WO2000071709A1 - Polypeptides, transporteurs vesiculaires du glutamate et du gaba - Google Patents

Polypeptides, transporteurs vesiculaires du glutamate et du gaba Download PDF

Info

Publication number
WO2000071709A1
WO2000071709A1 PCT/FR2000/001383 FR0001383W WO0071709A1 WO 2000071709 A1 WO2000071709 A1 WO 2000071709A1 FR 0001383 W FR0001383 W FR 0001383W WO 0071709 A1 WO0071709 A1 WO 0071709A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
nucleotide
seq
nucleic acid
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/001383
Other languages
English (en)
Inventor
Bruno Giros
Bruno Gasnier
Corinne Sagne
Salah El Mestikawy
Michel Hamon
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of WO2000071709A1 publication Critical patent/WO2000071709A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to amino acid transporter polypeptides, and more particularly glutamate and GABA, and peptide fragments thereof, the nucleotide sequences coding for such polypeptides or peptide fragments and recombinant vectors containing these nucleotide sequences L ' invention also relates to means of ⁇ o detection of these polypeptides and nucleic acids, such as primers or nucleotide probes or antibodies, as well as to methods and detection kits implementing such detection means The invention also relates to methods of screening for candidate molecules capable of inhibiting or on the contrary activating the
  • ammes acids proline, taurine, glutamate, glycine and GABA
  • Glutamate and GABA neurotransmitters
  • the specific molecular mechanisms of neurotransmission can, schematically, be divided into four main stages 1) the biosynthesis of the neurotransmitter, 2) its vesicular storage and its
  • Glutamate the amino acid dicarboxylic acid
  • glutamate is also an excitatory neurotransmitter in the central nervous system Accumulates in synaptic vesicles, it is released in the synapse by a mechanism of calcium-dependent exocytosis and it interacts with lonotropic receptors (iGluR) or metabotropics (mGluR)
  • the stopping of glutamatergic transmission is carried out essentially by a rapid desensitization of the receptors (in approximately 1 to 3 msec), but also by an active retro-transport in the glial cells and the surrounding neurons This recapture is ensured by localized transporters on the surfar ⁇ -I have the plasma membrane and whose activity depends on the Na + and K 'ions
  • glutamatergic agonists with psychotropic properties have been characterized (Moghaddam et al., 1998).
  • glutamate is a major neurotransmitter of the central nervous system (CNS) present in 40 to 50% of neurons. Malfunctions in the transport of this excitatory neurotransmitter are likely to induce various neurological or neuro-psychiatric conditions
  • the plasma transporters of GABA belong to the superfamily of transporters whose activity depends on Na + and Cl Molecular biology has shown that there were 5 sub- types of GABA plasma transporters called GAT1,, GAT2, GAT3, betaine / GABA transporter 1 and rB16a [see review by Masson et al 1999]
  • the vesicular transporter of GABA belongs to a different and new family of genes [see [Sagné et al, FEBS letters, 417, 177-183 (1997)]
  • GABAergic neurotransmission Pharmacological compounds that modulate GABAergic neurotransmission are used for the treatment of anxiety and epilepsy
  • Benzodiazepines such as diazepam or Valium
  • barbiturates produce their therapeutic effects in the treatment of anxiety by binding to the GABAA receptor and increasing its activity.
  • the inhibitors of GABA plasma transporters such as tiagabme or SK & F89976-A) they are used in the treatment of seizures
  • a family of polypeptides has now been isolated, having the general structure of a vesicular transporter of amino acids, such as the vesicular transporters of inhibitory amino acids such as GABA or glycine (VIAAT transporters) described. by Sagne et al (1997)
  • polypeptides according to the invention are produced essentially at the level of the different types of GABAergic neurons as well as in central glutamatergic neurons and also have a strong affinity for an inhibitor of vesicular transport of glutamate, such as Blue Trypan (Roseth et al, 1998)
  • strong affinity for an inhibitor of glutamate vesicular transport, in the present description is meant an affinity defined by a value of Km between a polypeptide according to the invention and an inhibitor preferably between 10 "8 M and 10 " M, even more preferably between 10 “9 M and 10 " 13 M and very preferably between 10 "10 M and 10 " 12 M
  • GABA with low affinity and high capacity The transport of GABA induced by such a polypeptide according to the invention is more important at acid pH than at physiological pH
  • the transport of GABA induced by such polypeptide according to the invention is dependent on the concentration of sodium at physiological pH, whereas at acid pH, the concentration of sodium does not significantly alter the transport of GABA as induced
  • the invention therefore relates firstly to a carrier polypeptide amino acid, more particularly of glutamate and GABA, in mammalian cells, characterized in that it has a high affinity for an inhibitor of glutamate transport as Trypan Blue, or a peptide fragment thereof
  • Such a polypeptide according to the invention can also be characterized in that the transport of GABA which it induces in the cell in which it is expressed is more active at acidic pH, for example at pH 5.5, than at physiological pH 7.5
  • Such a polypeptide according to the invention can also be characterized in that the transport of GABA which it induces is dependent on the sodium concentration at physiological pH, and independent of the sodium concentration at acid pH
  • the applicant has isolated and characterized nucleic acids coding for a family of polypeptides having the above characteristics of the polypeptides according to the invention, from a bank of rat hippocampus cDNA II could thus be highlighted that two genes were expressed mainly in glutamatergic neurons and GABAergic, these two genes being each expressed in the form of two transcripts respectively (mRNA) resulting from an alternative splicing event
  • the transcripts of the first gene were designated by vg1 and vg3
  • the transcripts of the second gene were been designated by vg41 and vg51
  • the two isoforms of each of the above transcripts result in the production of distinct polypeptides all having the general structure of a vesicular amino acid transporter More specifically, the vg1 mRNA codes for the polypeptide VG1, the vg3 mRNA codes mainly for the VG3 polypeptide, the vg41 mRNA codes for the VG41 nolypeptide and the vg51 mRNA codes for the VG51 polypeptide In addition, the vg3 mRNA comprises a second open open reading phase located upstream of the phase open reading coding VG3, coding for a small polypeptide which will be designated VG3-1 in the present description
  • a polypeptide, designated hVG51 for the purposes of the present description, has also been identified, which is coded by the human gene which constitutes the ortholog of the rat gene, one of the transcripts of which codes for the abovementioned VG51 polypeptide.
  • the nucleotide sequences of each of the 10 exons of the human gene hvg51 have also been identified by the applicant, as well as the coding sequence of the corresponding mRNA, all of these sequences also forming part of the invention
  • VG51 and hVG51 polypeptides according to the invention are GABA transporters, more particularly GABA / proton symporters which can use either a gradient of protons (H + ) or of sodium ions (Na + ) as an energy source, which are capable of transporting other amino acids than GABA and which are synthesized by the glutamatergic and GABAergic neurons
  • GABA transporters more particularly GABA / proton symporters which can use either a gradient of protons (H + ) or of sodium ions (Na + ) as an energy source, which are capable of transporting other amino acids than GABA and which are synthesized by the glutamatergic and GABAergic neurons
  • symporteur according to the invention, is meant a transporter for which the amino acid and the proton are both exchanged in the same direction
  • the invention relates to a polypeptide encoded by any one of the messenger RNAs corresponding respectively to vg1, vg3, vg41 and vg51 as well as to a peptide fragment derived from the latter, as well as to the hVG51 polypeptide or a peptide fragment derived of the last
  • a polypeptide according to the invention will be in an isolated or purified form.
  • isolated within the meaning of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located )
  • a polypeptide or a polynucleotide present naturally in an animal or a plant is not isolated.
  • same polypeptide separated from its natural environment or the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids into which it is naturally inserted in the animal or plant genome is isolated
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state, since the vector or the composition does not constitute its natural environment
  • a polypeptide or a polynucleotide is in the purified state after purification of the starting material of at least an order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude
  • the invention therefore relates to a polypeptide, characterized in that it is chosen from a) a polypeptide comprising at least 15 consecutive amino acids of any of the amino acid sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and SEQ ID No 21, b) a polypeptide having at least 60% identity in amino acids ⁇ with the sequence of a polypeptide as defined in a), c) a polypeptide recognized by an antibody directed specifically against a polypeptide as defined in a) or b)
  • the "percentage identity" of amino acids or nucleotides between two sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the peptide or nucleotide sequence, in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the sequence of
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid or nucleic base is observed for the two sequences compared, then by dividing the number 0 of positions at which there is identity between the two amino acids or between the two bases, by the total number of positions in the comparison window, then by multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of identity between the two sequences compared
  • the percentage of identity between two nucleotide sequences or between two peptide sequences according to the invention will be implemented using the aforementioned FASTA software (FASTA-N or FASTA-P), using only the default parameters.
  • polypeptides having at least 60%, 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% or ⁇ o 99.8% identity in amino acids with a polypeptide chosen from the polypeptides of sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10 and SEQ ID N ° 21
  • a polypeptide according to the invention has modifications of amino acids ranging from 1, 3, 5, 10, 15 to 20 substitutions, additions or deletions of an amino acid, compared to one of the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10 and SEQ ID N ° 21
  • amino acids - consecutive or non-consecutive - are preferably replaced by "equivalent” amino acids.
  • “equivalent” amino acid we mean an amino acid whose introduction into the peptide sequence, in place of the initial amino acid a ) does not significantly modify the capacity of the polypeptide thus
  • polypeptides according to the invention comprise a characteristic glutamate binding domain.
  • the polypeptides VG1 and VG3 comprise the sequence "EASPWSCLQRQAAWGRS", which has significant homology with a portion of a protein. encoding a glutamic acid enzyme
  • amino acids belonging to the same class such as acidic acids (D and E), basic (K, R and H), non-polar (A, V, L , I, P, M, F and W) or unloaded polar (G, S, T, C, Y, N and Q)
  • polypeptides according to the invention are used in particular for the production of antibodies capable of specifically recognizing one
  • polypeptides or peptides used
  • IO for the production of antibodies have an amino acid sequence of a length less than I any of the polypeptides of sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and Seq ID No 21.
  • Such peptide fragments preferably have a length of amino acid sequence between 10 and 200 amino acids preferably between 12,
  • such peptide fragments have a size of 10, 12, 15, 20, 25, 30 , 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 consecutive amino acids of a polypeptide according to the invention
  • VG1 polypeptide the VG1-4 peptide of 16 amino acids in length, of sequence SEQ ID NO 8, induces the production of antibodies directed against both the VG1 polypeptide and the VG3 polypeptide,
  • the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 6 to SEQ ID NO 10, useful in particular for the production of antibodies which can be used as means for detecting a vesicular glutamatergic transporter polypeptide presently describes
  • Another subject of the invention consists of nucleic acids coding for a polypeptide according to the invention, and more particularly a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and SEQ ID No 21, or for peptide fragments of these polypeptides
  • the invention also provides nucleic acids comprising all or part of the coding region of complementary DNAs corresponding to the messenger RNAs of vg1, vg3, vg41, vg51 and hvg51, nucleotide fragments of the latter as well as the polynucleotides of complementary sequence
  • a subject of the invention is therefore also a nucleic acid, characterized in that it is chosen from the following nucleic acids a) a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides if a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14 and SEQ ID No 22 to SEQ ID No 32, or a nucleic acid of complementary sequence, b) a nucleic acid having at least 60% nucleotide identity with a nucleic acid as defined in a), c) a nucleic acid hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid as defined in a) or b)
  • N ° 14 respectively code for the polypeptides VG1, VG3, VG41 and
  • nucleotide sequences of exons n ° 1 to 10 of the human gene hvg51 coding for the polypeptide hVG51 The nucleic acid of sequence SEQ ID N ° 32 codes for the peptide hVG51
  • nucleic acids having at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% or else
  • nucleotide identity with a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences of sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of Hames and Higgins (1985) or also in the work of Sambrook et al (1989)
  • nucleic acids comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14 and SEQ ID N °
  • nucleic acids advantageously comprise from 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200 to 250 300 or 400 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14 and SEQ ID No 22 to SEQ ID No 32
  • nucleic acids can include, for example, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250 , 300 or 400 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14 and Seq ID N ° 22 to SEQ ID N ° 32
  • nucleotide sequences according to the invention are explicitly excluded from the nucleotide sequence SEQ ID No. 6461 described in PCT application No. WO 95/14 772 published on June 1, 1995
  • nucleotide sequence is used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • the expression “nucleotide sequence” encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information. regarding his sequence.
  • the cDNA corresponding to the messenger RNA of vg1 constitutes the nucleotide sequence SEQ ID NO 1 1.
  • sequence SEQ ID NO 1 1 comprises an open reading phase going from the nucleotide at position 39 to the nucleotide at position 1536 of the sequence SEQ ID NO 1 1, coding for the polypeptide VG1 of sequence SEQ ID NO 1
  • the sequence SEQ ID NO 1 1 has a certain homology with a human EST sequence referenced in the Genbank database under the access number H08076 More specifically, an identity of nucleotide sequence was found between vg41 and H8076 (49% identity) and between vg1 and H8076 (72% identity)
  • the cDNA corresponding to the messenger RNA of vg3 constitutes the nucleotide sequence SEQ ID NO 12
  • the sequence SEQ ID NO 12 comprises a first open reading phase going from the nucleotide at position 392 to the nucleotide at position 715 of the sequence SEQ ID NO 12 and coding for the polypeptide VG3-1 of sequence SEQ ID NO 2
  • the sequence SEQ ID NO 12 comprises a second open reading phase going from the nucleotide at position 756 to the nucleotide at position 1862 of the sequence SEQ ID NO 12 and coding for the polypeptide VG3 of sequence SEQ ID NO 3
  • the cDNA corresponding to the messenger RNA of vg41 constitutes the nucleotide sequence SEQ ID NO 13
  • the sequence SEQ ID NO 13 comprises an open reading phase going from the nucleotide at position 352 to the nucleotide at position 1498 of the sequence SEQ ID NO 13, coding for the polypeptide VG41 of sequence SEQ ID NO
  • the coding sequence of the cDNA corresponding to the messenger RNA of hvg51 constitutes the nucleotide sequence SEQ ID No. 32.
  • the sequence SEQ ID No. 32 begins with the first nucleotide of the codon “ATG” coding for the N-terminal methionm of the polypeptide hVG51 5
  • the nucleotide at position 1420 of SEQ ID No. 32 is the last nucleotide of the codon coding for C-terminal isolate of the hVG51 polypeptide, as shown in Figure 13
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the following nucleotide sequences a) the sequence going from the nucleotide in position 39 to the nucleotide in position 1536 of the sequence SEQ ID NO 1 1; b) the sequence going from the nucleotide at position 392 to the nucleotide at position 715 of the sequence SEQ ID NO 12,
  • the invention also relates to nucleotide probes and primers capable of specifically hybridizing with any of the nucleic acids according to the invention as defined above.
  • the nucleotide probes and primers are defined in such a way that they hybridize. with any of the nucleic acids according to the invention under the conditions of strong hybridization defined in the description.
  • the nucleotide probes according to the invention are useful in particular for detecting the presence of a nucleic acid coding for an amino acid transporter, preferably a vesicular glutamate transporter or a GABA transporter, in a
  • probes can for example be used in in situ hybridization experiments on histological sections of tissues, preferably histological sections of the brain, as described in Example 2
  • nucleotide primers according to the invention are useful in particular for amplifying all or part of a target nucleic acid coding for a vesicular transporter of glutamate present in a sample.
  • the nucleic acids amplified using a pair of primers according to I invention can subsequently be integrated into a cloning or expression vector or even be simply
  • the size of the nucleotide probes and primers varies from 10 to 1000 nucleotides and is preferably understood v .he 10, 12, 15, 18, 0 20, 25 to 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 400, 500, or 1000 nucleotides, and preferably from 10 to 1000 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14 and SEQ ID No 22 to SEQ ID No 32, or an acid
  • the GC base content of the probes and primers according to the invention is between 35% and 70%, and very preferably between 40% and 60%.
  • Preferred nucleotide probes are the sequence
  • nucleotide SEQ ID NO 19 which specifically hybridizes with RNA messengers vg1 and vg3, as well as the nucleotide sequence SEQ ID NO 20, which specifically hybridizes with the messenger RNAs vg41 and vg51
  • Preferred nucleotide primers are the following:
  • Preferred pairs of primers for the purpose of amplifying a nucleic acid according to the invention are the following. i o - the pair of primers consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 16, making it possible to amplify nucleic acids corresponding to vg1 and vg3,
  • nucleic acids of sequences SEQ ID No. 22 to SEQ ID NO: 31 may constitute in themselves hybridizing probes under hybridization conditions of high stringency, with a genomic sequence, cDNA or RNA of the gene hvg51
  • nucleic acids SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 32 are useful for constructing oligonucleotide primers capable of amplifying all or part of the coding sequence (genomic, cDNA or RNA) of the gene
  • oligonucleotide primers capable of amplifying all or part of the coding sequence (genomic, cDNA or RNA) of the gene
  • hvg51 a pair of nucleotide primers respectively comprising a first primer hybridizing
  • nucleic acid of sequence SEQ ID No 22 and a second primer hybridizing specifically with the nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid of sequence SEQ ID No 31 are useful for the amplification of the whole genomic sequence or all of the cDNA encoding the polypeptide
  • a bank of BAC or PAC vector clones containing mserts of human genomic DNA, and more particularly mserts of human genomic DNA originating from chromosome 5, can be screened using one or more of the sequences SEQ ID No. 22 to SEQ ID No. 31 or alternatively primers or probes constructed from the sequences SEQ ID No. 22 to SEQ ID No.
  • probes and primers according to the invention can be prepared by any of the appropriate synthesis methods well known to those skilled in the art, such as the phosphodiester synthesis technique of Narang et al (1979) or Brown et al (1979) or the diethylphosphoramidite method of Beaucage et al (1981)
  • any of the nucleic acids according to the invention can be labeled by incorporation of a detectable marker by photochemical, biochemical, immunochemical or chemical spectroscopy.
