JPH09503913A

JPH09503913A - ヒト代謝向性グルタミン酸受容体サブタイプ（ｈｍｒ４，ｈｍｒ６，ｈｍｒ７）および関連ｄｎａ化合物

Info

Publication number: JPH09503913A
Application number: JP7509529A
Authority: JP
Inventors: ヨーゼフフロール，ペーター; クーン，ライナー; リンダウアー，クリスティン; ピートナー，イレーネ; クヌーフェル，トマス
Original assignee: チバ−ガイギーアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-09-20
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1997-04-22
Also published as: US6228610B1; US20020127638A1; DE69434166T2; HU9600692D0; FI961251A0; ATE522610T1; EP0720650B1; AU7615994A; EP1199359A1; CA2171206A1; DE69434166D1; US20030113868A1; EP0720650A1; HUT74247A; FI961251A; AU695641B2; NO961115D0; WO1995008627A1; US6515107B2; EP1199359B1

Abstract

(57)【要約】この発明はヒト代謝向性グルタミン酸受容体（hmGluR）タンパク質、分離されたそれらをコードする核酸、この発明のタンパク質を製造する宿主細胞、そのようなタンパク質、核酸および宿主細胞を製造する方法並びにそれらの使用に関する。更にこの発明はhmGluRに対する抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト代謝向性グルタミン酸受容体サブタイプ（HMR4，HMR6，HMR7）および関連DN A化合物この発明はヒト代謝向性（metabotropic）グルタミン酸（glutamate）受容体（hmGluR）タンパク質、単離されたそれらをコードする核酸、この発明のタンパク質を製造する宿主細胞、そのようなタンパク質、核酸および宿主細胞を製造する方法、およびそれらの使用に関する。さらに、この発明は、この発明のhmGluR タンパク質に対する抗体を提供する。グルタミン酸リガンドの結合によって受容体に連結するＧ−タンパク質（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）の類に属する代謝向性グルタミン酸受容体は、カルシウムイオン、環状ヌクレオチド、ジアシルグリセロールおよび１，４，５−トリリン酸イノシトールのような細胞内の第２メッセンジャーシステムを経て、細胞外のシグナルを生理的応答に交換することができる。大きな細胞外アミノ末端ドメインが先に立ち、そして大きなカルボキシ末端ドメインが後に続くという、７つの推定されたトランスメンブランにわたるセグメントを持つという共通の構造により、代謝向性グルタミン酸受容体によって特徴づけられる。アミノ酸レベルでの配列の一致性の程度に基づいて、mGluRの類は、個々の受容体サブタイプ（中西、「Science」597-603(1992)）を含んでなる異なったサブファミリーに分類することができる。各mGluRサブタイプ(subtype)は個有の遺伝子によりコードされる。個々のmGluRサブタイプの、異なったサブファミリーの他のサブタイプに対する相同性を考えると、アミノ酸配列の一致性は約50％よりは少ない。サブファミリーの内では、配列の一致性の程度は一般に約70％よりも少ない。このように、特定のサブタイプは、そのアミノ酸配列の他のmGluRサブタイプ、特に同じ哺乳類種のサブタイプ、に対する相同性によって特徴づけられる。さらに、特定のサブタイプは、その領域または組織分布、その細胞またはサブ細胞発現パターンまたはその正確な生理学上のプロフィール、たとえば、電気生理学および薬理学特性、によって特徴づけることができる。アミノ酸Ｌ−グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質であるから、グルタミン酸のシステムは、いくつかの神経単位変性の異常と同様に、速い興奮性シナプス伝達、神経伝達物質遊離の制御、長期間ポテンテーション(potentation)、学習と記憶、発達上のシナプスの柔軟性、低酸素虚血の損傷と神経細胞の死、てんかん性発作を含む、多数の神経単位の過程において重要な役割を演じると推定される。今日まで、ヒト代謝向性グルタミン酸受容体（hmGluR）サブタイプについての、たとえばそのアミノ酸配列または組織分布についての、どのような情報も利用できない、この知識の欠如は、グルタミン酸のシステムにおける欠点に帰すことができる任意の異常性に特異的に影響を与え得る、人間の治療薬をさがし求めることを妨げる。可能性のある生理学上および病理学上の代謝向性グルタミン酸受容体の重要性の点からみて、ヒト受容体サブタイプおよびこれらのタンパク質の電気生理学特性および薬理学の特性を明らかにするのに十分な量でこれらのサブタイプを製造する細胞に対するニーズがある。たとえば、薬のスクリーニングアッセイは、精製されたヒト受容体タンパク質を活性形で必要とするが、活性形はいまだに得られてはいない。この発明の目的は、このニーズを充足、すなわち、正確なhmGluRサブタイプ、それらをコードする核酸およびそのようなサブタイプを製造する宿主細胞を提供するものである。とりわけ、この発明は hmGluR4を示すサブタイプを含むhmGluRサブファミリーおよび上記サブファミリーの個々のタンパク質を開示する。以下のように、上記サブファミリーはhmGluR 4サブファミリーに関する。他のhmGluRサブファミリーに反して、このサブファミリーのメンバーは、Ｌ−２−アミノ−４−ホスホブタン酸によって強く活性化され、たとえばチャイニーズハムスターの卵巣または赤ちゃんハムスターの腎臓中に発現されたとき、Ｇタンパク質を経てアデニル酸シクラーゼにネガティブに連結される。この発明の組換え体hmGluRサブタイプを含むシステムをhmGluR活性の薬剤のスクリーニングに用いることは、（中でも）増大した受容体サブタイプ特異性と同様に（もしかするとより大きな生化学的および病気特異性に起因して）、試薬の大生産量を与える、細胞当りの大量の受容体およびアッセイにおけるノイズの割合に対するより高度なシグナルを達成する可能性を提供する。具体的には、この発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号：２に述べられているアミノ酸配列を有するhmGluR4の配列と約65％以上同一であることで特徴づけられるhmGluRサブタイプに関する。この発明によると、「hmGluRサブタイプ」なる表現は、精製されたタンパク質に関し、そのタンパク質は、Ｇタンパク質連結受容体の類に属し、グルタミン酸作動性(glutamatergic)リガンドの結合によって、細胞内の第２メッセンジャーシステムを経て、細胞外シグナルを変換する。このような場合この発明のサブタイプは、それが環状ヌクレオチド（cAMP，cGMP）のレベルを変更することにより特徴づけられる。あるいはシグナルの変換は、この発明の受容体サブタイプと、たとえばイオンチャンネルまたは他の受容体のような他の膜タンパク質と連結したＧタンパク質の直接的な相互作用を経て起こるのかもしれない。この発明の受容体サブタイプは、他の代謝向性グルタミン酸受容体をコードしない、正確な遺伝子によってコードされていると信じられる。この発明の特定のサブタイプは、正確な生理学のプロフィール、好ましくはそのシグナル変換および薬理学特性によって特徴づけられ得る。薬理学特性は、たとえば、アゴニストおよびアンタゴニスト応答に対する選択性である。この明細書において定義する場合グルタミン酸リガンドはグルタミン酸様の態様でhmGluRと相互作用し、そして特にそれと結合する、Ｌ−グルタミン酸または他の化合物、たとえばACPD（１Ｓ，３Ｒ−１−アミノシクロペンタン−１，３− ジカルボン酸），QUIS（キスカル酸）のようなACPD様リガンド、AP4およびその類似物である。他のリガンド、たとえば、（Ｐ，Ｓ）−α−メチルカルボキシフェニルグリシン（MCPG）またはα−メチル−Ｌ−AP4は、この発明の受容体と、グルタミン酸作動性リガンドの結合が妨げられるような方法で相互作用する。以上の記載または以下の記載において用いられるように、「精製された」または「単離された」なる用語は、天然源からまたは遺伝子工学の方法によって得ることができる、濃厚化したまたは純粋な形のこの発明の分子を指すことを意図している。この発明の精製されたタンパク質、DNAおよびRNAは、タンパク質、DNAおよびR NAが天然に存在する場合にはそうではないが、この発明のhmGluRの発現または活性を選択的に調節する化合物の同定のような面で有用であろう。この発明の精製されたhmGluRは、hmGluR4サブファミリーのメンバーであることを意味し、該サブファミリーは同定されており、その天然環境の一つまたはそれよりも多い成分を欠く。精製されたhmGluRは、組換え細胞培養におけるこの発明の精製されたhmGluRを含む。この発明のサブタイプの濃厚型は、たとえばそのサブタイプを含む膜分画のような天然よりも高濃度でそのサブタイプを含有する標品(preparation)を指す。もし、そのサブタイプが純粋な型であるなら、本質的に他の高分子、特に天然源のタンパク質性の汚染がない。所望なら、この発明のサブタイプは溶解され得る。この発明の好ましい精製されたhmGluRサブタイプは組換えタンパク質である。好ましくは、この発明のサブタイプは、リガンド結合性とシグナル変換活性の両方を有するという意味での活性状態にある。受容体の活性は、当業界で既知の方法にしたがって、たとえば、結合アッセイまたは機能性アッセイ、たとえば、下記のアッセイを用いて測定される。 hmGluR4サブファミリーの好ましいhmGluRサブタイプは、hmGluR4，hmGluR7およびhmGluR6である。特に好ましいhmGluR4サブタイプは、配列番号：２に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質である。hmGluR7型タンパク質は、それぞれ配列番号：４，６，８および10に述べられているアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドを含み得る。このようなhmGluR 7サブタイプは好ましい。特に好ましいのは、それぞれ、配列番号：12および14 に示されているアミノ酸配列を有するhmGluR7サブタイプである。好ましいhmGlu R6型タンパク質は配列番号：16に述べられているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この発明は、さらに、この発明の受容体サブタイプの変異体を含むものである。たとえば、この発明のhmGluRサブタイプの変異体は、上記サブタイプの機能的または免疫学的同等物である。機能的同等物は、上記特定のサブタイプを特徴づけるプロフィールと本質的に一致する生理学的プロフィールを示すタンパク質、特にヒトタンパク質である。生体外のまたは生体内の生理学的プロフィールは、たとえばアゴニストまたはアンタゴニストとの相互作用である、受容体作動体機能、電気生理学特性および薬理学特性である。典型的な機能的同等物は、第１次転写体の選択的スプライシングによって生じたmRNAによってコードされたスプライス変異体、アミノ酸突然変異体およびグリコシル化変異体の三者であり得る。特定のhmGluRサブタイプの免疫学的同等物は上記サブタイプに対して特異的な抗体を生じ得るタンパク質またはペプチドである。受容体の細胞外ドメインの部分、たとえば、少くとも６から８アミノ酸、特に20アミノ酸からなるペプチドは、特に有用な免疫学的同等物と考えられている。ここに含まれるさらなる変異体は、膜結合した溶解性のフラグメントおよび他の化学物質成分との共有結合体または凝集結合体であって、これらの変異体は、たとえばリガンド結合性またはシグナル変換のような１またはそれよりも多い受容体機能を示す。この発明のhmGluRサブタイプのフラグメントは、それぞれ配列番号：４，６，８，10および16に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この発明のフラグメントは、天然源から得ることも化学合成または組換え技術によって得ることもできる。その内因性リガンドに対してこの発明の hmGluRサブタイプの内在性の対応物と競合する可能性があるため、リガンド結合性ドメインを含むフラグメントまたはそれらの誘導体は治療薬となることが想像される。共有結合誘導体は、たとえば受容体カルボキシル基の脂肪族エステルまたはアミド、水酸基含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体である。このような誘導体は、受容体タンパク質の側鎖およびＮおよびＣ末端に見い出される反応性基への機能性の結合によって製造され得る。この発明のタンパク質は、たとえば放射能標識、希土類キレートとの共有結合または蛍光性成分との接合などの検出できる基で標識され得る。さらなる誘導体は、この発明のタンパク質と他のタンパク質またはペプチドとの共有結合した結合体（融合タンパク質）である。例としては異なるグルタミン酸受容体の異なる部分を含んでなる融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、Ｇ−タンパク質の連結を変えることおよび／または機能的アッセイの感受性を改良するために有用であり得る。たとえば、このような融合タンパク質またはキメラ受容体においては、この発明のサブタイプの分子内ドメインは、他のmGluRサブタイプ、特にたとえば他のサブファミリーに属するhmGluRサブタイプである。他のhmGluRサブタイプの相当するドメインと置換され得る。特にこのようなキメラ受容体の構成に適当なものは、たとえばmGluR1（Masu他「Nature」 349，760-765）またはmGluR5である、ホスホリパーゼＣ／Ca²⁺シグナル経路を活性化する受容体の細胞内ドメインである。