acides aminés. Plus précisément, l'ARNm vg1 code pour le polypeptide VG1, l'ARNm vg3 code principalement pour le polypeptide VG3, l'ARNm vg41 code pour le polypeptide VG41 et l'ARNm vg51 code pour le polypeptide VG51. En outre, l'ARNm vg3 comprend une seconde phase ouverte de lecture, localisée en amont de la phase ouverte de lecture codant VG3, codant pour un petit polypeptide qui sera désigné VG3-1 dans la présente description.
L'invention est relative à un polypeptide codé par l'un quelconque des ARNs messagers correspondant respectivement à vg1, vg3, vg41 et vg51 ainsi qu'à un fragment peptidique dérivé de ce dernier.
De manière préférée, un polypeptide selon l'invention sera sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polypeptide ou un polynucléotide présent à l'état naturel dans un animal ou une plante n'est pas
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isolé. Le même polypeptide séparé de son environnement naturel ou le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'animal ou de la plante est isolé.
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé, du fait que le vecteur ou la composition ne constituent pas son environnement naturel.
Le terme "purifié" ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polypeptide ou un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
L'invention concerne donc un polypeptide, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide comprenant au moins 15 acides aminés consécutifs de l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 ; b) un polypeptide ayant au moins 60% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide tel que défini en a) ; c) un polypeptide reconnu par un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide tel que défini en a) ou b).
Le "pourcentage d'identité" d'acides aminés ou de nucléotides entre deux séquences, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de séquence peptidique ou nucléotidique, dans la fenêtre de comparaison, peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemples des "gaps") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
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Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé ou une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés ou entre les deux bases, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences comparées.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus (par exemple le logiciel FASTA de la Société Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin, Etats-Unis).
Préférentiellement, le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques ou entre deux séquences peptidiques selon l'invention sera réalisé à l'aide du logiciel précité FASTA (FASTA-N ou FASTA-P), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Font également partie de l'invention les polypeptides ayant au moins 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou encore 99,8% d'identité en acides aminés avec un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 9.
Les différences en acides aminés que peut comprendre un polypeptide selon l'invention ayant au moins 60% d'identité en acides aminés par rapport à la séquence d'acides aminés de référence, telle que définie dans le listage de séquences présenté à la fin de la présente description, peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non par rapport à la séquence de référence considérée.
Préférentiellement, un polypeptide selon l'invention possède des modifications d'acides aminés allant de 1, 3, 5,10, 15 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé, comparé à l'une des séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 9.
Dans le cas de substitutions d'acides aminés, un ou plusieurs acides aminés-consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés préférentiellement par des acides aminés "équivalents". Par acide aminé "équivalent", on entend un acide aminé dont l'introduction dans la séquence peptidique, à la place de l'acide aminé initial :
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a) ne modifie pas significativement la capacité du polypeptide ainsi modifié d'être reconnu par des anticorps dirigés spécifiquement contre le polypeptide initial, ou encore b) ne modifie pas significativement la capacité du polypeptide ainsi modifié à se fixer avec une forte affinité à un inhibiteur du transport glutamatergique, tel que le Bleu Trypan. La capacité d'un polypeptide modifié à se fixer à un inhibiteur du transport glutamatergique n'est pas significativement modifiée, au sens de la présente invention, si la valeur de l'affinité Km du polypeptide modifié pour l'inhibiteur ne diffère pas de plus de deux ordres de grandeur (10-3 à 10+3) par rapport à l'affinité du polypeptide initial pour le même inhibiteur. Ainsi, font partie de l'invention les polypeptides dont la séquence a été modifiée par rapport à l'un des polypeptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et qui ont une affinité pour le Bleu Trypan comprise entre 10-9 M et 10-15 M.
Certains polypeptides selon l'invention, en particulier VG1 et VG3, comprennent un domaine caractéristique de liaison au glutamate. Par exemple, les polypeptides VG1 et VG3 comprennent la séquence EASPWSCLQRQAAWGRS , qui présente une homologie significative avec une portion d'une protéine codant une enzyme acide glutamique décarboxylase codée par le génome de Xenopus laevis.
Sont compris dans la définition d'acides aminés "équivalents" les acides aminés appartenant à la même classe, tels que les acides aminés acides (D et E), basiques (K, R et H), non polaires (A, V, L, I, P, M, F et W) ou encore polaires non chargés (G, S, T, C, Y, N et Q).
Font également partie de l'invention les polypeptides rendus résistants à la protéolyse par l'introduction d'une ou plusieurs liaisons non peptidiques, telles qu'une liaison réduite (CH2NH), une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison méthylène-oxy (CH2-0), une liaison thiométhylène (CH2-S), une liaison carba (CH2-CH2), une liaison cétométhylène (CO-CH2), une liaison hydroxyéthylène (CHOH-CH2) ou encore une liaison CH=CH.
Les polypeptides selon l'invention sont utilisés notamment pour la production d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement l'un quelconque des polypeptides VG1, VG3, VG3-1, VG41 ou VG51, afin de réaliser des moyens de détection de ces polypeptides dans un échantillon, par exemple sur une coupe histologique de cerveau.
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De manière avantageuse, des polypeptides ou peptides utilisés pour la production d'anticorps ont une séquence en acides aminés d'une longueur inférieure à l'un quelconque des polypeptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5. De tels fragments peptidiques ont préférentiellement une longueur de séquence en acides aminés comprise entre 10 et 200 acides aminés, de préférence entre 12,15, 20,25 et 30, 40 à 50,75, 100 ou 150 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'invention. Alternativement, de tels fragments peptidiques ont une taille de 10,12, 15,20, 25,30, 40,50, 60, 70,80, 90,100 ou 150 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l' invention.
Plus particulièrement, divers fragments peptidiques dérivés respectivement des polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 ont été sélectionnés comme décrit à l'exemple 3 pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement un seul de ce polypeptides ou plusieurs d'entre eux : - le peptide VG1-1 de 20 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 6, induit la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement le polypeptide VG1 ; - le peptide VG1-2 de 21 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 7, induit la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement le polypeptide VG1; - le peptide VG1-4 de 16 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 8, induit la production d'anticorps dirigés à la fois contre le polypeptide VG1 et le polypeptide VG3 ; - le peptide VG51-1 de 17 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 9, induit la production d'anticorps dirigés spécifiquement contre le polypeptide VG51 ; - le peptide VG51-2 de 15 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 10, induit la production d'anticorps dirigés à la fois contre le polypeptide VG51 et le polypeptide VG41.
Selon un autre aspect, l'invention est aussi relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 6 à SEQ ID NO 10, utiles notamment pour la production d'anticorps qui
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peuvent être mis en oeuvre en tant que moyens de détection d'un polypeptide transporteur vésiculaire glutamatergique présentement décrit.
Un autre objet de l'invention consiste en des acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'invention, et plus particulièrement un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, ou pour des fragments peptidiques de ces polypeptides.
L'invention fournit aussi des acides nucléiques comprenant tout ou partie de la région codante des ADNs complémentaires correspondant aux ARNs messagers de vg1, vg3, vg41 et vg51, des fragments nucléotidiques de ces derniers ainsi que les polynucléotides de séquence complémentaire..
L'invention a donc également pour objet un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs s'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 11à SEQ ID NO 14 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini en a) ; c) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini en a) ou b) .
Font ainsi partie de l'invention les acides nucléiques ayant au moins 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou encore 99,8% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques de séquences SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entend les conditions d'hybridations suivantes : - préhybridation des filtres pendant au moins 1 heure à 42 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 0,1 % PVP, 0,1 % SAB, 0,1% Ficoll, 0,05% NaPPi, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé ; - hybridation des filtres avec une sonde nucléotidique marquée pendant au moins 4 heures à 45 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-
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HCI (pH 7,5), 0,02% PVP, 0,02% SAB, 0,02% Ficoll, 0,05% NaPPi, 0,1 mg/ml d'ARNt de levure ; - trois lavages pendant 20 minutes de chacun des filtres dans une solution contenant 6 x SSC et 0,05% NaPPi à 61 C.
Les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-dessus sont adaptées à l'hybridation d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 20 nucléotides.
Il va sans dire que ces conditions d'hybridation doivent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de Hames and Higgins (1985) ou encore dans l'ouvrage de Sambrook et al. (1989).
Font ainsi partie de l'invention les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14. De tels acides nucléiques comprennent avantageusement de 15,20, 25,30, 35,40, 50,100, 150,200 à 250 300 ou 400 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14. De tels acides nucléiques peuvent comprendre par exemple 15,20, 25,30, 35,40, 50, 100,150, 200,250, 300 ou 400 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14.
Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotidique est employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg1 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 11. La séquence SEQ ID NO 11 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 39 au nucléotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 11, codant pour le polypeptide VG1 de séquence SEQ ID NO 1. La séquence SEQ ID NO 11 possède une certaine homologie avec une séquence EST humaine référencée dans la base de données Genbank sous le numéro d'accès H08076. Plus précisément, une
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identité de séquence en nucléotides a été retrouvée entre vg41 et H8076 (49% d'identité) et entre vg1 et H8076 (72% d'identité)
L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg3 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 12. La séquence SEQ ID NO 12 comprend une première phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 392 au nucléotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3-1 de séquence SEQ ID NO 2. La séquence SEQ ID NO 12 comprend une seconde phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 756 au nucléotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3 de séquence SEQ ID NO 3.
L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg3 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 12. La séquence SEQ ID NO 12 comprend une première phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 392 au nucléotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3-1 de séquence SEQ ID NO 2. La séquence SEQ ID NO 12 comprend une seconde phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 756 au nucléotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3 de séquence SEQ ID NO 3.
L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg41 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 13. La séquence SEQ ID NO 13 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 352 au nucléotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13, codant pour le polypeptide VG41 de séquence SEQ ID NO 4.
L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg51 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 14. La séquence SEQ ID NO 14 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 105 au nucléotide en position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14, codant pour le polypeptide VG51 de séquence SEQ ID NO 5..
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 39 au nucléotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 11 ; b) la séquence allant du nucléotide en position 392 au nucléotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 ; c) la séquence allant du nucléotide en position 756 au nucléotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 ; d) la séquence allant du nucléotide en position 352 au nucléotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13 ; e) la séquence allant du nucléotide en position 105 au nucléotide en position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14 ; ou un acide nucléique de séquence complémentaire aux séquences a) à e).
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L'invention concerne aussi des sondes et des amorces nucléotidiques capables d'hybrider spécifiquement avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention tels que définis précédemment. Avantageusement, les sondes et les amorces nucléotidiques sont définies de telle manière qu'elles hybrident avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies dans la description.
Les sondes nucléotidiques selon l'invention sont utiles notamment pour détecter la présence d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate dans un échantillon. Ces sondes peuvent par exemple être mises en #uvre dans des expériences d'hybridation in situ sur des coupes histologiques de tissus, préférentiellement des coupes histologiques de cerveau, telles que décrites à l'exemple 2.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont utiles notamment pour amplifier la totalité ou une partie d'un acide nucléique cible codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate présent dans un échantillon. Les acides nucléiques amplifiés à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention pourront subséquemment être intégrés dans un vecteur de clonage ou d'expression ou encore être simplement détectés sur gel ou révélés à l'aide d'une sonde appropriée , comme par exemple dans les expérience de Northern Blot sur de l'ARN messager provenant de différents tissus, tel que décrit à l'exemple 1.
La taille des sondes et des amorces nucléotidiques varie de 10 à 1000 nucléotides et est préférentiellement comprise entre 10,12, 15,18, 20,25 à 30, 35,40, 45,50, 60, 70,80, 90,100, 200,250, 400,500, ou 1000 nucléotides, et de manière préférée de 10 à 1000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, le contenu en bases GC des sondes et des amorces selon l'invention est compris entre 35% et 70%, et de manière tout à fait préférée entre 40% et 60%.
Des sondes nucléotidiques préférées sont la séquence nucléotidique SEQ ID NO 19, qui hybride spécifiquement avec les ARN messagers vg1 et vg3, ainsi que la séquence nucléotidiques SEQ ID NO 20, qui hybride spécifiquement avec les ARN messagers vg41 et vg51.
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Des amorces nucléotidiques préférées sont les suivantes : - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 15 ; - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 16 ; - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 17 ; - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 18 ;
Des couples d'amorces préférés aux fins d'amplifier un acide nucléique selon l'invention sont les suivants : - le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 16, permettant d'amplifier des acides nucléiques correspondant à vg1et vg3 ; - le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO 18, permettant d'amplifier des acides nucléiques correspondant à vg41 et vg51;
Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être préparées par l'un quelconque des procédés de synthèse appropriés bine connus de l'homme du métier, tels que la technique de synthèse au phosphodiester de Narang et al.
Des couples d'amorces préférés aux fins d'amplifier un acide nucléique selon l'invention sont les suivants : - le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 16, permettant d'amplifier des acides nucléiques correspondant à vg1et vg3 ; - le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO 18, permettant d'amplifier des acides nucléiques correspondant à vg41 et vg51;
Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être préparées par l'un quelconque des procédés de synthèse appropriés bine connus de l'homme du métier, tels que la technique de synthèse au phosphodiester de Narang et al.
(1979) ou de Brown et al. (1979) ou encore la méthode au diéthylphosphoramidite de Beaucage et al. (1981).
L'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et tout particulièrement les acides nucléiques utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques, peuvent être marqués par incorporation d'un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immuno-chimiqués ou chimiques. Le marqueur détectable peut notamment consister en des isotopes radioactfis (32P, 35S, 3H ou 125I), des colorants fluorescents (5-bromodésoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène ou digoxygénine) ou encore par un ligand telle que la biotine. De préférence, les polynucléotides sont marqués à leur extrémité 3' ou 5'. Des exemples illustratifs de marquage non radioactif de fragments nucléotidiques sont décirits dans le brevet français N FR-7810975 ou encore dans les articles de Urdea et al.