  • the detectable marker may in particular consist of radioactive isotopes ( 32 P, 35 S, H or 125 l), fluorescent dyes (5-bromodesoxyu ⁇ dine, fluorescein, acetylaminofluorene or digoxygenine) or also by a ligand such as biotin
  • the polynucleotides are marked at their 3 ′ or 5 ′ end
  • Illustrative examples of non-radioactive labeling of nucleotide fragments are described in French patent N ° FR-7810975 or in Articles from Urdea et al (1988) or Sanchez-Pescador (1988)
  • the nucleotide probes according to the invention can have structural characteristics such as those of branched probes allowing
  • probes or nucleotide primers can be immobilized on a support such as the surface of wells of microtitration plates, polystyrene beads, nitrocellulose filters etc io L invention also relates to a method for detecting a nucleic acid coding for a transporter of ammes acids preferably a vesicular transporter of glutamate or a transporter of GABA in a sample, comprising the steps of a) bringing into contact one or more nucleotide probes according to I 5 the invention with the sample to be tested, b) detecting the presence of a complex possibly formed between the probe and the nucleic acid of the sample
  • the detection method is characterized in that the nucleotide probe (s) is (are) immobed on a support
  • the detection method is further characterized in that the nucleotide probe (s) is (are) marked with a detectable marker 2
  • the nucleotide probes are chosen from the polynucleotides of sequences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 and SEQ ID N ° 22-32
  • the subject of the invention is also a kit or kit for detecting a nucleic acid coding for an amino acid transporter, preferably a vesicular glutamate transporter or a GABA transporter in a sample, comprising. a) a nucleotide probe as defined above, b) where appropriate, the reagents necessary for the detection of the complex possibly formed between the probe and the nucleic acid of the sample
  • the detection kit or kit is characterized in that the nucleotide probe (s) is (are) immobed on a support
  • the detection kit or kit is characterized in that the nucleotide probe (s) is (are) marked with a detectable marker
  • the nucleotide probes are chosen from the polynucleotides of sequences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 and SEQ ID N ° 22-32.
  • the invention also relates to a method for the amplification of a nucleic acid coding for an amino acid transporter, preferably a vesicular transporter for glutamate or a transporter for GABA comprising the steps according to r. a) bringing a pair of nucleotide primers as defined above into contact with a sample capable of containing a target nucleic acid whose amplification is sought; in the presence of the reagents necessary for carrying out the amplification reaction, b) if necessary, detecting the amplified nucleic acids
  • the nucleotide primers are chosen from the nucleic acids of sequences SEQ ID NO 15 to SEQ ID NO 18
  • the invention also relates to a kit or kit for the amplification of a nucleic acid coding for an amino acid transporter, preferably a vesicular glutamate transporter or a GABA transporter comprising. a) a pair of nucleotide primers as defined above, b) where appropriate, the reagents necessary for carrying out the amplification reaction and / or the means for detecting the amplified nucleic acids
  • the nucleotide primers are chosen from the nucleic acids of sequences SEQ ID NO 15 to SEQ ID NO 18
  • the means for detecting the amplified nucleic acids consist of probes specifically hybridizing with the latter, for example probes comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 and SEQ ID N ° 22-32
  • Amplification techniques which can be implemented in the context of the present invention include, but are not limited to, the "Ligase Chain Reaction (LCA) ) "" described in European patents No. EP-320 308 and EP-439 182 or also in PCT application No. WO 93/20227, the polymerase chain reaction (PCR and RT-PCR) as well as techniques such that the NASBA technique (Guatelli et al, 1990, Compton, 1991) amplification with Q-beta replicase described in European patent application No. EP-4544610 or the SDA technique (Walker et al, 1996)
  • nucleic acids corresponding to the different transcripts vg1, vg3, vg41, and vg51 were inserted into recombinant expression vectors, these recombinant vectors having been used to transfect mammalian cells such as cells of the HEK-293 line for the production of the VG1, VG3 polypeptides.
  • the nucleic acid corresponding to the transcription product of the hvg51 gene can also be inserted into such recombinant expression vectors.
  • the subject of the invention is also a family of recombinant cloning or expression vectors comprising any of the nucleic acids defined in the present description, and in particular any of the nucleic acids chosen from the polynucleotides of sequences SEQ ID NO 1 1 to SEQ ID NO 14, nucleic fragments thereof and the nucleic acids of complementary sequence.
  • the invention also relates to a family of cloning or expression vectors comprising a nucleotide insert comprising one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 22 to SEQ ID No. 32.
  • recombinant vector within the meaning of the present invention designates a circular or linear DNA or RNA molecule. which may be in the simplest form or double-stranded, and that comprises a polynucleotide of interest, the amplification or expression is sought after its transfer into a suitable host cell.
  • a recombinant expression vector according to the invention comprises. in addition to the nucleic acid of interest whose expression is sought, sequences of functional regulations in the desired cellular host, such as promoters, signals for the start and stop of translation and, where appropriate, activator sequences Of type
  • promoter if necessary.
  • Such regulatory sequences are located, with respect to the nucleic acid whose expression is desired, so as to operably linked to the nucleic acid of interest, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the promoter sequence will therefore be located on the 5 ′ side of the nucleic acid of interest, and in phase with the latter, so that the promoter function can be effective
  • the recombinant vectors according to the invention advantageously comprise several origins of functional replications respectively in different cellular hosts, including in cellular hosts whose polymerases do not recognize the different signals for regulating transcription and translation possibly contained in these vectors, Said shuttle vectors Said recombinant vectors preferably comprise one or more selection markers chosen from antibiotic resistance markers, such as resistance to neomycin, tetracycline, ⁇ fampicin or ampicillin
  • the promoters are, for example, chosen from the Lacl, LacZ promoters, the RNA polymerase promoters of the bacteriophage T3 or T7, the PL and PR promoters of the lambda phage or else the p10 promoter of the baculovirus polyhedrm (O'Reilly et al. , 1992)
  • the recombinant vectors according to the invention are indifferently bacterial, viral, baculovirus vectors or also vectors for eukaryotic cells, in particular for mammalian cells.
  • Vectors particularly suitable for expression of the nucleic acids according to the invention in bacteria are for example the vectors pQE70, pQE60 or pQE-9 (marketed by the company QIAGEN), the vectors pBluesc ⁇ pt, Page script, pNH8A, pNH16a, pNH18a pNH46A (marketed by the company Stratagene), the vectors pKK223-3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5 (marketed by the company Pharmacia)
  • Vectors particularly suitable for expression in eukaryotic cells are for example the vectors pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (marketed by the company Stratagene), vectors pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (marketed by the company Pharmacia)
  • a first vector preferably used in the context of the invention is the vector pcDNA3 sold by the company Invitrogen
  • a second particularly preferred vector is the vector pBluescript SK (-), sold by the company Stratagene
  • polynucleotides of sequences SEQ ID NO 11 to SEQ ID NO 14 were inserted into pcDNA3 or pBluescript SK (-) vectors more particularly at the level of a single EcoRI restriction site contained in the multiple cloning sites located in these vectors
  • the construction maps of these vectors are shown respectively in Figures 5 to 8
  • a nucleic acid comprising any of the polynucleotides of sequences SEQ ID No 22 to SEQ ID No 32 can also be inserted into one of the vectors described above
  • a third vector which is particularly preferred according to the invention is the vector pcDNA3-VG1 contained in the strain of E coli deposited at the
  • nucleotide insert contained in this recombinant vector is SEQ ID no 1 1
  • a fourth vector which is particularly preferred according to the invention is the vector pcDNA3-VG51 contained in the strain of E coli deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) on 05/21/1999 under the access number I-2209 L nucleotide insert contained in this recombinant vector is the sequence SEQ ID NO 14
  • the recombinant vectors described above are preferably used to transfect or transform an appropriate host cell in which the multiplication of the vector or in which the expression of the nucleotide insert of interest is sought
  • Another subject of the invention consists of a recombinant host cell comprising a nucleic acid according to the invention or a recombinant vector as defined above
  • Preferred host cells intended to receive a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention are, for example, the following host cells a) prokaryotic host cells Esche ⁇ chia co // (in particular the strain DH5- ⁇ ), strains of Bacillus, such that strains of Bacillus subtilis, or even strains of Pseudomonas, Streptomyces and io Staphylococcus b) eukaryotic cells HeLa (ATCC N ° CCL2, N ° CCL2 1 NXCL2 2), Cv 1 (ATCC N ° CCL70), COS ( ATCC N ° CRL1650 N ° CRL1651), Sf-9 (ATCC N ° CRL171 1), C127 (ATCC N ° CRL-1804) 3T3 (ATCC N ° CRL-6361), CHO (ATCC N ° CCL-61), HEK -293 (ATCC
  • Another category of preferred host cells according to the invention comprises neuronal cells, more particularly glutamatergic neuron cells from patients affected by a dysfunction in the vesicular transport of glutamate, either in the form of a
  • a first particularly preferred recombinant host cell according to the invention is of the E coli strain containing the vector
  • a second particularly preferred recombinant host cell according to the invention is of the E coli strain containing the vector pcDNA3-VG51, deposited in the National Collection of Cultures of
  • VG51 and hVG51 their peptide homologs as well as the peptide fragments of these homologous polypeptides or polypeptides can be obtained in a recombinant form by the insertion of a nucleic acid encoding them in an expression vector as defined above and introduction of the recombinant vector obtained into an appropriate host cell
  • the invention also relates to a process for the production of a polypeptide according to the invention comprising the steps of a) transfecting an appropriate host cell, in which the expression of the polypeptide is sought, with a recombinant vector according to
  • I invention b) cultivating the recombinant host cell obtained in step a) in an appropriate culture medium, c) recovering the recombinant polypeptide produced by the recombinant host cell in the culture supernatant or in the cell lysate of the host cell cultured in step b), d) if necessary purifying the recombinant polypeptide present in the culture supernatant or in the cell lysate, e) if necessary, characterizing the recombinant polypeptide obtained in step c) or d)
  • polypeptides obtained according to the method described above can be characterized by fixation on an immunoaffinity chromatography column on which antibodies recognizing said polypeptide have been immobilized beforehand.
  • polypeptides according to the invention and more particularly the recombinant polypeptides according to the invention can also be purified by high performance liquid chromatography (HPLC) techniques, such as for example chromatography techniques in reverse phase or anion or cation exchange chromatography, well known to those skilled in the art
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • polypeptides, recombinant or non-recombinant, according to the invention can be used for the preparation of antibodies. It has been shown according to the invention that peptides derived from the polypeptides VG1, VG3, VG41 and VG51 could be advantageously used for the preparation of antibodies, in particular polyclonal antibodies, capable of specifically recognizing VG1, VG3, VG1 and VG3, VG41, VG51, VG41 and VG51, depending on whether the polypeptides had an amino acid sequence only present in one of these polypeptides, or at on the contrary, an amino acid sequence common to two of them, for example VG1 and VG3 or VG41 and VG51
  • the hVG51 polypeptide can also be used for the preparation of antibodies which specifically recognize the latter.
  • the invention therefore also relates to an antibody specifically recognizing a polypeptide according to the invention or a peptide fragment of the latter, in particular a polypeptide of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and SEQ ID N ° 21 or a single peptide fragment or on the contrary common to them
  • Preferred antibodies according to the invention are the antibodies prepared by immunization of an animal with one of the peptides of sequences SEQ ID NO 6 to SEQ ID NO 10
  • the antibodies prepared from the peptide VG1-4 of sequence SEQ ID NO 8 recognize both the polypeptide VG1 and the polypeptide VG3, -
  • the antibodies prepared from the peptide VG51-1 of sequence SEQ ID NO 9 specifically recognize the polypeptide VG51, - the antibodies prepared from the peptide VG-51 -2 of sequence SEQ ID NO 10 recognize both the polypeptide VG51 and the polypeptide VG41
  • the antibodies according to the invention can be monoclonal or polyclonal.
  • the monoclonal antibodies can be prepared from hybridoma cells according to the technique described by Kohler and Milstein (1975).
  • the polyclonal antibodies can be prepared by immunization of a mammal, in particular in particular. mice, rats or rabbits with a polypeptide of the invention against which an immune response is sought, where appropriate in the presence of an adjuvanting immunity compound, such as the complete adjuvant of Freund, Freund's incomplete adjuvant of aluminum hydroxide or a compound of the family of muramyl peptides
  • an adjuvanting immunity compound such as the complete adjuvant of Freund, Freund's incomplete adjuvant of aluminum hydroxide or a compound of the family of muramyl peptides
  • the antibody fragments such as the Fab, Fab, F (ab ′) 2 fragments, or even the single chain antibody fragments containing the variable part (ScFv) described by Martineau et al (1988) or also in American patent n ° US 4,946,778, as well as the humanized antibodies described by Remman et al (1997) or by Léger et al (s 997)
  • the antibody preparations according to the invention are useful in qualitative or quantitative immunological tests aimed either at simply detecting the presence of a vesicular glutamate transporter polypeptide in a sample, for example on a tissue section, or at quantifying the quantity of the antibody target polypeptide in a
  • sample for example a biological fluid or a culture supernatant or a cell lysate of a recombinant host cell according to the invention
  • the antibodies according to the invention can also be used, because of their character of gands of one of the antibodies according to the invention.
  • transporter polypeptides according to the invention in order to modulate the activity of these polypeptides, and therefore to modulate -inhibit or on the contrary activate it transport of ammes acids, more particularly the vesicular transport of glutamate or the transport of GABA, for example at the level of glutamatergic neurons or GABAergic neurons
  • Another subject of the invention consists in a method of detecting an amino acid transporter polypeptide, preferably a vesicular transporter of glutamate or a transporter of GABA, or a peptide fragment of the latter, in a sample, said process comprising the steps of a) bringing an antibody according to the invention into contact with the test sample, b) detecting IF antigen / antibody complex possibly formed
  • the invention also relates to a kit or kit for detecting a polypeptide according to the invention in a sample, comprising a) an antibody according to the invention, b) if appropriate, reagents necessary for the detection of antigen / possibly formed antibody
  • An antibody according to the invention can be labeled using a detectable isotopic or non-isotopic marker, according to methods well known to those skilled in the art
  • the intra-cytoplasmic vesicles have the property of accumulating the glutamate present in the cytoplasm of these cells, the glutamate thus present in high concentration which can be released very quickly and in large quantity into the extra-cellular space, in particular inter-neuronal during reception of an excitatory signal by the cells concerned It has in particular been determined that the activity of these glutamatergic transporters is such as to place glutamate at a concentration 10 times greater in the intra-cytoplasmic vesicles than in the cytoplasm itself A defect in the expression of the vesicular glutamate transporter polypeptides according to the invention or a mutation in the coding region causing
  • nucleotide probes and primers as well as antibodies according to the invention
  • the scope of the invention therefore also extends to the screening heads of candidate molecules interacting with one of the polypeptides according to the invention or even with a peptide fragment of the latter, these candidate molecules being capable of acting as inhibitors or on the contrary as activators of glutamate vesicular transport
  • the subject of the invention is also a method of screening a candidate molecule capable of binding to a polypeptide according to the invention, comprising the steps of a) bringing a polypeptide according to the invention into contact with the candidate molecule test, b) detecting the polypeptide / candidate molecule complex possibly formed
  • the invention also relates to a kit or kit for screening a candidate molecule capable of binding to a polypeptide according to the invention, comprising a) a polypeptide according to the invention,> b) where appropriate the reagents necessary for the detection of the candidate polypeptide / molecule complex possibly formed
  • the polypeptides used in the method and the screening kit described above are the polypeptides VG1, VG3, VG41 io VG51 and hVG51 as well as peptide fragments of the latter capable of binding inhibitors of glutamatergic transport, such as Bleu Trypan
  • use will be made of the polypeptides chosen from the sequences SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3 to SEQ ID NO 5 and SEQ ID No 21 or even peptide fragments of
  • candidate molecules capable of being positively selected according to the screening process described above are, for example, other inhibitors of glutamate vesicular transport, such as
  • candidate molecules capable of being positively selected according to the screening process described above are, for example, compounds modulating GABAergic neurotransmission. Mention may be made of the compounds of the family of benzodiazepmes to which
  • candidate molecules capable of being positively selected according to the screening method described above may have psychotropic properties in psychiatric pathologies and anti-excitotic properties in neurological pathologies At the peripheries, such candidate molecules may possess properties modulating the contraction of smooth muscle cells and applications in multiple fields such as vis-à-vis asthma and hypertension.
  • candidate molecules can have the property, on neuronal metabolism, of regulate the activity of amino acid transport at the level of intracellular compartments including towards lysosomes and thus allow the prevention or the treatment of metabolic lysosomal diseases
  • the invention also relates to a method of screening for inhibitory molecules or, on the contrary, activat ⁇ ces of the transport of amine acids, more particularly of the transport of glutamate and even more precisely of the vesicular transport of glutamate or of GABA, such a method implementing vesicles obtained from cells of preference of mammalian cells, transfected with a recombinant vector according to the invention and expressing one of the polypeptides chosen from VG1, VG3, VG41 and VG51, or also a fragment of such a polypeptide having a strong affinity for an inhibitor of glutamatergic transport.