このような交換のために適当な細胞内ドメインは、たとえば第２の細胞内ループであって、またｉ２（Pin他「EMBOJ.1 3」342-348(1994)）に関連している。このように、試験化合物とこの発明の受容体のリガンド結合ドメインとの相互作用をカルシウムイオンのためのアッセイを用いて分析することができる。この発明のキメラ受容体は、組換え技術またはタンパク質の架橋のために適当であると当業界に既知である試薬によって合成され得る。凝集誘導体はたとえば、細胞膜との吸着複合体である。他の実施態様では、この発明は、この発明のhmGluRサブタイプを含んでなる物質の組成物に関する。この発明のタンパク質は、たとえば薬のスクリーニングアッセイにおける免疫源として、免疫分析のための試薬として、結合リガンドのためのアフィニティ精製のためのような精製方法において有用である。この発明のタンパク質は、たとえば脳組織からの単離によって天然源から得られるか、化学合成または組換え技術によって得られる。この発明は、この発明のhmGluRサブタイプを製造する方法を提供し、その方法は、この発明の受容体サブタイプを製造する適当な宿主細胞が試験管内または生体内で増殖するということにより特徴づけられる。好ましくは、宿主細胞は、プロモーターと上記サブタイプをコードするDNA配列（そのDNAは上記プロモーターによって調節されている）を含む発現カセットを含んでなるハイブリッドベクターで形質転換（トランスフェクト）される。続いて、この発明のhmGluRサブタイプは回収され得る。回収は、たとえばこの発明のサブタイプを宿主細胞から単離するか、サブタイプを含む宿主細胞を、たとえば、培養ブロスから単離することを含む。特に好ましいのは機能的に活性な受容体の製造のための方法である。 hmGluR突然変異物（mutein）は、この発明のhmGluRをコードするDNAであって、たとえば１またはそれよりも多いアミノ酸の付加、交換および／または削除に起因する生体外の突然変異誘発を受けたDNAから製造されるであろう。たとえば、この発明のhmGluRの置き換え、削除または挿入された変異体は、組換え法により製造され、そしてhmGluRの生来型との免疫交叉反応性についてスクリーニングされる。この発明のタンパク質は、また当業界で既知の通常の方法にしたがって、試験管内で誘導体にされる。適当な宿主細胞は、真核生物細胞、たとえば動物細胞、植物細胞および真菌、およびグラム陽性およびたとえば大腸菌である、グラム陰性菌のような原核細胞を含む。好ましい真核生物の宿主細胞は両生類または哺乳類起原のものである。この明細書に用いる場合、試験管内(in vitro)は生体の外へ(ex vivo)を意味し、たとえば細胞培養および組織培養条件を含む。この発明は更に精製された、好ましくは組換え体を含む核酸（DNA，RNA）、この発明のサブタイプをコードする核酸（DNA，RNA）またはこのような核酸のフラグメントに及ぶ。上述の組換えhmGluRタンパク質の製造に有用であることに加えて、かくのごとく、当業者が容易にこの発明のhmGluRタンパク質をコードする核酸を同定および／または単離することができるので、これらの核酸はプローブとして有用である。核酸は標識せずにまたは検出できる成分で標識されてもよい。さらにこの発明による核酸は、たとえばhmGluRの存在を決定する方法において有用であり、その方法はhmGluRをコードする（または相補的）DNA(またはRNA)を試験試料である核酸とハイブリダイズせしめ、hmGluRの存在を決定することを含む。この発明のhmGluRをコードする精製された核酸は、天然源のhmGluR核酸に通常は付随している少くとも１つの不純物核酸をも含んでいない核酸を含む。このように精製された核酸は、自然に見い出される形または背景以外で存在する。しかしながら、精製されたhmGluR核酸は通常hmGluRを発現する細胞中にあるhmGluRを包含し、その細胞ではその核酸は、自然の細胞の染色体位置とは異なった染色体の位置にあるか、または、さもなければ自然に見い出されるものとは異なったDN A配列に挟まれている。特に、この発明はこの発明のhmGluRをコードする精製されたもしくは単離されたDNA、またはそのようなDNAのフラグメントを提供する。定義によれば、そのようなDNAはコード一本鎖DNA、そのコードDNAおよびそれに相補的DNAからなる二本鎖DNA、またはこの相補的（一本鎖）DNA自身を含む。前記の好ましいhmGluRサブタイプをコードするDNAまたはそのフラグメントが好ましい。したがって、本発明はそのようなDNAを含んで成るDNAに関する。さらに詳細には、hmGluR4サブタイプまたはその部分をコードするDNA、特に配列番号：２に記載したアミノ酸配列を有するhmGluR4をコードするDNA、たとえば配列番号：１に記載したヌクレオチド配列をもつDNAは好ましい。hmGluR4の部分をコードする例示的なDNAフラグメントは、例に記載されるcDNA cmR20の部分をコードするhmGluR4である。等しく好ましいのは、hmGluR7サブタイプをコードするDNA、特にそれぞれ配列番号：12および14に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR7のいずれかをコードするDNA、たとえば、それぞれ配列番号：11および13に記載されているヌクレオチド配列を有するDNAである。この発明は、さらにhmGluR7サブタイプの部分、特に上記で好ましいとされたhmGluR7サブタイプをコードするDNAフラグメントを提供する。例示的なhmGluR7 DNAフラグメントは例に記載するような、cDNA のhmGluR7コード部分cmR2，cmR3，cmR5およびcR7PCR1、または受託番号DSM8550 の下に1993年９月13日にDSMに寄託されたプラスミドcmR2のhmGluR7コード部分によってコードされているのと本質的に同じアミノ酸配列をコードするDNAフラグメントである。これらのDNAはこの明細書に記載するhmGluR7サブタイプの推定スプライス変異体の部分をコードする。同様に好ましいのは、hmGluR6サブタイプまたはその部分をコードするDNA、特にhmGluR6サブタイプの部分をコードするDNA（そのアミノ酸配列は配列番号：16 に記載されている）または受託番号DSM8549の下に、1993年９月13日にDSMに寄託されたプラスミドcmR1のhmGluR6コード部分によってコードされているのと本質的に同じアミノ酸配列をコードするDNAである。典型的なDNA配列は配列番号：15に記載されている。この明細書に提供される核酸配列は、さらなるhmGluRサブタイプをコードする DNAを同定するのに用いられ得る。たとえば、この発明の核酸配列は、hmGluR4を含むサブファミリーに属するさらなるhmGluRサブタイプをコードするDNAの同定に用いられてもよい。このようなDNAを同定する方法はヒトDNAと上記の核酸プローブとを接触させ、そのプローブとハイブリダイズするDNAを同定することを含む。上記に代ってこの発明の例示的な核酸は、この発明のhmGluRサブタイプをコードし、配列番号：１，３，５，７，９，11，13または15に記載されているDNA配列またはそのDNA配列の選択された部分（フラグメント）とハイブリッドを形成する核酸として特徴づけられ得る。たとえば、ハイブリッド形成に有用な選択されたフラグメントは上記DNAのタンパク質をコードしている部分である。この発明のhmGluRをコードするDNAは、高ストリンジェンシーの条件のもとで、上述のD NAとハイブリッドを形成するものが好ましい。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、その条件のもとでポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。そのような条件は、当業者に明らかである。当業者にとって、ハイブリッドの安定性は、配列の相同性が１％減じるごとに約１〜1.5℃減じるというハイブリッドの融点（Tm）に反映される。一般にハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリッド形成反応はより高いストリンジェンシーの条件のもとに行なわれ、多様なストリンジェンシーの洗浄が続く。この明細書において、高ストリンジェンシーは、65−65℃で１ＭNa⁺において安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリッド形成を許容する条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、たとえば、６×SSC、５×デンハルツ（Denhardt's）、１％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1 Na⁺ピロリン酸塩および0.1mg／mlの非特異的競合体（compet itor）としての変性サケ精子DNAを含有する水溶液中でハイブリッド形成により提供され得る。ハイブリッド形成につづいて、最後の洗浄は（約３０分）ハイブリッド形成温度で、0.2−0.1×SSC、0.1％ SDS中である、高ストリンジェンシー洗浄が数段階行なわれてもよい。中程度のストリンジェンシーは、上記溶液中であるが、約60−62℃におけるハイブリッド形成と同等の条件を指す。その場合、最後の洗浄は、ハイブリッド形成温度で、１×SSC、0.1％ SDS中で実施される。低ストリンジェンシーは、上記溶液中であるが約50−52℃におけるハイブリッド形成と同等の条件を指す。その場合、最後の洗浄は、ハイブリッド形成温度で、２×SSC、0.1％ SDS中で実施される。これらの条件は、種々の緩衝液、たとえば、ホルムアミドベースの緩衝液および温度を用いて、適合され、および二重にされ得るものと理解される。デンハルツ溶液およびSSCは他の適当なハイブリッド形成緩衝液（たとえばSambrook，J. ，Fritsch，E.F.およびManiatis，T.の「Molecular Cloning：A Laboratory Man ual（第２版）」Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， USA（1989）またはF.M.，他の「Current Protocols in Molecular Biology」Gre ene and Wiley，USA (1993)参照）として、当業者に良く知られている。最適ハイブリッド形成条件は、プローブの長さとGC量が同様に役割を演ずるので、経験的に決定されねばならない。この発明の手引を与えると、この発明の核酸は当業界においてよく知られた方法で入手できる。この発明はさらに、このような核酸を製造するための方法に関する。たとえば、この発明のDNAは、化学的合成、組換えDNA技術またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって入手できる。組換えDNA技術は、適当なcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを含み得る。DNAの製造のためのこの発明の方法は数多くのオリゴヌクレオチドの合成、PCR法によるそれらの増幅および所望のD NAを得るためのそれらのスプライシングを含む。適当なライブラリーは、たとえば例において用いられたライブラリーは商業的に入手できるか、神経またはニューロン組織のサンプル、たとえば、海馬および小脳の組織、細胞系並びにその同等物から製造され得る。この発明の個々のhmGluRサブタイプ（およびスプライス変異体）のために、神経またはニューロン組織における発現パターンは変わり得る。このように、特定のサブタイプ（またはスプライス変異体）をコードするcDNAを単離するために、異なった適当な組織または細胞から製造されたライブラリーをスクリーニングするのが有利である。スクリーニングのプローブとして、この発明のhmGluRサブタイプの本質的に全コード領域を含むDNAもしくはRNA、またはそのDNAに基づく適当なオリゴヌクレオチドを用い得る。適当なオリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリッド形成を含むスクリーニングのための）は、配列番号：１，３，５，７，９，11，13および15のいずれかに記載されている、14またはそれよりも多い隣接する塩基の同じ（または相補的な）任意の少くとも14の隣接する塩基を含むヌクレオチドの配列を有する一本鎖のDNAまたはRNAである。プローブは、検出の準備のために適当な化学的成分で標識され得る。プローブとして選択される核酸配列は、にせの陽性の結果が最少になるように十分な長さと十分に明瞭となるべきである。プローブを構成する好ましい領域は、５′および／または３′コード配列、リガンド結合部位をコードすると予測された配列並びにその他同種のものを含む。たとえば、この明細書に開示されている全長さのcDNAまたはそのフラグメントのいづれかがプローブとして用いられ得る。好ましくは、この発明の核酸プローブは、ハイブリッド形成に基づく検出のための準備のため、適当な標識手段で標識される。たとえば、適当な標識手段は放射能標識である。DNAフラグメントの好ましい標識方法は、当業界で良く知られているように、ランダム開始反応においてDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いて³²Ｐ−標識α−dATPを導入することによるものである。オリゴヌクレオチドは、通常、³²Ｐ−標識γ−ATP およびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかしながら、たとえば酵素標識およびビオチニル化を含む他の方法（たとえば、非放射能活性）も同様にフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを標識するのに用いられ得る。ライブラリーのスクリーニングの後、たとえば、本質的に全hmGluRをコードする配列を含むDNAの部分またはそのDNAの部分をベースとする適当なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成シグナルを検出することにより陽性クローンが同定される。