(1988) ou Sanchez-Pescador (1988). Avantageusement, les sondes nucléotidiques selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurales telles que celles des sondes ramifiées permettant une amplification du signal décrites par Urdea en 1991 ou encore dans le brevet Européen N EP-0225 807 (Chiron).
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Selon un mode de réalisation particulier des sondes ou des amorces nucléotidiques selon l'invention, celles-ci peuvent être immobilisées sur un support tel que la surface de puits de plaques de microtitration, des billes de polystyrène, des filtres de nitrocellulose etc.
L'invention concerne également un procédé de détection d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; b) détecter la présence d'un complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon.
Selon un premier mode de réalisation particulier, le procédé de détection est caractérisé en ce que la ou les sonde(s) nucléotidique(s) est (sont) immobilisée(s) sur un support.
Selon un second mode de réalisation particulier, le procédé de détection est en outre caractérisé en ce que la ou les sonde(s) nucléotidique(s) est (sont) marquée (s) par un marqueur détectable.
Selon un troisième mode de réalisation particulier, les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 19 et Seq ID NO 20.
L'invention' a également pour objet un kit ou trousse de détection d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate dans un échantillon, comprenant : a) une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon.
Selon un premier mode de réalisation, le kit ou trousse de détection est caractérisé en ce que la ou les sonde(s) nucléotidique(s) est (sont) immobilisée(s) sur un support.
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Selon un second mode de réalisation, le kit ou trousse de détection est caractérisé en ce que la ou les sonde(s) nucléotidique(s) est (sont) marquée(s) par un marqueur détectable.
Selon un troisième mode de réalisation particulier, les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 19 et Seq ID NO 20.
L'invention est aussi relative à un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un couple d'amorces nucléotidiques telles que définies cidessus avec un échantillon susceptible de contenir un acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; en présence des réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification ; b) le cas échéant, détecter les acides nucléiques amplifiés.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 15 à SEQ ID NO 18.
L'invention concerne également un kit ou trousse pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification et/ou les moyens de détection des acides nucléiques amplifiés.
Selon un premier mode de réalisation, les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 15 à SEQ ID NO 18.
Selon un second mode de réalisation, les moyens de détection des acides nucléiques amplifiés sont constitués par des sondes hybridant spécifiquement avec ces derniers, par exemple des sondes comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20.
Les techniques d'amplification d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. Des techniques d'amplification pouvant être mises en #uvre dans le contexte de la présente invention comprennent, sans toutefois y
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être limitées, à la Ligase Chain Reaction (LCA) décrite dans les brevets européens N EP-320 308 et EP-439 182 ou encore dans la demande PCT n WO 93/20227, la réaction en chaîne à la polymérase (PCR et RT-PCR) ainsi que des techniques telles que la technique NASBA (Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), l'amplification à la Q-beta réplicase décrite dans la demande de brevet européen n EP-4544610 ou encore la technique SDA (Walker et al., 1996).
La technique PCR proprement dite est décrite en détails dans la revue de White et al. (1997), dont le contenu est incorporé ici par référence.
Les acides nucléiques correspondants aux différents produits de transcription vg1, vg3, vg41, et vg51 ont été insérés dans des vecteurs d'expression recombinants, ces vecteurs recombinants ayant été utilisés pour transfecter des cellules de mammifères comme les cellules de la lignée HEK- 293 en vue de la production des polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 correspondants. Ces expériences sont décrites en particulier à l'exemple 4.
Ainsi, l'invention a également pour objet une famille de vecteurs recombinants de clonage ou d'expression comprenant l'un quelconque des acides nucléiques définis dans la présente description, et en particulier l'un quelconque des acides nucléiques choisis parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14, des fragments nucléiques de ces derniers ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Le terme vecteur recombinant , au sens de la présente invention désigne une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire, qui peut être sous la forme simple brin ou double brin, et qui comprend un polynucléotide d'intérêt dont l'amplification ou l'expression est recherchée après son transfert dans un hôte cellulaire approprié.
Un vecteur d'expression recombinant selon l'invention comprend, outre l'acide nucléique d'intérêt dont l'expression est recherchée, des séquences de régulations fonctionnelles dans l'hôte cellulaire désiré, telles que des promoteurs, des signaux de début et d'arrêt de la traduction et le cas échéant des séquences activatrices de type enhancer , si nécessaire. De telles séquences de régulation sont localisées, par rapport à l'acide nucléique dont l'expression est recherchée, de telle manière à fonctionnellement liée à l'acide nucléique d'intérêt, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
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De préférence, la séquence promotrice sera donc localisée du côté 5' de l'acide nucléique d'intérêt, et en phase avec ce dernier, de manière à ce que la fonction de promoteur puisse être effective.
Les vecteurs recombinants selon l'invention comprennent avantageusement plusieurs origines de réplications fonctionnelles respectivement dans différents hôtes cellulaires, y compris dans des hôtes cellulaires dont les polymérases ne reconnaissent pas les différents signaux de régulation de la transcription et de la traduction éventuellement contenus dans ces vecteurs, dits vecteurs navettes. Lesdits vecteurs recombinants comprennent de préférence un ou plusieurs marqueurs de sélection choisis parmi les marqueurs de résistance aux antibiotiques, tels que la résistance à la néomycine, à la tétracycline, à la rifampicine ou à l'ampicilline.
Les promoteurs sont par exemple choisis parmi les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PL et PR du phage lambda ou encore le promoteur p10 de la polyhédrine de baculovirus (O'Reilly et al., 1992).
Les vecteurs recombinants selon l'invention sont indifféremment des vecteurs bactériens, viraux, de baculovirus ou encore des vecteurs pour cellules eucaryotes, en particulier pour cellules de mammifères.
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression des acides nucléiques selon l'invention dans des bactéries sont par exemple les vecteurs pQE70, pQE60 ou pQE-9 (commercialisés par la société QIAGEN), les vecteurs pBluescript, Page script, pNH8A; pNH16a, pNH18a, pNH46A (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pKK223-3, pKK233-3, pDR540 et pRIT5 (commercialisés par la société Pharmacia) .
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression dans cellules eucaryotes sont par exemple les vecteurs pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 et pSG (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pSVK3, pBPV, pMSG et pSVL (commercialisés par la société Pharmacia)
Un premier vecteur préférentiellement mis en #uvre dans le cadre de l'invention est le vecteur pcDNA3 commercialisé par la société Invitrogen .
Un premier vecteur préférentiellement mis en #uvre dans le cadre de l'invention est le vecteur pcDNA3 commercialisé par la société Invitrogen .
Un second vecteur particulièrement préféré est le vecteur pBluescript SK (-), commercialisé par la société Stratagene.
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Ainsi, les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14 ont été inséré dans des vecteurs pcDNA3 ou pBluescript SK (-), plus particulièrement au niveau d'un site de restriction unique EcoRI contenu dans le sites de clonage multiple localisé dans ces vecteurs. Les cartes de construction de ces vecteurs sont représentées respectivement aux figures 5 à 8.
Un troisième vecteur particulièrement préféré selon l'invention est le vecteur pcDNA3-VG1 contenu dans la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210. L'insert nucléotidique contenu dans ce vecteur recombinant est la séquence SEQ ID NO 11.
Un quatrième vecteur particulièrement préféré selon l'invention est le vecteur pcDNA3-VG51 contenu dans la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209. L'insert nucléotidique contenu dans ce vecteur recombinant est la séquence SEQ ID NO 14.
Les vecteurs recombinants décrits ci-dessus sont préférentiellement utilisés pour transfecter ou transformer une cellule hôte appropriée dans laquelle la multiplication du vecteur ou dans laquelle l'expression de l'insert nucléotidique d'intérêt est recherchée.
Un autre objet de l'invention consiste en une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'invention ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Des cellules hôtes préférées destinées à recevoir un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention sont par exemples les cellules hôtes suivantes : a) cellules hôtes procaryotes : Escherichia coli(en particulier la souche DH5-a), des souches de Bacillus, telles que des souches de Bacillus subtilis, ou encore des souches de Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococcus. b) cellules hôtes eucaryotes: HeLa (ATCC N CCL2 ; N CCL2.1 ; N CCL2.2), Cv 1 (ATCC N CCL70), COS (ATCC N CRL1650 ; N CRL1651), Sf-9 (ATCC N CRL1711), C127 (ATCC N CRL-1804) ; 3T3 (ATCC N CRL-6361), CHO (ATCC N CCL-61), HEK-293 (ATCC N 45504 ; N CRL-1573) et BHK (ATCC N 84100501 ; N 84111301).
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Une autre catégorie de cellules hôtes préférées selon l'invention comprend des cellules neuronales, plus particulièrement des cellules de neurones glutamatergiques de patients affectés d'un dysfonctionnement dans le transport vésiculaire du glutamate, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme de cellules établies en lignées, par exemple après transformation par le virus d'Epstein-Barr selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Une première cellule hôte recombinante particulièrement préférée selon l'invention est de la souche de E. coli contenant le vecteur pCDNA3-VG1, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210.
Une seconde cellule hôte recombinante particulièrement préférée selon l'invention est de la souche de E. coli contenant le vecteur pcDNA3-VG51, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209.
L'un quelconque des polypeptides VG1, VG3-1, VG3, VG41 et VG51, leurs homologues peptidiques ainsi que les fragments peptidiques de ces polypeptides ou polypeptides homologues peuvent être obtenus sous une forme recombinante par l'insertion d'un acide nucléique codant pour ceux-ci dans un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus et introduction du vecteur recombinant obtenu dans une cellule hôte appropriée.
L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un polypeptide selon',!, invention comprenant les étapes de : a) transfecter une cellule hôte appropriée, dans laquelle l'expression du polypeptide est recherchée ; avec un vecteur recombinant selon l'invention ; b) cultiver la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) dans un milieu de culture approprié ; c) récupérer le polypeptide recombinant produit par la cellule hôte recombinante dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire de la cellule hôte cultivée à l'étape b) ; d) le cas échéant, purifier le polypeptide recombinant présent dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant obtenu à l'étape c) ou d).
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Les polypeptides obtenus selon le procédé décrit ci-dessus peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immuno-affinité sur laquelle des anticorps reconnaissant ledit polypeptide ont été préalablement immobilisés.
Les polypeptides selon l'invention, et plus particulièrement les polypeptides recombinants selon l'invention peuvent aussi être purifiés par des techniques de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), telle que par exemple des techniques de chromatographie en phase inverse ou de chromatographie d'échange d'anions ou de cations, bienconnues de l'homme du métier.
Les polypeptides, recombinants ou non recombinants, selon l'invention peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps.
On a montré selon l'invention que des peptides dérivés des polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 pouvaient être avantageusement utilisés pour la préparation d'anticorps, en particulier d'anticorps polyclonaux, capables de reconnaître spécifiquement VG1, VG3, VG1et VG3, VG41, VG51, VG41 et VG51, selon que les polypeptides possédaient une séquence en acides aminés uniquement présente dans un seul de ces polypeptides, ou au contraire une séquence d'acides aminés commune à deux d'entre eux, par exemple VG1 et VG3 ou encore VG41 et VG51.
Selon un autre aspect, l'invention a donc encore pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement un polypeptide selon l'invention ou un fragment peptidique de ce dernier, en particulier un polypeptide de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 ou un fragment peptidique unique ou au contraire commun à ces derniers.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps préparés par immunisation d'un animal avec l'un des peptides de séquences SEQ ID NO 6 à SEQ ID NO 10.
- Les anticorps préparés à partir du peptide VG1-1 de séquence SEQ ID NO 6 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG1 ; - Les anticorps préparés à partir du peptide VG1-2 de séquence SEQ ID NO 7 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG1 ;
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- Les anticorps préparés à partir du peptide VG1-4 de séquence SEQ ID NO 8 reconnaissent à la fois le polypeptide VG1 et le polypeptide VG3 ; - Les anticorps préparés à partir du peptide VG51-1 de séquence SEQ ID NO 9 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG51 ; - les anticorps préparés à partir du peptide VG-51-2 de séquence SEQ ID NO 10 reconnaissent à la fois le polypeptide VG51 et le polypeptide VG41.
Les anticorps selon l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir de cellules d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975).
Les anticorps polyclonaux peuvent être préparés par immunisation d'un mammifère, en particulier en particulier des souris, des rats ou des lapins, avec un polypeptide de l'invention à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée, le cas échéant en présence d'un composé adjuvant de l'immunité, tel que de l'adjuvant complet de Freund, de l'adjuvant incomplet de Freund, de l'hydroxyde d'aluminium ou encore un composé de la famille des muramyl peptides.
Constituent également des anticorps , au sens de la présente invention, les fragments d'anticorps tels que les fragments Fab, Fab', F(ab')2, ou encore les fragments d'anticorps simple chaîne contenant la partie variable (ScFv) décrits par Martineau et al. (1988) ou encore dans le brevet américain n US 4,946,778, ainsi que les anticorps humanisés décrits par Reinman et al.
(1997) ou par Leger et al. (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests immunologiques qualitatifs ou quantitatifs visant soit à simplement détecter la présence d'un polypeptide transporteur vésiculaire du glutamate dans un échantillon, par exemple sur une coupe tissulaire, soit à quantifier la quantité du polypeptide cible des anticorps dans un échantillon, par exemple un fluide biologique ou encore une surnageant de culture ou un lysat cellulaire d'une cellule hôte recombinante selon l'invention.
Selon un autre aspect, les anticorps selon l'invention peuvent être également utilisés, du fait de leur caractère de ligands de l'un des polypeptides transporteurs selon l'invention, pour moduler l'activité de ces polypeptides, et donc moduler -inhibier ou au contraire activer- le transport d'acides aminés,
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plus particulièrement le transport vésiculaire du glutamate, par exemple au niveau des neurones glutamatergiques.