  • a detectable marker sensitive to pH conditions will be introduced into the vesicles obtained from the transfected cells, for example a fluorescent marker such as a fluorescent marker chosen from SNAFL, SNARF, HPTS, BCEF the "Oregon Green Dye” or Rhodol markers
  • the vesicular transporters of glutamate are proteins ensuring the function of an "antiport" type transport using the proton gradient generated by the proton pump / ATPase as energy. It is thus estimated that a proton leaves the vesicle for each molecule of incorporated glutamate
  • the activity of the glutamate transporting polypeptides according to the invention therefore induces a leak of protons towards the extra-vesicular medium and consequently a modification of the intra-vesicular pH, which can be followed by means of detectable markers sensitive to the conditions pH, such as those described above Consequently, molecules capable of modulating their glutamate transport activity can be selected by incubating a candidate molecule in the presence of vesicles obtained from recombinant cells expressing one of the transporter polypeptides according to the invention and by following the modifications of their activity by measuring, by example continuously, of the pH or of the change in pH of the intra-vesicular medium, using one of the markers sensitive to pH which will have been previously introduced into
  • the vesicles used in the implementation of such a screening process can be membrane vesicles as described in Example 6
  • the subject of the invention is also a method of screening for candidate molecules inhibiting or activating the vesicular transport of amino acids, in particular the vesicular transport of glutamate or GABA, characterized in that it comprises the steps of a) obtaining membrane vesicles or intracellular vesicles of cells transfected with a recombinant vector according to the invention b) introducing into the vesicles obtained in I stages a) a detectable marker sensitive to pH conditions, c) bringing the vesicles obtained into contact in step b) with a candidate molecule to be tested d) measuring the changes in intra-vesicular pH
  • the invention also relates to a kit or kit for the implementation of the screening process described above, such a kit comprising a) intra-cellular vesicles or membrane vesicles obtained from cells transfected with a recombinant vector according to the invention b) where appropriate a detectable marker sensitive to pH conditions
  • Figure 1 illustrates the nucleic acid sequence of I corresponding to
  • the upper line is the nucleotide sequence of vg1
  • the underlined part corresponds to the nucleotide fragment absent from the nucleotide sequence of the vg3 cDNA, which is the result of an alternative splicing event 25
  • the line designated VG1 corresponds to the translation product of Vg1 cDNA, the VG1 polypeptide
  • the line designated VG3 corresponds to the main translation product of vg3 the VG3 polypeptide
  • Figure 2 illustrates the nucleic acid sequence corresponding to the vg51 cDNA
  • the top line is the nucleotide sequence of vg51
  • the underlined part corresponds to the nucleotide fragment absent from the sequence of vg41, which is the result of an alternative splicing event
  • FIG. 3 represents two Northern blot gels produced after specific amplification by RT-PCR of the mRNA present in different tissues using two pairs of primers a pair of primers specific for the cDNA vg1 (gel on the left) and a pair of primers specific for vg51 cDNA (Right gel)
  • the left column indicates the migration positions of different markers of known molecular weights
  • the experiment was carried out on messenger RNAs originating respectively from the track at the left end to the is-te at the right end of each gel, of the heart, of the brain, of the spleen, of the lung, of the liver, muscle, rem and testes
  • FIG. 4 illustrates the results of an in situ hybridization experiment on a histological section of the adult rat male Sprague-Dawley brain with a nucleic probe specific for the mRNA vg1 and vg3 respectively and a nucleic probe specific for the mRNA vg41 and vg51
  • FIG. 5 represents the graphic construction of the vector pcDNA3-VG1 containing the nucleotide insert corresponding to the cDNA vg1, located between the two EcoRI restriction sites located respectively at nucleotide coordinates 938 and 4505 of the vector
  • FIG. 6 represents the graphic construction of the vector pcDNA3- s VG3 containing the nucleotide insert corresponding to the cDNA vg3 located between the two EcoRI restriction sites located respectively at the nucleotide coordinates 938 and 51 of the vector
  • FIG. 7 represents the graphic construction of the vector pcDNA3-I O VG51 containing the nucleotide insert corresponding to the cDNA vg51 localizes between the two EcoRI restriction sites located respectively at the nucleotide coordinates 938 and 2768 of the vector
  • FIG. 8 represents the graphic construction of the vector pBluescript I SK (-) - VG41 containing the nucleotide insert corresponding to the cDNA vg41, located between the two EcoRI restriction sites indicated on the vector map
  • FIG. 9 illustrates the results of an immunoradiadiographic detection experiment on a histological section of the rat brain with antibodies directed respectively against the polypeptides VG1 and VG51
  • FIG 10 shows the results of the Biacore Blue fixation test
  • Figure 11 is an electron micrograph showing the ultrastructural location of the VG51 polypeptide in the rat hippocampus The dense black dots represent the locations of the VG51 protein
  • FIG. 12 illustrates the transport (internalization) activity of GABA by cells of the COS-7 line transfected by a vector containing a nucleotide insert coding for the VG51 polypeptide (designated VG51) or by a vector lacking a nucleotide insert ( denotes pcDNA3)
  • FIG. 12 A illustrates the activity of transport of GABA by the cells transfected and cultured in a culture medium adjusted to pH ranging from 5.5 to 8
  • FIG. 12B illustrates the activity of transport of GABA by the cells transfected and cultured in a culture medium adjusted to pH 5.4, in the presence or absence respectively of NaCI, LiCI or ChoCI (choline chloride)
  • FIG. 12C illustrates the activity of transport of GABA by the cells transfected and cultured in a culture medium adjusted to pH 7, in presence or absence respectively of NaCI, LiCI or ChoCI (choline chloride)
  • FIG. 13 illustrates the nucleotide sequence SEQ ID No. 32 coding for the hVG51 polypeptide (upper line) as well as the amino acid sequence SEQ ID No. 21 of the hVG51 polypeptide (lower line) Examples
  • Example 1 Expression profile of the vg1 and vg51 transcripts in different tissues.
  • the mRNAs corresponding to the transcription products of the vg1 and vg51 genes are of different sizes
  • the size of the messenger RNAs is 7 and 5.5 kb respectively for vg1 and vg51 in all tissues except in the testes or a doublet around 2.5 kb is observed Both transcripts are found in the brain as well as in many other peripheral tissues
  • VG1 / 3 and VG51 / 41 have messengers of different sizes, expressed in different types of tissue. It should be noted that the mRNA of VG51 / 41 is mainly expressed in the brain.
  • Example 2 Detection of the expression of the vg1 / vg3 and vg41 / vg51 transcripts by in situ hybridization on histological sections of the brains of adult male rats.
  • the results of the in situ hybridization experiment show that the genes expressing the messenger RNA vg1 and vg51 are transcribed in neurons known for their glutamatergic nature, such as pyramidal cells, cortex or hippocampus or even cells granular hippocampus and cerebellum ( Figure 4)
  • VG1 / 3 In the brain the mRNA of VG1 / 3 is scarce The one coding for VG51 / 41 is more abundant and has a more contrast marking We find the two transcribed in regions very rich in glutamatergic neurons (cortex, hippocampus, thalamus)
  • Example 3 Preparation of antisera directed respectively against VG1 / VG3 and VG41 / VG51.
  • Synthetic peptides derived from the sequence of VG1 / 3 (VG1 -1 NH2-EAPAPEAAGCEELDMDVMRP-COOH (SEQ ID NO 6) VG1 -2 NH2-CEEQEQTLLPMQKHYQLDGHQ-COOH (SEQ ID N07), VG1-4 NH2-CENQMRESKRFPQALN-COOH (SEQ ID NO 8)) and VG51 / 41 (VG51 -1 NH2-SSTSDVSPEESPSEGLG-CONH2 (SEQ ID NO 9), VG51 -2 NH2-RRLNKPFLDYGDTVC-CONH2 (SEQ ID NO 10) ) have been conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH) and injected into rabbits
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Example 4 Transfection of cells of the human kidney line HEK-293 with the vectors according to the invention and detection of the recombinant polypeptides produced.
  • the cells are cultured at 37 ° C. (under a constant atmosphere of 7% C ⁇ 2 93% air) in GIBCO culture medium. When they reach 50% confluence, they are transfected with the expression vectors pcDNA3-VG1 ( Figure 5) pcDNA3-VG3 ( Figure 6) or -pcDNA3-VG51 ( Figure 7)
  • the precipitate diluted in culture medium in the absence of fetal serum (SVF) from calves, is placed on the cells. After an incubation of 5 2-3 hours, in the oven the culture medium is replaced by medium containing SVF.
  • SVF fetal serum
  • Example 5 Immuno-autoradiographic detection of the production of the VG1 / VG3 and VG41 / VG51 polypeptides on histological sections of the brain of rats.
  • IAR buffer PBS containing 3% bovine serum albumin (BSA) and 1% donkey serum
  • IAR buffer containing the different antisera generally 1 / 1000th
  • the protein VG51 is very abundant in regions receiving a strong glutamatergic innervation such as the cortex, the hippocampus and the st ⁇ atum (see Figure 9) This distribution of the production of the VG51 polypeptide is therefore in agreement with current knowledge relating to the localization of the glutamatergic innervation regions.
  • Example 6 Real-time measurement of the interaction between the VG51 polypeptide and a vesicular glutamate reuptake inhibitor.
  • HEK-293 cells transiently transfected with the expression vector pcDNA3-VG51 or pcDNA3-DAT (allowing expression of the plasma transporter of dopamma) are detached from their
  • VG51 or DAT are fixed on different channels of a microchip covered with a hydrophobic surface (Sensor Chip L1, flow rate 5 ⁇ l / min, Hepes / NaCl buffer, ambient temperature) using a Biacore 3000 (Biacore)
  • a solution of Bleu Trypan (0 1nM in Hepes / NaCI buffer) is then injected into the channels containing either VG51 or the dopamine transporter (DAT). Ligand fixation is monitored in real time on the detection device (Sensogram)
  • the upper curve (VG51) shows the overall Blue Trypan binding signal obtained with the membranes of cells expressing the VG51 polypeptide immobilized on the support, this signal including background noise due to non-specific interactions.
  • the median curve shows the non-specific binding signal of the Blue Trypan observed on the membranes of the cells expressing the plasma dopam transporter molecules (DAT)
  • the lower curve is an illustration of the signal obtained reflecting the specific interactions between Trypan Blue and the immobilized VG51 polypeptide, the curve having been obtained by subtracting, for each measurement time, the value of the signal of non-specific interactions observed with DAT at the overall value of the signal obtained with VG51
  • Example 7 Location of the VG51 polypeptide in the rat hippocampus.
  • Brain sections (40 ⁇ m) are removed using a cryostat, they are incubated with the primary antiserum (overnight at 4 ° C) and then with the secondary antiserum (anti IgG rabbit or mouse IgG conjugated to CY2 or CY3 from Jackson, USA) diluted 1 800 th The images are analyzed using a Leitz confocal microscope
  • COS cells (cultured in DMEM 4 5 g / l of glucose, 10% fetal calf serum, 2mM L-glutamine, 37 ° C 5% C0 2 ) are subcultured the day before transfection at the rate of 50,000 cells per well 15 mm in diameter
  • the transfection is carried out by lipofection (Lipofectin, Life
  • Transport tests are performed 48 or 72 hours after transfection
  • the cells are washed for 20 minutes in Krebs-Rmger buffer (Tp KR NaCI 146 mM 3 mM KCl, CaCI 2 1 mM, MgCI 2 1 mM Na 2 HP0 4 + NaH 2 P0 4 2mM pH 7.4)
  • the cells are then incubated in 200 ⁇ l of Tp KR added with 0 5 ⁇ Ci of radioactive GABA then the transport is stopped by aspiration of the medium FOLLOWED by 2 rapid washes with 500 ⁇ l of Tp KR ice
  • the cells are then lysed in 200 ⁇ l of 0.1 N NaOH and the amount of radioactive GABA accumulated in the cells determined by counting
  • Transport characteristics are determined by varying different parameters during the accumulation phase time (between 5 minutes and 1 hour), pH (between 5.5 and 7.5), amount of non-radioactive GABA, replacement of the Na + by other monovalent cations L ⁇ + , Chol ⁇ ne + )
  • COS-7 cells transfected with a pcDNA3 vector devoid of msert or with a vector containing a nucleotide insert coding for the VG51 polypeptide were cultured in a culture medium at pH 7.4.
  • the measurement of GABA reuptake was then carried out. either at pH 5.4 ( Figure 12B), or at pH 7 ( Figure 12C), in the presence of sodium chloride (NaCI), lithium chloride (LiCI) or chlorine chloride (ChoCI) as salts of culture centre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des polypeptides transporteurs d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate ou du GABA, et des fragments peptidiques de ces derniers, les séquences nucléotidiques codant pour de tels polypeptides ou fragments peptidiques et des vecteurs recombinants contenant ces séquences nucléotidiques. L'invention est également relative à des moyens de détection de ces polypeptides et acides nucléiques, tels que des amorces ou sondes nucléotidiques ou encore des anticorps, ainsi qu'à des procédés et des kits de détection mettant en oeuvre de tels moyens de détection. L'invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules candidates capables d'inhiber ou au contraire d'activer le transport d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate ou du GABA.

Description

POLYPEPTIDES, TRANSPORTEURS VESICULAIRES DU GLUTAMATE ET DU GABA
La présente invention concerne des polypeptides transporteurs d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate et du GABA, et des fragments peptidiques de ces derniers, les séquences nucléotidiques codant pour de tels polypeptides ou fragments peptidiques et des vecteurs recombinants contenant ces séquences nucléotidiques L'invention est également relative à des moyens de ιo détection de ces polypeptides et acides nucléiques, tels que des amorces ou sondes nucléotidiques ou encore des anticorps, ainsi qu a des procèdes et des kits de détection mettant en œuvre de tels moyens de détection L'invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules candidates capables d'inhiber ou au contraire d activer le
15 transport d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate et du GABA
Dans le cerveau des mammifères, une large majorité de neurones utilisent les acides ammes (proline, taurine, glutamate, glycine et GABA) comme neurotransmetteurs Le glutamate et le GABA sont,
20 respectivement, les neurotransmetteurs effecteurs excitateurs et inhibiteurs majeurs du système nerveux central
Les mécanismes moléculaires spécifiques de la neurotransmission peuvent, schématiquement, être divisés en quatre grandes étapes 1 ) la biosynthèse du neurotransmetteur, 2) son stockage vésiculaire et sa
25 libération, 3) son action sur des récepteurs (pré- ou post-synaptiques) et 4) l'arrêt du signal par dégradation et/ou recapture Tous ces processus sont responsables de l'homéostasie de la neurotransmission dans le système nerveux central (SNC) Les marqueurs neuronaux spécifiques dont nous disposons à l'heure actuelle pour étudier le SNC proviennent,
30 dans leur grande majorité, de l'une de ces 4 étapes. Le glutamate, acide aminé dicarboxylique, est synthétisé par toutes les cellules a partir de
- l'α-cetoglutarate grâce a l'activité catalytique de la glutamate déshydrogenase ou de la glutamate oxaloacétate transaminase,
- de la glutamine grâce a l'activité catalytique de la glutaminase
Outre son rôle métabolique ubiquitaire, le glutamate est également un neurotransmetteur excitateur dans le système nerveux central Accumule dans les vésicules synaptiques, il est libéré dans la synapse par un mécanisme d'exocytose calcium-dépendante et il interagit avec des récepteurs lonotropiques (iGluR) ou métabotropiques (mGluR)
L'arrêt de la transmission glutamatergique s'effectue essentiellement par une désensibilisation rapide des récepteurs (en environ 1 à 3 msec), mais également par un rétro-transport actif dans les cellules gliales et les neurones environnants Cette recapture est assurée par des transporteurs localisés sur la surfar ^ -Je la membrane plasmique et dont l'activité dépend des ions Na+ et K'
De nombreux travaux ont montré que des concentrations synaptiques élevées en glutamate entraînent une hyper-stimulation des récepteurs glutamatergiques conduisant à la destruction des neurones cibles Afin d'éviter une telle cytotoxicité, il est donc primordial de maintenir dans l'espace extracellulaire de faibles concentrations de glutamate (environ 1 à 3 μM)
De fait, des concentrations anormalement élevées de cet acide aminé excitateur ont pu être mises en évidence dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose amyotrophique latérale (SLA) ou la maladie de Huntington, ou encore dans la mort neuronale subséquente à une hypoxie.
La nécessité d'un contrôle strict de la transmission glutamatergique a été récemment illustrée par la caractérisation du gène impliqué dans la dégénérescence des motoneurones chez la souris lurcher. Il s'agit d'une mutation ponctuelle dans le troisième domaine transmembranaire du gène d'un récepteur glutamatergique (GluRδ2), dont la conséquence est la production d'un récepteur constitutivement actif (Zuo et al-, 1997) Chez ces souris, la stimulation chronique de la transmission glutamatergique a des effets délétères importants, telles qu'une ataxie provoquée par la dégénérescence par apoptose des cellules de Purkinje chez les souris hétérozygotes, et une mort post- natale due à une perte massive des neurones du cerveau moyen et du cerveau antérieur chez les homozygotes. Les effets délétères sont d'autant plus remarquables que la mutation lurcher est de type semi- dominante.
En outre, il apparaît de plus en plus clairement , depuis des années, que des dysfonctionnements dans la transmission glutamatergique sont responsables de pathologies psychiatriques variées. Cela peut être expliqué, du moins en partie, par les interrelations importantes existant entre les neurones dopaminergiques et glutamatergiques dans le cortex frontal et les noyaux gris centraux.