同定されたクローンは、制限酵素マッピングおよび／またはDNA配列分析によって特徴づけられ、次いで、たとえばこの明細書に記載されている配列と比較することによって、それらが完全なhmGluRをコードするDNAを含んでいるかどうか確認するために試験される（すなわち、もし、それらが翻訳、開始、終結コドンを含むなら）。もし選択されたクローンが不完全なら、それらは、重なり合うクローンを得るために、同じまたは異なったライブラリーを再スクリーニングするために用いられ得る。もし、そのライブラリーがゲノムであるなら、重なり合うクローンはエクソンとイントロンを含み得る。もし、そのライブラリーがcDNAライブラリーであるなら、重なりあうクローンはオープンリーディングフレームを含むであろう。いずれの場合にも完全なクローンは、この明細書に提供されているDNAおよび推測されたアミノ酸配列との比較により同定される。さらに、この発明の内因性hmGluRサブタイプのどんな異常性をも検出するため、ハイブリッド形成プローブとしてこの発明のヌクレオチド配列を用いてゲノムスクリーニングを実行することができる。同様に、この明細書に提供されている核酸配列に基づいて、アンチセンス型治療薬もデザインされ得る。この発明の核酸は、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの挿入またはヌクレオチドのストレッチの反転およびそれらのいずれかの組み合せによって容易に修飾され得ることが期待される。このような修飾された配列は、自然に見い出される受容体サブタイプとは異なる変異体を製造するのに用い得る。変異誘発は、前もって決められているか（部位−特異的）またはランダムであり得る。サイレント変異ではない、変異は、配列をリーディングフレームの外に置いてはならないし、ハイブリッドを形成してループまたはヘアピンのような第２のmRNA構造を形成することができるような相補的領域を生成しないのが好ましい。この発明の生来の、または変異体hmGluRをコードする、cDNAまたはゲノムDNA は、さらに操作するために、ベクターに挿入され得る。更に、この発明は、上述のDNAの少くとも１種を含むハイブリッドベクターである組換えDNAに関する。この発明のハイブリッドベクターは、複製開始点または自己複製配列、１またはそれより多い優性マーカー配列、並びに随意に、発現調節配列、シグナル配列および付加的な制限部位を含む。特にこの明細書に後で記載するが、好ましくは、この発明のハイブリッドベクターは、発現調節配列に作用可能に結合した、上記の核酸挿入断片を含む。ベクターは典型的には適合性の宿主細胞と共同して二つの作用を行う。一つの作用は、この発明のhmGluRサブタイプをコードする核酸のクローン化を容易にすること、すなわち使用に適した量の核酸を製造することである（クローニングベクター）。他の作用は、染色体外要素の維持または宿主染色体の中への統合のいずれかにより、適当な宿主の内で遺伝子構成物の複製および発現を提供することである。クローン化ベクターは、上記のように、DNA、複製開始点または自己複製配列、選択マーカー配列、並びに随意に、シグナル配列および付加的な制限部位を含む。発現ベクターは、付加的にこの発明のDNAの転写および翻訳に必須の発現調節配列を含む。したがって、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入するとクローン化DNAの発現を生じる組換えDNA構成体、たとえばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターを指す。適当な発現ベクターは当業界によく知られており、真核生物および／または原核生物の細胞において複製できるものを含む。ほとんどの発現ベクターは、少くとも１種の生物体の中で複製できるが、発現のために他の生物体へトランスフェクトされ得る。たとえば、ベクターが大腸菌の中でクローン化され、次いで、同じベクターが、宿主細胞の染色体から独立して複製することはできないとしても、酵母または哺乳類の細胞にトランスフェクトされる。DNAは、また、宿主のゲノムの中への挿入によっても増幅され得る。しかしながら、hmGluRをコードするゲノムDNAの回収は、hmGluR DNAを切除するのに制限酵素消化が必要であるという理由で、外因的に複製されたベクターの回収よりも複雑である。DNAはPCRによって増幅することができ、そしていかなる複製成分も伴わないで、宿主細胞へ直接にトランスフェクトされ得る。有利なことに、発現およびクローン化ベクターは、選択マーカーとも言われる選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培養培地において増殖する、形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、培地中で生存しないだろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒、たとえばアムピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに抵抗性を与え、栄養要求性の欠乏を補完し、または合成培地から得られない必須の栄養を供給するタンパク質をコードする。ベクターの増幅は大腸菌の中で行なわれるのが便利であるから、大腸菌の遺伝標識物質および大腸菌の複製開始領域は有利に含まれる。これらはpBR322のような大腸菌プラスミド、ブルースクリプト（Bluescript）ベクターまたはpUCプラスミドから得ることができる。哺乳類細胞のための適当な選択マーカーは、ジヒドロホレート還元酵素（DHFR 、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、もしくはG418またはヒグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子のようなhmGluR核酸を取り込む能力を有する(c ompetent)細胞の同定を可能にするものである。哺乳動物の細胞形質転換体はマーカーを取り込みそしてそれを発現している形質転換体のみが生存するのに適合された選択圧力のもとに置かれる。発現およびクローン化ベクターは、通常宿主生物によって認識され、hmGluR核酸へ作用可能に結合されるプロモーターを含有している。このようなプロモーターは、誘導的でもよく構成的であってもよい。プロモーターを源DNAから制限酵素消化によって除去し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、プロモーターはhm GluRをコードするDNAへ作用可能に結合される。生来のhmGluRプロモーター配列および多数の異種性プロモーターのいずれも増幅およびまたはhmGluR DNAの発現を指令するために用いられ得る。しかしながら、異種性プロモーターは、生来の hmGluRプロモーターに比較して一般により大きい転写および発現hmGluRの高収量という理由で、好ましい。原核生物の宿主と用いるのに適当なプロモーターは、たとえばβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp) プロモーターシステム並びにtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。それらのヌクレオチド配列は公表されているので、当業者は、任意の必要とする制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを用いて、hmGluRをコードするDNAに、それらを作用可能に結合させることができる。細菌系において使用するためのプロモーターもまた、一般に、hmGluRをコードする DNAに作用可能に結合したシャイン−デルガルノ配列を含むだろう。哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのhmGluR遺伝子の転写は、宿主細胞系と適合するプロモーター、たとえばウイルスのゲノムから誘導されたプロモーターによって調節され得る。真核生物の宿主細胞、特に哺乳動物の細胞におけるこの発明のhmGluRサブタイプの発現のために適当なプラスミドは、たとえばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター含有ベクター、RSVプロモーター含有ベクターおよびSV40プロモーター含有ベクターおよびMMTVLTRプロモーター含有ベクターである。それらの調節の性質に依存して、プロモーターは、実験の条件によって構成的または調節的であろう。この発明により高級真核生物による、hmGluRサブタイプをコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより、増大する。ベクターDNAの種々のDNAセグメントは、作用可能に結合される。すなわち、それらは隣接しており、お互いに機能的な関係に配置される。この発明によるベクターの構成には通常の連結反応技術を用いる。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントは、所望の型に切断、適合、再結合されて必要とされるプラスミドを生成する。所望なら、構成されたプラスミド中の、正しい配列を確認する分析は、当業者により知られた方法で実行される。発現ベクターを構成し、試験管内転写体を製造し、宿主細胞にDNAを導入し、hmGluRの発現および作用を評価するための分析を実行するための適当な方法は当業者に既知である。遺伝子の存在、複製および／または発現は、サンプルで直接に、たとえば、通常のサザンブロット、mRNAの転写の定量のためのノーザンブロット、ドットブロット（DNAまたはRNA分析）、in situハイブリッド形成、この明細書において提供されている配列に基づいた適切に標識されたプローブを用いて、結合アッセイ、免疫検出および機能アッセイによって、測定され得る。適当な方法は例中で詳細に記載したものを含む。当業者は、所望なら、これらの方法をどのように修正するか容易に重い浮かべるだろう。この発明は、さらに、この発明のhmGluR サブタイプを生産することができ、かつ、該サブタイプをコードする異種性（外来の）DNAを含む宿主細胞を提供する。この発明の核酸は、たとえば上述したような、適当な発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた広範囲の宿主細胞中で発現され得る。この発明の受容体（またはそれらの部分）はまた融合タンパク質としても発現され得る。組換え体細胞は次いで、この発明のDNAによってコードされたタンパク質が発現される条件で培養され得る。適当な原核生物は、真正細菌、たとえばグラム陰性生物体またはグラム陽性生物体、たとえば大腸菌K-12株、DH5αおよびHB101またはバチラスを含む。さらに、hmGluRをコードするベクターのために適当な宿主細胞は、真核微生物たとえば糸状菌または酵母、たとえばサッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces cere visiae）を含む。高級真核細胞は、昆虫、両生動物および脊椎動物の細胞、特に、哺乳類の細胞、たとえば神経芽細胞腫細胞系または繊維芽細胞誘導細胞系を含む。好ましい哺乳類の細胞系は、たとえばHEK293細胞、CHO細胞、CVI細胞、BHK 細胞、Ｌ細胞、LICPK-1細胞、GH3細胞、Ｌ細胞およびCOS細胞である。近年、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の普及は日常的な手順となってきた。この出願における宿主細胞は、宿主動物の中にある細胞と同様に試験管内培養における細胞を含む。この発明の活性な組換えhmGluRの発現のための適当な細胞は、有利に、内因性のまたは組換え体Ｇ−タンパク質を発現する。内因性の代謝向性のグルタミン酸受容体を生産するとしてもわずかしか生産しない細胞が好ましい。通常の方法によりDNAは安定に細胞に導入されるかまたは一時的に発現され得る。安定にトランスフェクトされた哺乳類の細胞は、選択マーカー遺伝子を有している発現ベクターにより、細胞に形質導入し、マーカー遺伝子を発現する細胞のために選択された条件のもとにトランスフェクトされた細胞を増殖させることによって製造される。一時的なトランスフェクタントを製造するために、哺乳類の細胞に、レポーター遺伝子をトランスフェクトしてトランスフェクション効率をモニターする。そのような安定なまたは一時的にトランスフェクトされた細胞を製造するために、細胞は、この発明のhmGluRを生成するために十分な量のhmGluRをコードする核酸をトランスフェクトされねばならない。この発明のhmGluRをコードするDNA の正確な量は実験的に決定され、そして特定の細胞およびアッセイのために、最適化され得る。この発明のDNAは、また、非−ヒト形質転換動物、特に形質転換された温血動物においても発現され得る。マウス、ラット、うさぎ、羊および豚を含む、トランスジェニック動物を製造する方法は当業界で既知であり、たとえばHammel他（「Nature」315，680-683，1985）によって開示されている。hmGluRをコードする本発明のDNAと適切に位置する発現調節配列を含有する発現ユニットは、受精卵の前核に導入される。導入はたとえばマイクロインジェクションによってなされるだろう。注入されたDNAの組込みは、たとえば、適当な組織サンプルからのDNA のブロット分析によって検出される。導入されたDNAは、動物の子孫に渡るように動物の胚系に導入されることが望ましい。好ましくは、トランスジェニック動物は、hmGluR配列を中断するように突然変異を目標化することにより開発させる。このような動物は、たとえば代謝における代謝向性受容体の役割を研究するために、有用である。さらに、ノックアウト動物はhmGluR配列中に突然変異を導入することによって開発され、それによってもはや機能的hmGluR遺伝子を発現しない動物を生じる。このようなノックアウト動物はたとえば代謝における代謝向性受容体の役割を研究するために有用である。ノックアウトマウスを製造する方法は当業界で既知である。宿主細胞は上記の発現またはクローン化ベクターにより形質導入または形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択または、所望の配列をコードする遺伝子を複製するために適当であるように改変した、通常の栄養倍地において培養される。