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de détection d'un polypeptide transporteur vésiculaire du glutamate, ou un fragment peptidique de ce dernier, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact un anticorps selon l'invention avec l'échantillon à tester ; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
L'invention est également relative à un kit ou trousse de détection d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon l'invention ; b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection de complexe antigène/anticorps éventuellement formé
Un anticorps selon l'invention peut être marqué à l'aide d'un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, selon des procédés bien connus de l'homme du métier.
Un anticorps selon l'invention peut être marqué à l'aide d'un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, selon des procédés bien connus de l'homme du métier.
Comme déjà indiqué précédemment, il a été isolé et caractérisé pour la première fois selon l'invention une famille de polypeptides transporteurs vésiculaires d'acides aminés, particulièrement du glutamate, structuralement apparentés et impliqués dans le stockage du glutamate, neuro-transmetteur excitateur, notamment dans des vésicules intra-cytoplasmiques des cellules de type glutamatergique du système nerveux central. Les résultats des exemples montrent que lesgènes codant pour les polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 selon l'invention sont également exprimés dans d'autres tissus tels que les poumons, le foie, la rate etc. Les polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 sont donc également susceptibles de jouer un rôle important dans le transport d'acides aminés, plus particulièrement du glutamate, par exemple au niveau des poumons.
Les vésicules intra-cytoplasmiques ont la propriété d'accumuler le glutamate présent dans le cytoplasme de ces cellules, le glutamate ainsi présent à haute concentration pouvant être relargué très rapidement et en grande quantité dans l'espace extra-cellulaire, notamment inter-neurona,l lors de la réception d'un signal excitateur par les cellules concernées. Il a en particulier été déterminé que l'activité de ces transporteurs glutamatergiques est de nature à placer le
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glutamate à une concentration 10 fois plus grande dans les vésicules intracytoplasmiques que dans le cytoplasme lui-même. Un défaut dans l'expression des polypeptides transporteurs vésiculaires du glutamate selon l'invention ou une mutation dans la région codante entraînant des modifications dans les séquences de ces polypeptides serait de nature à conduire à diverses pathologies du sustème nerveux central et en particulier à divers désordres neuro-psychiatriques ou encore à des pathologies liées à un défaut dans la physiologie des types cellulaires dans lesquels VG1, VG3, VG41 et VG51 sont synthétisés. Un défaut de production de ces polypeptides par cellules pulmonaires serait susceptible de conduire à diverses pathologie du système respiratoire, tel que l'asthme.
Une détection du niveau , d'expression et de traduction des gènes concernés chez des patients souffrant de telles affections est rendue possible grâce aux sondes et amorces nucléotidiques ainsi qu'aux anticorps selon l' invention.
En outre, dans le cas de pathologies liées à un dysfonctionnement dans le transport vésiculaire du glutamate, et plus précisément dans l'accumulation du glutamate dans les vésicules intra-cytoplasmiques des cellules glutamatergiques du système nerveux central, il existe un besoin important de disposer de moyens thérapeutiques destinés à réguler le transport du glutamate à l'intérieur des cellules glutamatergiques, c'est à dire de molécules interagissant avec l'un quelconque ou même plusieurs des polypeptides transporteurs vésiculaires du glutamate selon l'invention, de telles molécules ayant en outre la capacité d'inhiber, ou au contraire d'activer le fonctionnement de ces polypeptides transporteurs vésiculaires du glutamate, selon le type de pathologies à traiter .
Des tests permettant de sélectionner des molécules candidates d'intérêt thérapeutique interagissant avec un transporteur vésiculaire du glutamate est désormais rendu possible grâce à l'invention selon laquelle de tels polypeptides transporteurs du glutamate ont pour la première fois été isolés et caractérisés.
La portée de l'invention s'étend donc également à des tets de criblage de molécules candidates interagissant avec l'un des polypeptides selon l'invention, ou encore avec un fragment peptidique de ces derniers, ces molécules
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candidates étant susceptibles d'agir comme inhibiteurs ou au contraire comme activateurs du transport vésiculaire du glutamate
Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'invention, comprenant les étapes de : a) mettre en contact un polypeptide selon l'invention avec la molécule candidate à tester ; b) détecter le complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé.
Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'invention, comprenant les étapes de : a) mettre en contact un polypeptide selon l'invention avec la molécule candidate à tester ; b) détecter le complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé.
L'invention concerne aussi un kit ou trousse pour le criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'invention, comprenant : a) un polypeptide selon l'invention ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé.
Préférentiellement, les polypeptides utilisés dans le procédé et Ir kit de criblage décrit ci-dessus sont les polypeptides VG1, VG3, VG41 et VG51 ainsi que des fragments peptidiques de ces derniers capables de fixer des inhibiteurs du transport glutamatergique, tel que Bleu Trypan. De manière tout à fait préférée, on aura recours aux polypeptides choisis parmi les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 5, ou encore des fragments peptidiques de ces derniers capables de fixer un inhibiteur du transport glutamatergique, tel que le Bleu Trypan. Des fragments ayant la capacité de fixer le Bleu Trypan, éventuellement avec une forte affinité, peuvent être sélectionnés, par exemple selon la technique du Biacore présentée à l'exemple 6, tirant profit de la résonance plasmonique de surface pour la détection du complexe polypeptide (ou fragment polypeptidique)/molécule candidate (inhibiteur) éventuellement formé.
D'autres molécules candidates susceptibles d'être sélectionnées positivement selon le procédé de criblage décrit ci-dessus sont par exemple d'autres inhibiteurs du transport vésiculaires du glutamate, tels que le Bleu Evans ou le Chicago Skye Blue.
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L'invention a également trait à un procédé de criblage de molécules inhibitrices ou au contraire activatrices du transport d'acides aminés, plus particulièrement du transport du glutamate et encore plus précisément du transport vésiculaire du glutamate, un tel procédé mettant en #uvre des vésicules obtenues à partir de cellules, de préférences des cellules de mammifère, transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention et exprimant l'un des polypeptides choisis parmi VG1, VG3, VG41 et VG51, ou encore un fragment d'un tel polypeptide possédant une forte affinité pour un inhibiteur du transport glutamatergique.
Avantageusement, on introduira dans les vésicules obtenues à partir des cellules transfectées un marqueur détectable sensible aux conditions de pH, par exemple un marqueur fluorescent tel qu'un marqueur fluorescent choisi parmi le SNAFL, le SNARF, le HPTS, le BCEF, le Oregon Green Dye ou encore des marqueurs de type Rhodol.
En effet, les transporteurs vésiculaires du glutamate sont des protéines assurant la fontion d'un transport de type antiport , utilisant le gradient de protons engendré par la pompe à protons/ATPase comme énergie. On estime ainsi qu'un proton sort de la vésicule pour chaque molécule de glutamate incorporée. L'activité des polypeptides transporteurs de glutamate selon l'invention induit donc une fuite de protons vers le milieu extra-vésiculaire et en conséquence une modification du pH intra-vésiculaire, qui peut être suivi au moyen de marqueurs détectables sensibles aux conditions de pH, tels que ceux décrits ci-dessus. En conséquence, des molécules capables de moduler leur activité de transport du glutamate peuvent être sélectionnées en incubant une molécule candidate en présence de vésicules obtenues à partir de cellules recombinante exprimant l'un des polypeptides transporteurs selon l'invention et en suivant les modifications de leur activité par la mesure, par exemple en continu, du pH ou du changement de pH du milieu intra-vésiculaire, à l'aide de l'un des marqueurs sensibles au pH qui aura été préalablement introduit .dans les vésicules. Dans le cas où est mis en oeuvre un marqueur flourescent sensibles aux conditions de pH, la mesure du changement de pH intra- vésiculaire sera réalisée par détection l'émission de fluorescence de ce marqueur à la longueur d'onde d'émission qui lui est spécifique.
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Les vésicules utilisées dans la mise en #uvre d'un tel procédé de criblage peuvent être des vésicules membranaires telles que décrites à l'exemple 6.
En conséquence, l'invention a également pour objet un procédé de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire d'acides aminés, en particulier le transport vésiculaire du glutamate, caractérisé en ce qu'ilcomprend les étapes de : a) obtenir des vésicules membranaires ou des vésicules intracellulaires de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention ; b) introduire dans les vésicules obtenues à l'étapes a) un marqueur détectable sensibles aux conditions de pH ; c) mettre en contact les vésicules obtenues à l'étape b) avec une molécule candidate à tester ; d) mesurer les modifications de pH intra-vésiculaires.
L'invention concerne aussi un kit ou trousse pour la mise en #uvre du procédé de criblage ci-dessus décrit, un tel kit comprenant : a) des vésicules intra-cellulaires ou des vésicules membranaires obtenues à partir de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention ; b) le cas échéant, un marqueur détectable sensible aux conditions de pH.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants :
La Figure 1 illustre la séquence de l'acide nucléique correspondant à l'ADNc de vg1.
La Figure 1 illustre la séquence de l'acide nucléique correspondant à l'ADNc de vg1.
La ligne supérieure est la séquence nucléotidique de vg1. La partie soulignée correspond au fragment nucléotidique absent de la séquence nucléotidique de l'ADNc de vg3, qui est le résultat d'un événement d'épissage alternatif.
La ligne désignée VG1 correspond au produit de traduction de l'ADNc vg1, le polypeptide VG1 ; La ligne désignée VG3 correspond au produit de traduction principal de vg3, le polypeptide VG3.
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La Figure 2 illustre la séquence de l'acide nucléique correspondant à l'ADNc de vg51.
La ligne supérieure est la séquence nucléotidique de vg51. La partie soulignée correspond au fragment nucléotidique absent de la séquence de vg41, qui est le résultat d'un événement d'épissage alternatif.
La ligne désignée VG51 correspond au produit de traduction de l'ADNc vg5l, le polypeptide VG51 : La ligne désignée VG41 correspond au produit de traduction de l'ADNc vg41, le polypeptide VG41.
La Figure 3 représente deux gels de Northern blot réalisés après amplification spécifique par RT-PCR de l'ARNm présents dans différents tissus à l'aide de deux paires d'amorces, une paire d'amorces spécifique de l'ADNc vg1 (Gel de gauche) et une paire d'amorces spécifique de l'ADNc vg51 (Gel de droite).
La colonne de gauche indique les positions de migrations de différents marqueurs de poids moléculaires connus.
L'expérience a été réalisée sur des ARN messagers provenant respectivement, de la piste à l'extrémité gauche à la piste à l'extrémité droite de chaque gel, du c#ur, du cerveau, de la rate, du poumon ; du foie, du muscle, du .rein et des testicules.
La Figure 4 illustre les résultats d'une expérience d'hybridation in situ sur une coupe histologique de cerveau de rat adulte mâle Sprague-Dawley avec respectivement une sonde nucléique spécifique des ARNm vg1 et vg3 et une sonde nucléique spécifique des ARNm vg41 et vg51 .
[Fournir La figure correspondante -d'excellente qualité reprographique en Noir et Blanc- et compléter la légende en décrivant la photo d'hybridation S.V.P.] La Figure 5 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3-VG1 contenant l'insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg1, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI situés respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 4505 du vecteur.
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La Figure 6 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3-VG3 contenant l'insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg3, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI situés respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 5115 du vecteur.
La Figure 7 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3-VG51 contenant l'insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg51, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI situés respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 2768 du vecteur.
La Figure 8 représente la construction graphique du vecteur pBluescript SK (-)VG41 contenant l'insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg41, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI indiqués sur la carte du vecteur.
La Figure 9 illustre les résultats d'une expérience de détection immunoautoradiographique sur une coupe histologique de cerveau de rat avec des anticorps dirigés respectivement contre les polypeptides VG1 et VG51.
[Fournir La figure correspondante -d'excellente qualité reprographique en Noir et Blanc- et compléter la légende en décrivant la photo d'hybridation S. V.P.] La Figure 10 représente les résultats du test Biacore de fixation du Bleu Trypan au polypeptide VG51.
En ordonnées, représentation de l'intensité du signal de résonance plasmonique reflétant le nombre de molécules de Bleu Trypan fixées à un temps t au polypeptide VG51 préalablement immobilisé sur un support.
En abscisses, temps de l'expérience en secondes.
La partie grisée correspond au moment pendant lequel le Bleu Trypan, à la concentration de 0,1 mM, a été mis en contact avec le polypeptide VG51 immobilisé sur le support.
Exemples Exemple 1 : Profil d'expression des transcrits vg1 et vg51 dans différents tissus.
<Desc/Clms Page number 29>
Deux fragments d'ADN ont été amplifiés par PCR en utilisant pour matrice soit VG1/3 (eniron 500bp, amorce en 5'= aga cca cag tgg tcg ttt cg (SEQ ID NO 15) et en 3' = act gat aca acc aca tgt cc (SEQ ID NO 16) soit VG51/41 (environ 950bp, amorce en 5' = aca ggt gat aga ggc agc caa cgg (SEQ ID NO 17) et en 3' = cac tgg tgg aat tgg tag agg agt (SEQ ID NO 18)).
Ils ont été purifiés puis radiomarqués au 32p par nick translation (Boerhinger). Un northern blot contenant 2 g d'ARNm polyA+ provenant de 8 tissus de rats différents (coeur, cerveau, rate, poumon, foie, muscle, rein, testicules; Clontech) est hybridé avec chacune des deux sondes (une nuit à 68 C) puis lavé jusqu'à une stringence finale de 0,1X SSC à 42 C. La membrane est alors exposée à un film d'autoradiographie (b-max, Amersham) à -80 C (15 et 7 jours pour VG1 et VG51 respectivement). Les résultats sont exprimés sur la Figure 3.
Les ARNm correspondant aux produits de transcription des gènes vg1 et vg51 sont de taille différente La taille des ARN messagers est de 7 et 5,5 kb respectivement pour vg1 et vg51 dans tous les tissus sauf dans les testicules ou un doublet autour de 2,5 kb est observé.