Très récemment, des agonistes glutamatergiques ayant des propriétés psychotropes on été caractérisés (Moghaddam et al., 1998). Comme déjà évoqué précédemment, le glutamate est un neurotransmetteur majeur du système nerveux central (SNC) présent dans 40 a 50% des neurones Des dysfonctionnements dans le transport de ce neurotransmetteur excitateur sont susceptibles d'induire diverses affections neurologiques ou neuro-psychiatriques
Il existe donc actuellement un grand besoin d'identifier des molécules d'intérêt thérapeutique capables de moduler ou réguler le transport glutamatergique, en particulier le transport glutamatergique vesiculaire intra-cytoplasmique dans les neurones cibles, afin de traiter les diverses pathologies liées à une dérégulation du transport glutamatergique
De plus il n'existe a l'heure actuelle aucun marqueur, par exemple protéique, spécifique des neurones glutamatergiques qui permettrait de les visualiser aisément
Au cours de la décade qui vient de s'écouler ont été clones les transporteurs plasmiques du GABA, du glutamate, de la glycine, de la proline et de la taurine ainsi que le transporteur vésiculaire du GABA et de la glycine [pour revue voir Masson et al , Pharmacological Rev , 51 , 439-464 (1999)] Les transporteurs plasmique du GABA appartiennent a la superfamille des transporteurs dont I activité dépend du Na+ et du Cl La biologie moléculaire a permis de montrer qu'il existait 5 sous-types de transporteurs plasmique du GABA appelés GAT1 , ,GAT2, GAT3, betaine/GABA transporteur 1 et rB16a [voir la revue de Masson et al 1999] Le transporteur vésiculaire du GABA lui appartient à une famille différente et nouvelle de gènes [voir [Sagné et al , FEBS letters , 417, 177-183 (1997)]
Des composés pharmacologiques qui modulent la neurotransmission GABAergiques sont utilisés pour le traitement de l'anxiété et de l epilepsie Les benzodiazépines (tel que le diazepam ou Valium) et les barbiturates produisent leurs effets thérapeutiques dans le traitement de l'anxiété en se liant au récepteur GABAA et en augmentant son activité Les inhibiteurs des transporteurs plasmiques du GABA (tels que la tiagabme ou le SK&F89976-A) eux sont utilisés dans le traitement des convulsions
Selon la présente invention, il a été désormais isolé une famille de polypeptides ayant la structure générale d'un transporteur vésiculaire d'acides am es, tels que les transporteurs vésiculaires d'acides ammes inhibiteurs comme le GABA ou la glycine (transporteurs VIAAT) décrits par Sagne et al (1997)
Les polypeptides selon l'invention sont produits essentiellement au niveau des différents types de neurones GABAergiques ainsi que dans les neurones glutamatergiques centraux et possèdent en outre une forte affinité pour un inhibiteur du transport vésiculaire du glutamate, tel que le Bleu Trypan (Roseth et al , 1998)
Par " forte affinité " pour un inhibiteur du transport vésiculaire du glutamate, on entendra dans la présente description une affinité définie par une valeur de Km entre un polypeptide selon l'invention et un inhibiteur comprise preférentiellement entre 10"8 M et 10" M , encore plus preférentiellement entre 10"9 M et 10"13 M et de manière tout à fait préférée entre 10"10 M et 10"12 M
En outre il a ete montré qu'un polypeptide selon l'invention lorsqu'il est exprimé dans des cellules, est responsable d'un transport de
GABA à basse affinité et forte capacité Le transport de GABA induit par un tel polypeptide selon l'invention est plus important à pH acide qu'à un pH physiologique De plus, le transport de GABA induit par un tel polypeptide selon l'invention est dépendant de la concentration en sodium à pH physiologique, alors qu'à pH acide, la concentration de sodium ne modifie pas significativement le transport de GABA ainsi induit
L'invention concerne donc en premier lieu un polypeptide transporteur d'acides aminés, et plus particulièrement du glutamate ou du GABA, dans les cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il possède une forte affinité pour un inhibiteur du transport du glutamate tel que le Bleu Trypan, ou un fragment peptidique de ce dernier
Un polypeptide transporteur d'acides aminés selon l'invention se caractérise aussi en ce qu'il est capable d'induire un transport du GABA dans les cellules dans lesquelles ce polypeptide est exprimé
Un tel polypeptide selon l'invention peut aussi se caractériser en ce que le transport de GABA qu'il induit dans la cellule dans laquelle il est exprimé est plus actif à pH acide, par exemple à pH 5,5, qu'au pH physiologique de 7,5
Un tel polypeptide selon l'invention peut se caractériser aussi en ce que le transport de GABA qu'il induit est ODendant de la concentration de sodium à pH physiologique, et indépendant de la concentration de sodium a pH acide
Un tel polypeptide se caractérise encore en ce qu'il est présent dans la membrane des lysosomes intracytoplasmiques et qu'il peut participer à l'échange d'acides aminés ou de peptides entre les lysosomes et le cytoplasme
Plus particulièrement, le demandeur a isolé et caractérisé des acides nucléiques codant pour une famille de polypeptides possédant les caractéristiques ci-dessus des polypeptides selon l'invention, à partir d'une banque d'ADNc d'hippocampe de rat II a ainsi pu être mis en évidence que deux gènes étaient exprimés principalement dans les neurones glutamatergiques et GABAergiques, ces deux gènes étant exprimés chacun sous la forme respectivement de deux produits de transcription (ARNm) résultant d'un événement d'épissage alternatif Les transcrits du premier gène ont été désignes par vg1 et vg3, alors que les transcrits du second gène ont été désignes par vg41 et vg51
Il a été également montre que les deux isoformes de chacun des transcrits ci-dessus résultaient en la production de polypeptides distincts ayant tous la structure générale d'un transporteur vésiculaire d'acides aminés Plus précisément, l'ARNm vg1 code pour le polypeptide VG1 , l'ARNm vg3 code principalement pour le polypeptide VG3, l'ARNm vg41 code pour le nolypeptide VG41 et l'ARNm vg51 code pour le polypeptide VG51 En outre, l'ARNm vg3 comprend une seconde phase ouverte de lecture localisée en amont de la phase ouverte de lecture codant VG3, codant pour un petit polypeptide qui sera désigné VG3-1 dans la présente description
Il a aussi été identifié, un polypeptide, désigné hVG51 aux fins de la présente description, qui est codé par le gène humain qui constitue l'orthologue du gène de rat dont l'un des transcrits code pour le polypeptide VG51 précité Les séquences nucléotidiques de chacun des 10 exons du gène humain hvg51 ont également été identifiées par le demandeur, ainsi que la séquence codante de l'ARN m correspondant, l'ensemble de ces séquences faisant également partie de l'invention
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les polypeptides VG51 et hVG51 selon l'invention sont des transporteurs du GABA, plus particulièrement des symporteurs GABA/protons qui peuvent utiliser indifféremment un gradient de protons (H+) ou d'ions sodium (Na+) comme source d'énergie, qui sont capables de transporter d'autres acides aminés que le GABA et qui sont synthétisés par les neurones glutamatergiques et GABAergiques Par « symporteur » selon l'invention, on entend un transporteur pour lequel l'acide aminé et le proton sont tous les deux échangés dans le même sens
L'invention est relative à un polypeptide codé par l'un quelconque des ARNs messagers correspondant respectivement à vg1, vg3, vg41 et vg51 ainsi qu'à un fragment peptidique dérivé de ce dernier, ainsi qu'au polypeptide hVG51 ou un fragment peptidique dérivé de ce dernier
De manière préférée, un polypeptide selon l'invention sera sous une forme isolée ou purifiée Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement) Par exemple, un polypeptide ou un polynucleotide présent à l'état naturel dans un animal ou une plante n'est pas isolé Le même polypeptide séparé de son environnement naturel ou le même polynucleotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'animal ou de la plante est isolé
Un tel polynucleotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucleotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isole, du fait que le vecteur ou la composition ne constituent pas son environnement naturel
Le terme "purifié" ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés II s'agit plutôt d'une définition relative Un polypeptide ou un polynucleotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et preférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur
L'invention concerne donc un polypeptide, caractérisé en ce qu il est choisi parmi a) un polypeptide comprenant au moins 15 acides aminés consécutifs de l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 5 et SEQ ID N° 21 , b) un polypeptide ayant au moins 60% d'identité en acides aminés ^ avec la séquence d un polypeptide tel que défini en a) , c) un polypeptide reconnu par un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide tel que défini en a) ou b)
Le "pourcentage d'identité" d'acides aminés ou de nucléotides entre deux séquences, au sens de la présente invention, peut être îo détermine en comparant deux séquences alignées de manière optimale, a travers une fenêtre de comparaison
La partie de séquence peptidique ou nucléotidique, dans la fenêtre de comparaison, peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemples des "gaps") par rapport à la séquence de
| référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière a obtenir un alignement optimal des deux séquences
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé ou une base nucléique identique est observe pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre 0 de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés ou entre les deux bases, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences comparées
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut
25 être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus (par exemple le logiciel FASTA de la Société Wisconsin Genetics Software
Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Doctor,
Madison Wisconsin, Etats-Unis)
Preférentiellement, le pourcentage d'identité entre deux 30 séquences nucléotidiques ou entre deux séquences peptidiques selon l'invention sera réalisé à l'aide du logiciel précité FASTA (FASTA-N ou FASTA-P), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques ou entre deux séquences d'acides
5 ammes selon l'invention est déterminé à l'aide du logiciel BLAST 2 0 6 de septembre 1998, en utilisant exclusivement les paramètres par défaut
Font également partie de l'invention les polypeptides ayant au moins 60%, 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou encore ι o 99,8% d'identité en acides aminés avec un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 et SEQ ID N° 21
Les différences en acides aminés que peut comprendre un polypeptide selon l'invention ayant au moins 60% d'identité en acides
15 aminés par rapport à la séquence d'acides aminés de référence, telle que définie dans le listage de séquences présenté à la fin de la présente description, peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non par rapport à la séquence de référence considérée
20 Preférentiellement, un polypeptide selon l'invention possède des modifications d'acides ammes allant de 1 , 3, 5, 10, 15 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé, comparé à l'une des séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 et SEQ ID N° 21
Dans le cas de substitutions d'acides aminés, un ou plusieurs
25 acides aminés -consécutifs ou non consécutifs- sont remplaces preférentiellement par des acides aminés "équivalents" Par acide amme "équivalent", on entend un acide aminé dont l'introduction dans la séquence peptidique, a la place de l'acide aminé initial a) ne modifie pas significativement la capacité du polypeptide ainsi
30 modifié d'être reconnu par des anticorps dirigés spécifiquement contre le polypeptide initial, ou encore b) ne modifie pas significativement la capacité du polypeptide ainsi modifié à se fixer avec une forte affinité à un inhibiteur du transport glutamatergique, tel que le Bleu Trypan La capacité d'un polypeptide modifié a se fixer a un inhibiteur du transport glutamatergique n'est pas significativement modifiée, au sens de la présente invention, si la valeur de l'affinité Km du polypeptide modifié pour l'inhibiteur ne diffère pas de plus de deux ordres de grandeur (10~3 à 10+3) par rapport à l'affinité du polypeptide initial pour le même inhibiteur Ainsi, font partie de l'invention les polypeptides dont la séquence a été modifiée par rapport à l'un des
I O polypeptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 et SEQ ID N° 21 et qui ont une affinité pour le Bleu Trypan comprise entre 10~9 M et 10"15 M , ou c) n'annihile pas la fonction de transport du GABA du polypeptide ainsi modifié
I 5 Certains polypeptides selon l'invention, en particulier VG1 et VG3, comprennent un domaine caractéristique de liaison au glutamate Par exemple, les polypeptides VG1 et VG3 comprennent la séquence " EASPWSCLQRQAAWGRS ", qui présente une homologie significative avec une portion d'une protéine codant une enzyme acide glutamique
20 décarboxylase codée par le génome de Xenopus laevis
Sont compris dans la définition d'acides aminés "équivalents" les acides aminés appartenant à la même classe, tels que les acides ammes acides (D et E), basiques (K, R et H), non polaires (A, V, L, I, P, M, F et W) ou encore polaires non chargés (G, S, T, C, Y, N et Q)
2 Font également partie de l'invention les polypeptides rendus résistants à la protéolyse par l'introduction d'une ou plusieurs liaisons non peptidiques, telles qu'une liaison réduite (CH2NH), une liaison rétro- inverso (NHCO), une liaison méthylène-oxy (CH2-0), une liaison thiométhylène (CH2-S), une liaison carba (CH2-CH2), une liaison cetomethylène (CO-CH2), une liaison hydroxyéthylène (CHOH-CH2) ou encore une liaison CH=CH
Les polypeptides selon l'invention sont utilisés notamment pour la production d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement l'un
^ quelconque des polypeptides VG1 , VG3, VG3-1 , VG41 , VG51 ou hVG51 , afin de réaliser des moyens de détection de ces polypeptides dans un échantillon, par exemple sur une coupe histologique de cerveau
De manière avantageuse, des polypeptides ou peptides utilisés
I O pour la production d'anticorps ont une séquence en acides aminés d'une longueur inférieure à I un quelconque des polypeptides de séquences SEQ I D NO 1 à SEQ ID NO 5 et Seq ID N° 21 De tels fragments peptidiques ont preférentiellement une longueur de séquence en acides aminés comprise entre 10 et 200 acides aminés de préférence entre 12,
1 15, 20, 25 et 30, 40 à 50, 75, 100 ou 150 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'invention Alternativement, de tels fragments peptidiques ont une taille de 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 150 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon I invention
20 Plus particulièrement, divers fragments peptidiques dérives respectivement des polypeptides VG1 , VG3, VG41 et VG51 ont été sélectionnes comme décrit à l'exemple 3 pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement un seul de ce polypeptides ou plusieurs d'entre eux
25 - le peptide VG1 -1 de 20 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 6, induit la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement le polypeptide VG1 ,
- le peptide VG1 -2 de 21 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 7, induit la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement le
30 polypeptide VG1 , - le peptide VG1-4 de 16 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 8, induit la production d'anticorps dirigés à la fois contre le polypeptide VG1 et le polypeptide VG3,
- le peptide VG51-1 de 17 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 9 induit la production d'anticorps dirigés spécifiquement contre le polypeptide VG51 ,
- le peptide VG51 -2 de 15 acides aminés de longueur, de séquence SEQ ID NO 10, induit la production d'anticorps dirigés à la fois contre le polypeptide VG51 et le polypeptide VG41 Selon un autre aspect, l'invention est aussi relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 6 à SEQ ID NO 10, utiles notamment pour la production d'anticorps qui peuvent être mis en oeuvre en tant que moyens de détection d'un polypeptide transporteur vésiculaire glutamatergique présentement décrit
Un autre objet de l'invention consiste en des acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'invention, et plus particulièrement un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et SEQ ID N° 21 , ou pour des fragments peptidiques de ces polypeptides
L'invention fournit aussi des acides nucléiques comprenant tout ou partie de la région codante des ADNs complémentaires correspondant aux ARNs messagers de vg1, vg3, vg41, vg51 et hvg51, des fragments nucléotidiques de ces derniers ainsi que les polynucléotides de séquence complémentaire
L'invention a donc également pour objet un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants a) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs s'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et SEQ ID N°22 à SEQ ID N°32, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, b) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini en a) , c) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini en a) ou b)
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 1 à SEQ ID
N°14 codent respectivement pour les polypeptides VG1 , VG3, VG41 et
VG51 Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 22 à SEQ ID N°
31 sont les séquences nucléotidiques des exons n°1 à 10 du gène humain hvg51 codant pour le polypeptide hVG51 L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°32 code pour le peptide hVG51
Font ainsi partie de l'invention les acides nucléiques ayant au moins 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou encore
99,8% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques de séquences SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO
14 et SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32
Par " conditions d'hybridation de forte strmger -> " au sens de la présente invention on entend les conditions d'hybridations suivantes
- préhybridation des filtres pendant au moins 1 heure à 42°C dans un tampon compose de 6 x SSC, 50 mM Tπs-Hcl (pH 7,5), 0, 1 % PVP, 0, 1 % SAB, 0, 1 % Ficoll, 0,05% NaPPi, 0,5% SDS, 0, 1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé , - hybridation des filtres avec une sonde nucléotidique marquée pendant au moins 4 heures à 45°C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tns-HCI (pH 7,5), 0,02% PVP, 0,02% SAB, 0,02% Ficoll, 0,05% NaPPi, 0, 1 mg/ml d'ARNt de levure ,
- trois lavages pendant 20 minutes de chacun des filtres dans une solution contenant 6 x SSC et 0,05% NaPPi à 61 °C. Les conditions d'hybridation de forte stπngence définies ci-dessus sont adaptées à l'hybridation d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 20 nucléotides
Il va sans dire que ces conditions d'hybridation doivent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée, selon des techniques bien connues de l'homme du métier
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de Hames and Higgins (1985) ou encore dans l'ouvrage de Sambrook et al (1989)
Font ainsi partie de l'invention les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et SEQ ID N°
22 à SEQ ID N° 32 De tels acides nucléiques comprennent avantageusement de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200 à 250 300 ou 400 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32 De tels acides nucléiques peuvent comprendre par exemple 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou 400 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et Seq ID N° 22 à SEQ ID N° 32
Est explicitement exclue des séquences nucléotidiques selon l'invention la séquence nucléotidique SEQ ID N°6461 décrite dans la demande PCT N° WO 95/14 772 publiée le 1 er Juin 1995
Aux fins de la présente description, l'expression ' séquence nucléotidique " est employée pour désigner indifféremment un polynucleotide ou un acide nucléique L'expression ' séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg1 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 1. La séquence SEQ ID NO 1 1 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucleotide en position 39 au nucleotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 1 1 , codant pour le polypeptide VG1 de séquence SEQ ID NO 1 La séquence SEQ ID NO 1 1 possède une certaine homologie avec une séquence EST humaine référencée dans la base de données Genbank sous le numéro d'accès H08076 Plus précisément, une identité de séquence en nucléotides a été retrouvée entre vg41 et H8076 (49% d'identité) et entre vg1 et H8076 (72% d'identité)
L'ADNc correspondant a l'ARN messager de vg3 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 12 La séquence SEQ ID NO 12 comprend une première phase de lecture ouverte allant du nucleotide en position 392 au nucleotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3-1 de séquence SEQ ID NO 2 La séquence SEQ ID NO 12 comprend une seconde phase de lecture ouverte allant du nucleotide en position 756 au nucleotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 et codant pour le polypeptide VG3 de séquence SEQ ID NO 3 L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg41 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 13 La séquence SEQ ID NO 13 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucleotide en position 352 au nucleotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13, codant pour le polypeptide VG41 de séquence SEQ ID NO 4 L'ADNc correspondant à l'ARN messager de vg51 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID NO 14 La séquence SEQ ID NO 14 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucleotide en position 105 au nucleotide en position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14, codant pour le polypeptide VG51 de séquence SEQ ID NO 5. La séquence codante de l'ADNc correspondant à l'ARN messager de hvg51 constitue la séquence nucléotidique SEQ ID N°32. La séquence SEQ ID N°32 débute par le premier nucleotide du codon « ATG » codant pour la méthionme N-terminale du polypeptide hVG51 5 Le nucleotide en position 1420 de la SEQ ID N°32 est le dernier nucleotide du codon codant pour l'isoleucme C-terminale du polypeptide hVG51 , comme illustre sur la figure 13
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi p i o armi les séquences nucléotidiques suivantes a) la séquence allant du nucleotide en position 39 au nucleotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 1 1 ; b) la séquence allant du nucleotide en position 392 au nucleotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 ,
15 c) la séquence allant du nucleotide en position 756 au nucleotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 , d) la séquence allant du nucleotide en position 352 au nucleotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13 , e) la séquence allant du nucleotide en position 105 au nucleotide en 20 position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire aux séquences a) à e)
L'invention concerne aussi des sondes et des amorces 25 nucléotidiques capables d'hybπder spécifiquement avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention tels que définis précédemment Avantageusement, les sondes et les amorces nucléotidiques sont définies de telle manière qu'elles hybrident avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention dans les conditions d'hybridation de 30 forte strmgence définies dans la description. Les sondes nucléotidiques selon l'invention sont utiles notamment pour détecter la présence d'un acide nucléique codant pour un transporteur d'acides aminés, preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA, dans un
5 échantillon Ces sondes peuvent par exemple être mises en œuvre dans des expériences d'hybridation in situ sur des coupes histologiques de tissus, preférentiellement des coupes histologiques de cerveau, telles que décrites à l'exemple 2
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont utiles i o notamment pour amplifier la totalité ou une partie d'un acide nucléique cible codant pour un transporteur vésiculaire du glutamate présent dans un échantillon Les acides nucléiques amplifiés à l'aide d'un couple d amorces selon I invention pourront subséquemment être intégrés dans un vecteur de clonage ou d'expression ou encore être simplement
15 détectés sur gel ou révélés à l'aide d'une sonde appropriée , comme par exemple dans les expérience de Northern Blot sur de l'ARN messager provenant de différents tissus, tel que décrit à l'exemple 1
La taille des sondes et des amorces nucléotidiques varie de 10 a 1000 nucléotides et est preférentiellement comprise v .he 10, 12, 15, 18, 0 20, 25 à 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 400, 500, ou 1000 nucléotides, et de manière préférée de 10 à 1000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d un acide nucléique choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32, ou un acide
2 nucléique de séquence complémentaire
De préférence, le contenu en bases GC des sondes et des amorces selon l'invention est compris entre 35% et 70%, et de manière tout à fait préférée entre 40% et 60%.