異種性のDNAは、宿主細胞へ、リン酸カルシウム共沈技術、エレクトロポレーションまたはリポフェクチン（lipofectin）−仲介のような、当業界で既知の任意の方法によって、導入され得る。トランスフェクションの多数の方法が当業者に既知である。成功したトランスフェクションは、このベクターの作用のいかなるしるしでも宿主細胞に生じる時に認められる。形質転換は、用いられる特定の宿主細胞に対して適切な標準的技術を用いて達成される。クローン化DNAの適当な発現ベクターへの導入、プラスミドベクター、各々が１つまたはそれよりも多い別個の遺伝子をコードしているプラスミドベクターの組み合せまたは直線状DNAによる真核細胞へのトランスフェクションおよびトランスフェクトされた細胞の選択は当業界に既知である（たとえば、Sambrook他「 Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Second Edition」Cold Spring Har bor Laboratory Press (1989)参照。）。トランスフェクトまたは形質転換した細胞は、当業者に既知の倍地または培養法を用いて、好ましくは、DNAによりコードされたhmGluRが発現されるような条件のもとに培養される。適当な倍地の組成物は当業界において知られているので、容易に製造し得る。適当な培養倍地はまた商業的に入手できる。この明細書に提供されているDNAは、たとえば上記の、いかなる適当な宿主細胞においても発現され得るが、機能的なhmGluRをコードするDNAの発現のために好ましいのは、真核の発現系、特に哺乳類の発現系であって、商業的に入手できる系および他の当業界に既知の系を含むものである。この発明のヒトmGluR DNAはベクターの中に結合され、そしてこの発明の特定のhmGluRサブタイプまたはサブタイプの特異的組み合せを発現する、形質転換した細胞系を製造するために適当な宿主細胞に導入される。生じた細胞系は次いで、受容体アゴニスト、アンタゴニストまたはアロステリック調節剤の効果の再現可能な定性または定量分析のために十分な量で製造され得る。さらにmRNAはこの発明のサブタイプをコードするDNAの試験管内転写によって製造され得る。このmRNAはアフリカツメガエルの卵母細胞に注入され、そこでmRNAは活性な受容体サブタイプの合成を指示する。代りに、DNAをコードするサブタイプが直接卵母細胞に注入され得る。トランスフェクトされた哺乳類の細胞または注入された卵母細胞は次いでこの明細書の後の方で提供する薬物スクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。このような薬物は、この発明のhmGluRの病因と関連する病気に有用である。このような病気は、hmGluRによって優先的に仲介されるグルタミン酸の過剰反応に起因する、発作、てんかんおよび慢性神経発生病のような病気を含む。化合物と特異的なhmGluRサブタイプの特異的な相互反応を評価するのに有用なものは、この発明のhmGluRを発現する安定にトランスフェクトされた細胞系である。このように、この発明のhmGluRを発現する宿主細胞は、薬物のスクリーニングに有用であり、この発明のさらなる目的は、hmGluRの活性を調節する化合物またはシグナルを同定する方法を提供することであり、その方法はこの発明のhmGluR をコードする異種性のDNAを含有し、そこで機能的なhmGluRを生産する細胞を、そのhmGluRの活性を調節する能力を決定しようとする少くとも１つの化合物またはシグナルに暴露し、その後その調節により生じた細胞の変化をモニターする方法を含む。このようなアッセイは、この発明のhmGluRのアゴニスト、アンチアゴニスト、アロステリック調節剤の同定を可能にする。他の面では、この発明は、この発明のhmGluRの活性を調節する化合物を同定するためのアッセイに関し、そのようなアッセイは、この発明の活性hmGluRを発現し、そのhmGluRをコードする異種性のDNAを含有している細胞と、その受容体の活性を調節するために、その能力をテストすべき少くとも１種の化合物と接触させることおよび第２メッセンジャーレベルまたは受容体活性における差について細胞を分析することを含む。特にこの発明はこの発明のhmGluRの活性を調節する化合物を同定するためのアッセイを含む。そのアッセイは、この発明の活性hmGluRを発現し、そのhmGluRサブタイプをコードする異種性のDNAを含有する細胞と、その受容体の活性を調節する能力をテストすべき少くとも１種の化合物と接触させることおよびその細胞の第２メッセンジャー活性の生じる変化をモニターすることを含む。アッセイで得られた結果は、負の対照として適切なアッセイと比較される。アッセイ法は一般に種々の対照との比較を要する。受容体活性におけるまたは第２メッセンジャーレベルにおける変化は、もし、このような効果が、試験化合物がないと起こらないのなら、試験化合物によって引き起こされたといわれる。この発明の受容体サブタイプに関する試験化合物の影響は、もしこの効果が受容体を発現しない細胞では観察されないなら、その試験化合物によって仲介されたといわれる。この明細書において用いられているように、この発明のhmGluRの活性を調節する化合物またはシグナルは、細胞内でそのhmGluRによって調停される応答経路を変更する（そのhmGluRがない場合と比較して）化合物またはシグナルを指す。応答経路は、第２メッセンジャー濃度または酵素活性における変化に起因するか、または、受容体またはイオンチャンネルのような膜結合タンパク質の活性の変化に起因する、細胞外の剌激によって活性化される。たとえば、アデニル酸シクラーゼ応答経路、ホスホリパーゼＣ／細胞内カルシウムイオン応答経路またはイオンチャンネルへの連結を含む、多数の応答経路を利用できる。アデニル酸シクラーゼ活性を決定するアッセイは当業界によく知られ、そして、たとえば中島（Nakajima）他による「J．Biol．Chem.」267，2437-2442（1992）によって開示されたアッセイを含む。このように、この発明のhmGluRを発現する細胞は、化合物、特にグルタミン酸アゴニストまたはアンチアゴニストとして作用することができる低分子量化合物、の同定のために用いられ得る。1,000ダルトンよりも少ない低分子量分子が好ましい。この発明の文脈の内で、アゴニストは、受容体と相互作用ができ、Ｌ− グルタミン酸の作用をまねる分子を指すと理解される。特にグルタミン酸アゴニストは、この発明のhmGluRと相互作用する能力により特徴づけられ、それによって細胞内の応答経路の刺激を増加または減少する。たとえば、アゴニストは、自然のリガンドがそのパラメーターを増加または減少するように、宿主細胞内の測定可能なパラメーター、たとえば第２メッセンジャーの濃度を増加または減少する。たとえば、この発明のhmGluRが、アデニルシクラーゼとネガティブに結合するような適当な試験系、たとえばこの発明のhmGluRを発現するCHOまたはBHK細胞においてそのようなアゴニストは、細胞内のcAMPの濃度が減少するように、その hmGluRの作用を調節することができる。反対に、hmGluRの活性を下げることが望まれる状況においては、アンタゴニスト分子は有用である。この発明の文脈のなかで、アンタゴニストは、受容体またはＬ−グルタミン酸と相互作用できるが細胞内の応答経路を剌激しない分子を指すと理解される。特に、グルタミン酸アンタゴニストは一般にこの発明のhmGluRと相互作用する能力により同定され、それによって、たとえばこの発明のhmGluRへのＬ−グルタミン酸の結合を妨げまたは、hmGluRの活性のために必要とされる他の細胞作用を抑制することによって、細胞内応答経路を刺激する自然のリガンドの能力を減少する。たとえば、適当なアッセイ、たとえばこの発明のhmGluRを発現するCHOまたはBHK細胞を含むアッセイにおいて、グルタミン酸アンタゴニストは、自然のリガンドの細胞内cAMP濃度を減少する能力が弱められるように、この発明のhmGluRの活性を調節できる。今まだ、アンタゴニストの影響を達成する他の選択肢はアンチセンスhmGluR RNAの過発現に依存する。hmGluR⁴サブファミリー、たとえばhmGluR4，hmGluR6またはh mGluR7の受容体に選択的に作用するアゴニストまたはアンタゴニストが好ましい。特に有用なのは、他のいかなるサブタイプの活性に影響を与えることなく特定のhmGluRサブタイプの活性を特異的に調節するアゴニストまたはアンタゴニストである。この発明のhmGluRのアロステリック調節剤は、Ｌ−グルタミン酸とよりは、受容体タンパク質と他の部位で相互作用する。このようにして、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。だから、この明細書に記載されたアッセイは、また、この発明の受容体のアロステリック調節剤を検出するために有用である。たとえば、アゴニストとして作用するアロステリック調節剤はこの発明のhmGluR とＬ−グルタミン酸の間の特異的な相互作用を促進する。もし、アロステリック調節剤がアンタゴニストとしてふるまうなら、たとえばアゴニストの結合が機能的に効果が少ないような風に受容体タンパク質と相互作用し得る。グルタミン酸アゴニストまたはアンタゴニストのための試験管内アッセイは、この発明のhmGluRが組み換えDNAの方法を用いて、機能的な形で十分な量で製造されることを要するかもしれない。アッセイは、次いでhmGluRの機能的な特性、たとえば、グルタミン酸作動性リガントとの相互作用を測定するように設計される。この発明のhmGluRの生産は、もし、その受容体が測定できる応答を生じるなら、十分な量で起こるとみなされる。たとえば、哺乳類の細胞、たとえば、HEK293細胞、Ｌ細胞、CHO-K1細胞、LLCP K-1細胞またはGH３細胞（たとえばAmerican Tissue Type Culture Collectionから入手できる）は、グルタミン酸を減じた、好ましくはグルタミン酸のない、倍地で増殖するのに順応する。hmGluR発現プラスミド、たとえば例に記載されているプラスミドは、一時的に細胞に、たとえばカルシウム−ホスフェート沈殿によって、トランスフェクトされる（Ausubel，F.M.，他「Current Protocols in Mo lecular Biology」Greene and Wiley，USA (1993)）。この発明のhmGluRを安定に発現する細胞系は、たとえば、リポフェクチン−仲介のhmGluR発現プラスミドおよび選択的なマーカーを含むプラスミド、たとえば抗−Ｇ 418遺伝子をコードするプラスミドベクターであるpSV2-NEO（Southern and Berg「J．Mol．Appl．G enet.」1，327-341(1982)）により生成され得る。選別に生き残った細胞は単離され選択倍地において増殖される。耐性のクローン性細胞系は、たとえば、サブタイプ−特異的hmGluR抗体との免疫反応性について、またはアゴニスト付加に続くhmGluR機能応答についてのアッセイで分析される。所望のhmGluRサブタイプを製造する細胞は、この発明のhmGluRに結合する化合物を検出する方法において、またはグルタミン酸アゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法において用いられる。さらなる実施態様では、この発明はhmGluRサブタイプと結合する化合物を同定する方法を提供し、その方法はこの発明のhmGluRサブタイプを競合結合アッセイにおいて用いることを含む。主要な基礎をなす、競合結合アッセイは一般に当業界に既知である。簡単にいえば、この発明による結合アッセイは、そのhmGluR結合能力について試験されるべき化合物を、既知の適当に標識されたグルタミン酸リガンドと、hmGluR標的分子の結合部位に対して競合させることによって行なわれる。適当に標識されたリガンドは、たとえば、〔³Ｈ〕グルタ酸のような放射能標識されたリガンドまたは吸収または蛍光のような光学特性で検出され得るリガンドである。結合していないリガンドおよび試験化合物の除去後、hmGluRと結合した標識されたリガンドの量が測定される。もし、標識されたリガンドの量が、試験化合物の存在において減少しているなら、この化合物は標的分子に結合されたといわれる。競合結合アッセイはたとえば、この発明のhmGluR を発現する形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を用いて、またはこの発明のhmGluRを含む膜を形成する細胞の分画を用いて実行される。標的hmGluRに結合した化合物はhmGluRの機能的な特性を調節し、それでもって、機能的アッセイにおいてグルタミン酸アゴニストまたはアンタゴニストとして同定され得る。機能的アッセイは、この発明のhmGluRの機能的な活性における変化を検出するのに、すなわち、たとえばそのhmGluRと試験される化合物の相互作用の結果として、機能的応答を検出するのに用いられる。機能的な応答は、たとえば適当な第２メッセンジャーの濃度の変化（相違）またはこの発明の機能的なhmGluRを発現する細胞内でこの発明の受容体によって影響を受ける他の膜結合タンパク質の活性の変化（負対照との比較において）である。当業者は容易に活性なhmGluRの発現を指示する細胞内の第２メッセンジャーレベルの変化を検出するのに適当なアッセイ（機能アッセイ）を同定し得る。例はcAMPアッセイ（たとえば中島他「J．Biol．Chem.」267，2437-2442（1992）参照）、cGMP アッセイ（たとえばSteiner他「J．Biol．Chem.」247，1106-1113（1972）参照）、ホスファチジルイノシトール（PI）転倒アッセイ（中島他「J．Biol．Chem. 」267，2437-2442 (1992)）、カルシウムイオンフラックスアッセイ（Ito 他「J ．Neurochem．」56，531-540 (1991)）、アラキドン酸遊離アッセイ（たとえばF elder他「J．Biol．Chem.」264，20356-20362 (1989)）およびその他同様のもの、を含む。