Les deux transcrits sont présents dans le cerveau ainsi que dans de nombreux autres tissus périphériques.
Par ordre décroissant d'abondance, on trouve l'ARNm de vg1 dans le poumon, la rate, le cerveau, le rein (quantité identique au cerveau), le c#ur, le foie et le muscle.
Par ordre décroissant d'abondance, on trouve l'ARNm de vg51 dans le cerveau, le foie, le poumon (quantité identique au foie), le rein, la rate (quantité identique au rein), le c#ur et le muscle (quantité identique au c#ur).
Ces expériences montrent que VG1/3 et VG51/41 ont des messagers de différentes tailles, exprimés dans différents types de tissus. Il faut remarquer que l'ARNm de VG51/41 est exprimé principalement dans le cerveau.
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Exemple 2 : Détection de l'expression des transcrits vg1/vg3 et vg41/vg51 par hybridation in situ sur des coupes histologiques de cerveau de rats adultes mâles.
Le cerveau de rats adultes mâles (Sprague-Dawley, 250-300g) est rapidement disséqué et congelé dans l'isopentane à -30 C. Des sections sagittales (10pm) sont prélevées à -20 C à l'aide d'un cryostat, montées sur des lames de verre, fixées au paraformaldehyde (4% dans du tampon phosphate de sodium 0,12M pH 7,5) déshydratés dans des bains d'alcool (50% et 70%) et stockées à -80 C jusqu'à leur utilisation. Les oligonucléotides antisens (VG1/VG3: cac ttc tcc tct cac aga ctt gag aca gat (SEQ ID NO 19); VG51/41: tct ggg agg cgc cat cag caa ctg ctg tag (SEQ ID NO 20)) sont radiomarqués au 35S par la terminal transférase (Tdt 14U, Amersham). Pour cela, 30ng de chaque oligonucléotide sont incubés en présence de [aS35]dATP (20pci) pendant 45 minutes à 37 C. La réaction est stoppée par addition d'EDTA puis les oligonucléotides marqués sont purifiés sur résine de Biogel P10 (Biorad), repris (0,2pmoles de sondes/50 l) dans du tampon d'hybridation (Amersham) en présence de formamide (40%) de dithiotreitol (DTT, 200mM) et de polyA (1 mg/ml). Les sections sont incubées 15h à 42 C puis l'excès de sonde est éliminé par lavages (1- 1X SSC, 53 C, 2x15 min, 2- 0,5X SSC, 53 C, 2x15min et 3- 0,5X SSC, température ambiante 1x15min; tous les tampons contiennent 10mM de DTT). Les lames sont rincées rapidement dans un bain d'ethanol (96%), séchées et exposées en autoradiographie (film b-max, Amersham) pendant 2 mois.
Les résultats sont représentés sur le Figure 4.
Les résultats de l'expérience d'hybridation in situ montre que les gènes exprimant les ARN messagers vg1 et vg51 sont transcrits dans des neurones connus pour leur nature glutamatergique, tels que les cellules pyramidales, du cortex ou de l'hippocampe ou encore les cellules granulaires de l'hippocampe et du cervelet (Figure 4)
Dans le cerveau l'ARNm de VG1/3 est peu abondant. Celui codant pour VG51/41 est plus abondant et présente un marquage plus contrasté. On
Dans le cerveau l'ARNm de VG1/3 est peu abondant. Celui codant pour VG51/41 est plus abondant et présente un marquage plus contrasté. On
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retrouve les deux transcrits dans des régions très riches en neurones glutamatergiques (cortex, hippocampe, thalamus).
Exemple 3: Préparation d'antisera dirigés respectivement contre VG1/VG3etVG41/VG51.
Des peptides synthétiques dérivés de la séquence de VG1/3 (VG1-1: NH2-EAPAPEAAGCEELDMDVMRP-COOH (SEQ ID NO 6); VG1-2: NH2CEEQEQTLLPMQKHYQLDGHQ-COOH (SEQ ID N07); VG1-4 : NH2CENQMRESKRFPQALN-COOH (SEQ ID NO 8)) et de VG51/41 (VG51-1: NH2-SSTSDVSPEESPSEGLG-CONH2 (SEQ ID NO 9); VG51-2 : RRLNKPFLDYGDTVC-CONH2 (SEQ ID NO 10)) ont été conjugués à l'hémocyanine de patelle (KLH) et injectés à des lapins par la société Eurogentec Les critères ayant conduit au choix de ces différents peptides sont les suivants : -1) pas de séquences similaires chez les mamifères après recherche d'homologie dans les banques de données (GenBank, SwissProt) et -2) séquences hydrophiles et antigéniques.
Les saignements ont été décomplémentés par chauffage à 56 C (30 minutes), dialysés contre un grand volume de NaCI à 9 /oo puis dilués dans du glycérol (50%) et stockés à -20 C. D'autre part, après la saignée finale, les meilleurs antisérum dirigés contre VG1/3 ou VG51/41 ont été purifiés sur des colonnes d'Affigel-10 ou-15 (Biorad, selon leurs points isoélectriques) couplées aux différents peptides.
Exemple 4 : Transfection de cellules de la lignée de rein humaine HEK-293 par les vecteurs selon l'invention et détection des polypeptides recombinants produits. a) Transfection des cellules
Les cellules sont cultivées à 37 C (sous une atmosphère constante de 7% C02 : 93% air) dans du milieu de culture GIBCO. Lorsqu'elle parviennent à 50% de confluence elles sont transfectées par les vecteurs d'expressions
Les cellules sont cultivées à 37 C (sous une atmosphère constante de 7% C02 : 93% air) dans du milieu de culture GIBCO. Lorsqu'elle parviennent à 50% de confluence elles sont transfectées par les vecteurs d'expressions
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pcDNA3-VG1 (Figure 5), pcDNA3-VG3 (Figure 6) ou-pcDNA3-VG51 (Figure 7).
Pour l'étape de transfection des cellules, , 5 g d'ADN sont pré-incubés avec du CaCl2 0,25 mM. Cette solution est additionnée de NaH2P04 (0,75 mM final) pour former un précipité de phosphate de calcium/ADN (1 minute à température ambiante).
Le précipité, dilué dans du milieu de culture en absence de sérum foetal(SVF) de veau, est placé sur les cellules. Après une incubation de 2-3 heures, dans l'étuve le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant du SVF. b) Détection par immunofluorescence des polypeptides recombinants produits par les cellules transfectées.
L'expérience suivante se déroule à température ambiante. Trois jours après la transfection, les cellules sont lavées par du tampon PBS (PBS; MgCl2 0,1mM; CaCl2 0,1 mM) puis fixées 10 min dans du paraformaldéhyde (PAF 4% dans du PBS). Après 3 lavages de 10 min, les cellules sont perméabilisées (20 min) dans le tampon d'immunofluorescence (tampon IF: Triton X100 0,25% ; sérum normal d'âne 3%) et incubées 1-2 heure avec l'anticorps primaire dilué dans le tampon IF (1/1000ème). Après 3 lavages supplémentaires l'anticorps secondaire (IgG d'âne anti-lapin conjugués avec le CY3, Jackson) dilué dans le tampon IF (1/800ème) est ajouté sur les cellules. Les lames sont rincées trois fois et montées en milieu Vectashield (Vector). L'immunofluorescence est observée à l'aide d'un photomicroscope (Leica) ou un microscope confocal (Molecular Dynamics).
Ce travail a permis d'établir, d'une part, la spécificité des antiséra produits conformément à l'Exemple 3 et, d'autre part, de confimer la présence de VG1/3 et de VG51/41 dans un compartiment intracellulaire de type vésiculaire dans les cellules recombinantes de la lignée HEK-293, ainsi que dans des neurones culture.
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Exemple 5 : Détection immuno-autoradiographique de la production des polypeptides VG1NG3 et VG41/VG51 sur des coupes histologiques de cerveau de rats.
Des rats adultes mâles (Sprague-Dawley, 250-300g) sont anesthésiés avec de l'hydrate de chloral (350mg/kg, i. p.) et perfusés via l'aorte ascendante avec 200 ml d'une solution de NaCI à 9g/l contenant du nitrite de sodium (1g/l). Le cerveau est ensuite rapidement prélevé et congelé dans l'isopentane à - 30 C. Des coupes sagittales de 10 m sont obtenues à l'aide d'un cryostat et montées sur des lames de verre. La suite de l'expérience se déroule entièrement à 20 C. Les échantillons sont incubés avec du tampon IAR (PBS contenant de la 3% de sérum albumine bovine (BSA) et 1 % de sérum d'âne) pendant 30 minutes puis avec du tampon IAR contenant les différents antisérum (généralement au 1/1000ème). Au bout de 2-4 heures les coupes sont lavées dans du PBS (3x10 minutes) puis immergées 1 heure dans du tampon IAR contenant des [125I]IgG-anti IgG de lapin (0,2 ci/ml). Après 4 lavages supplémentaires les lames sont séchées et exposées à un film autoradiographique (b-max, Amersham) pendant 3 jours.
Les résultats de l'expérience sont représentés sur le cliché de la Figure 9.
Cette expérience a permis de montrer que les protéines VG1/3 et VG51/41 sont bien traduites dans le cerveau. De plus leurs distributions régionales ont pu être déterminées sur le cliché d'immuno-autoradiograpjhie de la Figure 9.
En particulier, la protéine VG51 est très abondante dans les régions recevant une forte innervation glutamatergique telles que le cortex, l'hippocampe et le striatum (voir Figure 9).
Cette répartition de la production du polypeptide VG51 est donc accord avec les connaissances actuelles relatives à la localisation des régions d'innervation glutamatergique.
<Desc/Clms Page number 34>
Exemple 6 : Mesure en temps réel de l'interaction entre le polypeptide VG51 et un inhibiteur de recapture vésiculaire du glutamate.
Des inhibiteurs compétitif à haute affinité du transporteur vésiculaire du glutamate, comme le bleu Trypan (IC50 50nM), ont été caractérisés (Roseth et al., 1998).
La liaison de ces inhibiteurs sur le polypeptide VG51 a été étudiée en utilisant le phénomène de résonance plasmonique de surface comme signal de la liaison.
Cette technologie, développée par la société Biacore, permet d'étudier les interactions moléculaires telles que protéine-ligand ou protéine-anticorps.
Des cellules HEK-293 transfectées transitoirement avec le vecteur d'expression pcDNA3-VG51 ou pcDNA3-DAT (permettant l'expression du transporteur plasmique de la dopamine) sont détachées de leur boites de culture, homogénéisée dans du sucrose (0,32M) à l'aide d'un poter (Teflon/verre) et centrifugées à basse vitesse, de façon à éliminer les noyaux.
Les surnageants sont repris dans 4 volumes d'un tampon Hepes/NaCI (25mM pH 7,4, NaCI 120mM) et homogénéisés vigoureusement à l'aide d'un Polytron.
Les membranes des cellules exprimant VG51 ou DAT sont fixées sur différents canaux d'une micropuce recouverte d'une surface hydrophobe (Sensor Chip L1, débit 5 l/min, tampon Hepes/NaCI, température ambiante) à l'aide d'un Biacore 3000 (Biacore).. Une solution de Bleu Trypan (0.1nM dans du tampon Hepes/NaCI) est alors injectée dans les canaux contenant soit VG51 soit le transporteur de la dopamine (DAT). La fixation du ligand est suivie en temps réel sur l'appareil de détection (Sensogram).
Les résultats sont représentés sur la Figure 10.
La courbe supérieure (VG51) montre le signal de fixation global de Bleu Trypan obtenu avec les membranes des cellules exprimant le polypeptide VG51 immobilisé sur le support, ce signal incluant un bruit de fond dû à des interactions non spécifiques.
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La courbe médiane (DAT) montre le signal de fixation non spécifique du Bleu Trypan observé sur les membranes des cellules exprimant les molécules de transporteur plasmique de la dopamine (DAT).
La courbe inférieure est une illustration du signal obtenu reflétant les interactions spécifiques entre le Bleu Trypan et le polypeptide VG51 immobilisé, la courbe ayant été obtenue en retranchant, pour chaque temps de mesure, la valeur du signal d'interactions non spécifiques observé avec DAT à la valeur globale du signal obtenu avec VG51.
Cette expérience a permis de mesurer la liaison spécifique du Bleu Trypan sur VG51 et de calculer une valeur de Km de 10-12 M..
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Zuo J. et al., 1997, Nature, 388 : 769-773.