Des sondes nucléotidiques préférées sont la séquence
30 nucléotidique SEQ ID NO 19, qui hybride spécifiquement avec les ARN messagers vg1 et vg3, ainsi que la séquence nucléotidiques SEQ ID NO 20, qui hybride spécifiquement avec les ARN messagers vg41 et vg51 Des amorces nucléotidiques préférées sont les suivantes :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 15 , 5 - la séquence nucléotidique SEQ ID NO 16 ,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 17 ,
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO 18 ,
Des couples d'amorces préférés aux fins d'amplifier un acide nucléique selon l'invention sont les suivants . i o - le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 16, permettant d'amplifier des acides nucléiques corresponαant à vg1 et vg3 ,
- le couple d'amorces constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO 18, permettant d'amplifier des acides nucléiques
15 correspondant à vg41 et vg51 ,
Les acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 22 à SEQ ID N°31 peuvent constituer en elles-mêmes des sondes hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec une séquence génomique, un ADNc ou un ARN du gène hvg51
20 De plus, les acides nucléiques SEQ ID N°22 à SEQ ID N° 32 sont utiles à la construction d'amorces nucléotidiques capables d'amplifier tout ou partie de la séquence codante (génomique, ARN ou ADNc) du gène hvg51 Par exemple, une paire d'amorces nucléotidiques comprenant respectivement une première amorce hybridant
25 spécifiquement avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 22 et une seconde amorce hybridant spécifiquement avec l'acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 31 sont utiles pour I amplification de la totalité de la séquence génomique ou de la totalité de l'ADNc codant pour le polypeptide
30 hVG51 Ainsi, une banque de clones de vecteurs BAC ou PAC contenant des mserts d'ADN génomique humain, et plus particulièrement des mserts d'ADN génomique humain provenant du chromosome 5, peut être criblée à l'aide d'une ou de plusieurs des séquences SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 31 ou encore d'amorces ou de sondes construites à partir des séquences SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 31 afin d'identifier les clones de ta banque dont les mserts d'ADN génomique comprennent tout ou partie du gène hvg51, puis de séquencer le ou les mserts d'ADN du ou des clones sélectionnes positivement afin d'obtenir la séquence génomique du gène hvg51, selon toute technique connue de l'homme du métier Pour l'isolement et la caractérisation de la séquence génomique du gène hvg51 ou de la séquence d'ADNc correspondant au transcrit du gène hvg51, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la demande PCT publiée sous le numéro WO 99/02546 le 21 janvier 1999
Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être préparées par l'un quelconque des procédés de synthèse appropriés bien connus de l'homme du métier, tels que la technique de synthèse au phosphodiester de Narang et al (1979) ou de Brown et al (1979) ou encore la méthode au diéthylphosphoramidite de Beaucage et al (1981 )
L'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et tout particulièrement les acides nucléiques utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques, peuvent être marqués par incorporation d un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques photochimiques, biochimiques, immuno-chimiques ou chimiques Le marqueur détectable peut notamment consister en des isotopes radioactfis (32P, 35S, H ou 125l), des colorants fluorescents (5- bromodésoxyuπdine, fluorescéine, acétylaminofluorène ou digoxygénine) ou encore par un ligand telle que la biotine De préférence, les polynucléotides sont marqués à leur extrémité 3' ou 5' Des exemples illustratifs de marquage non radioactif de fragments nucléotidiques sont déciπts dans le brevet français N° FR-7810975 ou encore dans les articles de Urdea et al (1988) ou Sanchez-Pescador (1988) Avantageusement, les sondes nucléotidiques selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurales telles que celles des sondes ramifiées permettant une amplification du signal décrites par Urdea en 1991 ou encore dans le brevet Européen N° EP-0225 807 (Chiron)
Selon un mode de réalisation particulier des sondes ou des amorces nucléotidiques selon l'invention, celles-ci peuvent être immobilisées sur un support tel que la surface de puits de plaques de microtitration, des billes de polystyrène, des filtres de nitrocellulose etc i o L invention concerne également un procédé de détection d'un acide nucléique codant pour un transporteur d acides ammes preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA dans un échantillon, comprenant les étapes de a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon I 5 l'invention avec l'échantillon à tester , b) détecter la présence d'un complexe éventuellement forme entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon
Selon un premier mode de réalisation particulier le procédé de 20 détection est caractérise en ce que la ou les sonde(s) nucleotιdιque(s) est (sont) ιmmobιlιsée(s) sur un support
Selon un second mode de réalisation particulier, le procédé de détection est en outre caractérisé en ce que la ou les sonde(s) nucléotιdιque(s) est (sont) marquée(s) par un marqueur détectable 2 Selon un troisième mode de réalisation particulier, les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 et SEQ ID N° 22-32
L'invention a également pour objet un kit ou trousse de détection 30 d'un acide nucléique codant pour un transporteur d'acides aminés, preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA dans un échantillon, comprenant . a) une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus , b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection du complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon
Selon un premier mode de réalisation, le kit ou trousse de détection est caractérise en ce que la ou les sonde(s) nucléotιdιque(s) est (sont) ιmmobιlιsée(s) sur un support
Selon un second mode de réalisation, le kit ou trousse de détection est caractérise en ce que la ou les sonde(s) nucléotιdιque(s) est (sont) marquee(s) par un marqueur détectable
Selon un troisième mode de réalisation particulier, les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 et SEQ ID N° 22-32.
L'invention est aussi relative à un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur d'acides aminés, preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA comprenant les étapes suivant r. a) mettre en contact un couple d'amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus avec un échantillon susceptible de contenir un acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; en présence des réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification , b) le cas échéant, détecter les acides nucléiques amplifiés
Selon un mode de réalisation particulier du procédé décrit ci- dessus, les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 15 à SEQ ID NO 18
L'invention concerne également un kit ou trousse pour l'amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur d'acides aminés, preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA comprenant . a) un couple d'amorces nucléotidiques telles que définies ci-dessus , b) le cas échéant, les reactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification et/ou les moyens de détection des acides nucléiques amplifiés Selon un premier mode de réalisation, les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 15 à SEQ ID NO 18
Selon un second mode de réalisation, les moyens de détection des acides nucléiques amplifiés sont constitués par des sondes hybridant spécifiquement avec ces derniers, par exemple des sondes comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 et SEQ ID N° 22-32
Les techniques d amplification d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier Des techniques d'amplification pouvant être mises en œuvre dans le contexte de la présente invention comprennent, sans toutefois y être limitées, à la " Ligase Chain Reaction (LCA) " décrite dans les brevets européens N° EP-320 308 et EP-439 182 ou encore dans la demande PCT n° WO 93/20227, la reaction en chaîne à la polymérase (PCR et RT-PCR) ainsi que des techniques telles que la technique NASBA (Guatelli et al , 1990 , Compton, 1991 ) l'amplification a la Q-beta replicase décrite dans la demande de brevet européen n° EP-4544610 ou encore la technique SDA (Walker et al , 1996)
La technique PCR proprement dite est décrite en détails dans la revue de White et al (1997), dont le contenu est incorporé ICI par référence
Les acides nucléiques correspondant aux différents produits de transcription vg1, vg3, vg41, et vg51 ont été insérés dans des vecteurs d'expression recombinants, ces vecteurs recombinants ayant été utilisés pour transfecter des cellules de mammifères comme les cellules de la lignée HEK-293 en vue de la production des polypeptides VG1 , VG3.
VG41 et VG51 correspondants. Ces expériences sont décrites en particulier à l'exemple 4.
L'acide nucléique correspondant au produit de transcription du gène hvg51 peut aussi être inséré dans de tels vecteurs d'expression recombinants.
Ainsi, l'invention a également pour objet une famille de vecteurs recombinants de clonage ou d'expression comprenant l'un quelconque des acides nucléiques définis dans la présente description, et en particulier l'un quelconque des acides nucléiques choisis parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14, des fragments nucléiques de ces derniers ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à une famille de vecteurs de clonage ou d'expression comprenant un insert nucléotidique comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32 .
Le terme " vecteur recombinant ", au sens de la présente invention désigne une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire. qui peut être sous la forme simple brin ou double brin, et qui comprend un polynucleotide d'intérêt dont l'amplification ou l'expression est recherchée après son transfert dans un hôte cellulaire approprié.
Un vecteur d'expression recombinant selon l'invention comprend. outre l'acide nucléique d'intérêt dont l'expression est recherchée, des séquences de régulations fonctionnelles dans l'hôte cellulaire désiré, telles que des promoteurs, des signaux de début et d'arrêt de la traduction et le cas échéant des séquences activatrices de type
" enhancer ", si nécessaire. De telles séquences de régulation sont localisées, par rapport à l'acide nucléique dont l'expression est recherchée, de telle manière à fonctionnellement liée à l'acide nucléique d'intérêt, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. De préférence, la séquence promotrice sera donc localisée du côté 5' de l'acide nucléique d'intérêt, et en phase avec ce dernier, de manière à ce que la fonction de promoteur puisse être effective
Les vecteurs recombinants selon l'invention comprennent avantageusement plusieurs origines de réplications fonctionnelles respectivement dans différents hôtes cellulaires, y compris dans des hôtes cellulaires dont les polymérases ne reconnaissent pas les différents signaux de régulation de la transcription et de la traduction éventuellement contenus dans ces vecteurs, dits vecteurs navettes Lesdits vecteurs recombinants comprennent de préférence un ou plusieurs marqueurs de sélection choisis parmi les marqueurs de résistance aux antibiotiques, tels que la résistance à la néomycine, à la tetracycline, à la πfampicine ou à l'ampicillme
Les promoteurs sont par exemple choisis parmi les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactéπophage T3 ou T7, les promoteurs PL et PR du phage lambda ou encore le promoteur p10 de la polyhédrme de baculovirus (O'Reilly et al , 1992)
Les vecteurs recombinants selon l'invention sont indifféremment des vecteurs bactériens, viraux, de baculovirus ou encore des vecteurs pour cellules eucaryotes, en particulier pour cellules de mammifères
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression des acides nucléiques selon l'invention dans des bactéries sont par exemple les vecteurs pQE70, pQE60 ou pQE-9 (commercialisés par la société QIAGEN), les vecteurs pBluescπpt, Page script, pNH8A , pNH16a, pNH18a pNH46A (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pKK223-3, pKK233-3, pDR540 et pRIT5 (commercialisés par la société Pharmacia)
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression dans cellules eucaryotes sont par exemple les vecteurs pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 et pSG (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pSVK3, pBPV, pMSG et pSVL (commercialisés par la société Pharmacia)
Un premier vecteur preférentiellement mis en œuvre dans le cadre de l'invention est le vecteur pcDNA3 commercialisé par la société Invitrogen
Un second vecteur particulièrement préféré est le vecteur pBluescript SK (-), commercialise par la société Stratagene
Ainsi, les polynucléotides de séquences SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 ont été inséré dans des vecteurs pcDNA3 ou pBluescript SK (-) plus particulièrement au niveau d'un site de restriction unique EcoRI contenu dans le sites de clonage multiple localisé dans ces vecteurs Les cartes de construction de ces vecteurs sont représentées respectivement aux figures 5 à 8
Un acide nucléique comprenant l'un quelconque des polynucléotides de séquences SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32 peut aussi être inséré dans l'un des vecteurs décrits ci-dessus
Un troisième vecteur particulièrement préféré selon l'invention est le vecteur pcDNA3-VG1 contenu dans la souche de E coli déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Mιcroorganιc mes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210 L'insert nucléotidique contenu dans ce vecteur recombinant est la séquence SEQ ID NO 1 1
Un quatrième vecteur particulièrement préféré selon l'invention est le vecteur pcDNA3-VG51 contenu dans la souche de E coli déposée a la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209 L'insert nucléotidique contenu dans ce vecteur recombinant est la séquence SEQ ID NO 14
Les vecteurs recombinants décrits ci-dessus sont preférentiellement utilisés pour transfecter ou transformer une cellule hôte appropriée dans laquelle la multiplication du vecteur ou dans laquelle l'expression de l'insert nucléotidique d'intérêt est recherchée Un autre objet de l'invention consiste en une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'invention ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus
Des cellules hôtes préférées destinées à recevoir un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention sont par exemples les cellules hôtes suivantes a) cellules hôtes procaryotes Escheπchia co//(en particulier la souche DH5-σ), des souches de Bacillus, telles que des souches de Bacillus subtilis, ou encore des souches de Pseudomonas, Streptomyces et i o Staphylococcus b) cellules .êtes eucaryotes HeLa (ATCC N°CCL2 , N°CCL2 1 NXCL2 2), Cv 1 (ATCC N° CCL70), COS (ATCC N°CRL1650 N°CRL1651 ), Sf-9 (ATCC N°CRL171 1 ), C127 (ATCC N° CRL-1804) 3T3 (ATCC N° CRL-6361 ), CHO (ATCC N° CCL-61 ), HEK-293 (ATCC
15 N°45504 , N° CRL-1573) et BHK (ATCC N° 84100501 , N° 841 1 1301 )
Une autre catégorie de cellules hôtes préférées selon l'invention comprend des cellules neuronales, plus particulièrement des cellules de neurones glutamatergiques de patients affectés d'un dysfonctionnement dans le transport vésiculaire du glutamate, soit sous la forme d'une
20 culture primaire, soit sous la forme de cellules établies en lignées, par exemple après transformation par le virus d'Epstein-Barr selon des techniques bien connues de l'homme du métier
Une première cellule hôte recombinante particulièrement préférée selon l'invention est de la souche de E coli contenant le vecteur
2^ pCDNA3-VG1 , déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210
Une seconde cellule hôte recombinante particulièrement préférée selon l'invention est de la souche de E coli contenant le vecteur pcDNA3-VG51 , déposée à la Collection Nationale de Cultures de
30 Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209 L'un quelconque des polypeptides VG1 , VG3-1 , VG3, VG41
VG51 et hVG51 , leurs homologues peptidiques ainsi que les fragments peptidiques de ces polypeptides ou polypeptides homologues peuvent être obtenus sous une forme recombinante par l'insertion d un acide nucléique codant pour ceux-ci dans un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus et introduction du vecteur recombinant obtenu dans une cellule hôte appropriée
L invention est également relative à un procède pour la production d'un polypeptide selon I invention comprenant les étapes de a) transfecter une cellule hôte appropriée, dans laquelle l'expression du polypeptide est recherchée , avec un vecteur recombinant selon
I invention , b) cultiver la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) dans un milieu de culture approprie , c) récupérer le polypeptide recombinant produit par la cellule hôte recombinante dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire de la cellule hôte cultivée a l'étape b) , d) le cas échéant purifier le polypeptide recombinant présent dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire , e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant obtenu a l'étape c) ou d)
Les polypeptides obtenus selon le procédé décrit ci-dessus peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immuno-affinité sur laquelle des anticorps reconnaissant ledit polypeptide ont été préalablement immobilisés
Les polypeptides selon l'invention, et plus particulièrement les polypeptides recombinants selon l'invention peuvent aussi être purifies par des techniques de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), telle que par exemple des techniques de chromatographie en phase inverse ou de chromatographie d'échange d'anions ou de cations, bienconnues de l'homme du métier
Les polypeptides, recombinants ou non recombinants, selon l'invention peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps On a montré selon l'invention que des peptides dérivés des polypeptides VG1 , VG3, VG41 et VG51 pouvaient être avantageusement utilises pour la préparation d'anticorps, en particulier d'anticorps polyclonaux, capables de reconnaître spécifiquement VG1 , VG3, VG1 et VG3, VG41 , VG51 , VG41 et VG51 , selon que les polypeptides possédaient une séquence en acides aminés uniquement présente dans un seul de ces polypeptides, ou au contraire une séquence d'acides aminés commune à deux d'entre eux, par exemple VG1 et VG3 ou encore VG41 et VG51
Le polypeptide hVG51 peut également être utilisé pour la préparation d'anticorps reconnaissant spécifiquement ce dernier
Selon un autre aspect, l'invention a donc encore pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement un polypeptide selon l'invention ou un fragment peptidique de ce dernier, en particulier un polypeptide de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et SEQ ID N° 21 ou un fragment peptidique unique ou au contraire commun à ces derniers
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps prépares par immunisation d un animal avec l'un des peptides de séquences SEQ ID NO 6 à SEQ ID NO 10
- Les anticorps prépares à partir du peptide VG1-1 de séquence SEQ ID NO 6 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG1 ,
- Les anticorps préparés à partir du peptide VG1-2 de séquence SEQ ID NO 7 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG1 ,