さらに詳細には、この発明によると、グルタミン酸アゴニストを検出する方法は、（ａ）化合物を、該化合物と受容体との相互作用および経路を介しての関連する応答を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、応答経路に関連した本発明のhmGluRサブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）該化合物とhmGluRサブタイプの相互作用に起因する剌激の増加または減少を、試験化合物の不存在に対して検出し、そしてそれからグルタミン酸アゴニストの存在を決定する工程、を含む。グルタミン酸アンタゴニストを同定する方法は（ａ）アゴニストと受容体との相互作用および経路を介しての関連する反応を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、既知グルタミン酸アゴニストの存在下で応答経路に関連した本発明のhmGluRサブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）グルタミン酸アゴニストのみによる応答経路の刺激に比して、化合物とhmGluRサブタイプとの相互作用から生ずるアゴニストによる応答経路の阻害を検出し、そしてそれからグルタミン酸アンタゴニストの存在を決定することを含んで成る。たとえば、もしその試験化合物が、この発明のhmGluRに対して、グルタミン酸アゴニストと競争するなら、阻害が検出され得る。このような方法を用いてスクリーニングされ得る化合物は、たとえばhmGluRサブタイプに特異的に結合する遮断抗体である。さらにこのようなアッセイはＬ−グルタミン酸と相互作用する化合物、たとえばドメインに結合するリガンドの一部またはすべてを含む溶解hmGluRフラグメントのスクリーニングに有用である。優先的に、この発明のhmGluRとアゴニストまたはアンタゴニストの相互反応は、アゴニストまたはアンタゴニストとそのhmGluRの結合を意味する。この明細書において用いられているように、グルタミン酸アゴニストまたはアンタゴニストの受容体への相互作用のために十分な条件および時間は受容体の出所により変化するであろうが、一般的に約４℃から約40℃の間、好ましくは約４ ℃から約37℃の間で、０から２ＭのNaCl、好ましくは０から0.9Ｍ NaCl特に好ましくは0.1ＭNaClからなる緩衝液中で、５から９の間、好ましくは6.5から８の間のPH範囲で結合が生じる条件が適当である。結合と応答に十分な時間は一般に暴露後約１分から約24時間の間であろう。この発明の一つの実施態様のなかで、応答経路は膜−結合アデニル酸シクラーゼ経路であり、そして、アゴニストの検出の工程は、対照におけるcAMPの生産に比較して、膜−結合アデニル酸シクラーゼ応答経路によるcAMP生産の減少または増加、このましくは減少を測定することを含む。この発明の目的のために、cAMP 生産の減少または増加は、IC₅₀濃度に相当する濃度で適用されたＬ−グルタミン酸によって引き起こされる減少または増加に等しいか、それよりも大きい。アンタゴニストのための、検出の工程は、アンタゴニストの不在におけるcAMP生産に比較してのアンタゴニストの存在下における膜−結合アデニル酸シクラーゼ応答経路によるcAMP生産の、Ｌ−グルタミン酸により引き起こされる減少または増加を測定することを含む。cAMPの測定は、細胞破壊または、細胞内に認められた、蛍光染料のようなcAMP感受性プローブ（それはcAMPと結合するとその性質、たとえばその蛍光特性を変えるのである）によって実行され得る。環状AMPの生産は、たとえば、前述の中島他によって記載された方法を含む当業界によく知られた方法または商業的に入手し得るキット、たとえば、放射能標識cAMP、たとえば〔¹²⁵Ｉ〕cAMPまたは〔³Ｈ〕cAMPを含むキットを用いて測定され得る。典型的なキットは、沃素化−cAMPとcAMP抗体との競争によるcAMPの生産を測定する、AmershamによるScintillation Proximity Assay KitまたはAmersha mによるCyclic AMP〔³Ｈ〕Assay Kitである。アデニル酸シクラーゼ経路にネガティブに関連する受容体サブタイプをすなわち、剌激によりcAMPの減少をそして剌激の減少によりcAMPの増加を引き起こすサブタイプを発現する細胞を用いるアッセイ系においては、（潜在的）受容体アゴニストまたはアンタゴニストに添加するに先立って、細胞を、可逆的または非可逆的にアデニル酸シクラーゼを刺激する化合物、たとえばホルスコリンまたは、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）のようなホスホジエステラーゼ阻害剤である化合物に暴露することが好ましい。この発明の他の実施態様では、応答経路はPI加水分解／Ca²⁺動員経路である。試験化合物のこの発明のhmGluRサブタイプとの特異的相互作用を決定するためのアッセイは、細胞内カルシウムイオン（Ca²⁺）濃度における変化に機能的に関連しているかもしれない。Ca²⁺細胞内濃度の変化を決定するいくつかの方法は当業界に既知であり、たとえば、fura-2（Grynkiewisg他「J．Biol．Chem.」260，34 40-3450（1980）参照）、fluo-3またはIndo-1のようなカルシウムイオン感受性蛍光染料を含む方法、Charest他（「J．Biol．Chem．」259，8679-8773 (1993)）によって記載された、the calcium fluor Quin Ｚ法またはNakajima-Shimadaによって記載されたエクオリン発光タンパク質法（「 Proc．Natl A cad．Sci．USA」88，6878-6882 (1991)）がある。この発明の−実施態様においては、細胞内カルシウムイオン濃度は、マイクロ蛍光定量法によって、カルシウム感受性蛍光染料fluo-3またはfura-2を詰めた組み換え細胞中で測定される。これらの測定は、単細胞レベルで、倒立顕微鏡およびビデオイメージ技術または蛍光光度計の使用を可能にするカバーガラス中において増殖する細胞を用いて実施され得る。両アプローチのため、hmGluRを発現するプラスミドで形質転換した細胞はカルシウム指示薬により負荷されるべきである。この目的のため、増殖倍地は細胞から除去され、fura-2またはfluo-3を含有する溶液で置換される。細胞は、優先的に次に続く８時間の間、カルシウム測定のために用いられる。マイクロ蛍光定量法は、標準的な手順に従う。化合物と標的分子との機能的相互作用の結果として生ずるCa²⁺シグナルは、もし、その化合物が限定された期間、たとえば、灌流システムを経て適用されるなら、一時的であり得る。一時的な適用を用いて、同じ細胞で、内部対照および試験される多数の化合物を考慮に入れて、いくつかの測定がなされ得る。この発明のhmGluRのCa²⁺シグナルへの機能的な関連は、たとえばCHO細胞中において、種々の方法：（ｉ）この発明の組換えhmGluRおよび組換え電圧−ゲートカチオンチャンネルの共発現であって、イオンチャンネルの活性が機能的にhmGluRの活性と関連しているもの、（ii）直接PI／Ca²＋経路を刺激するキメラhmGluR受容体の発現、（iii）この発明の組換えhmGluRのカチオンチャンネル従属Ca²⁺−透過性cAMP− 組換えとの共発現によって達成され得る。他の発現システムにおいて、もし、これらの細胞が自然に、（ｉ）その活性が機能的にmGluRの活性と関連している、電圧−ゲートCaチャンネルまたは（ii）イオンチャンネルに従属してCa²⁺−透過性cAMPを発現するのであるなら、hmGluR のCa²⁺シグナルへの連結はこの発明のhmGluRのトランスフェクションによって達成され得る。たとえば、自然に電圧−ゲートCaチャンネルを発現するGH３細胞は、直接的に、hmGluRの共トランスフェクションによってhmGluR機能的活性のテストにCa²⁺アッセイの応用を許容する。さらなる細胞ベーススクリーニングアッセイは、たとえばレポータータンパク質、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)またはルシフェラーゼのような、容易に測定できるタンパク質の発現がこの発明のhmGluRの機能に依存している、細胞系を構成することによって設計され得る。たとえば、cAMP応答要素を含むDNA構成物は、ルシフェラーゼをコードするDNAに作用可能に結合している。酵素DNAを含む結果として生じたDN A構成物は、安定に宿主細胞に移入される。宿主細胞は、次いで、受容体の発現のために必要な付加的なDNAセグメントに作用可能に連結した、この発明のhmGlu Rをコードする第１のDNAセグメントを含有する第２のDNAをもってトランスフェクトされる。たとえば、この発明のhmGluRへの試験化合物の結合が、上昇したcA MPレベルで起こるなら、ルシフェラーゼの発現は、選択されたプロモーターに依存して、誘発または減少される。ルシフェラーゼはルシフェリンへ暴露され、ルシフェリンの酸化の間に放射されたフォトンが測定される。この明細書に提供される薬物のスクリーニングアッセイは、受容体サブタイプ −特異性化合物、特に受容体タンパク質に結合して、結果として病気に特異的な薬の発展へと導びくリガンドの同定とデザインを可能とするだろう。もし、唯一のhmGluRサブタイプ（または前もって決定されたhmGl uRサブタイプ）と特に特異的に相互作用するようにデザインされるなら、そのような薬物は、（未知の）多数の受容体サブタイプを発現する細胞によるスクリーニングによって同定された薬物よりも、望まない副作用がたぶん少いであろう。同様に、この発明の単一受容体サブタイプまたは異った受容体サブタイプと種々の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストの特異的な組み合せの試験は、個々のサブタイプの機能と活性に関する付加的な情報を提供し、／またはそれよりも多い受容体サブタイプと非常に特異的な相互作用をすることができる化合物の同定とデザインに導びくべきである。他の実施態様において、この発明は、この発明のhmGluRサブタイプに反して生じるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、たとえば診断または治療上の応用と同様に免疫組織化学を含む、免疫アッセイに有用であり得る。たとえば、細胞外ドメインまたはそれらの特定のhmGluRサブタイプの部分に対する抗体特異性は内因性のhmGluRサブタイプを遮断するために応用され得る。この発明の抗体は、当業界に良く知られた方法により、抗原として、この発hm GluRサブタイプ、そのフラグメントもしくはそのサブタイプまたはフラグメントを発現する細胞を用いることによって製造され得る。抗原はこの発明の受容体の活性のまたは不活性の形を表わすことができる。抗体は活性のまたは不活性の形に区別できるかもしれない。抗原として（合成ペプチドまたは融合タンパク質のいずれかとして）、サブタイプフラグメントを選択するのに考えられる因子は、特定のサブタイプに対する抗原性、接近性（すなわち、細胞外および細胞質ドメイン）および唯一性である。特に有用なのは、他のサブファミリーのサブタイプに結合することなく、上記サブファミリーの受容体サブタイプを認識および結合する抗体選択性および他のいかなるサブタイプと結合することなく、一つの特定のサブタイプを認識および結合する抗体選択性である。この発明の抗体は、それを必要とする患者に普通の方法を用いて投与され得る。当業者は投与型、治療法などを、用いられる投与法に依存して容易に決定できる。この発明は特に例に記載した特定の実施態様に関連するが、それはこの発明を説明するためのものであって、発明を限定するものと解すべきではない。略語：hmGluR＝ヒト代謝向性グルタミン酸受容体 nt＝ヌクレオチド例１：hmGluR４をコードするcDNA ヒトmGluR4 cDNAクローンをヒトの胎児の脳およびヒトの小脳のcDNAライブラリーから、ラットの脳のcDNAからのPCRによって生じた放射能標識ラットがmGluR 4プローブを用いて、低ストリンジェンシーハイブリダイゼイションにより、単離する。 1.1 ラットの前脳からのポリ（Ａ）⁺RNAの製造成体の雄スプラーグ−ドーリー（Sprague-Dawley）ラットを窒息によって殺し、その前脳を除去し、直ちに液体窒素中で凍結する。全RNAをグアニジンチオシアネート−手順を用いて単離する（ChomczynskiおよびSacchi「Anal．Biochem. 」162，156-159）。オリゴ（dT）−セルロース上のアフィニティクロマトグラフィーによって、普通の手順でポリ（Ａ）⁺DNAの濃縮を達成する（Sambrook，J.， Fritsch，E.F．およびManiatis，T．「Molecular Cloning：A La boratory Mannual（第２版）」Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring H arbor，USA）。 1.2 PCRのための第１の鎖cDNA ポリ（Ａ）⁺RNA(mRNA)をモロニームラインロイケミアウイルス（Molone y Murine Leukemia Virus）逆転写酵素によって、DNAに逆転写する。50μｇの反応は次のように手はずをととのえる：10μｌの殺菌水中の10μｇのラットの前脳のポリ（Ａ）⁺RNAを70℃で10分間加熱し、次いで氷上で急冷する。次いで、10μ ｌの５×反応緩衝液（250mM Tris-HCl PH8.3，375mMのKCl，15mMのMgCl₂），５ μｌの0.1 Ｍジチオスレイトール、５μｌの混合dNTP(各10mMのdATP，dCTP，dDT P，dTTP，Pharmacia)，1.25μｌのオリゴdT_12-18(２mg／ml，Pharmacia)，2.5μ ｌ RNA_sin（40Ｕ／μｌ，Promega），12.25μｌの殺菌水および４μｌ（200Ｕ／μｌ）M-MLVRTを添加する。反応は37℃で60分間行われる。 1.3 ラットのmGluR4フラグメントを生成するためのPCR条件 PCRに用いるオリゴデオキシヌクレオチドプライマーをホスホラミダイト（pho sphoramidite）法によって合成する。配列を表１に示す。 