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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA
RECHERCHE MEDICALE (INSERM) (B) RUE : 101,rue.de Tolbiac (C) VILLE : CEDEX 13 (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : 75654(ii) TITRE DE L' INVENTION : POLYPEPTIDES TRANSPORTEURS DU GLUTAMATE ET
PROCEDES DE CRIBLAGE DE COMPOSES INHIBITEURS OU
ACTIVATEURS DU TRANSPORT VESICULAIRE DU GLUTAMATE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
Met Glu Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp
1 5 10 15
Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Asp Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gln Lys His Tyr
35 40 45
Gln Leu Asp Gly Gln His Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr Leu Met His
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu Val Phe Ile
85 90 95
Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val Arg Cys Ser His
100 105 110
Phe Leu Cys Gln Arg Phe Lys Lys Ser Thr Leu Gly Tyr Ser Asp Thr
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RECHERCHE MEDICALE (INSERM) (B) RUE : 101,rue.de Tolbiac (C) VILLE : CEDEX 13 (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : 75654(ii) TITRE DE L' INVENTION : POLYPEPTIDES TRANSPORTEURS DU GLUTAMATE ET
PROCEDES DE CRIBLAGE DE COMPOSES INHIBITEURS OU
ACTIVATEURS DU TRANSPORT VESICULAIRE DU GLUTAMATE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
Met Glu Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp
1 5 10 15
Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Asp Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gln Lys His Tyr
35 40 45
Gln Leu Asp Gly Gln His Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr Leu Met His
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu Val Phe Ile
85 90 95
Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val Arg Cys Ser His
100 105 110
Phe Leu Cys Gln Arg Phe Lys Lys Ser Thr Leu Gly Tyr Ser Asp Thr
115 120 125
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Val Ser Phe Ala Met Glu Ala Ser Pro Trp Ser Cys Leu Gln Arg Gln
130 135 140 Ala Ala Trp Gly Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val Ile Thr Gln 145 150 155 160 Leu Gly Phe Cys Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu Asn Val Lys
165 170 175 Gln Val His Glu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Val. Val Ser Asn Ser
180 185 190 Ser Asp Leu Ser Gln Val Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp Leu Arg Val
195 200 205 Tyr Met Leu Cys Phe Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu Val Phe Ile Arg
210 215 220 Glu Leu Lys Ser Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn Ile Ser Met 225 230 235 240 Ala Ala Ser Leu Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg Ser Met Pro
245 250 255 Asp Pro His Asn Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys Tyr Pro Leu
260 265 270 Phe Phe Gly Thr Ala Val Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly Val Val Leu
275 280 285 Pro Leu Glu Asn Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gln Ala Leu
290 295 300 Asn Ile Gly Met Ala Ile Val Thr Val Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Thr 305 310 315 320 Leu Gly Tyr Met Cys Phe Arg Asp Glu Ile Lys Gly Ser Ile Thr Leu
325 330 335 Asn Leu Pro Gln Asp Met Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Tyr
340 345 350 Ser Phe Gly Ile Phe Val Thr Tyr Ser Ile GlnPhe Tyr Val Pro Ala
355 . 360 365 Glu Ile Ile Ile Pro Ala Val Thr Ala Arg Leu His Ala Lys Trp Lys
370 375 380 Cys Ile Cys Asp Phe Gly Ile Arg Ser Leu Leu Val Ser Ile Thr Cys 385 390 395 400 Ala Gly Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile Ser Phe Val
405 410 415 Gly Ala Val Ser Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro Pro Leu Val
420 425 430 Glu Ile Leu Thr Phe Ser Lys Asp His Tyr Asn Val Trp Met Val Leu
435 440 445 Lys Asn Ile Ser Ile Ala Phe Thr Gly Phe Val Gly Phe Leu Leu Gly
450 455 460 Thr Tyr Val Thr Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Thr Ala Val Ala 465 470 475 480 Asp Gly Ala Ser Gln Ser Leu Ser Leu Asn Val Asn Ser Thr Cys Val
130 135 140 Ala Ala Trp Gly Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val Ile Thr Gln 145 150 155 160 Leu Gly Phe Cys Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu Asn Val Lys
165 170 175 Gln Val His Glu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Val. Val Ser Asn Ser
180 185 190 Ser Asp Leu Ser Gln Val Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp Leu Arg Val
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210 215 220 Glu Leu Lys Ser Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn Ile Ser Met 225 230 235 240 Ala Ala Ser Leu Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg Ser Met Pro
245 250 255 Asp Pro His Asn Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys Tyr Pro Leu
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275 280 285 Pro Leu Glu Asn Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gln Ala Leu
290 295 300 Asn Ile Gly Met Ala Ile Val Thr Val Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Thr 305 310 315 320 Leu Gly Tyr Met Cys Phe Arg Asp Glu Ile Lys Gly Ser Ile Thr Leu
325 330 335 Asn Leu Pro Gln Asp Met Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Tyr
340 345 350 Ser Phe Gly Ile Phe Val Thr Tyr Ser Ile GlnPhe Tyr Val Pro Ala
355 . 360 365 Glu Ile Ile Ile Pro Ala Val Thr Ala Arg Leu His Ala Lys Trp Lys
370 375 380 Cys Ile Cys Asp Phe Gly Ile Arg Ser Leu Leu Val Ser Ile Thr Cys 385 390 395 400 Ala Gly Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile Ser Phe Val
405 410 415 Gly Ala Val Ser Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro Pro Leu Val
420 425 430 Glu Ile Leu Thr Phe Ser Lys Asp His Tyr Asn Val Trp Met Val Leu
435 440 445 Lys Asn Ile Ser Ile Ala Phe Thr Gly Phe Val Gly Phe Leu Leu Gly
450 455 460 Thr Tyr Val Thr Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Thr Ala Val Ala 465 470 475 480 Asp Gly Ala Ser Gln Ser Leu Ser Leu Asn Val Asn Ser Thr Cys Val
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<tb>
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<tb> 40
<tb> 45
<tb> 50
<tb> 55
<tb> 60
<tb> 65
<tb>
485 490 495
Ser Ser Gly Leu
500 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
Met Glu Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp 1 5 10 15
Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Asp Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gln Lys His Tyr
35 40 45
Gln Leu Asp Gly Gln His Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr Leu Met His
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu Val Phe Ile
85 90 95
Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val
100 105 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3 :
Met Glu Ala Ser Pro Trp Ser Cys Leu Gln Arg Gln Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15
Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val Ile Thr Gln Leu Gly Phe Cys
Ser Ser Gly Leu
500 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
Met Glu Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp 1 5 10 15
Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Asp Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gln Lys His Tyr
35 40 45
Gln Leu Asp Gly Gln His Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr Leu Met His
50 55 60
Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu Val Phe Ile
85 90 95
Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val
100 105 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3 :
Met Glu Ala Ser Pro Trp Ser Cys Leu Gln Arg Gln Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15
Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val Ile Thr Gln Leu Gly Phe Cys
<Desc/Clms Page number 40>
20 25 30
Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu Asn Val Lys Gln Val His Glu
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Val Val Ser Asn Ser Ser Asp Leu Ser
50 55 60
Gln Val Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp Leu Arg Val Tyr Met Leu Cys
65 70 75 80
Phe Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu Val Phe Ile Arg'Glu Leu Lys Ser
85 90 95
Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn Ile Ser Met Ala Ala Ser Leu
100 105 110
Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg Ser Met Pro Asp Pro His Asn
115 120 125
Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr
130 135 140
Ala Val Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly Val Val Leu Pro Leu Glu Asn
145 150 155 160
Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gln Ala Leu Asn Ile Gly Met
165 170 175
Ala Ile Val Thr Val Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Met
180 185 190
Cys Phe Arg Asp Glu Ile Lys Gly Ser Ile Thr Leu Asn Leu Pro Gln
195 200 205
Asp Met Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Tyr Ser Phe Gly Ile
210 215 220
Phe Val Thr Tyr Ser Ile Gln Phe Tyr Val Pro Ala Glu Ile Ile Ile
225 230 235 240
Pro Ala Val Thr Ala Arg Leu His Ala Lys Trp Lys Cys Ile Cys Asp
245 250 255
Phe Gly Ile Arg Ser Leu Leu Val Ser Ile Thr Cys Ala Gly Ala Val
260 265 270
Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile Ser Phe Val Gly Ala Val Ser
275 280 285
Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro Pro Leu Val Glu Ile Leu Thr
290 295 300
Phe Ser Lys Asp His Tyr Asn Val Trp Met Val Leu Lys Asn Ile Ser
305 310 315 320
Ile Ala Phe Thr Gly Phe Val Gly Phe Leu Leu Gly Thr Tyr Val Thr
325 330 335
Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Thr Ala Val Ala Asp Gly Ala Ser
340 345 350
Gln Ser Leu Ser Leu Asn Val Asn Ser Thr Cys Val Ser Ser Gly Leu
355 360 365 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 :
Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu Asn Val Lys Gln Val His Glu
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Val Val Ser Asn Ser Ser Asp Leu Ser
50 55 60
Gln Val Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp Leu Arg Val Tyr Met Leu Cys
65 70 75 80
Phe Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu Val Phe Ile Arg'Glu Leu Lys Ser
85 90 95
Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn Ile Ser Met Ala Ala Ser Leu
100 105 110
Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg Ser Met Pro Asp Pro His Asn
115 120 125
Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr
130 135 140
Ala Val Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly Val Val Leu Pro Leu Glu Asn
145 150 155 160
Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gln Ala Leu Asn Ile Gly Met
165 170 175
Ala Ile Val Thr Val Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Met
180 185 190
Cys Phe Arg Asp Glu Ile Lys Gly Ser Ile Thr Leu Asn Leu Pro Gln
195 200 205
Asp Met Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Tyr Ser Phe Gly Ile
210 215 220
Phe Val Thr Tyr Ser Ile Gln Phe Tyr Val Pro Ala Glu Ile Ile Ile
225 230 235 240
Pro Ala Val Thr Ala Arg Leu His Ala Lys Trp Lys Cys Ile Cys Asp
245 250 255
Phe Gly Ile Arg Ser Leu Leu Val Ser Ile Thr Cys Ala Gly Ala Val
260 265 270
Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile Ser Phe Val Gly Ala Val Ser
275 280 285
Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro Pro Leu Val Glu Ile Leu Thr
290 295 300