- Les anticorps prépares a partir du peptide VG1-4 de séquence SEQ ID NO 8 reconnaissent à la fois le polypeptide VG1 et le polypeptide VG3, - Les anticorps prépares à partir du peptide VG51-1 de séquence SEQ ID NO 9 reconnaissent spécifiquement le polypeptide VG51 , - les anticorps prépares à partir du peptide VG-51 -2 de séquence SEQ ID NO 10 reconnaissent à la fois le polypeptide VG51 et le polypeptide VG41
Les anticorps selon l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir de cellules d hybπdomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975) Les anticorps polyclonaux peuvent être préparés par immunisation d un mammifère, en particulier en particulier des souris, des rats ou des lapins avec un polypeptide de l'invention à rencontre i o duquel une réponse immunitaire est recherchée, le cas échéant en présence d'un compose adjuvant de l'immunité, tel que de I adjuvant complet de Freund, de l'adjuvant incomplet de Freund de l'hydroxyde d aluminium ou encore un composé de la famille des muramyl peptides
Constituent également des " anticorps ", au sens de la présente
! 5 invention, les fragments d'anticorps tels que les fragments Fab, Fab , F(ab')2, ou encore les fragments d'anticorps simple chaîne contenant la partie variable (ScFv) décrits par Martineau et al (1988) ou encore dans le brevet américain n° US 4,946,778, ainsi que les anticorps humanises décrits par Remman et al (1997) ou par Léger et al ( s 997)
20 Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests immunologiques qualitatifs ou quantitatifs visant soit à simplement détecter la présence d'un polypeptide transporteur vésiculaire du glutamate dans un échantillon, par exemple sur une coupe tissulaire, soit à quantifier la quantité du polypeptide cible des anticorps dans un
25 échantillon, par exemple un fluide biologique ou encore une surnageant de culture ou un lysat cellulaire d'une cellule hôte recombinante selon l'invention
Selon un autre aspect, les anticorps selon l'invention peuvent être également utilises, du fait de leur caractère de gands de l'un des
30 polypeptides transporteurs selon l'invention, pour moduler l'activité de ces polypeptides, et donc moduler -inhiber ou au contraire activer- le transport d'acides ammes, plus particulièrement le transport vésiculaire du glutamate ou le transport du GABA, par exemple au niveau des neurones glutamatergiques ou des neurones GABAergiques
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de détection d'un polypeptide transporteur d'acides aminés, preférentiellement un transporteur vésiculaire du glutamate ou un transporteur du GABA, ou un fragment peptidique de ce dernier, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de a) mettre en contact un anticorps selon l'invention avec l'échantillon a tester , b) détecter IF complexe antigène/anticorps éventuellement formé
L'invention est également relative à un kit ou trousse de détection d'un polypeptide selon I invention dans un échantillon, comprenant a) un anticorps selon l'invention , b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection de complexe antigène/anticorps éventuellement formé
Un anticorps selon l'invention peut être marque à l'aide d'un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, selon des procèdes bien connus de l'homme du métier
Comme déjà indiqué précédemment, il a été isolé et caractérise pour la première fois selon I invention une famille de polypeptides transporteurs membranaires d'acides aminés, particulièrement du glutamate ou du GABA, structuralement apparentés et impliqués dans le stockage du glutamate, neuro-transmetteur excitateur, notamment dans des vésicules mtra-cytoplasmiques des cellules de type glutamatergique ou GABAergique du système nerveux central Les résultats des exemples montrent que les gènes codant pour les polypeptides VG1 , VG3, VG41 et VG51 selon l'invention sont également exprimés dans d'autres tissus tels que les poumons, le foie, la rate etc. Les polypeptides VG1 , VG3, VG41 , VG51 et hVG51 sont donc également susceptibles de jouer un rôle important dans le transport d'acides aminés, plus particulièrement du glutamate ou du GABA, par exemple au niveau des poumons
Les vésicules intra-cytoplasmiques ont la propriété d'accumuler le glutamate présent dans le cytoplasme de ces cellules, le glutamate ainsi présent a haute concentration pouvant être relargué très rapidement et en grande quantité dans l'espace extra-cellulaire, notamment inter- neuronal lors de la réception d'un signal excitateur par les cellules concernées II a en particulier été détermine que I activité de ces i o transporteurs glutamatergiques est de nature à placer le glutamate à une concentration 10 fois plus grande dans les vésicules intra- cytoplasmiques que dans le cytoplasme lui-même Un défaut dans I expression des polypeptides transporteurs vesiculaires du glutamate selon I invention ou une mutation dans la région codante entraînant des
15 modifications dans les séquences de ces polypeptides serait de nature à conduire à diverses pathologies du sustème nerveux central et en particulier à divers désordres neuro-psychiatriques ou encore à des pathologies liées a un défaut dans la physiologie des types cellulaires dans lesquels VG 1 , VG3, VG41 , VG51 et hVG51 sont synthétisés. Un
20 défaut de production de ces polypeptides par les cellules pulmonaires serait susceptible de conduire à diverses pathologies du système respiratoire, tel que l'asthme
Des défauts dans la régulation de la neurotransmission GABAergique provoquent des pathologies ou des troubles tels que
25 I anxiété et l'épilepsie ou encore des convulsions
Une détection du niveau d'expression et de traduction des gènes concernes chez des patients souffrant de telles affections est rendue possible grâce aux sondes et amorces nucléotidiques ainsi qu'aux anticorps selon l'invention
30 En outre, dans le cas de pathologies liées à un dysfonctionnement dans le transport vésiculaire du glutamate, et plus précisément dans I accumulation du glutamate dans les vésicules mtra- cytoplasmiques des cellules glutamatergiques du système nerveux central, il existe un besoin important de disposer de moyens thérapeutiques destines a réguler le transport du glutamate à l'intérieur des cellules glutamatergiques, c'est à dire de molécules interagissant avec l'un quelconque ou même plusieurs des polypeptides transporteurs vésiculaires du glutamate selon l'invention, de telles molécules ayant en outre la capacité d inhiber, ou au contraire d'activer le fonctionnement de ces polypeptides transporteurs vésiculaires du glutamate, selon le type de pathologies à traiter
Des tests permettant de sélectionner des molécules candidates d intérêt thérapeutique interagissant avec un transporteur vésiculaire d acides aminés preférentiellement un transporteur du glutamate ou un transporteur du GABA est désormais rendu possible grâce à l'invention selon laquelle de tels polypeptides transporteurs ont pour la première fois été isolés et caractérisés
La portée de I invention s'étend donc également à des têts de criblage de molécules candidates interagissant avec I un des polypeptides selon I invention ou encore avec un fragment peptidique de ces derniers, ces molécules candidates étant susceptibles d'agir comme inhibiteurs ou au contraire comme activateurs du transport vésiculaire du glutamate
Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'invention, comprenant les étapes de a) mettre en contact un polypeptide selon l'invention avec la molécule candidate à tester , b) détecter le complexe polypeptide/molécule candidate éventuellement formé L'invention concerne aussi un kit ou trousse pour le criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon I invention, comprenant a) un polypeptide selon I invention , > b) le cas échéant les reactifs nécessaires à la détection du complexe polypeptide/molecule candidate éventuellement formé
Preférentiellement, les polypeptides utilises dans le procédé et le kit de criblage décrit ci-dessus sont les polypeptides VG1 , VG3, VG41 i o VG51 et hVG51 ainsi que des fragments peptidiques de ces derniers capables de fixer des inhibiteurs du transport glutamatergique, tel que Bleu Trypan De manière tout à fait préférée, on aura recours aux polypeptides choisis parmi les séquences SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3 a SEQ ID NO 5 et SEQ ID N° 21 ou encore des fragments peptidiques de
15 ces derniers capables de fixer un inhibiteur du transport glutamatergique tel que le Bleu Trypan Des fragments ayant la capacité de fixer le Bleu Trypan éventuellement avec une forte affinité, peuvent être sélectionnes, par exemple selon la technique du Biacore présentée a I exemple 6, tirant profit de la résonance plasmoniquf ce surface pour la
20 détection du complexe polypeptide (ou fragment polypeptιdιque)/molecule candidate (inhibiteur) éventuellement forme
D'autres molécules candidates susceptibles d'être sélectionnées positivement selon le procède de criblage décrit ci-dessus sont par exemple d'autres inhibiteurs du transport vésiculaires du glutamate, tels
2^ que le Bleu Evans ou le Chicago Skye Blue
D'autres molécules candidates susceptibles d'être sélectionnées positivement selon le procède de criblage décrit ci-dessus sont par exemples des composes modulant la neurotransmission GABAergique On peut citer les composés de la famille des benzodiazépmes auquel
30 appartient le diazepam, ou encore les composés de type barbiturates On peut citer aussi les composés inhibiteurs des transporteurs plasmiques du GABA, tels que la tiagabine et le SK&F89976-A
De manière générale, des molécules candidates susceptibles d'être sélectionnées positivement selon le procédé de criblage décrit ci- dessus peuvent avoir des propriétés psychotropes dans des pathologies psychiatriques et des propriétés anti-excitotiques dans des pathologies neurologiques A la périphéries, de telles molécules candidates pourront posséder des propriétés modulant la contraction des cellules musculaires lisses et des applications dans des champs multiples tels que vis-à-vis de l'asthme et de l'hypertension De telles molécules candidates r .uvent avoir la propriété, sur le métabolisme neuronal, de réguler I activité de transport des acides aminés au niveau des compartiments intracellulaires y compris vers les lysosomes et permettre ainsi la prévention ou le traitement de maladies lysosomiales métaboliques
L'invention a également trait a un procédé de criblage de molécules mhibitrices ou au contraire activatπces du transport d'acides ammes, plus particulièrement du transport du glutamate et encore plus précisément du transport vésiculaire du glutamate ou du GABA, un tel procède mettant en œuvre des vésicules obtenues à partir de cellules de préférences des cellules de mammifère, transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention et exprimant l'un des polypeptides choisis parmi VG1 , VG3, VG41 et VG51 , ou encore un fragment d'un tel polypeptide possédant une forte affinité pour un inhibiteur du transport glutamatergique.
Avantageusement, on introduira dans les vésicules obtenues a partir des cellules transfectées un marqueur détectable sensible aux conditions de pH, par exemple un marqueur fluorescent tel qu'un marqueur fluorescent choisi parmi le SNAFL, le SNARF, le HPTS, le BCEF le " Oregon Green Dye " ou encore des marqueurs de type Rhodol
En effet, les transporteurs vésiculaires du glutamate sont des protéines assurant la fontion d un transport de type " antiport ' utilisant le gradient de protons engendre par la pompe a protons/ATPase comme énergie On estime ainsi qu un proton sort de la vésicule pour chaque molécule de glutamate incorporée L'activité des polypeptides transporteurs de glutamate selon l'invention induit donc une fuite de protons vers le milieu extra-vésiculaire et en conséquence une modification du pH intra-vesiculaire, qui peut être suivi au moyen de marqueurs détectables sensibles aux conditions de pH, tels que ceux décrits ci-dessus En conséquence, des molécules capables de moduler leur activité de transport du glutamate peuvent être sélectionnées en incubant une molécule candidate en présence de vésicules obtenues a partir de cellules recombinante exprimant l'un des polypeptides transporteurs selon l'invention et en suivant les modifications de leur activité par la mesure, par exemple en continu, du pH ou du changement de pH du milieu intra-vésiculaire, à l'aide de l'un des marqueurs sensibles au pH qui aura été préalablement introduit dans les vésicules Dans le cas où est mis en œuvre un marqueur flourescent sensibles aux conditions de pH, la mesure du changement de pH intra-vesiculaire sera réalisée par détection I émission de fluorescence de ce marqueur a la longueur d'onde d'émission qui lui est spécifique
Les vésicules utilisées dans la mise en œuvre d'un tel procède de criblage peuvent être des vésicules membranaires telles que décrites a I exemple 6
En conséquence l'invention a également pour objet un procède de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire d acides am es, en particulier le transport vésiculaire du glutamate ou du GABA caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) obtenir des vésicules membranaires ou des vésicules intracellulaires de cellules transfectées avec un vecteur recombinaπt selon l'invention b) introduire dans les vésicules obtenues a I étapes a) un marqueur détectable sensibles aux conditions de pH , c) mettre en contact les vésicules obtenues a l'étape b) avec une molécule candidate a tester d) mesurer les modifications de pH intra-vesiculaires
L invention concerne aussi un kit ou trousse pour la mise en i o œuvre du procède de criblage ci-dessus décrit un tel kit comprenant a) des vésicules intra-cellulaires ou des vésicules membranaires obtenues a partir de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon I invention b) le cas échéant un marqueur détectable sensible aux conditions de pH
L invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants
La Figure 1 illustre la séquence de I acide nucléique correspondant a
Figure imgf000039_0001
La ligne supérieure est la séquence nucléotidique de vg1 La partie soulignée correspond au fragment nucléotidique absent de la séquence nucléotidique de l ADNc de vg3, qui est le résultat d un événement d epissage alternatif 25 La ligne désignée VG1 correspond au produit de traduction de l'ADNc vg1, le polypeptide VG1
La ligne désignée VG3 " correspond au produit de traduction principal de vg3 le polypeptide VG3 La Figure 2 illustre la séquence de l'acide nucléique correspondant à l'ADNc de vg51
La ligne supérieure est la séquence nucléotidique de vg51 La partie soulignée correspond au fragment nucléotidique absent de la séquence de vg41, qui est le résultat d'un événement d'épissage alternatif
La ligne désignée " VG51 " correspond au produit de traduction de
I ADNc vg51, le polypeptide VG51
La ligne désignée ' VG41 " correspond au produit de traduction de
I ADNc vg41, le polypeptide VG41
La Figure 3 représente deux gels de Northern blot réalises après amplification spécifique par RT-PCR de l ARNm présents dans différents tissus a I aide de deux paires d'amorces une paire d'amorces spécifique de l'ADNc vg1 (Gel de gauche) et une paire d amorces spécifique de l'ADNc vg51 (Gel de droite)
La colonne de gauche indique les positions de migrations de différents marqueurs de poids moléculaires connus
L'expérience a été réalisée sur des ARN messagers provenant respectivement, de la piste à I extrémité gauche à la ' is-te à I extrémité droite de chaque gel, du cœur, du cerveau, de la rate, du poumon , du foie, du muscle, du rem et des testicules
La Figure 4 illustre les résultats d'une expérience d'hybridation in situ sur une coupe histologique de cerveau de rat adulte mâle Sprague- Dawley avec respectivement une sonde nucléique spécifique des ARNm vg1 et vg3 et une sonde nucléique spécifique des ARNm vg41 et vg51
La Figure 5 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3- VG1 contenant l'insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg1, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI situés respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 4505 du vecteur
La Figure 6 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3- s VG3 contenant I insert nucléotidique correspondant à l'ADNc vg3 localise entre les deux sites de restriction EcoRI situes respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 51 15 du vecteur
La Figure 7 représente la construction graphique du vecteur pcDNA3- I O VG51 contenant l'insert nucléotidique correspondant a l'ADNc vg51 localise ent^ les deux sites de restriction EcoRI situes respectivement aux coordonnées nucléotidiques 938 et 2768 du vecteur
La Figure 8 représente la construction graphique du vecteur pBluescript I SK(-)-VG41 contenant l'insert nucléotidique correspondant a l'ADNc vg41, localisé entre les deux sites de restriction EcoRI indiques sur la carte du vecteur
La Figure 9 illustre les résultats d'une expérience de détection immuno- 20 autoradiographique sur une coupe histologique de cerveau de rat avec des anticorps diriges respectivement contre les polypeptides VG1 et VG51
La Figure 10 représente les résultats du test Biacore de fixation du Bleu
25 Trypan au polypeptide VG51
En ordonnées, représentation de l'intensité du signal de résonance plasmonique reflétant le nombre de molécules de Bleu Trypan fixées a un temps t au polypeptide VG51 préalablement immobilisé sur un support
30 En abscisses, temps de l'expérience en secondes La partie gπsee correspond au moment pendant lequel le Bleu Trypan, a la concentration de 0 1 mM, a été mis en contact avec le polypeptide VG51 immobilise sur le support
La Figure 11 est un cliché de microscopie électronique montrant la localisation ultrastructurale du polypeptide VG51 dans I hippocampe de rat Les points de coloration noire dense représentent les localisations de la protéine VG51
Sur le cliché supérieur on peut observer la localisation du polypeptide VG51 dans un compartiment cytoplasmique des cellules pyramidales de la couche CA3 pyramidal de l'hippocampe de rat
Sur le cliché inférieur gauche, on observe la localisation du polypeptide
VG51 sur la membrane des dendntes
Sur le cliché inférieur droit, on observe la localisation du polypeptide VG51 sur la membrane des axones
La Figure 12 illustre l'activité de transport (internalisation) du GABA par des cellules d-e la lignée COS-7 transfectées par un vecteur contenant un insert nucléotidique codant pour le polypeptide VG51 (désigné VG51 ) ou par un vecteur dépourvu d'insert nucléotidique (désigne pcDNA3)
La Figure 12 A illustre I activité de transport du GABA par les cellules transfectées et cultivées dans un milieu de culture ajuste à des pH allant de 5,5 à 8 La Figure 12B illustre I activité de transport du GABA par les cellules transfectées et cultivées dans un milieu de culture ajusté à pH 5,4, en présence ou en l'absence respectivement de NaCI, LiCI ou ChoCI (chlorure de choline)
La Figure 12C illustre I activité de transport du GABA par les cellules transfectées et cultivées dans un milieu de culture ajusté à pH 7, en présence ou en l'absence respectivement de NaCI, LiCI ou ChoCI (chlorure de choline)
La figure 13 illustre la séquence nucléotidique SEQ ID N°32 codant pour le polypeptide hVG51 (ligne supérieure) ainsi que la séquence en acides aminés SEQ ID N°21 du polypeptide hVG51 (ligne inférieure) Exemples
Exemple 1 : Profil d'expression des transcrits vg1 et vg51 dans différents tissus.