100μｌ反応混合物のための標準のPCR−条件は；30ngのラットの前脳のcDNA， 50ｐモルのプライマ−Ｐ１およびＰ２、各200μモルの４種のデオキシヌクレオチドトリオスフェートdATP，dCTP，cGTPおよびdTTP ，PCR−緩衝液（10mMのTris-HCl，PH8.3，1.5mMのMgCl₂，50mMのKCl，10mMのβ −メルカプトエタノール、0.05％のTween(w／v)，0.05％のNP−40(w／v)）中の1 0％DMSOおよび0.5ＵのAmpli Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）。次の条件を用いて複製を行なう。93℃で30秒変性し、56℃で１分30秒、徐冷再対合し、72℃で３分伸長を全部で40サイクル。最初の変性は94℃で４分間行なう。 1.4 ラットのmGluR４ PCRフラグメントのサブクローン化制限エンドヌクレアーゼ消化、修飾酵素の使用、ベクターの製造（脱リン酸化、ゲル精製）、連結反応、大腸菌の形質転換およびプラスミドDNAの製造を通常の手順に従って行う（Sambrook他、前述 (1989)）。 1.3に記載された手順に従って得られたPCRフラグメント（888bp）をBluescrip t SK⁺プラスミド（Stratagene，La Jolla，USA）のSmaＩ部位に連結する。Blues criptベクターに挿入されたフラグメントは、Ｔ７およびＴ３プライマー（Strat agene，La Jolla，USA）を用いて両端から配列される。 1.5 放射能標識プローブの製造 20−50ngのPCRで生成したラットのmGluR4フラグメントをゲル精製しDNA標識キット（Boehringer Mannheim）を用いてランダムプライミングにより³²Ｐ−標識する。 1.6 ライブラリースクリーニングヒトの胎児の脳ライブラリー（λZAPII，Stratagene，La Jolla，USA）、ヒト海馬（λZAP，Stratagene，La Jolla，USA）およびヒト小脳cDNAライブラリー（ λZAP，Stratagene）からの約１×10⁶ファージをラットのmGluR₄フラグメントへハイブリダイゼーションのためにスクリーニングする。ハイブリダイゼーションを、５×SSC，0.02％（ｗ／ｖ）Ficoll（Type400），0.02％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、0.1％（ｗ／ｖ）SDS，50μｇ／mgのHerring Testis DNA中で行う。58℃で30分から３時間の間、プレハイブリダイゼーションを実行する。１−３×10⁵cpm/mlの濃度で³²Ｐ−標識したフラグメントを含有する同じ溶液中で、58℃で低ストリンジェンシーで一晩ハイブリダイゼーションを実行する。20分間で３度、各々58度で２ ×SSC／0.1％のSDSで、洗浄する。ラットのmGluR4プローブにハイブリダイズするファージを上述した条件で、第２および第３ラウンドのスクリーニングにより精製する。精製ファージによりかくまわれたcDNAの挿入断片は、Ｅ×Assist／SOLRシステム（Stratagene，La Jol la，USA）を用いて、生体内切除により救助される。 1.7 単離されたcDNAクローンの特徴づけいくつかのcDNA挿入断片は、制限酵素マッピングおよびDNA配列分析によって特徴づけられる。これらのクローンの一つであるcDNA cmR20（ヒト小脳ライブラリーから単離された）は約3.3kbの挿入断片を含有している。cmR20の配列分析は、それは約750ntの３′不翻訳領域と同様に、翻訳終結コドン（nt158から2739，配列番号：１参照）を含むヒトmGluR4のほとんど完全なコード領域を含有していることを示している。翻訳開始コドンを含む５′末端は欠如している。 1.8 ヒトmGluR4の５′末端の単離ヒトmGluR4のコード領域を完成させるためにヒトゲノムDNAまたはヒトの脳のR NAの最初の鎖cDNAを鋳型としてPCR反応を行う。センスプライマーＰ３はラットのmGluR4 cDNAの５′末端に一致し、アンチセンスプライマーＰ４がラットのmGl uR4 cDNAの nt440-459 に一致する。ラットのmGluR4 cDNAのnt440-459に一致する。（田辺他「Neuron」８，169-17 9 (1992)）付加的な配列にアンダーラインをし、制限酵素のための部位は肉太活字で示した。 100μｌ反応混合物のためのPCR反応は： 400ngのヒトゲノムDNA，μｌＭの各プライマー、PCR緩衝液（10mMのTris-HCl，PH8.3，1.5mlのMg Cl₂，50mMaKCl）中の各２mMのデオキシヌクレオチドトリリン酸（dATP，dCTP，dGTPおよびdTTP）および２ＵのAmPli Taqポリメラーゼ、複製は次の条件で実行される：95℃で１分間変性、56℃で１分間徐冷再対合し、72℃で１分間伸長を全部で32サイクル。最初の変性は94℃で３分間行う。いくつかの独立したPCRの生成物は、制限酵素PstＩおよびEcoRＩで消化され、ゲル精製されて、P Bluescript SK（Stratagene）のPstＩ／EcoRＩ部位に連結される。いくつかの独立したPCRのサブクローン化フラグメントはDNA配列分析(cR4 PCRl-4)で分析される。配列分析はクローンcR4PCR2は、一時的な開始コドン（nt １−380、配列番号：１参照）を含む、hmGluR4をコードする領域の３80ntをコードしていることを表わす。cR4PCR2はcmR20と223ntの３′末端で重なっている。 hmGluR4タンパク質の完全な推測されたアミノ酸配列は配列番号：２に記載されている。例２： hmGluR7をコードするcDNAクローン放射能標識したラットのmGluR4フラグメントを用いる（1.5および1.6において記載したように）、ヒト胎児の脳およびヒト小脳cDNAライブラリーの低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによるスクリーニングは、ヒト代謝向性グルタミン酸受容体サブタイプを同定するcDNAクローンの単離を許容する。DNA配列分析によるcDNAクローンの特徴づけは、単離されたcDNAはヒトmGluR7 mRNAの少くとも２つの明らかなスプライス変異体を表わすことを明らかにする。 cDNAcmR2（ヒトの胎児の脳のcDNAライブラリーから単離された）は3804ntのサイズを有している。クローンCmR2は３′不翻訳配列（配列番号：３）の1200ntに続く翻訳終結コドンを含む、hmGluR7をコードする配列の2604ntを含有する。 cDNAcmR3（ヒト海馬cDNAライブラリーから単離した）は1399ntのサイズを有している。（配列番号：５）。cmR3は、３′不翻訳配列の1129ntが続く、翻訳停止コドン（推定されたアミノ酸配列は配列番号：６に記載されている）を含む、hm GluR7の３′末端をコードする領域の270ntを含んでいる。cmR3の配列は、完全に cmR2に含有されているか、配列番号：３における2534位置のntから2625の位置の ntにわたる92ヌクレオチドの削除によりcmR2と異っている。このhmGluR7の明らかなスプライス変異体は推定されたhmGluR7アミノ酸配列の異った３′末端を生成する。 cDNAcmR5（ヒトの胎児の脳のcDNAライブラリーから単離された）は、1588ntのサイズを有している（配列番号：７）。cDNAcmR5は、cDNAcmR2とl424nt重なる。それはcmR2／cmR3の３′末端で正に92−nt−挿入／削除の位置で分岐する。cmR5 の付加的な164ntは、直ちにcmR5およびcmR2／cmR3配列分岐がつづく、保護されたスプライスドナー配列の存在により示されるイントロン配列をコードするか、第３のスプライス変異体を表わすかのいずれかである。 cDNAクローンにおいてcmR2，cmR3およびcmR5を失っているhmGluR7 DNAの５′ 末端コード領域は、ゲノムライブラリークローニングおよびPCR技術の組み合せにより単離される、Lamda-Fixゲノムライブラリーを、上述のSambrook他に記載されている高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件で、cDNAcmR2のnt １−1304を含むEcoRＩ／SmaＩ制限フラグメントでスクリーニングした。cDNAクローンcmR2の５′末端にハイブリダイズしたLambdaクローンを精製し、制限分析および配列決定により分析した。ATG翻訳開始コドンを含む、ヒトmGluR7をコードする領域の完全な５′末端は、クローン化ゲノムフラグメントから誘導されるプライマー配列を用いてヒト脳cDNAからPCRによって複製される。PCRフラグメントは557ntのサイズを有している。それはcR7PCRと呼ばれ、配列番号：９に述べられている。推定されたアミノ酸配列は配列番号：10に明らかにされている。cR 7PC1はcmRの３′末端において392nt重なっている。完全なhmGluR7ａおよびｂタンパク質をコードするDNA配列は、それぞれ配列番号：11および13に記載されている。推定されたアミノ酸配列は、例１のhmGluR4 サブタイプと約70％の配列一致を表わしている。例３：部分hmGluR6をコードするcDNA 1.0kbの挿入断片を有する一本鎖cDNAクローン、cmR1は例1.５および1.６に上記したように、hmGluRを用いて、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによってヒト海馬ライブラリーから単離する、およそ630ヌクレオチドはヒトm GluR4と相同である。cmR1の５′および３′末端における付加的な配列は、推定のスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位配列の存在によって示されるように明らかにイントロン配列をコードする。cDNAcmR1はヒト代謝向性グルタミン酸受容体サブタイプhmGluR6の部分と同定される（配列番号：１５）。推定されたアミノ酸配列は配列番号：16に記載されている。 hmGluR6の完全なコード領域は、プローブとしてcDNAcmR1で、高ストリンジェンシー条件でcDNAおよびゲノムライブラリーのスクリーニングすることにより単離される。推定されたアミノ酸配列の比較は例１のhmGluR4と約70％の配列一致していることを表わしている。例４：哺乳類の細胞におけるhmGluR cDNAの発現 4.1 受容体発現プラスミド上記の全長さのhmGluR4，hmGluR6およびhmGluR7タンパク質をコードするcDNA はcDNAフラグメントから生成され、構成プロモーター（CMV，SV40，RSV）または誘導できるプロモーターに基づく哺乳類発現ベクターに連結される。例はpBK-CM V(Stratagene)，pBK-RSV(Stratagene)pCMV-T7(Sibia，Inc.)およびpICP4(Novage n，USA)である。 hmGluR4サブタイプをコードする、全長さのcDNAを、hmGluR4 cDNAのnt346-351 に位置する独特なXhoＩ部位において、hmGluR4の５′末端フラグメント（クローンcR4PCR2）とcDNAcmR20を連結することによって、哺乳類の発現ベクターpBK−C MVに導入する。特に、プラスミドpBK−CMV−hmGluR4は、cR4PCR2のNotＩ／XhoＩフラグメント、cDNAcmR20のXhoＩ／NotＩフラグメントおよびNotＩ消化ベクター pBK−CMVの三方連結によって生じる。プラスミドpCMV−Ｔ７−hmGluR4は、cR4PC R4のPstＩ／XhoＩフラグメント、cmR20のXhoＩ／EcoRＩフラグメントおよびPst Ｉ／EcoRＩ消化ベクターpCMV−Ｔ７−２の三方連結により生じる。両発現構成物は、３′の不翻訳配列の約750ntと同様にhmGluR4の完全なコード領域を含有する。２つのhmGluR7スプライス変異体を表わしている全長さのcDNAは、hmGluR7ａ（配列番号：１２）およびhmGluR7b（配列番号：１４）と呼ばれ、重り合うcDNAであるcmR2，cmR3およびhcR7PCR1を用いてpCMV−Ｔ７−２（SIBIA Inc.）に導入される。全長さのhmGluR7ｂ発現構成物は、pCMV-Ｔ７−hmGluR7ｂと呼ばれ、hcR7P CR1のpstＩ／BsaＩフラグメント、cmR2のBsaＩ／EagＩフラグメントおよびpCMV −Ｔ７−２のPstＩ／NotＩの三方連結により製造される。プラスミドpCMV−Ｔ７ −hmGluR7ｂはhmGluR7ｂの完全なコード領域および３′の不翻訳配列の191ntを含有する。pCMV-Ｔ７−hmGluR7ａと呼ばれるhmGluR7ａ発現構成物の全長さを構成するために、cmR2の370bp HindIII／EagＩフラグメントがcmR3の相当するフラグメントと交換される。生じたクローンのEsaＩ／EagＩフラグメントは上述のように三通り−連結に用いられる。プラスミドpBK−CMV−hmGluR6は同様に通常の技術を用いて生成される。 4.2 哺乳類の細胞のトランスフェクション哺乳類の細胞（たとえば、CHO-K1，GH3; American Tissue Type Culture Coll ection）をグルタミン酸のない培地において増殖させるために適合させる（Ｌ− グルタミン酸を欠き、減じた濃の２mMのＬ−グルタミンを含有するDulbecoの修飾したEagleの培地に、0.046mg／mlのプロリンおよび10％の透析した胎児のウシの血清(Gibco-BRL) を追加）。hmGluR発現プラスミドをリン酸カルシウム沈殿によって、細胞の中に一時的に形質導入する（Ausubel，F.M．他「Current Protoc ols in Molecular Biology」Greene and Wiley，US A (1993)）。 CHO-K1細胞(Gibco-BRL)にhmGluR発現プラスミドおよび、Ｇ-418耐性をコードするプラスミドベクターである、pSV2-Neo（Southern and Berg，1982）をリポフェクチン仲介のトランスフェクションによって、安定にhmGluRを発現する細胞系を生成する。１mg／mlのＧ-418サルフェートの添加に先立って、細胞系を48時間増殖させる。培養液を２，３日ごとに置換する。