Phe Ser Lys Asp His Tyr Asn Val Trp Met Val Leu Lys Asn Ile Ser
305 310 315 320
Ile Ala Phe Thr Gly Phe Val Gly Phe Leu Leu Gly Thr Tyr Val Thr
325 330 335
Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Thr Ala Val Ala Asp Gly Ala Ser
340 345 350
Gln Ser Leu Ser Leu Asn Val Asn Ser Thr Cys Val Ser Ser Gly Leu
355 360 365 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 :
<Desc/Clms Page number 41>
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 382acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 4 :
Met Gly Ile Leu Val Lys Cys Ala His His Leu Cys Arg Arg Leu Asn 1 5 10 15
Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Met Tyr Gly Leu Glu Cys
20 25 30
Ser Pro Ser Thr Trp Ile Arg Asn His Ser His Trp Gly Arg Arg Ile
35 40 45
Val Asp Phe Phe Leu Val Val Thr Gln Leu Gly Phe Cys Cys Val Tyr
50 55 60
Phe Val Phe Leu Ala Asp Asn Phe Lys Gln Val Ile Glu Ala Ala Asn
65 70 75 80
Gly Thr Thr Thr Asn Cys Asn Asn Asn Glu Thr Val Ile Leu Thr Pro
85 90 95
Thr Met Asp Ser Arg Leu Tyr Met Leu Thr Phe Leu Pro Phe Leu Val
100 105 110
Leu Leu Ser Phe Ile Arg Asn Leu Arg Ile Leu Ser Ile Phe Ser Leu
115 120 125
Leu Ala Asn Ile Ser Met Phe Val Ser Leu Ile Met Ile Tyr Gln Phe
130 135 140
Ile Val Gln Arg Ile Pro Asp Pro Ser His Leu Pro Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Trp Lys Thr Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Ile Phe Ala Phe Glu
165 170 175
Gly Ile Gly Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Lys Met Lys Asp Ser Gln
180 185 190
Lys Phe Pro Leu Ile Leu Tyr Leu Gly Met Ala Ile Ile Thr Val Leu
195 200 205
Tyr Ile Ser Leu Gly Ser Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Gly Ala Asp Ile
210 215 220
Lys Gly Ser Ile Thr Leu Asn Leu Pro Asn Cys Trp Leu Tyr Gln Ser
225 230 235 240
Val Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Ile Phe Phe Thr Tyr Ala Leu Gln
245 250 255
Phe Tyr Val Ala Ala Glu Ile Ile Ile Pro Ala Ile Val Ser Arg Val
260 265 270
Met Gly Ile Leu Val Lys Cys Ala His His Leu Cys Arg Arg Leu Asn 1 5 10 15
Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Met Tyr Gly Leu Glu Cys
20 25 30
Ser Pro Ser Thr Trp Ile Arg Asn His Ser His Trp Gly Arg Arg Ile
35 40 45
Val Asp Phe Phe Leu Val Val Thr Gln Leu Gly Phe Cys Cys Val Tyr
50 55 60
Phe Val Phe Leu Ala Asp Asn Phe Lys Gln Val Ile Glu Ala Ala Asn
65 70 75 80
Gly Thr Thr Thr Asn Cys Asn Asn Asn Glu Thr Val Ile Leu Thr Pro
85 90 95
Thr Met Asp Ser Arg Leu Tyr Met Leu Thr Phe Leu Pro Phe Leu Val
100 105 110
Leu Leu Ser Phe Ile Arg Asn Leu Arg Ile Leu Ser Ile Phe Ser Leu
115 120 125
Leu Ala Asn Ile Ser Met Phe Val Ser Leu Ile Met Ile Tyr Gln Phe
130 135 140
Ile Val Gln Arg Ile Pro Asp Pro Ser His Leu Pro Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Trp Lys Thr Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Ile Phe Ala Phe Glu
165 170 175
Gly Ile Gly Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Lys Met Lys Asp Ser Gln
180 185 190
Lys Phe Pro Leu Ile Leu Tyr Leu Gly Met Ala Ile Ile Thr Val Leu
195 200 205
Tyr Ile Ser Leu Gly Ser Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Gly Ala Asp Ile
210 215 220
Lys Gly Ser Ile Thr Leu Asn Leu Pro Asn Cys Trp Leu Tyr Gln Ser
225 230 235 240
Val Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Ile Phe Phe Thr Tyr Ala Leu Gln
245 250 255
Phe Tyr Val Ala Ala Glu Ile Ile Ile Pro Ala Ile Val Ser Arg Val
260 265 270
<Desc/Clms Page number 42>
Pro Glu Arg Phe Glu Leu Val Val Asp Leu Ser Ala Arg Thr Ala Met
275 280 285
Val Cys Val Thr Cys Val Leu Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Leu
290 295 300
Val Ile Ser Leu Val Gly Ser Val Ser Ser Ser Ala Leu Ala Leu Ile
305 310 315 320
Ile Pro Pro Leu Leu Glu Val Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Gly Ile Ser
325 330 335
Pro Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Leu Ile Ser Ile Leu Gly Phe Val
340 345 350
Gly Phe Val Val Gly Thr Tyr Glu Ser Leu Trp Glu Leu Ile Gln Pro
355 360 365
Ser His Ser Asp Ser Ser Thr Asn Ser Thr Ser Ala Phe Ile
370 375 380 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5 :
Met Ser Thr Gln Arg Leu Arg Asn Glu Asp Tyr His Asp Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Asp Val Ser Pro Glu Glu Ser Pro Ser Glu Gly Leu Gly Ser Phe
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Tyr Gln Arg Leu Gly Glu Asn Ser Ser Met Thr Trp
35 40 45
Phe Gln Thr Leu Ile His Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu
50 55 60
Leu Gly Leu Pro Leu Ala Val Lys Asn Ala Gly Leu Leu Leu Gly Pro
65 70 75 80
Leu Ser Leu Leu Val Ile Gly Ile Val Ala Val His Cys Met Gly Ile
85 90 95
Leu Val Lys Cys Ala His His Leu Cys Arg Arg Leu Asn Lys Pro Phe
100 105 110
Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Met Tyr Gly Leu Glu Cys Ser Pro Ser
115 120 125
Thr Trp Ile Arg Asn His Ser His Trp Gly Arg Arg Ile Val Asp Phe
130 135 140
Phe Leu Val Val Thr Gln Leu Gly Phe Cys Cys Val Tyr Phe Val Phe
275 280 285
Val Cys Val Thr Cys Val Leu Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Leu
290 295 300
Val Ile Ser Leu Val Gly Ser Val Ser Ser Ser Ala Leu Ala Leu Ile
305 310 315 320
Ile Pro Pro Leu Leu Glu Val Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Gly Ile Ser
325 330 335
Pro Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Leu Ile Ser Ile Leu Gly Phe Val
340 345 350
Gly Phe Val Val Gly Thr Tyr Glu Ser Leu Trp Glu Leu Ile Gln Pro
355 360 365
Ser His Ser Asp Ser Ser Thr Asn Ser Thr Ser Ala Phe Ile
370 375 380 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5 :
Met Ser Thr Gln Arg Leu Arg Asn Glu Asp Tyr His Asp Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Asp Val Ser Pro Glu Glu Ser Pro Ser Glu Gly Leu Gly Ser Phe
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Tyr Gln Arg Leu Gly Glu Asn Ser Ser Met Thr Trp
35 40 45
Phe Gln Thr Leu Ile His Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu
50 55 60
Leu Gly Leu Pro Leu Ala Val Lys Asn Ala Gly Leu Leu Leu Gly Pro
65 70 75 80
Leu Ser Leu Leu Val Ile Gly Ile Val Ala Val His Cys Met Gly Ile
85 90 95
Leu Val Lys Cys Ala His His Leu Cys Arg Arg Leu Asn Lys Pro Phe
100 105 110
Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Met Tyr Gly Leu Glu Cys Ser Pro Ser
115 120 125
Thr Trp Ile Arg Asn His Ser His Trp Gly Arg Arg Ile Val Asp Phe
130 135 140
Phe Leu Val Val Thr Gln Leu Gly Phe Cys Cys Val Tyr Phe Val Phe
<Desc/Clms Page number 43>
145 150 155 160
Leu Ala Asp Asn Phe Lys Gln Val Ile Glu Ala Ala Asn Gly Thr Thr
165 170 175
Thr Asn Cys Asn Asn Asn Glu Thr Val Ile Leu Thr Pro Thr Met Asp
180 185 190
Ser Arg Leu Tyr Met Leu Thr Phe Leu Pro Phe Leu Val Leu Leu Ser
195 200 205
Phe Ile Arg Asn Leu Arg Ile Leu Ser Ile Phe Ser'Leu Leu Ala Asn
210 215 220
Ile Ser Met Phe Val Ser Leu Ile Met Ile Tyr Gln Phe Ile Val Gln
225 230 235 240
Arg Ile Pro Asp Pro Ser His Leu Pro Leu Val Ala Pro Trp Lys Thr
245 250 255
Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Ile Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly
260 265 270
Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Lys Met Lys Asp Ser Gln Lys Phe Pro
275 280 285
Leu Ile Leu Tyr Leu Gly Met Ala Ile Ile Thr Val Leu Tyr Ile Ser
290 295 300
Leu Gly Ser Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Gly Ala Asp Ile Lys Gly Ser
305 310 315 320
Ile Thr Leu Asn Leu Pro Asn Cys Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Leu
325 330 335
Leu Tyr Ser Ile Gly Ile Phe Phe Thr Tyr Ala Leu Gln Phe Tyr Val
340 345 350
Ala Ala Glu Ile Ile Ile Pro Ala Ile Val Ser Arg Val Pro Glu Arg
355 360 365
Phe Glu Leu Val Val Asp Leu Ser Ala Arg Thr Ala Met Val Cys Val
370 375 380
Thr Cys Val Leu Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Leu Val Ile Ser
385 390 395 400
Leu Val Gly Ser Val Ser Ser Ser Ala Leu Ala Leu Ile Ile Pro Pro
405 410 415
Leu Leu Lys Val Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Gly Ile Ser Pro Leu Thr
420 425 430
Ile Thr Lys Asp Ala Leu Ile Ser Ile Leu Gly Phe Val Gly Phe Val
435 440 445
Val Gly Thr Tyr Glu Ser Leu Trp Glu Leu Ile Gln Pro Ser His Ser
450 455 460
Asp Ser Ser Thr Asn Ser Thr Ser Ala Phe Ile
465 470 475 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS :
Leu Ala Asp Asn Phe Lys Gln Val Ile Glu Ala Ala Asn Gly Thr Thr
165 170 175
Thr Asn Cys Asn Asn Asn Glu Thr Val Ile Leu Thr Pro Thr Met Asp
180 185 190
Ser Arg Leu Tyr Met Leu Thr Phe Leu Pro Phe Leu Val Leu Leu Ser
195 200 205
Phe Ile Arg Asn Leu Arg Ile Leu Ser Ile Phe Ser'Leu Leu Ala Asn
210 215 220
Ile Ser Met Phe Val Ser Leu Ile Met Ile Tyr Gln Phe Ile Val Gln
225 230 235 240
Arg Ile Pro Asp Pro Ser His Leu Pro Leu Val Ala Pro Trp Lys Thr
245 250 255
Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Ile Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly
260 265 270
Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Lys Met Lys Asp Ser Gln Lys Phe Pro
275 280 285
Leu Ile Leu Tyr Leu Gly Met Ala Ile Ile Thr Val Leu Tyr Ile Ser
290 295 300
Leu Gly Ser Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Gly Ala Asp Ile Lys Gly Ser
305 310 315 320
Ile Thr Leu Asn Leu Pro Asn Cys Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys Leu
325 330 335
Leu Tyr Ser Ile Gly Ile Phe Phe Thr Tyr Ala Leu Gln Phe Tyr Val
340 345 350
Ala Ala Glu Ile Ile Ile Pro Ala Ile Val Ser Arg Val Pro Glu Arg
355 360 365
Phe Glu Leu Val Val Asp Leu Ser Ala Arg Thr Ala Met Val Cys Val
370 375 380
Thr Cys Val Leu Ala Val Leu Ile Pro Arg Leu Asp Leu Val Ile Ser
385 390 395 400
Leu Val Gly Ser Val Ser Ser Ser Ala Leu Ala Leu Ile Ile Pro Pro
405 410 415
Leu Leu Lys Val Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Gly Ile Ser Pro Leu Thr
420 425 430
Ile Thr Lys Asp Ala Leu Ile Ser Ile Leu Gly Phe Val Gly Phe Val
435 440 445
Val Gly Thr Tyr Glu Ser Leu Trp Glu Leu Ile Gln Pro Ser His Ser
450 455 460
Asp Ser Ser Thr Asn Ser Thr Ser Ala Phe Ile
465 470 475 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS :
<Desc/Clms Page number 44>
(D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6 :
Glu Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp Met Asp 1 5 10 15
Val Met Arg Pro
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 21 acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 :
Cys Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gin Lys His Tyr Gin 1 5 10 15
Leu Asp Gly His Gin
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 :
Cys Glu Asn Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gin Ala Leu Asn
1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9 :
Glu Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Cys Glu Glu Leu Asp Met Asp 1 5 10 15
Val Met Arg Pro
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 21 acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 :
Cys Glu Glu Gln Glu Gln Thr Leu Leu Pro Met Gin Lys His Tyr Gin 1 5 10 15
Leu Asp Gly His Gin
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 :
Cys Glu Asn Gln Met Arg Glu Ser Lys Arg Phe Pro Gin Ala Leu Asn
1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9 :
<Desc/Clms Page number 45>
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9 :
Ser Ser Thr Ser Asp Val Ser Pro Glu Glu Ser Pro Ser Glu Gly Leu 1 5 10 15
Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 15 acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10 :
Arg Arg Leu Asn Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Cys 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3573 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: 3AATTCGGCA CGAGCGGCGA CCTGGAGACC CCCGAGGGAT GGAAGCGCCG GCGCCGGCGG 60 AGGCGGCGGG ATGCGAGGAG CTCGATATGG ACGTGATGAG GCCCTTAATA AACGAACAGA 120
Ser Ser Thr Ser Asp Val Ser Pro Glu Glu Ser Pro Ser Glu Gly Leu 1 5 10 15
Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 15 acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10 :
Arg Arg Leu Asn Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Val Cys 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3573 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: 3AATTCGGCA CGAGCGGCGA CCTGGAGACC CCCGAGGGAT GGAAGCGCCG GCGCCGGCGG 60 AGGCGGCGGG ATGCGAGGAG CTCGATATGG ACGTGATGAG GCCCTTAATA AACGAACAGA 120
<Desc/Clms Page number 46>
ATTTCGATGG GTCGTCCGAC GAGGAGCAGG AACAGACGCT TCTGCCCATG CAGAAACACT 180 ACCAGCTCGA TGGGCAGCAT GGGATTTCGT TTGTGCAGAC CTTGATGCAC CTTCTCAAGG 240 GGAACATTGG AACCGGCCTC TTAGGGCTTC CCTTGGCAAT AAAGAATGCA GGCATCGTGC 300 TTGGACCAAT CAGCCTTGTG TTTATAGGAA TTATTTCCGT CCACTGTATG CACATATTGG 360 TACGTTGCAG TCACTTTCTA TGTCAGAGGT TTAAGAAGTC AACGTTGGGG TACAGTGACA 420 CTGTGAGTTT TGCCATGGAG GCCAGCCCGT GGAGTTGTCT TCAGAGGCAG GCAGCGTGGG 480 GGCGGAGCGT GGTCGACTTC TTTCTGGTGA TAACACAGCT GGGATTCTGC AGTGTCTATA 540 TTGTCTTCTT AGCTGAGAAT GTGAAACAGG TTCATGAAGG ACTCCTGGAG ACCACAGTGG 600 TCGTTTCGAA TAGCTCGGAT CTGTCTCAAG TCTGTGAGAG GAGAAGTGTG GACCTCAGGG 660 TCTACATGCT CTGCTTTCTC CCACTTCTAA TTCTCTTGGT GTTCATTCGA GAGCTGAAGA 720 GTCTCTTTGT ACTCTCATTC CTTGCCAACA TTTCCATGGC TGCCAGTCTC GTGATAATTT 780 ACCAGTATGT TGTTAGGAGC ATGCCGGATC CCCACAACCT TCCGATAGTC GCGGGGTGGA 840 AGAAATACCC ACTGTTCTTC GGTACCGCTG TGTTTGCTTT TGAAGGCATA GGCGTGGTGC 900 TGCCACTGGA AAACCAAATG AGAGAGTCCA AGCGCTTCCC TCAGGCGTTG AACATTGGCA 960 TGGCCATCGT CACGGTGCTG TACATCAGCC TGGCCACGTT AGGCTACATG TGTTTCCGAG 1020 ATGAGATCAA AGGCAGCATA ACACTGAATC TTCCCCAGGA CATGTGGTTG TATCAGTCAG 1080 TGAAAATCCT GTATTCCTTT GGCATTTTTG TGACCTATTC TATTCAGTTC TATGTCCCAG 1140 CAGAGATCAT TATCCCCGCA GTCACTGCTA GACTTCATGC CAAATGGAAG TGCATCTGTG 1200 ACTTTGGGAT ACGGTCCCTC TTGGTTAGTA TCACCTGTGC TGGCGCGGTT CTCATTCCCC 1260 GCCTGGACAT TGTGATCTCC TTCGTGGGGG CTGTGAGTAG CAGCACTCTA GCCCTGATCC 1320 TGCCCCCGCT TGTGGAGATC CTGACGTTTT CCAAGGACCA TTACAACGTA TGGATGGTCC 1380 TGAAGAACAT TTCCATAGCG TTCACTGGGT TCGTGGGCTT CTTGTTGGGC ACGTATGTCA 1440 CCGTCGAAGA AATTATTTAT CCAACTACAG CAGTTGCTGA TGGCGCCTCC CAGAGTCTCT 1500 CTCTGAACGT GAACTCTACA TGTGTATCAA GTGGTTTGTA ATAGTGGGAG AAGAGCGGTG 1560 AACCCTCCGT TGTCACCCCA GTTCTAACAG CAATCAAGAA CGGGTACAGT GTATCGCCAT 1620 ACACTAAACA CAGTGCCAAA CTCCTGTTTT TGTTGGCAGA GTATTGTAAT TTGACTGTGA 1680 ACTGACATCT TTTGTAGCTG TGATAAACTA TAGCAGATTA TTGCTTTTAT CTAATGACAA 1740 TGAAACATTT TAAATTAGCT TTGAAGACTG AAAAAGTTTA AAATTCAAAA CGGAAACAAT 1800 AAGCATAGCC TGTTATTCTT TGTTTCTGTA AGAAATACTT TGGGTCATCT TTCTTACCAC 1860 CATTGAGAAG ACAAAGGATT TCAACATGGT ATAAATTAAA TAGGGGCATA GTTTTAAAAA 1920 CCTCTTGGAA GCATCCCACA ATAGCAGTGT TTACCTCCTG TGTACGTGTG CACAAAAATG 1980 CACTGATGGT GTTTTCTTCC GTGGGTGATG CTGCTGACGG GGCGATGCCT TGGAGGGATG 2040 GCAGATTCCC ACTGACCACC GTGTGAGCAG TAGAGCGTTC CCAGAGCCAG AGTCGCTTTA 2100 TTGTGCAGCT ATTCAGAGGG TAGAGCGTCA CGGTCACTGA GCAAGGCTCT GACTTCCTGT 2160
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TTCAGTCTAG GTGAAAAGGT CACGGAGGTA TCTGGAATAT CGCTCCCTTA GTTCTGTCTT 2220 AACTTAAGGG AGTTATTGCT CCCTTAGTTG TTCTGTCTTA ACTTGAGGGA GTTATTGCTC 2280 TCTCATTGGG TTTCTGTCAC TGATACAACA GCACAACCAG AAGCAATTCT GCAGGAGAAG 2340 GCTTCAGTTT ACAGTTCCAC ACCACAGTCC TTCATTAAGG GGAGTGAGGG CAGGAACTCA 2400 AGGCGGGAAC CTGGAGGCAG GAACTGACGA AGATGCCATG GAGGGGTGCT GCTTATTGGC 2460 TTGCTTCTTG TGGCTTGCTT CTCGTGGCTT GCTTCTCGTG GCTTGCTTCT CGTGGCTTGC 2520 TTCTCATGGC TTGCTCAGCC TGCTTTTTTA TAGTACCCAG GGTAGCCAGC CCGGGTTGGT 2580 ACCACCCACA GTGGGTATAT CCCTCCCACC TCGATCATCA ATCTGGAAAA TGCCCCCACA 2640 GGCTTGCCTG CAGTTCTGTC TTGCAGAGAC ATTGTCTTGA GTGAGTCTCT TCCAAAACCA 2700 CTCCAGATTG TGTTAAGCTG ACTTAAAATT CGCCAAGGAT GGCTACCGTT GTAGGAAATG 2760 GAGTCCAGAA TTGCTGGGTT ACTTGGTCAA GGAGGACTTA GGCTGGATCA AGAAGAACCT 2820 GACACGTGAC CCAATGAAAC AAATTATTTT TCATGTCACA GTCAGTAAGA ATTAAACACA 2880 CCCAGTTTAA TGTTAGTGTA AAGTTCAGTT AACATTTTCA ACCCTTTGGG AGAGTGTCCT 2940 ATCTCCGAAT AGTATTTGTG ACGAGTTAAA AAGCCGGAAA GGAAATCCAG GACATCACAC 3000 AGGGAAGGAG GTTACCAGTC ATATAAACAG CCGGAGACTG GCAGCCACAG ATGCGCTGTA 3060 GGGCGGAGGT CTCGGGGGCG AGCCCCTTAA ACAGTGGATA ATTTGTAGTG ATCTAGCCAC 3120 ATGCTTCCTT GTTTCCTTGT AGATACCTGA TAAAATACAG AACTCTAGAG CCTCCTAGCC 3180 ACATAGCATT CCTTACTGCC GGCTTCCGTT GATCTGAATG GGCAGATGAA CTGTGGGATG 3240 TATGTTTAAG AAAACTGGAG ACAATAGGGA ACTGTCTAGG AAAGACCAGG CACTTTAGGC 3300 ATTGTCCAGA GAGATGCTGC CTTCTTCCTG TCTTCACACA CACTAGCCAA AGCAACCAAG 3360 CTCACCTGAT GACGAAGAGG AGAACTGGGG AGTTTGAGGG ACGGGTGGGT CGTCTCTGAC 3420 CGTCTTTGCC CATTGGCTCT GTAATGTGTT ATCTGGAAGA CGTTACCAAG CCATCTGGGG 3480 GATTCTCTAT TTTTTACGTA AATGTTAATT TATTCAGGTG TGGCTTTGCG TACCTCATTA 3540 CTTTGTCTTT AAGTCTGAGC TCGTGCCGAA TTC 3573 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12 :
<Desc/Clms Page number 48>
GAATTCGGCA CGAGCTGACA GTGTGGGACA CCTCCCTCTA AGCCTTAACC CTGACGCCAG 60 CAGTCTTTAA GACACCAGTG CCAGAGCCTA CCAACATCGA GCTGCCTTTG CTAGTGTCAG 120 CTACGGTGGA CGAAGACTGA CAGTCGGCCG TCGGAGTTGC AGTCTGCCTG CTTTCCGCGC 180 GGTCCGAGAC CCTGTTCCCC GGCACCCGAA GCCCCGGAGT TCAGAGAATA GCTCCTTAGC 240 CTTTAGGTGC GGCTCCTGTC ACCCTGCGAG GCGCGGACCC GCGTGGGCTA CGGTCAAGGC 300 CGGCCCGGGC CCCGCCCCTC GGGGCGGCTC TGCGCATGCT CGGCGGTGCG GCCGGCAGAG 360 CGGGCGGCGG CGACCTGGAG ACCCCCGAGG GATGGAAGCG CCGGCGCCGG CGGAGGCGGC 420 GGGATGCGAG GAGCTCGATA TGGACGTGAT GAGGCCCTTA ATAAACGAAC AGAATTTCGA 480 TGGGTCGTCC GACGAGGAGC AGGAACAGAC GCTTCTGCCC ATGCAGAAAC ACTACCAGCT 540 CGATGGGCAG CATGGGATTT CGTTTGTGCA GACCTTGATG CACCTTCTCA AGGGGAACAT 600 TGGAACCGGC CTCTTAGGGC TTCCCTTGGC AATAAAGAAT GCAGGCATCG TGCTTGGACC 660 AATCAGCCTT GTGTTTATAG GAATTATTTC CGTCCACTGT ATGCACATAT TGGTTTAAGA 720 AGTCAACGTT GGGGTACAGT GACACTGTGA GTTTTGCCAT GGAGGCCAGC CCGTGGAGTT 780 GTCTTCAGAG GCAGGCAGCG TGGGGGCGGA GCGTGGTCGA CTTCTTTCTG GTGATAACAC 840 AGCTGGGATT CTGCAGTGTC TATATTGTCT TCTTAGCTGA GAATGTGAAA CAGGTTCATG 900 AAGGACTCCT GGAGACCACA GTGGTCGTTT CGAATAGCTC GGATCTGTCT CAAGTCTGTG 960 AGAGGAGAAG TGTGGACCTC AGGGTCTACA TGCTCTGCTT TCTCCCACTT CTAATTCTCT 1020 TGGTGTTCAT TCGAGAGCTG AAGAGTCTCT TTGTACTCTC ATTCCTTGCC AACATTTCCA 1080 TGGCTGCCAG TCTCGTGATA ATTTACCAGT ATGTTGTTAG GAGCATGCCG GATCCCCACA 1140 ACCTTCCGAT AGTCGCGGGG TGGAAGAAAT ACCCACTGTT CTTCGGTACC GCTGTGTTTG 1200 CTTTTGAAGG CATAGGCGTG GTGCTGCCAC TGGAAAACCA AATGAGAGAG TCCAAGCGCT 1260 TCCCTCAGGC GTTGAACATT GGCATGGCCA TCGTCACGGT GCTGTACATC AGCCTGGCCA 1320 CGTTAGGCTA CATGTGTTTC CGAGATGAGA TCAAAGGCAG CATAACACTG AATCTTCCCC 1380 AGGACATGTG GTTGTATCAG TCAGTGAAAA TCCTGTATTC CTTTGGCATT TTTGTGACCT 1440 ATTCTATTCA GTTCTATGTC CCAGCAGAGA TCATTATCCC CGCAGTCACT GCTAGACTTC 1500 ATGCCAAATG GAAGTGCATC TGTGACTTTG GGATACGGTC CCTCTTGGTT AGTATCACCT 1560 GTGCTGGCGC GGTTCTCATT CCCCGCCTGG ACATTGTGAT CTCCTTCGTG GGGGCTGTGA 1620 GTAGCAGCAC TCTAGCCCTG ATCCTGCCCC CGCTTGTGGA GATCCTGACG TTTTCCAAGG 1680 ACCATTACAA CGTATGGATG GTCCTGAAGA ACATTTCCAT AGCGTTCACT GGGTTCGTGG 1740 GCTTCTTGTT GGGCACGTAT GTCACCGTCG AAGAAATTAT TTATCCAACT ACAGCAGTTG 1800 CTGATGGCGC CTCCCAGAGT CTCTCTCTGA ACGTGAACTC TACATGTGTA TCAAGTGGTT 1860 TGTAATAGTG GGAGAAGAGC GGTGAACCCT CCGTTGTCAC CCCAGTTCTA ACAGCAATCA 1920 AGAACGGGTA CAGTGTATCG CCATACACTA AACACAGTGC CAAACTCCTG TTTTTGTTGG 1980 CAGAGTATTG TAATTTGACT GTGAACTGAC ATCTTTTGTA GCTGTGATAA ACTATAGCAG 2040
<Desc/Clms Page number 49>
ATTATTGCTT TTATCTAATG ACAATGAAAC ATTTTAAATT AGCTTTGAAG ACTGAAAAAG 2100 TTTAAAATTC AAAACGGAAA CAATAAGCAT AGCCTGTTAT TCTTTGTTTC TGTAAGAAAT 2160 ACTTTGGGTC ATCTTTCTTA CCACCATTGA GAAGACAAAG GATTTCAACA TGGAATAAAT 2220 TAAATAGGGG CATAGTTTTA AAAACCTCTT GGAAGCATCC CACAATAGCA GTGTTTACCT 2280 CCTGTGTACG TGTGCACAAA AATGCACTGA TGGTGTTTTC TTCCGTGGGT GATGCTGCTG 2340 ACGGGGCGAT GCCTTGGGAG GGATGGCAAG ATTCCCACTG ACCACCGTGT GAGCAGTAGA 2400 GCGTTCCCAG AGCCAGAGTC GCTTTATTGT GCAGCTATTC AGAGGGTAGA GCGTCACGGT 2460 CACTGAGCAA GGCTCTGACT TCCTGTTTCA GTCGTAGGTG AAAAGGTCAC GGAGGTATCT 2520 GGAATATCGC TCCCTTAGTT CTGTCTTAAC TTAAGGGAGT TATTGCTCCC TTAGTTGTTC 2580 TGTCTTAACT TGAGGGAGTT ATTGCTCTCT CAGTTGGGTT TCTGTCACTG ATACAACAGC 2640 ACAACCAGAA GCAATTCTGC AGGAGAAGGC TTCAGTTTAC AGTTCCACAC CACAGTCCTT 2700 CATTAAGGGG AGTGAGGGCA GGAACTCAAG GCGGGAACCT GGAGGCAGGA ACTGACGAAG 2760 ATGCCATGGA GGGGTGCTGC TTATTGGCTT GCTTCTTGTG GCTTGCTTCT CGTGGCTTGC 2820 TTCTCGTGGC TTGCTTCTCG TGGCTTGCTT CTCATGGCTT GCTCAGCCTG CTTTTTTATA 2880 GTACCCAGGG TAGCCAGCCC GGGTTGGTAC CACCCACAGT GGGTATATCC CTCCCACCTC 2940 GATCATCAAT CTGGAAAATG CCCCCACAGG CTTGCCTGCA GTTCTGTCTT GCAGAGACAT 3000 TGTCTTGATT GAGTCTCTTC CAAAACCACT CCAGATTGTG TTAAGCTGAC TTAAAATTCG 3060 CCAAGATGGC TACGTTGTAG GAAATGGAGT CCCAGAATGC TGGGTTACTT GGTCAAGAGG 3120 ACTTAGGCTG GAGTCAAGAG AACCTGACAC GTGACCCAAT GAAACAATTA TTTTCATGTC 3180 ACAGTCAGTA AGAATTAAAC ACACCAGTTT AATGTTAGTG TAAAGTTCAG TTACATTTTC 3240 ATCCTTTGGG AGAGTGTCCT ATCCCGAATA GTATTTGTGA CGAGATTAAA AAGCCAGAAA 3300 AGAAATCCAA GACCTCACAC AGGGAAAGAG GCTACCAGTC CTTTAAACAG CCGGAGACTG 3360 GCAGCCACAG GGTGCGÇTGT AGGGCGGAGG TCTCGGGGGC GAGGCCCCTT AAACAGCTGG 3420 CTAACTTTGT AGTGATCTAG CCACATGCTT CCTTGTTTCC TTGTAGATAC CTGATAAAAT 3480 ACAGAACTCT AGAGCCTCCT AGCCACATAG CATTCCTTAC TGCCGGCTTC CGTTGATCTG 3540 AATGGGCAGA TGAACTGTGG GATGTATGTT TAAGAAAACT GGAGACAATA GGGAACTGTC 3600 TAGGAAAGAC CAGGCACTTT AGGCATTGTC CAGAGAGATG CTGCCTTCTT CCTGTCTTCA 3660 CACACACTAG CCAAAGCAAC CAAGCTCACC TGATGACGAA GAGGAGAACT GGGGAGTTTG 3720 AGGGACGGGT GGGTCGTCTC TGACCGTCTT TGCCCATTGG CTCTGTAATG TGTTATCTGG 3780 AAGACGTTAC CAAGCCATCT GGGGGATTCT CTATTTTTTA CGTAAATGTT AATTTATTCA 3840 GGTGTGGCTT TGCGTACCTC ATTACTTTGT CTTTAAGTCT GAGCCTATAA ATATATCAGA 3900 AGCTTTATTT TGCTATGCAT TCATAAGAAC CAAAACTTTA AAAACATTTA TGTTAGATAT 3960 TTCTAATAAT TGTGATATTT TATGTTAAAT TGTTACTTCA AGTCTTCAGC CTTAGGCAGT 4020 GGATGAGTTT GTGAGAAAAG TGATTTCATT GGAATTGGAC TGTGAGGAAT GTATTAGGTA 4080
<Desc/Clms Page number 50>
TTTAAAACTA CAGTGGCACA CGGCTCTTGT CAGCTGTGTT CACGTTGTAT CTGTACTTGG 4140 CCTCGTTTTA TTTTTGTGTC TTCACCTGCT CCTTGCGGAA TTC 4183 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1889 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13 : AAACTGGAGC TCACCGCGGT GGCGGCCGCT CTAGAACTAG TGGATCCCCG GGCTGCAGGC 60 GGCGCTGAGG CTGCCCGGAA GCGGCTGTCC AGGAGGCTAA AAACCATGGC TAGGGGTCGG 120 CGCTGAGGCT GCGCGAGGTG GGCTGAGCGG GAGCCAGAGC GGGAGCCCGA GCCGGAGCCG 180 GAGCCAGAGC CCGGGCCGGG CCGGGCCGAC CGATGGTTCC AGACCCTGAT CCACCTGCTA 240 AAAGGCAACA TCGGCACCGG GCTGCTGGGG CTGCCTCTAG CAGTGAAGAA TGCAGGCCTC 300 TTGTTGGGCC CTCTCAGCCT GCTGGTGATT GGCATCGTGG CTGTGCACTG CATGGGCATC 360 CTGGTGAAGT GCGCTCATCA CTTGTGTCGG AGACTGAACA AACCCTTTCT GGACTATGGG 420 GACACGGTGA TGTATGGACT AGAATGCAGC CCCAGCACCT GGATCCGGAA CCACTCCCAC 480 TGGGGAAGGC GCATCGTGGA CTTCTTCCTC GTCGTCACTC AACTGGGTTT CTGCTGCGTC 540 TACTTTGTGT TTCTGGCAGA CAACTTTAAA CAGGTGATAG AGGCAGCCAA CGGGACCACC 600 ACCAACTGCA ACAACAATGA GACCGTGATC CTAACGCCCA CCATGGACTC TCGACTCTAC 660 ATGCTCACTT TCCTGCCCTT CCTGGTGCTG CTGTCTTTCA TCAGGAACTT GCGTATCTTG 720 TCCATCTTCT CCCTGCTGGC CAACATCAGC ATGTTCGTCA GCCTTATCAT GATATACCAG 780 TTCATTGTCC AGAGGATCCC AGACCCCAGC CACCTCCCCT TGGTGGCTCC ATGGAAGACC 840 TACCCTCTGT TCTTTGGCAC AGCGATTTTT GCTTTCGAAG GCATTGGAGT GGTGCTACCC 900 CTTGAGAACA AAATGAAGGA CTCACAGAAA TTTCCACTGA TCCTGTATTT GGGGATGGCT 960 ATCATCACTG TGCTCTACAT CAGCCTGGGG AGCCTGGGGT ACCTGCAGTT TGGAGCTGAT 1020 ATCAAGGGCA GCATCACACT CAACCTGCCC AACTGCTGGT TGTACCAGTC GGTGAAGCTG 1080 CTGTACTCCA TAGGCATCTT CTTCACGTAT GCGCTCCAGT TTTATGTCGC AGCTGAGATC 1140 ATCATCCCAG CCATTGTGTC CCGAGTGCCT GAACGTTTCG AGCTGGTGGT GGACCTCAGT 1200 GCTCGCACTG CCATGGTCTG TGTGACATGT GTTCTGGCCG TCCTCATCCC CCGCCTGGAC 1260 CTGGTCATCT CCCTGGTGGG CTCTGTGAGC AGCAGCGCCC TGGCCCTCAT CATCCCACCC 1320 CTGCTGGAGG TGACCACCTA CTATGGAGAG GGCATTAGTC CCCTGACCAT CACCAAGGAT 1380
<Desc/Clms Page number 51>
GCCCTCATCA GCATCCTAGG CTTCGTGGGC TTCGTGGTGG GGACCTATGA GTCTCTGTGG 1440 GAGCTAATCC AGCCAAGCCA TAGCGACTCC TCTACCAATT CCACCAGTGC CTTCATATAA 1500 GGATCTGGGT GTGCTCCCTT TACCTGCCCA GCCCTACCCT GTGTGTCTCC CAGTAGTGTC 1560 CCACATCCTT AGGTGTGGCT CAGCCTCTGG AAAAAGGCAG GGTTACTGCC TGGGCACTCC 1620 TCTGGCATTG GACCCTTGGG TAACCTGGGC TACATGAGAC AGATGAGGGG AGGGCAGGGA 1680 GCACCCTCCA CTTGTGATGG TGCAGTCACT GCTCCCCTTT ATCATGCCTC CTCCTTCAGC 1740 ACCACCCCAA CCCCGTCTGA CCTTCCACGC CTAAATTATT CCCCTTGCAC AGCTCACTTT 1800 ATTTAAAAGG TAGTCTCCTG CTCCCTCGTG CCGAATTCGA TATCAAGCTT ATCGATACCG 1860 TCGACCTCGA GGGGGGCCCG TACCCAATG 1889 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14 : GAATTCGGCA CGAGGCGAGG TGGGCTGAGC GGGAGCCAGA GCGGGAGCCC GAGCCCGGAG 60 CCCGGAGCCA GAGCCCGGGC CCGGGCCCGG GCCCGACCGC TACCATGTCC ACACAGAGGC 120 TTCGGAACGA AGACTATCAT GACTACAGTT CCACTGACGT GAGCCCCGAG GAGAGCCCAT 180 CTGAAGGCCT CGGGAGÇTTC TCCCCCGGCT CCTACCAGCG CTTAGGAGAG AACAGTAGCA 240 TGACATGGTT CCAGACCCTG ATCCACCTGC TAAAAGGCAA CATCGGCACC GGGCTGCTGG 300 GGCTGCCTCT AGCAGTGAAG AATGCAGGCC TCTTGTTGGG CCCTCTCAGC CTGCTGGTGA 360 TTGGCATCGT GGCTGTGCAC TGCATGGGCA TCCTGGTGAA GTGCGCTCAT CACTTGTGTC 420 GGAGACTGAA CAAACCCTTT CTGGACTATG GGGACACGGT GATGTATGGA CTAGAATGCA 480 GCCCCAGCAC CTGGATCCGG AACCACTCCC ACTGGGGAAG GCGCATCGTG GACTTCTTCC 540 TCGTCGTCAC TCAGCTGGGT TTCTGCTGCG TCTACTTTGT GTTTCTGGCA GACAACTTTA 600 AACAGGTGAT AGAGGCAGCC AACGGGACCA CCACCAACTG CAACAACAAT GAGACCGTGA 660 TCCTAACGCC CACCATGGAC TCTCGACTCT ACATGCTCAC TTTCCTGCCC TTCCTGGTGC 720 TGCTGTCTTT CATCAGGAAC TTGCGTATCT TGTCCATCTT CTCCCTGCTG GCCAACATCA 780 GCATGTTCGT CAGCCTTATC ATGATATACC AGTTCATTGT CCAGAGGATC CCAGACCCCA 840 GCCACCTCCC CTTGGTGGCT CCATGGAAGA CCTACCCTCT GTTCTTTGGC ACAGCGATTT 900
<Desc/Clms Page number 52>
TTGCTTTCGA AGGCATTGGA GTGGTGCTAC CCCTTGAGAA CAAAATGAAG GACTCACAGA 960 AATTTCCACT GATCCTGTAT TTGGGGATGG CTATCATCAC TGTGCTCTAC ATCAGCCTGG 1020 GGAGCCTGGG GTACCTGCAG TTTGGAGCTG ATATCAAGGG CAGCATCACA CTCAACCTGC 1080 CCAACTGCTG GTTGTACCAG TCGGTGAAGC TGCTGTACTC CATAGGCATC TTCTTCACGT 1140 ATGCGCTCCA GTTTTATGTC GCAGCTGAGA TCATCATCCC AGCCATTGTG TCCCGAGTGC 1200 CTGAACGTTT CGAGCTGGTG GTGGACCTCA GTGCTCGCAC TGCCATGGTC TGTGTGACAT 1260 GTGTTCTGGC CGTCCTCATC CCCCGCCTGG ACCTGGTCAT CTCCCTGGTG GGCTCTGTGA 1320 GCAGCAGCGC CCTGGCCCTC ATCATCCCAC CCCTGCTGAA GGTGACCACC TACTATGGAG 1380 AGGGCATTAG TCCCCTGACC ATCACCAAGG ATGCCCTCAT CAGCATCCTA GGCTTCGTGG 1440 GCTTCGTGGT GGGGACCTAT GAGTCTCTGT GGGAGCTAAT CCAGCCAAGC CATAGCGACT 1500 CCTCTACCAA TTCCACCAGT GCCTTCATAT AAGGATCTGG GTGTGCTCCC TTTACCTGCC 1560 CAGCCCTACC CTGTGTGTCT CCCAGTAGTG TCCCACATCC TTAGGTGTGG CTCAGCCTCT 1620 GGAAAAAGGC AGGGTTACTG CCTGGGCACT CCTCTGGCAT TGGACCCTTG GGTAACCTGG 1680 GCTACATGAG ACAGATGAGG GGAGGGCAGG GAGCACCCTC CACTTGTGAT GGTGCAGTCA 1740 CTGCTCCCCT TTATCATGCC TCCTCCTTCC TCGTGCCGAA TTCG 1784 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "amorce" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15 : AGACCACAGT GGTCGTTTCG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "amorce" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS :
<Desc/Clms Page number 53>
NON(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 16 : ACTGATACAA CCACATGTCC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "amorce" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 17 : ACAGGTGATA GAGGCAGCCA ACGG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "amorce" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18 : CACTGGTGGA ATTGGTAGAG GAGT 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "sonde nucleotidique" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS :
<Desc/Clms Page number 54>
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19 : CACTTCTCCT CTCACAGACT TGAGACAGAT 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 30 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc= "sonde nucleotidique" (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20 : TCTGGGAGGC GCCATCAGCA ACTGCTGTAG 30
Claims (26)
- REVENDICATIONS 1. Polypeptide transporteur du glutamate dans les cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il possède une forte affinité pour un inhibiteur du transport du glutamate tel que le Bleu Trypan, ou un fragment peptidique de ce dernier.
- 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide comprenant au moins 15 acides aminés consécutifs de l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 ; b) un polypeptide ayant au moins 60% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide tel que défini en a) ; c) un polypeptide reconnu par un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide tel que défini en a) ou b).
- 3. Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2.
- 4. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs s'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 11 à SEQ ID NO 14 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini en a) ; c) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini en a) ou b) .
- 5. Acide nucléique selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les séquences suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 39 au nucléotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 11 ; b) la séquence allant du nucléotide en position 392 au nucléotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 ;<Desc/Clms Page number 56>c) la séquence allant du nucléotide en position 756 au nucléotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 ; d) la séquence allant du nucléotide en position 352 au nucléotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13 ; e) la séquence allant du nucléotide en position 105 au nucléotide en position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14; ou un acide nucléique de séquence complémentaire aux séquences a) à e).
- 6. Sonde ou amorce nucléotidique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 3 à 5.
- 7. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléque selon l'une des revendications 3 à 5.
- 8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur recombinant pcDNA3-VG1 contenu dans la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210.
- 9. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur recombinant pcDNA3-VG51 contenu dans la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209
- 10. Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une de revendications 3 à 5 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 7 à 9.
- 11. Cellule hôte recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit des cellules de la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1- 2210.<Desc/Clms Page number 57>
- 12. Cellule hôte recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit des cellules de la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1- 2209.
- 13. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2.
- 14. Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact un anticorps selon la revendication 13 avec l'échantillon à tester ; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
- 15. Trousse ou kit de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 13 ; b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection de complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
- 16. Procédé de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant les étapes de : a) mettre en contact un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 avec la molécule candidate à tester ; b) détecter le complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé.
- 17. Kit ou trousse pour le criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant : a) un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé.
- 18. Procédé de détection d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 dans un échantillon, comprenant les étapes de :<Desc/Clms Page number 58>a) mettre en contact une sonde nucléotidique selon la revendication 6 avec l'échantillon à tester ; b) détecter la présence d'un complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon.
- 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la sonde nucléotidique est immobilisée sur un support.
- 20. Kit ou trousse de détection d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 dans un échantillon, comprenant : a) une sonde nucléotidique selon la revendication 6 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon.
- 21. Kit ou trousse selon la revendication 20, caractérisé en ce que la sonde nucléotidique est immobilisée sur un support.
- 22. Procédé pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 6; b) le cas échéant, détecter les acides nucléiques amplifiés.
- 23.Kit ou trousse pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 6 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification et/ou les moyens de détection des acides nucléiques amplifiés.
- 24. Procédé pour la production d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes : a) transfecter une cellule hôte appropriée, dans laquelle l'expression du polypeptide est recherchée ; avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 7 à 9 ;<Desc/Clms Page number 59>b) cultiver la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) dans un milieu de culture approprié ; c) récupérer le polypeptide recombinant produit par la cellule hôte recombinante dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire de la cellule hôte cultivée à l'étape b) ; d) le cas échéant, purifier le polypeptide recombinant présent dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant obtenu à l'étape c) ou d).
- 25. Procédé de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire du glutamate, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) obtenir des vésicules membranaires ou des vésicules intracellulaires de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 7 à 9 ; b) introduire dans les vésicules obtenues à l'étapes a) un marqueur détectable sensibles aux conditions de pH ; c) mettre en contact les vésicules obtenues à l'étape b) avec une molécule candidate à tester ; d) mesurer les modifications de pH intra-vésiculaires.
- 26. Kit ou trousse pour la mise en #uvre d'un procédé de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire du glutamate, un tel kit comprenant : a) des vésicules intra-cellulaires ou des vésicules membranaires obtenues à partir de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 7 à 9; b) le cas échéant, un marqueur détectable sensible aux conditions de pH.
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