Deux fragments d'ADN ont été amplifiés par PCR en utilisant pour matrice soit VG1/3 (eniron 500bp, amorce en 5 - aga cca cag tgg tcg ttt cg (SEQ ID NO 15) et en 3' = act gat aca ace aca tgt ce (SEQ ID NO 16) soit VG51/41 (environ 950bp, amorce en 5' = aca ggt gat aga ggc age caa cgg (SEQ ID NO 17) et en 3' = cac tgg tgg aat tgg tag agg agt (SEQ ID NO 18)). Ils ont été purifiés puis radiomarqués au 32p par niC\ translation
(Boerhmger) Un northern blot contenant 2 μg d'ARNm polyA+ provenant de 8 tissus de rats différents (coeur, cerveau, rate poumon, foie muscle, rem, testicules Clontech) est hybride avec chacune des deux sondes (une nuit à 68°C) puis lavé jusqu'à une stringence finale de 0,1 X SSC a 42°C La membrane est alors exposée à un film d'autoradiographie (b-max, Amersham) à -80°C (15 et 7 jours pour VG1 et VG51 respectivement) Les résultats sont exprimés sur la Figure 3
Les ARNm correspondant aux produits de transcription des gènes vg1 et vg51 sont de taille différente La taille des ARN messagers est de 7 et 5,5 kb respectivement pour vg1 et vg51 dans tous les tissus sauf dans les testicules ou un doublet autour de 2,5 kb est observé Les deux transcrits sont présents dans le cerveau ainsi que dans de nombreux autres tissus périphériques
Par ordre décroissant d'abondance, on trouve l ARNm de vg1 dans le poumon, la rate, le cerveau, le rein (quantité identique au cerveau) le cœur, le foie et le muscle
Par ordre décroissant d'abondance, on trouve l'ARNm de vg51 dans le cerveau, le foie le poumon (quantité identique au foie), le rein, la rate (quantité identique au rem), le cœur et le muscle (quantité identique au cœur)
Ces expériences montrent que VG1/3 et VG51/41 ont des messagers de différentes tailles, exprimés dans différents types de tissus II faut remarquer que l'ARNm de VG51/41 est exprime principalement dans le cerveau
Exemple 2 : Détection de l'expression des transcrits vg1/vg3 et vg41/vg51 par hybridation in situ sur des coupes histologiques de cerveau de rats adultes mâles.
Le cerveau de rats adultes mâles (Sprague-Dawley, 250-300g) est rapidement dissèque et congelé dans l'isopentane a -30°C Des sections sagittales (10μm) sont prélevées à -20°C à l'aide d'un cryostat, montées sur des lames de verre, fixées au paraformaldehyde (4%o dans du tampon phosphate de sodium 0.12M pH 7,5) déshydratés dans des bains d'alcool (50% et 70%) et stockées à -80°C jusqu'à leur utilisation Les oligonucleotides antisens (VG1/VG3 cac ttc tcc tct cac aga ctt gag aca gat (SEQ ID NO 19), VG51/41 tct ggg agg cgc cat cag caa ctg ctg tag (SEQ ID NO 20)) sont radiomarqués au 35s par la terminal transférase (Tdt 14U, Amersham) Pour cela, 30ng de chaque oligonucléotide sont incubés en présence de [a-S35]dATP (20μcι) pendant 45 minutes à 37°C La réaction est stoppée par addition d'EDTA puis les oligonucléotides marqués sont purifiés sur résine de Biogel P10 (Biorad), repris (0,2pmoles de sondes/50μl) dans du tampon d'hybridation (Amersham) en présence de formamide (40%) de dithiotreitol (DTT, 200mM) et de polyA (1 mg/ml) Les sections sont incubées 15h à 42°C puis l'excès de sonde est élimine par lavages (1 - 1X SSC, 53X, 2x15 mm, 2- 0,5X SSC, 53°C, 2x15mιn et 3- 0,5X SSC température ambiante 1 x15mιn, tous les tampons contiennent 10mM de DTT) Les lames sont rincées rapidement dans un bain d'ethanol (96%) séchées ef exposées en autoradiographie (film b-max, Amersham) pendant 2 mois
Les résultats sont représentés sur le Figure 4
Les résultats de l'expérience d'hybridation in situ montre que les gènes exprimant les ARN messagers vg1 et vg51 sont transcrits dans des neurones connus pour leur nature glutamatergique, tels que les cellules pyramidales, du cortex ou de l'hippocampe ou encore les cellules granulaires de l'hippocampe et du cervelet (Figure 4)
Dans le cerveau l'ARNm de VG1/3 est peu abondant Celui codant pour VG51/41 est plus abondant et présente un marquage plus contraste On retrouve les deux transcrits dans des régions très riches en neurones glutamatergiques (cortex, hippocampe, thalamus)
Exemple 3 : Préparation d'antisera dirigés respectivement contre VG1/VG3 et VG41/VG51.
Des peptides synthétiques dérivés de la séquence de VG1/3 (VG1 -1 NH2-EAPAPEAAGCEELDMDVMRP-COOH (SEQ ID NO 6) VG1 -2 NH2-CEEQEQTLLPMQKHYQLDGHQ-COOH (SEQ ID N07), VG1-4 NH2-CENQMRESKRFPQALN-COOH (SEQ ID NO 8)) et de VG51/41 (VG51 -1 NH2-SSTSDVSPEESPSEGLG-CONH2 (SEQ ID NO 9), VG51 -2 NH2-RRLNKPFLDYGDTVC-CONH2 (SEQ ID NO 10)) ont été conjugués à l'hémocyanine de patelle (KLH) et injectés à des lapins
^ par la société Eurogentec Les critères ayant conduit au choix de ces différents peptides sont les suivants:
-1 ) pas de séquences similaires chez les mamifères après recherche d'homologie dans les banques de données (GenBank SwissProt) et io -2) séquences hydrophiles et antigeniques
Les saignements ont été décomplementes par chauffage à 56°C (30 minutes), dialyses contre un grand volume de NaCI à 97oo puis dilués dans du glycerol (50%) et stockés à -20CC D'autre part après la saignée finale, les meilleurs antisérum dirigés contre VG1/3 ou VG51/41 ι ont été purifiés sur des colonnes d'Affιgel-10 ou -15 (Biorad, selon leurs points isoelectπques) couplées aux différents peptides
Exemple 4 : Transfection de cellules de la lignée de rein humaine HEK-293 par les vecteurs selon l'invention et détection des 20 polypeptides recombinants produits.
a) Transfection des cellules
Les cellules sont cultivées à 37°C (sous une atmosphère constante de 7% Cθ2 93% air) dans du milieu de culture GIBCO Lorsqu'elle parviennent a 50% de confluence elles sont transfectées par 25 les vecteurs d'expressions pcDNA3-VG1 (Figure 5) pcDNA3-VG3 (Figure 6) ou -pcDNA3-VG51 (Figure 7)
Pour l'étape de transfection des cellules , 5 μg d'ADN sont pre- incubés avec du CaCl2 0,25 mM Cette solution est additionnée de NaH2Pθ4 (0,75 mM final) pour former un précipité de phosphate de calcium/ADN (1 minute à température ambiante).
Le précipité, dilué dans du milieu de culture en absence de sérum foetal(SVF) de veau, est placé sur les cellules. Après une incubation de 5 2-3 heures, dans l'étuve le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant du SVF.
b) Détection par immunofluorescence des polypeptides recombinants produits par les cellules transfectées. i o L'expérience suivante se déroule à température ambiante. Trois jours après la transfection, les cellules sont lavées par du tampon PBS (PBS; MgCl2 0,1 mM; CaCl2 0,1 mM) puis fixées 10 min dans du paraformaldéhyde (PAF 4% dans du PBS). Après 3 lavages de 10 min. les cellules sont perméabilisées (20 min) dans le tampon
15 d'immunofluorescence (tampon IF: Triton X100 0,25%; sérum normal d'âne 3%) et incubées 1-2 heure avec l'anticorps primaire dilué dans le tampon IF (1/1000ème). Après 3 lavages supplémentaires l'anticorps secondaire (IgG d'âne anti-lapin conjugués avec le CY3. Jackson) dilué dans le tampon IF (1/800ème) est ajouté sur les cellules. Les lames sont
20 rincées trois fois et montées en milieu Vectashield (Vector). L'immunofluorescence est observée à l'aide d'un photomicroscope (Leica) ou un microscope confocal (Molecular Dynamics).
Ce travail a permis d'établir, d'une part, la spécificité des antiséra produits conformément à l'Exemple 3 et, d'autre part, de confimer la
25 présence de VG1/3 et de VG51/41 dans un compartiment intracellulaire de type vésiculaire dans les cellules recombinantes de la lignée HEK-
293, ainsi que dans des neurones culture. Exemple 5 : Détection immuno-autoradiographique de la production des polypeptides VG1/VG3 et VG41/VG51 sur des coupes histologiques de cerveau de rats.
Des rats adultes mâles (Sprague-Dawley, 250-300g) sont
^ anesthésies avec de l'hydrate de chloral (350mg/kg, i p ) et perfusés via l'aorte ascendante avec 200 ml d'une solution de NaCI à 9g/l contenant du nitnte de sodium (1 g/l) Le cerveau est ensuite rapidement prélevé et congelé dans l'isopentane à -30°C Des coupes sagittales de 10μm sont obtenues à l'aide d'un cryostat et montées sur des lames de verre La i o suite de l'expérience se déroule entièrement à 20°C Les échantillons sont incubés avec du tampon IAR (PBS contenant de la 3% de sérum albumine bovine (BSA) et 1 % de sérum d'âne) pendant 30 minutes puis avec du tampon IAR contenant les différents antisérum (généralement au 1/1000ème) Au bout de 2-4 heures les coupes sont lavées dans du
I PBS (3x10 minutes) puis immergées 1 heure dans du tampon IAR contenant des [125|]|gG_ant, |gQ de |ap,n (0,2μcι/ml) Après 4 lavages supplémentaires les lames sont séchées et exposées a un film autoradiographique (b-max, Amersham) pendant 3 jourε
Les résultats de I expérience sont représentés sur le cliché de la 20 Figure 9
Cette expérience a permis de montrer que les protéines VG1/3 et VG51 /41 sont bien traduites dans le cerveau. De plus leurs distributions régionales ont pu être déterminées sur le cliché d immuno- autoradiograpjhie de la Figure 9
25 En particulier, la protéine VG51 est très abondante dans les régions recevant une forte innervation glutamatergique telles que le cortex, l'hippocampe et le stπatum (voir Figure 9) Cette répartition de la production du polypeptide VG51 est donc accord avec les connaissances actuelles relatives à la localisation des régions d'innervation glutamatergique
^ Exemple 6 : Mesure en temps réel de l'interaction entre le polypeptide VG51 et un inhibiteur de recapture vésiculaire du glutamate.
Des inhibiteurs compétitif à haute affinité du transporteur vésiculaire du glutamate comme le bleu Trypan (IC50 50nM) ont été io caractérises (Roseth et al , 1998)
La liaison de ces inhibiteurs sur le polypeptide VG51 a été étudiée en utilisant le phénomène de résonance piasmonique de surface comme signal de la liaison
Cette technologie, développée par la société Biacore, permet d'étudier | 5 les interactions moléculaires telles que protéine-ligand ou protéine- anticorps
Des cellules HEK-293 transfectées transitoirement avec le vecteur d'expression pcDNA3-VG51 ou pcDNA3-DAT (permettant l'expression du transporteur plasmique de la dopamme) sont détachées de leur
20 boites de culture homogénéisée dans du sucrose (0,32M) à l'aide d'un poter (Teflon/verre) et centrifugées à basse vitesse, de façon à éliminer les noyaux Les surnageants sont repris dans 4 volumes d'un tampon Hepes/NaCI (25mM pH 7,4, NaCI 120mM) et homogénéisés vigoureusement à l'aide d'un Polytron Les membranes des cellules
25 exprimant VG51 ou DAT sont fixées sur différents canaux d'une micropuce recouverte d'une surface hydrophobe (Sensor Chip L1 , débit 5μl/mιn, tampon Hepes/NaCI, température ambiante) à l'aide d'un Biacore 3000 (Biacore) Une solution de Bleu Trypan (0 1nM dans du tampon Hepes/NaCI) est alors injectée dans les canaux contenant soit VG51 soit le transporteur de la dopamme (DAT) La fixation du ligand est suivie en temps réel sur I appareil de détection (Sensogram)
Les résultats sont représentés sur la Figure 10
La courbe supérieure (VG51) montre le signal de fixation global de Bleu Trypan obtenu avec les membranes des cellules exprimant le polypeptide VG51 immobilise sur le support, ce signal incluant un bruit de fond dû à des interactions non spécifiques
La courbe médiane (DAT) montre le signal de fixation non spécifique du Bleu Trypan observe sur les membranes des cellules exprimant les molécules de transporteur plasmique de la dopamme (DAT)
La courbe inférieure est une illustration du signal obtenu reflétant les interactions spécifiques entre le Bleu Trypan et le polypeptide VG51 immobilise, la courbe ayant ete obtenue en retranchant, pour chaque temps de mesure la valeur du signal d'interactions non spécifiques observe avec DAT a la valeur globale du signal obtenu avec VG51
Cette expérience a permis de mesurer la liaison spécifique du Bleu Trypan sur VG51 et de calculer une valeur de Km de 10 12 M
Exemple 7 : Localisation du polypeptide VG51 dans l'hippocampe de rat.
A. Matériels et Méthodes
A.1 Expériences d'immunofluorescence Ces expériences sont réalisées dans les conditions décrites par
Masson et al [Neuroscience, 96, 627-637 (2000)] Des coupes de cerveaux (40μm) sont prélevées au cryostat, elles sont incubées avec l'antiserum primaire (une nuit à 4°C) puis avec l'antiserum secondaire (IgG anti IgG de lapin ou de souris conjugués au CY2 ou CY3 de chez Jackson, USA) dilué au 1 800e e Les images sont analysées à l'aide d'un microscope confocal Leitz
A.2 Microscopie électronique
Ces expériences sont réalisées dans les conditions décrites par Bernard ét al [J Neuroscience, 19, 10237-10249 (2000)]
B. Résultats
B.1 Localisation de VG51 dans l'hippocampe de rat par immunofluorescence
Par des expériences d'immunofluorescence réalisées en microscopie confocale sur des coupes histologiques d'hippocampe de rat à l'aide d'anticorps fluorescents spécifiques respectivement du polypeptide VG52, la calbmdme et la synaptophysme, on a montré que le polypeptide VG51 est rès concentré dans le striatum lucidum ainsi que dans la couche des cellules pyramidales Dans cette région, le polypeptide VG51 coloca se avec la calbmdme, qui est un marqueur des fibres moussues En revanche, le polypeptide VG51 n'est pas retrouvé à proximité de la synaptophysme qui est une protéine concentrée dans les terminaisons nerveuses des fibres moussues Les résultats des expériences d'immunofluorescence montrent que dans la région de l'hippocampe contenant la couche des cellules pyramidales (CA3), de grandes quantités du polypeptide VG51 sont présentes dans les axones des fibres moussues ainsi que dans les soma des cellules pyramidales (soma de CA3), mais pas dans le terminaisons nerveuses B.2 Localisation ultrastructurale du polypeptide VG51 dans l'hippocampe de rat.