Ｇ-418選択を生存する細胞系を、抗−hmGluR7抗体を用いる免疫反応性による（免疫検出、下記4.３参照）最初のhmGluRタンパク質発現のためのトランスフェクションおよびcAMP放射能免疫アッセイ（下記5.1参照）を経るアゴニスト添加に続く機能的応答の後、６から８週間分析する。同様に、hmGluR発現構成物である、pBK−CMV−hmGluR4，pCMV−Ｔ７−hmGluR4 ，pCMV-Ｔ７−hmGluR7ｂおよびpCMV-Ｔ７−hmGluR7ａは、通常の手順にしたがって、一時的および安定に哺乳類細胞中に発現される（Ausubel，F.M．、他「Curr ent Protocols in Molecular Biology」Greene and Wiley，USA (1993)）。形質導入された細胞は、種々のアッセイによってhmGluR発現を分析される：〔³Ｈ〕−グルタミン酸結合研究、hmGluRサブタイプ特異的抗体を用いる免疫細胞化学およびcAMPの細胞内濃度（〔cAMP〕）における変化を検出するアッセイ。 4.3 サブタイプ−特異的hmGluR抗体を用いるhmGluRの免疫検出 hmGluRタンパク質発現をサブタイプ−特異的抗体を用いる免疫細胞化学によって分析する（例７参照）。トランスフェクションの１〜３日後、細胞をリン酸塩緩衝した塩類溶液(PBS) で２度洗浄し、PBS／４％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで洗浄する。細胞をPBS／0.4％トリトンX-100(Triton X-100)で透過性を上げ、次いでPBS／10mMのグリシンによる洗浄およびPBS洗浄する。細胞をPBSTB（１×PBS／0.1％トリトンX-100／１％ SBA）で１時間ブロックし、続いて免疫精製したhmGluR抗血清(PBSTB中0.5−0.2μｇ／ml）と１時間加温放置する。PBSによる３回洗浄後、細胞を１時間、ヤギ抗−うさぎIgG(PBSTB中１：200；Jackson Immuno Research)と接合したアルカリペルオキシダーゼと加温放置する。細胞を PBSで３回洗浄し、0.4mg／mlのリン酸ナフトール（Biorad）／１mg／mlのファストレッド（Fast Red(Biorad)）／10mMのレバミソル（Levamisol(Sigma)）／100m MのTris／HCl PH8.8／100mlのNaCl／50mMのMgCl₂で、免疫反応性を検出する。15 分後に、次に続く PBSによる洗浄により染色反応を止める。各相同的にhmGluR4 ，hmGluR6またはhmGluR7を発現する、２から４の細胞系を免疫染色により同定する。例５：hmGluRを発現する安定な細胞系の受容体活性の調節剤のスクリーニングのための使用 hmGluR4，hmGluR6およびhmGluR7を発現する安定な細胞系をアゴニスト、アンタゴニストおよびアロステック調節剤のスクリーニングに用いる。このような化合物は、〔³Ｈ〕グルタミン酸および／または細胞内第２メッセンジャーレベル（〔cAMP〕，〔Ca²⁺〕）における変化の測定を用いる結合研究によって同定する。 5.1 cAMP放射能免疫アッセイフォルスコリン刺激cAMP蓄積のリガンド結合およびアゴニスト−誘導的抑制（細胞内のcAMP濃度における変化）をcAMP放射能免疫アッセイによって分析する（ Amersham）。12のウェルに密度0.5−2.0×10⁵細胞／ウェルで細胞を接種し、細胞の集密的な層が得られるまで２日から４日成長させる。細胞をPBSで２回洗浄し、１mMの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（IBMX）を含有するPBS中で20分間加温放置する。細胞を10μＭのフォルスコリン、１mMのIBMXおよび既知のhmGluRアゴニストを含有する新鮮なPBS中で、20分間加温放置する。アゴニスト的効果を止め、細胞によって製造されたcAMPを、薬剤を含有する媒体を吸引させた後、１mlのエタノール−水−HCl混合物(100mlのエタノール、50mlの水、１m lの１Ｍ HCl) を加えることにより遊離する。cAMPレベルを、〔３Ｈ〕cAMP（Ame rsham）を含む、cAMP放射能免疫アッセイで測定する。 hmGluR4，６および７は、CHO細胞中で発現するとき、アデニル酸シクラーゼとネガティブに関連している。アゴニスト結合はフルルスコリン誘導cAMP蓄積の抑制に導く。すべてのサブタイプはAP-4感受性であり、AP−４は１mMより少い濃度においてアゴニスト的効果を有することを意味している。 5.2 細胞内〔Ca²⁺〕の測定上記の発現プラスミドの１つにより形質転換された細胞にfura-2またはfluro- 3のようなカルシウム感受性蛍光染料を負荷する。この細胞を得るために、細胞をカバーガラスを含むシグナルウェルまたは96−ウェルプレートに塗布し、50〜 100％の細胞の集密な層が得られるまで１日から５日増殖させる。ウェル調和塩溶液（balance salt solution，BBS）で３回洗浄し、BBS中で１時間加温放置し、続いてBBSでさらに３回洗浄する。次いで、細胞を50mgのfura-2-AM（またはfl uro3-AM）(Molecular Probes，Inc.)，4.99mlのBBS，75μｌのDMSOおよび6.25μ ｇのプルローニック（Pluronic）（Molecular Probes，Inc.）を含有する溶液中で20から60分加温放置する。細胞を２mg／mlのウシのアルブミンを含有するBBS で３回洗浄し、続いてBBSで３回洗浄する。少くとも10分間の間、細胞の回収を可能にしたのち、細胞を〔Ca²⁺〕の顕微蛍光測定に用いる。細胞を倒立顕微鏡、蛍光読み取り機の分光蛍光計のような蛍光のための装置に輸送する。カルシウム指示薬（たとえばfura2またはfluo-3）の蛍光は染料の励起スペクトルによってカバーされる波長の光の照明によって、誘導される（fura-2：340／380nm，fluo-33 480nm）。細胞内自由カルシウムイオン濃度の増加を、それぞれ、340nmおよび480nmで励起されたfura-2またはfluo-3蛍光の増加または380nmで励起したfura-2蛍光の減少としてモニターする。陽性の対照として、Ｌ−グルタミン酸を細胞上にそのEC。。価に相当する濃度で適用し、それで、細胞内カルシウムイオン濃度における測定可能な増加を誘発する。試験化合物はもし、それが、グルタミン酸によって誘導されるのに匹敵するCa²⁺シグナルを誘導するなら、アゴニストと言われる。もし、グルタミン誘導カルシウムシグナルが、試験化合物がないときよりも試験化合物があるときの方が少さいなら、試験化合物はアンタゴニストと言われる。例６：キメラhmGluR4，６および７受容体 mGluR1の細胞内ドメイン、特に第２の細胞内ループ（ｉ２）およびＣ末端領域は、Ｇ−タンパク質の結合に対して重要であることが示されてきており、Ｇ−タンパク質は、受容体の薬理学的プロフィールを変えることなく、ホスホリパーゼＣ／Ｃ²⁺シグナル経路を活性化する(Pin他、「MMBO J．」13，342-348 (1994)）。通常のPCR変異誘発技術は、hmGluR4，６および７の細胞内ドメインをhmGluR1 の相当するドメインと交換するのに用いられる。Ca²⁺−依存アッセイを用いて、受容体活性の調節剤(hmGluR4，６，７)の影響を分析させておきながら、安定なC HO細胞系がhmGluR／１，６／１および７／１キラメ発現構成物で生成される。下記では、我々は、キメラhmGluR／１受容体の生成を記載する。キメラhmGluR 4／１およびhmGluR6／１による発現構成物は、類似したクローニングおよびPCR 技術を用いて生成する。（ｉ）発現構成物pCMV−hmGluR7ｂはEagＩで消化され、それでもって完全なcD NA挿入断片を遊離する。cDNAは、pBluescript II（Stralagene）の誘導体であって、そこで独特なKpnＩおよびNotＩ部位の間のポリリンカー配列が欠失される、 pBluescript-NotのNotＩ部位にクローン化される。結果として生じるクローンは pBluescript-Not-hmGluR7と呼ぶ。（ii）hmGluRlのトランスメンブラン領域は上記Mass他の1991年から誘導されるプライマーを用いてPCRによってクローン化される。配列を有するオリゴヌクレオチド（Masu配列のnt1753から1774に相当する）をセンスプイマーとして用いる。アンチセンスプイマーは（Masu配列のnt2524から2544に相当する）配列を有している。スプライス変異体１ａ，１ｂおよび１ｃのＣ−末端は、上記Masu 他1991年、田辺他1992年およびPin他1992年（「Proc．Natl．Acad．Sci」USA．8 9．10331-10335 (1992)）から誘導されるプライマーを用いて、PCRによって、各々切断される。（Masu配列のnt2521から2543に相当する）配列を有するオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして用いる。Masu配列のnt35 77から3600に相当する、配列を有するオリゴヌクレオチド、田辺配列のnt2698から2721に相当する。およびPin配列のnt2671から2694に相当するが、それぞれ、hmGlR １ａ，１ｂおよび１ｃのためのアンチセンスプライマーとして用いられる。 PCRフラグメントは、pBluescript IIの中にクローン化され、完全に配列される。（iii）hmGluR7ａまたはhmGluR7ｂのｉ２−ループ（それぞれ配列番号11および13のnt2035から2106）がhmGluR１の相当する配列で置換されている。キメラcD NAフラグメントはPCRによって生成される（上記Pin他1994年に記載されているように）。フラグメントはSmaＩおよびBglIIで消化され、ｉ２−ループに隣接する独特な制限部位で切断される。キメラSmaＩ／BglIIフラグメントは、pBluescrip t-Not-mGluR7のSmaＩ／BglIIフラグメントに取り換えられる。（iv）hmGluR7ｂまたはhmGluR7ａのＣ−末端ドメインの、上述のhmGluR1スプライス変異体の相当する配列による付加的な置換は、hmGluR7のＣ−末端に隣接する、独特な制限部位BglIIおよびSacIIを用いて達成される。（ｖ）結果として生じるキメラhmGluR7／hmGluRl cDNAは配列されEagＩで消化され、それによって、pBluescript-Notから完全なcDNAが遊離される。CHO細胞中の安定な発現のために、キメラcDNAは、哺乳類の発現ベクターpCMV-TV-2の独特なNotＩ部位にクローン化される。例７：抗−hmGluR抗体の生成および応用 hmGluR4およびhmGluR7の推測されたＣ−末端アミノ酸配列に相当するペプチドを合成し、オボアルブミンまたはTentagelに連結させる。ポリクローナル抗血清をウサギ中に生じさせる。ヒトmGluR特異性抗体をペプチドカラム上の免疫親和性クロマトグラフィーによって抗血清から精製する。hmGluR特異性抗体をELISAおよびグルタチオン−Ｓ −トランスフェラーゼ／hmGluR融合タンパク質（大腸菌中で製造される）またはヒト脳抽出物による免疫ブロットにより特徴づける。それぞれhmGluR4およびhmG luR7に対する抗体特異性は形質導入された細胞中のhmGluR受容体を検出およびヒト脳物質の組織切片におけるhmGlu受容体タンパク質の細胞または副細胞(subcel lular)発現パターンを分析するのに用いられる。抗体は、20アミノ酸からなる異なったhmGluR−特異的ペプチドおよび大腸菌中に発現される融合タンパク質に対して生じる。ペプチドはキーホールリムピットヘモシアニン（keyhole limp it hemocyanin）（KLH）またはグルタルアルデヒドでオボアルブミンと連結される、固相合成により製造される。hmGluRの全推定細胞内Ｃ−末端フラグメントを含有するPCRフラグメントは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）／ hmGluR融合遺伝子を生ずる大腸菌発現プラスミドpGEX-2T（GuanおよびDixon「An alytical Biochemistry」192，262-267 (1991)）中にBamHＩ／EcoRＩフラグメントとしてクローン化される。GST／hmGluR融合遺伝子と共に発現プラスミドを持っている大腸菌DH５ａ細胞（Gibco-BRL）をLB培養液／100mg／mlアムピシリン中において37℃で一晩増殖させる。培養液をLBで１：30に希釈し、30℃で２時間増殖させる。融合タンパク質の発現は、0.1mMのイソプピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで30℃で３時間処理することによって誘発する。細胞を5,000×ｇで遠心分離によって収集する。融合タンパク質をグルタチオン親和性クロマトグラフィーを用いて単離する。寄託データ次のプラスミドはドイッチェサムルングフォンミクロオルガニズメンウントツェルクルチュレン GmbH(DSM)、マスケロデールヴェーク１ｂ，Ｄ−38124 ブラウンシュヴァイヒに寄託された。プラスミド cmR1：受託番号 DSM8549 プラスミド cmR2：受託番号 DSM8550

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１１月１６日【補正内容】請求の範囲１．hmGluR4，hmGluR6およびhmGluR7サブタイプよりなる群から選択されるhmG luR4サブファミリーのメンバーである精製されたヒト代謝向性（metabotropic）グルタミン酸受容体（hmGluR）であって、ここで、hmGluR4は配列番号：２に記載されているアミノ酸配列を有し、hmGluR7は配列番号：12に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR7a、配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR7bおよびそれぞれ配列番号：６，８または10に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むhmGluR7サブタイプからなる群より選択され、hmGluR6は配列番号：16に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。２．配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有しているhmGlu4サブタイプである請求項１による受容体。３．配列番号：12に記載のアミノ酸配列を有するhmGluR7aおよび配列番号：14 に記載のアミノ酸配列を有するhmGluR7bからなる群より選択されるhmGluR7サブタイプである請求項１による受容体。４．配列番号：６，８および10にそれぞれ記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含んでなるhmGluRである請求項１による受容体。５．配列番号：16に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなるhm GluR6サブタイプである請求項１による受容体。６．スプライス変異体、アミノ酸突然変異体、グリコシル化変異体、膜−結合し溶解性のフラグメントおよび他の化学的物質と共有結合または凝集する成分からなる群より選択される請求項１による受容体の変異体。７．プロモーターおよびDNAがそのプロモーターによって調節されているような受容体をコードするDNAを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換した適当な宿主細胞の試験管内または生体内の増殖を含んでなる請求項１による受容体の製造方法。８．請求項１による受容体の、その受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングのための使用。９．請求項１による受容体をコードする単離された核酸またはその核酸のフラグメントを含んでなる核酸。 10．DNAである請求項９による核酸。 11．それぞれ、配列番号：１３，５，７，９，11，13および15に記載のヌクレオチド配列を本質的に有しているDNAよりなる群から選択される請求項10によるDNA。 12．請求項10または11によるDNAの少くとも14の隣接する塩基またはそれらの補体を含んでなる核酸プローブ。 13．化学合成、組換えDNA技術またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含んでなる請求項10による核酸の製造方法。 14．ハイブリッドベクターである請求項10によるDNA。 15．請求項10のDNAを含んでなる宿主細胞。 16．請求項10のDNAを発現する真核宿主細胞。 17．哺乳類細胞である請求項15または16による宿主細胞。 18．請求項１による受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングのための請求項15による宿主細胞の使用。 19．宿主細胞の請求項14のハイブリッドベクターによるトランスフェクションまたは形質転換を含んでなる請求項15による宿主細胞の製造方法。 20．請求項11によるDNAに対して相補性の精製されたmRNA。 21．ヒトDNAと請求項12によるプローブを接触させ、そのプローブに本質的にハイブリダイズするDNAを同定することを含んでなる請求項１によるhmGluRをコードするDNAを同定する方法。 22．競合結合アッセイにおける、請求項１による受容体タンパク質の使用を含んでなるhmGluRサブタイプに結合する化合物を同定するための方法。 23．請求項16の細胞と、上記受容体サブタイプの活性を調節する能力を決定しようとする、少くとも一つの化合物またはシグナルと接触させ、次いで、上記受容体に帰すことができる機能性応答の差に対して細胞を分析することを含んでなる、請求項１によるhmGluRサブタイプの活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ。 24．請求項16の細胞と、この発明の受容体サブタイプの第２メッセンジャー活性を調節する能力を決定しようとする、少くとも一つの化合物またはシグナルとを接触させ、次いで特定の第２メッセンジャーのレベルにおける変化に対して細胞をモニターすることを含んでなる請求項23によるアッセイ。 25．下記サブタイプと請求項24のアッセイにおいて同定された少くとも１つの化合物の有効量を接触させることを含んでなる請求項１によるhmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性の調節のための方法。 26．（ａ）化合物を、該化合物と受容体との相互作用および経路を介しての関連する応答を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、応答経路に関連した請求項１のhmGluRサブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）該化合物とhmGluRサブタイプの相互作用に起因する剌激の増加または減少を、試験化合物の不存在に対して検出し、そしてそれからアゴニストまたはアゴニスト様の活性を有するアロステリック調節剤の存在を決定する工程を含んでなる、アゴニスト活性を有する請求項１のhmGluRサブタイプのグルタミン酸アゴニストまたはアロステリック調節剤を検出する方法。 27．（ａ）アゴニストと受容体との相互作用および経路を介しての関連する反応を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、既知グルタミン酸アゴニストの存在下で応答経路に関連した請求項１のhmGluRサブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）グルタミン酸アゴニストのみにより誘導される応答経路の刺激に比して、試験化合物とhmGluRサブタイプとの相互作用から生ずるアゴニストによる応答経路の阻害を検出し、そしてそれからグルタミン酸アンタゴニストまたはアンタゴニスト様活性を有するアロステリック調節剤の存在を決定する工程を含んで成るアンタゴニスト活性を有する請求項１のhmGl uRサブタイプのグルタミン酸アンタゴニストまたはアロステリック調節剤を同定する方法。 28．請求項１のタンパク質に対する抗体。 29．ポリクローナル抗体である請求項28による抗体。 30．モノクローナル抗体である請求項28による抗体。 31．受容体と請求項28の抗体とを接触させることを含んでなる請求項１による hmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性を調節する方法。 32．組換えDNA技術により得られ得る請求項１による受容体。 33．請求項１による受容体を含んでなる融合タンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リンダウアー，クリスティンドイツ連邦共和国，デー―79106 フライブルク，フェルディナンド―バイス―シュトラーセ 51 (72)発明者ピートナー，イレーネスイス国，ツェーハー―4053 バーゼル, メルティンガーシュトラーセ 19 (72)発明者クヌーフェル，トマススイス国，ツェーハー―4310 ラインフェルデン，マルクトガッセ 10 ベー

Claims

【特許請求の範囲】１．hmGluR4サブファミリーのメンバーである精製されたヒト代謝向性グルタミン酸受容体（hmGluR）。２．そのアミノ酸配列が配列番号：２に記載されているhmGluR4の配列と約65 ％よりも多く同一、特に約70％より多く同一であることを特徴とする請求項１によるhmGluR4サブファミリーの受容体。３．hmGluR4，hmGluR7およびhmGluR6からなる群より選ばれる請求項１による受容体。４．hmGluR4サブタイプである請求項２による受容体。５．配列番号：２に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR4サブタイプである請求項２による受容体。６．hmGluR7サブタイプである請求項２による受容体。７．配列番号：12に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR7aおよび配列番号：14に記載されているアミノ酸配列を有するhmGluR7bからなる群より選ばれるhmGluR7サブタイプである請求項２による受容体。８．配列番号：６，８および10にそれぞれ記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含んでなるhmGluR7である請求項２による受容体。９．hmGluR6サブタイプである請求項２による受容体。 10．配列番号：16に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む hmGluR6サブタイプである請求項２による受容体。 11．請求項１から10のいずれかによる受容体の変異体。 12．請求項１から11のいずれかの受容体を含む物質の組成物。 13．試験管内または生体内の適当な宿主細胞の増殖を含んでなる請求項１から 11のいずれかの受容体の製造方法。 14．請求項１から11のいずれかの受容体の、その受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングのための使用。 15．請求項１から11のいずれかによる受容体をコードする核酸またはその核酸のフラグメントを含んでなる核酸。 16．DNAである請求項15による核酸。 17．それぞれ、配列番号：１，３，５，７，９，11，13および15に記載されているヌクレオチド配列を本質的に有しているDNAよりなる群から選択される請求項16によるDNA。 18．請求項16または17によるDNAの少くとも14の隣接する塩基またはそれらの補体を含んでなる核酸プローブ。 19．請求項16による核酸の製造方法。 20．ハイブリッドベクターである請求項17によるDNA。 21．請求項17のDNAを含んでなる宿主細胞。 22．請求項17のDNAを発現する真核宿主細胞。 23．請求項20のDNAをトランスフェクトされた宿主細胞。 24．哺乳類細胞である請求項23による宿主細胞。 25．請求項１による受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングのための請求項22による宿主細胞の使用。 26．請求項21による宿主細胞の製造方法。 27．請求項７によるDNAに対して相補性の精製されたmRNA。 28．ヒトDNAと請求項18によるプローブを接触させ、そのプローブに本質的にハイブリダイズするDNAを同定することを含んでなる請求項１によるhmGluRをコードするDNAを同定する方法。 29．競合結合アッセイにおける、請求項１による受容体タンパク質の使用を含んでなるhmGluRサブタイプに結合する化合物を同定するための方法。 30．請求項22の細胞と、上記受容体サブタイプの活性を調節する能力を決定しようとする、少くとも一つの化合物またはシグナルとを接触させ、次いで、上記受容体に帰すことができる機能性応答の差に対して細胞を分析することを含んでなる、請求項１によるhmGluRサブタイプの活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ。 31．請求項22の細胞と、この発明の受容体サブタイプの第２メッセンジャー活性を調節する能力を決定しようとする、少くとも一つの化合物またはシグナルとを接触させ、次いで特定の第２メッセンジャーのレベルにおける変化に対して細胞をモニターすることを含んでなる請求項30によるアッセイ。 32．下記サブタイプと請求項31のアッセイにおいて同定された少くとも１つの化合物の有効量を接触させることを含んでなる請求項１によるhmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性の調節のための方法。 33．請求項30によって同定された、アゴニスト、アンタゴニストまたはアロステリック調節剤。 34．請求項30によって同定された、請求項１によるhmGluRの調節剤。 35．（ａ）化合物を、該化合物と受容体との相互作用および経路を介しての関連する応答を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、応答経路に関連した本発明のhmGluRサブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）該化合物とhmGluRサブタイプの相互作用に起因する剌激の増加または減少を、試験化合物の不存在に対して検出し、そしてそれからアゴニストまたはアゴニスト様の活性を有するアロステリック調節剤の存在を決定する工程を含んで成る、アゴニスト活性を有する請求項１のhmGluRサブタイプのグルタミン酸アゴニストまたはアロステリック調節剤を検出する方法。 36．（ａ）アゴニストと受容体との相互作用および経路を介しての関連する反応を許容するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、既知グルタミン酸アゴニストの存在下で応答経路に関連した本発明のhmGluR サブタイプに化合物を暴露する工程、および（ｂ）グルタミン酸アゴニストのみにより誘導される応答経路の刺激に比して、試験化合物とhmGluRサブタイプとの相互作用から生ずるアゴニストによる応答経路の阻害を検出し、そしてそれからグルタミン酸アンタゴニストまたはアンタゴニスト様活性を有するアロステリック調節剤の存在を決定する工程を含んで成る、アンタゴニスト活性を有する請求項１のhmGluRサブタイプのグルタミン酸アンタゴニストまたはアロステリック調節剤を同定する方法。 37．請求項１のタンパク質に対する抗体。 38．ポリクローナル抗体である請求項37による抗体。 39．モノクローナル抗体である請求項37による抗体。 40．受容体と請求項35の抗体とを接触させることを含んでなる請求項１による hmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性を調節する方法。 41．組換えDNA技術により得られ得る請求項１による受容体。 42．請求項１〜10のいずれかによる受容体を含んでなる融合タンパク質。