Des coupes histologiques d'hippocampe de rat traitées pour une observation en microscopie électronique selon ma technique décrite par Bernard et al (2000)
Les résultats sont présentés sur les clichés de la Figure 1 1
Sur les microphotographies électroniques de la Figure 1 1 , les localisations du polypeptide VG51 sont visibles sous la formes de grains i o noirs denses
Les résultats montrent que le polypeptide VG51 est retrouve dans un compartiment cytoplasmique des cellules pyramidales de la couche CA3 (Cliché supérieur) sur la membrane des dendntes (Cliché inférieur droit) et sur la membrane des axones (Cliché inférieur gauche)
15
Exemple 8 : Etude du transport du GABA par des cellules recombinantes exprimant le polypeptide VG51. A. Matériels et méthodes
Transfection des cellules COS:
20 Les cellules COS (cultivées dans DMEM 4 5 g/l de glucose , sérum de veau fœtal 10% , L-glutamine 2mM , 37°C 5% C02) sont repiquées la veille de la transfection à raison de 50000 cellules par puits de 15 mm de diamètre
La transfection est réalisée par lipofection (Lipofectine, Life
25 Technologies) 3 μl de Lipofectine par puits de cellules sont incubés 30 minutes dans 135 μl de DMEM puis mélangés à 135 μl de DMEM contenant 1 μg d'ADN (pcDNA3 ou pcDNA3-VG51 ). Après 15 minutes d'incubation, le mélange est placé sur les cellules préalablement lavées avec 500 μl de DMEM Après 16 heures 1 ml de milieu complet (= avec
30 sérum) est ajouté par puits et l'incubation prolongée 24 ou 48 heures Mesure du transport du GABA
Les essais de transport sont réalisés 48 ou 72 heures après transfection Les cellules sont lavées 20 minutes dans un tampon Krebs- Rmger (Tp KR NaCI 146 mM KCl 3 mM , CaCI2 1 mM , MgCI2 1 mM Na2HP04 + NaH2P04 2mM pH 7,4) Les cellules sont ensuite incubées dans 200 μl de Tp KR additionne de 0 5 μCi de GABA radioactif puis le transport est arrête par aspiration du milieu SUIVI de 2 lavages rapides avec 500 μl de Tp KR glace Les cellules sont ensuite lysees dans 200 μl de NaOH 0,1 N et la quantité de GABA radioactif accumulée dans les cellules deterπinee par comptage
La détermination des caractéristiques du transport est réalisée en faisant varier différents paramètres lors de la phase d'accumulation temps (entre 5 minutes et 1 heure) , pH (entre 5,5 et 7,5) , quantité de GABA non radioactive , remplacement du Na+ par d'autres cations monovalents Lι+, Cholιne+)
B. Résultats
B.1 Effet du pH sur l'activité de transport de GABA de VG51 Les cellules COS-7 transfectées avec un vecteur pcDNA3 dépourvu d insert ou avec un vecteur contenant un insert nucléotidique codant pour le polypeptide VG51 ont été cultivées dans un milieu de culture ajuste a différents pH et la quantité de [3H] GABA a été mesurée reflétant l'activité de transport de GABA de VG51 Les résultats sont présentes sur la Figure 12 A
Les résultats montrent qu'une activité maximale de transport du GABA peut être observée pour des valeurs de pH compris entre 5,5 et 6 En revanche, une décroissance de l'activité de transport du GABA est observée à des pH supérieurs à 6, et en particulier au pH physiologique de 7,5 B.2 Influence de la présence de chlorure de sodium sur l'activité de transport de GABA de VG51
Les cellules COS-7 transfectées avec un vecteur pcDNA3 dépourvu d'msert ou avec un vecteur contenant un insert nucléotidique codant pour le polypeptide VG51 ont été cultivées dans un milieu de culture à pH 7,4 La mesure de recapture de GABA a été ensuite réalisée soit à pH 5,4 (Figure 12B), soit à pH 7 (Figure 12C), en présence de chlorure de sodium (NaCI), de chlorure de lithium (LiCI) ou de chlorure de cholme (ChoCI) en tant que sels du milieu de culture
Les résultats montrent qu'à pH 7,5, le transport de GABA est dépendant de la présence de sodium (Figure 12C) , alors qu'à pH 5,5 le transport de GABA est dépendant de la présence de protons.
REFERENCES
Beaucage et al , Tetrahedron Lett 1981 , 22 1859-1862
Bernard et al , 2000, J Neuroscience, 19, 10237-10249] Brown EL, Belagaje R Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol 1979,68 109-151
Compton J Nature 1991 Mar 7 350(6313) 91-92
Guatelli J C et al Proc Natl Acad Sa USA, 35 273-286
Hames BD and Higgins SJ, 1985, "Nucleic acid hybndization a practical approach , Hames and Higgins Ed , IRL Press, Oxford
Kohler G and Milstem C 1975 Nature, 256 495
Léger OJ, et al 1997, Hum Antibodies, 8(1 ) 3-16
Martmeau P, Jones P, Wmter G, 1998, J Mol Biol, 280(1 ) 1 17-127
Masson et al ,1999, Pharmacological Rev , 51 , 439-464 Masson et al , 2000 Neuroscience, 96, 627-637
Moghaddam B et al , 1998, Science, 281 1349-1352
Narang SA, Hsiung HM Brousseau R, Methods Enzymol 1979,68 90-98
O'Reilly et al , 1992, Baculovirus expression vectors a Laboratory Manual W H Freeman and Co New York Reimann KA, ét al , 1997, AIDS Res Hum Retroviruses 13(1 1 ) 933-943
Roseth S et al , Biochem Pharmacol, 56 1249-1249
Sagne C et al , 1997 FEBS Letters, 417 177-183
Sambrook, J Fπtsch, E F , and T Maniatis 1989 Molecular clonmg a laboratory manual 2ed Sanchez-Pescador R , 1988, J Clin Microbiol , 26(10) 1934-1938 Urdea M. S., 1988, Nucleic Acids Research, 11 : 4937-4957 Urdea MS et al., 1991 , Nucleic Acids Symp Ser., 24: 197-200. Walker et al. Clin. Chem. 42:9-13, 1996 White, M.B. ét al., Genomics 1997; 12:301 -306. Zuo J. et al., 1997, Nature, 388 : 769-773.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Polypeptide transporteur d'acides aminés dans les cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il possède une forte affinité pour un inhibiteur du transport du glutamate tel que le Bleu Trypan. ou un fragment peptidique de ce dernier.
2- Polypeptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide comprenant au moins 15 acides aminés consécutifs de l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 à SEQ
ID N0 5 et SEQ ID N° 21 ; b) un polypeptide ayant au moins 60% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide tel que défini en a) ; c) un polypeptide reconnu par un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide tel que défini en a) ou b).
3. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquence en acides aminés SEQ ID N°6 à 10.
4. Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1 1 à SEQ ID NO 14 et SEQ ID N° 22 à SEQ ID N° 32 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) un acide nucléique, ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini en a) ; c) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique tel que défini en a) ou b) .
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucleotide choisi parmi les séquences suivantes : a) la séquence allant du nucleotide en position 39 au nucleotide en position 1536 de la séquence SEQ ID NO 1 1 ; b) la séquence allant du nucleotide en position 392 au nucleotide en position 715 de la séquence SEQ ID NO 12 ; c) la séquence allant du nucleotide en position 756 au nucleotide en position 1862 de la séquence SEQ ID NO 12 ; d) la séquence allant du nucleotide en position 352 au nucleotide en position 1498 de la séquence SEQ ID NO 13 ; e) la séquence allant du nucleotide en position 105 au nucleotide en position 1529 de la séquence SEQ ID NO 14 ; ou un acide nucléique de séquence complémentaire aux séquences a) à e).
7. Sonde ou amorce nucléotidique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6.
8. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6.
9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur recombinant pcDNA3-VG1 contenu dans la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210.
10 Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur recombinant pcDNA3-VG51 contenu dans la souche de E coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209
1 1 Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une de revendications 4 à 6 ou un vecteur recombinant selon I une des revendications 8 à 10
12 Cellule hôte recombinante selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce qu'il s'agit des cellules de la souche de E coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorgaπismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès 1-2210
13 Cellule hôte recombinante selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce qu'il s'agit des cellules de la souche de E coli déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 21/05/1999 sous le numéro d'accès I-2209
14 Anticorps dirigé contre un polypeptide selon I une des revendications 1 à 3
15 Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de • a) mettre en contact un anticorps selon la revendication 14 avec l'échantillon à tester , b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé
16 Trousse ou kit de détection d'un polypeptide selon l une des revendications 1 ou 2 dans un échantillon, comprenant a) un anticorps selon la revendication 14 , b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection de complexe antigène/anticorps éventuellement formé
17 Procédé de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant les étapes de a) mettre en contact un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 avec la molécule candidate à tester , b) détecter le complexe polypeptide/molecule candidate éventuellement formé
18 Kit ou trousse pour le criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 comprenant a) un polypeptide selon I une des revendications 1 ou 2 , b) le cas échéant, les reactifs nécessaires à la détec on du complexe polypeptide/molecule candidate éventuellement formé
19 Procédé de détection d'un acide nucléique selon l une des revendications 5 ou 6 dans un échantillon, comprenant les étapes de a) mettre en contact une sonde nucléotidique selon la revendication 7 avec l'échantillon a tester , b) détecter la présence d'un complexe éventuellement forme entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon
20 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la sonde nucléotidique est immobilisée sur un support.
21 Kit ou trousse de détection d'un acide nucléique selon l une des revendications 5 ou 6 dans un échantillon, comprenant a) une sonde nucléotidique selon la revendication 7 , b) le cas échéant, les reactifs nécessaires à la détection du complexe éventuellement formé entre la sonde et l'acide nucléique de l'échantillon
22 Kit ou trousse selon la revendication 21 , caractérisé en ce que la sonde nucléotidique est immobilisée sur un support
23 Procédé pour I amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire d'acides aminés comprenant les étapes suivantes a) mettre en contact un couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 7 , b) le cas échéant, détecter les acides nucléiques amplifiés
24 Kit ou trousse pour I amplification d'un acide nucléique codant pour un transporteur vésiculaire d'acides ammes comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 7 , b) le cas échéant, les reactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d amplification et/ou les moyens de détection des acides nucléiques amplifies
25 Procédé pour la production d'un polypeptide selon I invention comprenant les étapes suivantes a) transfecter une cellule hôte appropriée, dans laquelle l'expression du polypeptide est recherchée , avec un vecteur recombinant selon I une des revendications 8 à 10, b) cultiver la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) dans un milieu de culture approprié , c) récupérer le polypeptide recombinant produit par la cellule hôte recombinante dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire de la cellule hôte cultivée a l'étape b) ; d) le cas échéant, purifier le polypeptide recombinant présent dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant obtenu à l'étape c) ou d)
26 Procédé de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire d acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) obtenir des vésicules membranaires ou des vésicules intracellulaires de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon I une des revendications 8 à 10 , b) introduire dans les vésicules obtenues à I étapes a) un marqueur détectable sensibles aux conditions de pH ; c) mettre en contact les vésicules obtenues à l'étape b) avec une molécule candidate a tester , d) mesurer les modifications de pH intra-vésiculaires
20
27. Kit ou trousse pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de molécules candidates inhibant ou activant le transport vésiculaire d'acides aminés, un tel kit comprenant a) des vésicules intra-cellulaires ou des vésicules membranaires
T. obtenues à partir de cellules transfectées avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 8 à 10, b) le cas échéant, un marqueur détectable sensible aux conditions de PH
30
PCT/FR2000/001383 1999-05-21 2000-05-19 Polypeptides, transporteurs vesiculaires du glutamate et du gaba WO2000071709A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR99/06525 1999-05-21
FR9906525A FR2795074A1 (fr) 1999-05-21 1999-05-21 Polypeptides transporteurs d'acides amines, et en particulier du glutamate, et procedes de criblage de composes inhibiteurs ou activateurs de l'activite de transport

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000071709A1 true WO2000071709A1 (fr) 2000-11-30

Family

ID=9545910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2000/001383 WO2000071709A1 (fr) 1999-05-21 2000-05-19 Polypeptides, transporteurs vesiculaires du glutamate et du gaba

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2795074A1 (fr)
WO (1) WO2000071709A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002048367A2 (fr) * 2000-12-12 2002-06-20 Pe Corporation (Ny) Proteines transporteuses humaines isolees, molecules d'acides nucleiques codant pour des proteines transporteuses humaines, et leurs utilisations
WO2002048363A2 (fr) * 2000-12-12 2002-06-20 Pe Corporation (Ny) Proteines de transport humaines isolees, molecules d'acide nucleique codant des proteines de transport humaines, et leur utilisation
WO2002076174A2 (fr) * 2001-01-22 2002-10-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Fbh58295fl, nouveau transporteur d'acide amine humain et utilisations associees
US7108972B2 (en) 2001-02-21 2006-09-19 Curagen Corporation Proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995022626A1 (fr) * 1994-02-21 1995-08-24 Stichting Researchfonds Pathologie Detection du virus du papillome humain dans un procede d'amplification d'acide nucleique a l'aide d'amorces generales
EP0679716A1 (fr) * 1993-11-12 1995-11-02 Kenichi Matsubara Signature genique
WO1996029413A2 (fr) * 1995-03-22 1996-09-26 Merck & Co., Inc. Adn codant le virus du papillome de type 18 humain
WO1999053949A2 (fr) * 1998-04-23 1999-10-28 Arch Development Corporation Adjuvants faisant office de vaccins permettant l'immunisation contre les melanomes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0679716A1 (fr) * 1993-11-12 1995-11-02 Kenichi Matsubara Signature genique
WO1995022626A1 (fr) * 1994-02-21 1995-08-24 Stichting Researchfonds Pathologie Detection du virus du papillome humain dans un procede d'amplification d'acide nucleique a l'aide d'amorces generales
WO1996029413A2 (fr) * 1995-03-22 1996-09-26 Merck & Co., Inc. Adn codant le virus du papillome de type 18 humain
WO1999053949A2 (fr) * 1998-04-23 1999-10-28 Arch Development Corporation Adjuvants faisant office de vaccins permettant l'immunisation contre les melanomes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL EBI, Hinxton, UK; "DOE joint genome Institute", XP002132817 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002048367A2 (fr) * 2000-12-12 2002-06-20 Pe Corporation (Ny) Proteines transporteuses humaines isolees, molecules d'acides nucleiques codant pour des proteines transporteuses humaines, et leurs utilisations
WO2002048363A2 (fr) * 2000-12-12 2002-06-20 Pe Corporation (Ny) Proteines de transport humaines isolees, molecules d'acide nucleique codant des proteines de transport humaines, et leur utilisation
WO2002048363A3 (fr) * 2000-12-12 2003-03-13 Pe Corp Ny Proteines de transport humaines isolees, molecules d'acide nucleique codant des proteines de transport humaines, et leur utilisation
WO2002048367A3 (fr) * 2000-12-12 2003-04-24 Pe Corp Ny Proteines transporteuses humaines isolees, molecules d'acides nucleiques codant pour des proteines transporteuses humaines, et leurs utilisations
WO2002076174A2 (fr) * 2001-01-22 2002-10-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Fbh58295fl, nouveau transporteur d'acide amine humain et utilisations associees
WO2002076174A3 (fr) * 2001-01-22 2002-11-14 Millennium Pharm Inc Fbh58295fl, nouveau transporteur d'acide amine humain et utilisations associees
US7108972B2 (en) 2001-02-21 2006-09-19 Curagen Corporation Proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
FR2795074A1 (fr) 2000-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Taylor et al. Structure-function analysis of HKE4, a member of the new LIV-1 subfamily of zinc transporters
JP4118877B2 (ja) 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子
US20110288034A1 (en) Methods of identifying adipocyte specific genes, the genes identified, and their uses
CA2379336A1 (fr) Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
CA2506331C (fr) Proteine specifique des cellules pancreatiques beta des ilots de langerhans et ses applications
JPH09503913A (ja) ヒト代謝向性グルタミン酸受容体サブタイプ（ｈｍｒ４，ｈｍｒ６，ｈｍｒ７）および関連ｄｎａ化合物
JPH07507446A (ja) タウリン及びｇａｂａの輸送体をコードするｄｎａ並びにその使用
US5476782A (en) DNA encoding a human 5-HT1E receptor and uses thereof
JP2002514882A (ja) グリシン輸送体をコードするｄｎａおよびその使用
WO2000077203A1 (fr) Proteine de la famille des lipocalines
WO2000071709A1 (fr) Polypeptides, transporteurs vesiculaires du glutamate et du gaba
FR2759701A1 (fr) Utilisation des proteines ulip dans le diagnostic et la therapie des cancers et des syndromes neurologiques paraneoplasiques
WO2006082826A1 (fr) PROCEDE D’IDENTIFICATION D’UN GENE Corl2 CIBLANT LES CELLULES DE PURKINJE
BE1014938A4 (fr) Sequence d'adn codant pour une proteine de canal sodique, sa production et son utilisation.
WO2003045998A2 (fr) Polynucléotide et protéine impliqués dans la synaptogenèse, variants de ceux-ci, et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques.
CA2401438C (fr) Nouvelle proteine ulip/crmp humaine et son utilisation dans le diagnostic et la therapie des cancers et des syndromes neurologiques paraneoplasiques
JP2000023680A (ja) 昆虫アセチルコリン受容体サブユニットをコ―ドする核酸
Vincent et al. G protine mRNA expression in immunohistochemically identified dopaminergic and noradrenergic neurons in the rat brain
JP4085117B2 (ja) 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子
JPWO2004048573A1 (ja) 哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ遺伝子
WO2000078948A2 (fr) Clonage, expression et caracterisation d'un adnc codant pour un recepteur gamma-hydroxybutyrate (ghb) de cerveau de rat
EP1257642A1 (fr) Partenaires du domaine ptb1 de fe65, preparation et utilisations
JP2001333775A (ja) キネシンスーパーファミリーモーター蛋白質ｋｉｆ１７
WO2002036630A2 (fr) Proteine recepteur de la renine et/ou de la prorenine, acide nucleique codant pour ce recepteur et leurs applications
WO2002046420A2 (fr) Proteine liee a la nebuline

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP