JPH10504198A

JPH10504198A - グルタミン酸受容体

Info

Publication number: JPH10504198A
Application number: JP8507725A
Authority: JP
Inventors: ヨセフフロール，ペーテル; クーン，ライナー; リンダウアー，クリスティン; ピュットナー，イレーヌ; クネーフェル，トーマス
Original assignee: ノバルティスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 1998-04-28
Also published as: WO1996006167A1; MX9701267A; EP0776364A1; HUT76969A; GB9416554D0; NO970740D0; FI970633A0; FI970633A; CA2196997A1; AU3110095A; NO970740L

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト向代謝性グルタミン酸受容体（hmGluR）サブタイプ、それをコードする単離された核酸、本発明のタンパク質を生成する宿主細胞、そのようなタンパク質、核酸及び宿主細胞の調製方法、及びそれらの使用に関する。さらに、本発明は、本発明のhmGluRタンパク質に対して向けられた抗体も供給する。

Description

【発明の詳細な説明】グルタミン酸受容体本発明は、ヒト向代謝性（metabotropic）グルタミン酸受容体（hmGluR）サブタイプ、それをコードする単離された核酸、本発明のタンパク質を生成するための宿主細胞、そのようなタンパク質、核酸及び宿主細胞の調製方法、並びにそれらの使用に関する。さらに、本発明は、本発明のhmGluRタンパク質に対して向けられた抗体を供給する。向代謝性グルタミン酸受容体（hmGluR）は、グルタミン酸作用性リガンドの結合に基づいて、細胞内第二メッセンジャーシステム、たとえばカルシウムイオン、環状ヌクレオチド、ジアシルグリセロール、イノシトール、１，４，５−トリホスフェートを通して細胞外シグナルを生理学的応答中に形質導入することができるＧ−タンパク質（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）結合受容体の種類に属する。大きな細胞外アミノ末端ドメインが先行しており、そして大きなカルボキシ末端ドメインの向代謝性グルタミン酸受容体が後に続く７個の推定上のトランスメンブラン拡張セグメントは、共通する構造により特徴づけられる。アミノ酸レベルでの配列同一性の程度に基づけば、mGluRの種類は、個々の受容体サブタイプを含んで成る異なったサブファミリーに分類され得る（Nakanishi，Sci ence 258，597-603(1992)）。個々の mGluRサブタイプは、ユニーク遺伝子によりコードされる。異なったサブファミリー中の他のサブタイプに対する個々の m GluRサブタイプの相同性に関しては、アミノ酸配列は約50％以下の同一性を有する。サブファミリー内で、配列の同一性の程度は一般的に、約70％以下である。従って、特定のサブタイプは、他の mGluRサブタイプ、特に、同じ哺乳類種のサブタイプに対するそのアミノ酸配列の相同性により特徴づけられ得る。さらに、特定のサブタイプは、その領域及び組織分布、その細胞及びサブ細胞発現パターン、又はその明確な生理学的プロフィール、たとえばその電気生理学及び薬理学的性質により特徴づけられ得る。主要な興奮性神経伝達物質であるアミノ酸Ｌ−グルタミン酸、すなわちグルタミン酸作用性システムは、早い興奮性のシナプス伝達、神経伝達物質開放の調節、長期の活性作用、学習及び記憶、進行性シナプス形成性、低酸素性−虚血性損傷及びニューロン細胞の死、癲癇性発作、並びにいくつかの神経変性障害の病因を包含する多くのニューロン過程において重要な役割を演じることが推定される。今日まで、ヒト向代謝性グルタミン酸受容体（hmGluR）サブタイプに対する、たとえばアミノ酸配列又は組織分布に対に対する情報は入手できない。この知識の欠如は、特にグルタミン酸作用性システムにおける欠陥に寄与するいづれかの異常に対して特別に影響を及ぼすことができるヒト治療剤についての研究を妨げる。向代謝性グルタミン酸受容体の可能性ある生理学的及び病理学的有意性の観点から、それらのタンパク質の電気生理学的及び薬理学的性質を誘発するのに十分な量でヒト受容体サブタイプ及びそのようなサブタイプを生成するための細胞についての必要性が存在する。たとえば、薬物スクリーニングアッセイは、まだ入手できていない活性形での精製された受容体タンパク質を必要とする。この必要性を達成すること、すなわちhmGluRサブタイプ２、それをコードする核酸及びそのようなサブタイプを生成するための宿主細胞を供給することが本発明の目的である。HmGluR2は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−α−（カルボキシシクロプロピル）−グリシン(L-C CG-I)により実質的に活性化され、そしてたとえばチャイニーズハムスター卵巣( CHO)細胞又は子供のハムスターの腎臓(BHK)細胞において発現される場合、Ｇタンパク質を通してアデニル酸シクラーゼに消極的に結合される。hmGluR反応性薬物についてのスクリーニングへの本発明の組換えhmGluRサブタイプを含んで成るシステムの使用は、より高い収量の試薬を付与する細胞当たりの多数の受容体及びアッセイにおけるシグナル対ノイズの高い比並びに高められた受容体サブタイプの特異性（高い生物学的及び疾病特異性を実質的にもらたす）の達成を可能性にする。より特定的には、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する hmG luR2に関する。本発明によれば、“hmGluRサブタイプ”なる表現は、Ｇタンパク質結合受容体のクラスに属し、そしてグルタミン酸作用性リガンドの結合の後に、細胞内第２メッセンジャーシステムを通して細胞外シグナルを導入する精製されたタンパク質に関する。そのような場合、本発明のサブタイプは、それが環状ヌクレオチド（cAMP，cGMP）のレベルを変更することで特徴づけられる。他方、シグナル伝達入は、他の膜タンパク質、たとえばイオンチャネルと本発明の受容体サブタイプに結合されるＧタンパク質との直接的な相互作用を通して生じ得る。HmGluR2は、他の向代謝性グルタミン酸受容体サブタイプをコードしない区別された遺伝子によりコードされると思われる。特定のサブタイプは、その明確な生理学的プロフィール、好ましくはそのシグナル形質導入及び薬理学的性質により特徴づけられ得る。薬理学的性質は、たとえばアゴニスト及びアンタゴニスト応答についての選択性である。本明細書において定義される場合、グルタミン酸作用性リガンドは、Ｌ−グルタミン酸、又はたとえばグルタミン酸様態様において hmGluRサブタイプと相互作用し、そして特に、それに結合する他の化合物、たとえばACPD（ＩＳ，３Ｒ−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸）、 ACPD−様リガンド、たとえばQUIS（キスカル酸(quisqualate)）Ｌ−２−アミノ −２−ホスホ酪酸（AP４）、L-CCG-I、及び同様のものである。他のリガンド、たとえば（Ｒ，Ｓ）−α−メチル−４−カルボキシフェニルグリシン（MCPG）又はα−メチル−Ｌ−AP４は、グルタミン酸作用性リガンドの結合が妨げられるような態様で本発明の受容体と相互作用することができる。この前又はこの後で使用される場合、用語“精製された”又は“単離された” とは、天然源から又は遺伝子工学により得られる濃縮された又は純粋な形での本発明の分子を意味する。本発明の精製されたタンパク質、DNA及び RNAは、天然に存在するようなタンパク質、DNA及び RNAが存在しない態様、たとえば本発明のhmGluRの発現又は活性を選択的に変性する化合物の同定において有用である。本発明の精製されたhmGluRは、同定されており、そしてその天然環境の１又は複数の成分を有さない hmGluR2を意味する。精製されたhmGluRは、組換え細胞培養における本発明の精製されたhmGluRを包含する。サブタイプの濃縮された形は、天然においてよりも高い濃度で前記サブタイプを含む調製物、たとえば前記サブタイプを含んで成る細胞膜画分を意味する。サブタイプが純粋形で存在する場合、それは他の高分子、特に天然に存在するタンパク質性汚染を実質的に有さない。所望には、そのサブタイプは溶解され得る。本発明の好ましい精製された h mGluR2は組換えタンパク質である。好ましくは、本発明のサブタイプは、それがリガンド結合及びシグナル伝達活性を有することを意味する活性状態で存在する。受容体活性は、当業界において知られている方法に従って、たとえば結合アッセイ又は機能的アッセイ、たとえば下記のようなアッセイを用いて測定される。本発明は、本発明の受容体サブタイプの変異体の包含をさらに意図される。たとえば、本発明のhmGluRサブタイプの変異体は、前記サブタイプの機能的又は免疫学的同等物である。機能的同等物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する hmGluR2の特徴的なプロフィールと実質的に同一の生理学的プロフィールを示すヒトタンパク質である。さらに、機能的同等物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と70％以上、好ましくは90％以上の配列同一性を有する。従って、機能的同等物は、同じサブファミリーのもう１つのhmGluRサブタイプ、たとえば hmGluR3を包含しない。インビトロ及びインビボでの生理学的プロフィールは、受容体エフェクター機能、電気生理学的及び薬理学的性質、たとえばアゴニスト又はアンタゴニストとの選択的相互作用を包含する。典型的な機能的同等物は、一次転写体、アミノ酸変異体及びグリコシル化変異体のどちらか１つのスプライシングにより生成されるmRNAによりコードされるスプライス変異体であり得る。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する hmGluR2の免疫学的同等物は、前記サブタイプに対して特異的な抗体を生成できるタンパク質又はペプチドである。受容体の細胞外ドメインの部分、たとえば少なくとも６〜８個のアミノ酸、特に約20個のアミノ酸から成るペプチドが特に有用な免疫学的同等物と思われる。本明細書に包含されるさらなる変異体は膜−結合及び可溶性フラグメント及び他の化学成分との共有又は凝集接合体であり、それらの変異体は１又は複数の受容体機能、たとえばリガンド結合又はシグナル形質導入を示す。本発明のフラグメントは、天然源から、化学的合成により又は組換え技法により得られる。内因性リガンドのために本発明のhmGluRサブタイプの内因性相対物と競争するそれらの能力により、リガンド結合ドメインを含んで成るフラグメント又はその誘導体は、治療剤として見られる。共有誘導体はたとえば、受容体カルボキシル基の脂肪族エステル又はアミド、水酸基含有残基のＯ−アシル誘導体及びアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体を包含する。そのような誘導体は、側鎖において及び受容体タンパク質のＮ−及びＣ−末端で見出される反応性基への官能基の結合により調製され得る。本発明のタンパク質はまた、検出できるものによりラベルされ得、たとえば放射性ラベルされ得、稀土類キレートに共有結合され得、又は螢光成分に接合され得る。さらなる誘導体は、他のタンパク質又はペプチドと本発明のタンパク質との共有結合体（融合タンパク質）である。異なったグルタミン酸受容体の異なった部分を含んで成る融合タンパク質が例である。そのような融合タンパク質は、Ｇ− タンパク質への結合を変えるために及び／又は機能的アッセイの感受性を改良するために有用である。たとえば、そのような融合タンパク質又はキメラ受容体においては、本発明のサブタイプの細胞内ドメインが、他の mGluRサブタイプ、特にhmGluRサブタイプ、たとえば他のサブファミリーに属するhmGluRサブタイプのその対応するドメインにより置換され得る。ホスホリパーゼＣ／Ca²⁺シグナル路を活性化する受容体、たとえばmGluR1（Masuなど.，Nature 349，760-765）又は mGluR5の細胞内ドメインが、そのようなキメラ受容体の構成のために特に適切である。そのような交換のために適切な細胞内ドメインは、たとえば、ｉ２(Pinなど.，EMBO J．13，342-348(1994))としても言及される第２細胞内ループである。従って、たとえば、カルシウムイオンについてのアッセイを用いて本発明の受容体のリガンド結合ドメインと試験化合物との相互作用を分析することが可能である。本発明のキメラ受容体は、架橋タンパク質のために適切であるとして当業界において知られる組換え技法又は剤により合成され得る。凝集誘導体はたとえば、細胞膜との吸着複合体である。もう１つの態様において、本発明は、本発明のhmGluRサブタイプを含んで成る物質の組成物に関する。本発明のタンパク質は、薬物スクリーニングアッセイにおいて免疫源として、イムノアッセイのための及び精製方法において、たとえば結合リガンドの親和性精製のための試薬として有用である。本発明のタンパク質は、天然源から、たとえば脳組織からの単離により、化学合成により又は組換え技法により得られる。本発明はさらに、本発明のhmGluRサブタイプを製造するための方法を提供し、前記方法は本発明の受容体サブタイプを生成する適切な宿主細胞がインビトロ又はインビボで操作されることにより特徴づけられる。好ましくは、宿主細胞は、プロモーター、及びそのＤNAが前記プロモーターにより制御される前記サブタイプをコードする DNAを含んで成る発現カセットを含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換される（トランスフェクトされる）。続いて、本発明のhmGluR サブタイプが回収され得る。回収は、たとえば宿主細胞から本発明のサブタイプを単離するか又はたとえば培養ブイヨンからサブタイプを含んで成る宿主細胞を単離することを含んで成る。機能的活性受容体の調製のための方法が特に好ましい。 HmGluRムテインは、その DNAがたとえば、１又は複数のアミノ酸の付加、交換及び／又は欠失をもたらすインビボ変異誘発にゆだねられた本発明のhmGluRタンパク質をコードする DNAから生成され得る。たとえば、本発明のhmGluRサブタイプの置換、欠失及び挿入変異体は、組換え法により調製され、そしてhmGluRの天然形との免疫 −交差反応性についてスクリーンされる。本発明のタンパク質はまた、当業界において知られている従来の方法に従ってインビトロ誘導体化され得る。適切な宿主細胞は、真核細胞、たとえば動物細胞、植物細胞及び真菌、及び原核細胞、たとえばグラム陰性及びグラム陽性細菌、たとえばＥ．コリを包含する。好ましい真核宿主細胞は、両性類又は哺乳類起源のものである。本明細書で使用される場合、インビトロ（in vitro）とはエクスビボ(ex vivo )を意味し、従って、細胞培養及び組織培養条件を包含する。本発明はさらに、本発明のサブタイプをコードする精製された、好ましくは組換えの核酸（DNA，RNA）、又はそのような核酸のフラグメントを包含する。上記の組換えhmGluRタンパク質の生成のために有用である他に、それらの核酸は、プローブとして有用であり、従って、たとえば、本発明の hmGluR2タンパク質をコードする核酸の当業者への同定及び／又は単離を容易に可能にする。核酸はラベルされ得ず、又は検出可能な成分によりラベルされ得る。さらに、本発明の核酸は、たとえばhmGluRの存在を決定するための方法において有用であり、ここで前記方法は、サンプル核酸を試験し、そしてhmGluRの存在を決定するためにhmGluR をコードする（又はそれに対して相補的である）DNA(又はRNA)をハイブリダイズすることを含んで成る。本発明の、hmGluR2をコードする精製された核酸は、hmGluR核酸の天然源において通常関連している少なくとも１つの汚染核酸を有さない核酸を包含する。従って、精製された核酸は、天然において見出される形又は設定ではなく他の形又は設定で存在する。しかしながら、精製された hmGluR2核酸は、通常hmGluRを発現する細胞において hmGluR2を包含し、ここで前記核酸は天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置に存在し、あるいは、天然において見出される DNA配列とは異なった DNA配列を末端に有する。hmGluR2遺伝子は、ヒト染色体３に位置する。特に、本発明は、本発明の hmGluR2タンパク質をコードする精製された又は単離された DNA分子、又はそのような DNAのフラグメントを提供する。定義によれば、そのような DNAは、一本鎖コード DNA、前記コード DNAから成る二本鎖 DNA 及びそれに対する相補的 DNA、又はこの相補的(一本鎖)DNA自体を含んで成る。上記好ましい hmGluR2をコードする DNA、又はそのフラグメントが好ましい。さらに、本発明は、上記好ましい hmGluR2サブタイプをコードする DNA、又はそのフラグメントにも関する。さらに特定的には、hmGluR2をコードする DNA又はその一部、特に配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する hmGluR2をコードする DNA、たとえば配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する DNAが好ましい。本明細書において提供される核酸配列が、追加のhmGluRサブタイプをコードする DNAを同定するために使用され得る。たとえば、本発明の核酸配列は、同じ受容体サブファミリーに属する追加のhmGluRサブタイプをコードする DNAを同定するために使用され得る。そのような DNAを同定するための方法は、上記核酸プローブとヒト DNAとを接触せしめ、そしてそのプローブにハイブリダイズする DNA を同定することを含んで成る。本発明の典型的な核酸は他方では、本発明のhmGluRサブタイプをコードし、そして配列番号１に示される配列を有する DNA又は前記 DNAの選択された一部（フラグメント）にハイブリダイズするそれらの核酸として特徴づけられ得る。上記 DNAに対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする本発明のhmGluRをコードするそのような DNA分子が好ましい。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、ポリ核酸ハイブリッドが安定する条件を言及する。そのような条件は当業者に明らかである。当業者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、配列の相同性の１％の低下を伴って約１〜1.5 ℃ 低下するハイブリッドの融解温度（Tm）において影響される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオンの濃度及び温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、高い緊縮性の条件下で実施され、続いて種々の緊縮性での洗浄を伴う。本明細書において使用される場合、高い緊縮性は、65〜68℃で１ＭのNa⁺において安定したハイブリッドを形成する唯一のそれらの核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件を言及する。高い緊縮性の条件は、たとえば、６×SS C 、５×Denhardt、１％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1％ピロリン酸ナトリウム及び非特異的競争体としての 0.1mg／mlの変性サケ精子 DNAを含む水溶液におけるハイブリダイゼーションにより提供され得る。ハイブリダイゼーションに続いて、高い緊縮性の洗浄は、いくつかの段階により行なわれ得、そして 0 .2〜 0.1×SSC 、0.1％ SDSにおけるハイブリダイゼーション温度での最終洗浄（約30分）を伴う。適度な緊縮性は、上記溶液における（但し、約60〜62℃）ハイブリダイゼーションに同等の条件を言及する。この場合、最終洗浄は１×SSC 、0.1％ SDSにおいてハイブリダイゼーション温度で実施される。低い緊縮性は、約50〜52℃での上記溶液におけるハイブリダイゼーションに同等の条件を言及する。この場合、最終洗浄は、２×SSC 、0.1％ SDSにおいてハイブリダイゼーション温度で実施される。それらの条件は、種々の緩衝液、たとえばホルムアミド基材の緩衝液及び温度を用いて適合され、そして繰り返えされ得ることが理解される。Denhart溶液及び SSCは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液であるものとして当業者に良く知られている（たとえば、Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis，T. (1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd edition)，Cold Spring H arbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，USA 、又は Ansubel，F.M.，など（1993）Current Protocols in Molecular Biology，Green and Wiley，USAを参照のこと）。最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さ及びGC含有率がまた役割を演じるので、実験的に決定されるべきである。本発明の説明を付与する場合、本発明の核酸は当業界において良く知られている方法に従って得ることができる。本発明はさらに、そのような核酸の調製方法にも関する。たとえば、本発明の DNAは、化学合成により、組換え DNA技法により又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)により得ることができる。組換え DNA技法による調製は、適切なcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングを包含する。DNA又は本発明の DNAを調製するための適切な方法はたとえば、多くのオリゴヌクレオチドの合成、PCR法によるそれらの増幅及び所望する DNA配列を付与するためのそれらのスプライシングを含んで成る。適切なライブラリー、たとえば例において使用されるライブラリーは市販されており、又は神経又はニューロン組織サンプル、たとえば海馬又は小脳組織、細胞系及び同様のものから調製され得る。個々のhmGluRサブタイプ（及びスプライス変異体）に関しては、神経又はニューロン組織における発現パターンは種々である。従って、特定のサブタイプ（又はスプライス変異体）をコードするcDNAを単離するためには、種々の適切な組織又は細胞から調製されたライブラリーをスクリーンすることが好都合である。スクリーニングプローブとして、hmGluR2の全コード領域を実質的に含んで成る DNA又は RNA、又は前記 DNAに基づく適切なオリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。適切なオリゴヌクレオチドプローブ（スクリーニング関与のハイブリダイゼーションのための）は、配列番号１に示されるいづれか14個又はそれ以上の連続した塩基と同じである（又はそれに対して相補的である）少なくとも14個の連続した塩基を含むヌクレオチドの配列を有する一本鎖 DNA又は RNAである。そのプローブは、容易な検出のために適切な化学成分によりラベルされ得る。プローブとして選択された核酸配列は、誤った陽性の結果が最少にされるよう十分な長さのものであり、そして十分に明白なものであるべきである。プローブを構成するための好ましい領域は、５′及び／又は３′コード配列、リガンド結合部位をコードするように断定される配列及び同様のものを包含する。たとえば、本明細書に開示される十分な長さのcDNAクローン又はそのフラグメントのいづれかが、プローブとして使用され得る。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションに基づいての容易な検出のために適切なラベル手段によりラベルされる。たとえば、適切なラベル手段は放射性ラベルである。DNAフラグメントをラベルするための好ましい方法は、当業界において良く知られているように、ランダムプライミング反応において DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントと共に³²Ｐ−ラベルされたα−dATPを組込むことによる。しかしながら、他の方法（たとえば、非放射能）、たとえば酵素ラベリング及びビオチニル化がまた、フラグメント又はオリゴヌクレオチドをラベルするために使用され得る。全 hmGluR2コード配列を実質的に含む DNAの一部、又は前記 DNAの一部に基づく適切なオリゴヌクレオチドによるライブラリーのスクリーニングの後、陽性クローンがハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって同定され；その同定されたクローンは、制限酵素地図及び／又は DNA配列分析により特徴づけられ、そして次に、たとえば本明細書に示される配列との比較により、それらが完全なhmGluRをコードする DNAを含むかどうか（すなわち、それらが形質導入開始及び停止コドンを含むかどうか）を確かめるために試験される。選択されたクローンが不完全である場合、それらはオーバーラッピングクローンを得るために同じ又は異なったライブラリーを再スクリーンするために使用され得る。ライブラリーがゲノムである場合、オーバーラッピングクローンはエキソン及びイントロンを含むことができる。ライブラリーがcDNAライブラリーである場合、オーバーラッピングクローンは読み取り枠を含むであろう。両者の場合、完全なクローンは、本明細書に提供される DNA及び推定上のアミノ酸配列との比較により同定され得る。さらに、内因性 hmGluR2のいづれかの異常性を検出するためには、遺伝子スクリーニングがハイブリダイゼーションプローブとして本発明のヌクレオチド配列を用いて実施され得る。また、本明細書に提供される核酸配列に基づいて、アンチセンス型治療剤が企画され得る。本発明の核酸はヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入又はヌクレオチド拡張部の逆位、及びそれらのいづれかの組合せにより容易に変性され得ることが理解される。そのような変性された配列は、天然において見出される受容体サブタイプとは異なる変異hmGluRサブタイプを生成するために使用され得る。変異誘発は予定され得（特定部位）又はランダムであり得る。サイレント突然変異ではない突然変異は、読み取り枠からの配列を配置すべきではなく、そして好ましくは、二次mRNA構造体、たとえばループ又はヘアピンを生成するためにハイブリダイズできる相補的領域を創造しないであろう。本発明の天然又は変異hmGluRをコードするcDNA又はゲノム DNAは、さらなる操作のためにベクター中に導入され得る。さらに、本発明は、上記 DNAの少なくとも１つを含んで成るハイブリッドベクターである組換え DNAにも関する。本発明のハイブリッドベクターは、複製又は自律複製配列の起点、１又は複数の優性マーカー配列及び場合によっては、発現制御配列、シグナル配列及び追加の制限部位を含んで成る。好ましくは、本発明のハイブリッドベクターは、発現制御配列に操作可能的に連結される上記核酸挿入体、特にこの後に記載されるものを含んで成る。ベクターは典型的には、適切な宿主細胞と協力して２つの機能を実施する。１つの機能は、本発明のhmGluRサブタイプをコードする核酸のクローニングを促進すること、すなわち使用できる量の核酸（クローニングベクター）を生成することである。他の機能は、染色体外要素としての維持により又は宿主染色体（発現ベクター）中への組込みにより、適切な宿主において遺伝子構造体の複製及び発現を提供することである。クローニングベクターは、上記のような DNA、複製又は自律複製配列の起点、選択可能マーカー配列、及び場合によっては、シグナル配列及び追加の制限部位を含んで成る。発現ベクターはさらに、本発明の DNAの転写及び形質導入のために必須の発現制御配列を含んで成る。従って、発現ベクターとは、適切な宿主細胞中への導入に基づいて、クローン化された DNAの発現をもたらす組換え DNA構造体、たとえばプラスミド、ファージ、組換えウィルス又は他のベクターを言及する。適切な発現ベクターは当業界において良く知られており、そして真核及び／又は原核宿主において複製できるものを包含する。ほとんどの発現ベクターは、少なくとも１つの種類の生物において複製することができ、そして発現のために他の生物中にトランスフェクトされ得る。たとえば、ベクターはＥ．コリにおいてクローン化され、そして次に、その同じベクターは、それが宿主細胞の染色体とは無関係に複製することができない場合でさえ、酵母又は哺乳類細胞中にトランスフェクトされる。DNAはまた、宿主ゲノム中への挿入により増幅され得る。しかしながら、hmGluRをコードするゲノム DNAの回収は外因的に複製されたベクターの回収よりも複雑である。なぜならば、制限酵素消化がhmGluR DNAを切断するために必要とされるからである。DNAは PCRにより増幅され得、そしていづれの複製成分をも伴わないで宿主細胞中に直接的にトランスフェクトされ得る。好都合には、発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとしても言及される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培養培地において増殖される形質転換された宿主細胞の生存又は増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターにより形質転換されていない宿主細胞は、培養培地において生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性、補体栄養素要求欠損性、又は複合培地から利用できない供給臨界栄養素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。ベクターの増幅は便利には、Ｅ．コリにおいて行なわれるので、Ｅ．コリの遺伝子マーカー及びＥ．コリの複製の起点が好都合には、含まれる。それらは、Ｅ．コリのプラスミド、たとえばpBR322、Bluescriptベクター又は p UCプラスミドから得られる。哺乳類細胞のための適切な選択可能マーカーは、hmGluR核酸を摂取するのに有能な細胞の同定を可能にするもの、たとえばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR、メトトレキサート耐性）、チミジンキナーゼ、又はG418又はヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。哺乳類細胞トランスフェクタントは、マーカーを摂取しており、そしてそのマーカーを発現しているそれらのトランスフェクタントのみが生存するようユニークに適合される選択圧力下に配置される。発現及びクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、そして hmG luR2核酸に操作可能的に連結されるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、誘発でき又は構成的であり得る。そのプロモーターは、制限酵素消化により DNA源からプロモーターを除去し、そしてその単離されたプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、hmGluR2をコードする DNAに操作可能的に連結される。生来の hmGluR2プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両者は、hmGluR DNAの増幅及び／又は発現を指図するために使用され得る。しかしながら、異種プロモーターが好ましい。なぜならば、それらは一般的に、生来の hmGluR2プロモーターに比較される場合、発現された hmGluR2のより高い転写及びより高い収率を可能にするからである。真核宿主との使用のために適切なプロモーターはたとえば、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーターシステム及びハイブリッドプロモーター、たとえば tacプロモーターを包含する。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより、いづれかの必要とされる制限部位を供給するためのリンカー又はアダプターを用いて、hmGluRをコードする DNAへのそれらの操作可能的な連結を当業者に可能にする。細菌システムへの使用のためのプロモーターはまた、一般的に、hmGluR2をコードする DNAに操作可能的に連結されるShine-Delgarno配列を含むであろう。哺乳類宿主細胞におけるベクターからの hmGluR2遺伝子は、宿主細胞システムと適合できるプロモーター、たとえばウィルスのゲノムに由来するプロモーターにより制御され得る。真核宿主細胞における本発明のhmGluRサブタイプの発現のための適切なプラスミドは、たとえばサイトメガロウィルス(CMV)プロモーター含有ベクター、RSVプロモーター含有ベクター及びSV40プロモーター含有ベクター及び MMTVLTRプロモーター含有ベクターである。それらの調節の性質に依存して、プロモーターは実験条件により構成的であり又は調節可能であり得る。高等真核生物による本発明のhmGluRサブタイプをコードする DNAの転写は、ベクター中へのエンハンサー配列の挿入により高められ得る。ベクター DNAの種々の DNAセグメントは操作可能的に連結され、すなわちそれらはお互い隣接しており、そしてお互い機能的関係で配列される。本発明のベクターの構成は、従来の連結技法を用いる。単離されたプラスミド又は DNAフラグメントは、切断され、調整され、そして所望する形で再連結され、必要とされるプラスミドが生成される。所望により、構成されたプラスミドにおける正しい配列を確認するための分析は、当業界において知られている態様で実施される。発現ベクターを構成し、インビトロ転写体を調製し、宿主細胞中に DNAを導入し、そしてhmGluR発現及び機能を評価するために分析を実施するための適切な方法は、当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅及び／又は発現は、たとえばmRNAの転写体を定量化するためのノザンブロット、従来のサザンブロット、ドットブロット(DNA又は RNA分析)、本明細書に提供される配列に基づく適切にラベルされたプローブを用いての現場ハイブリダイゼーション、結合アッセイ、免疫検出及び機能的アッセイにより、サンプルにおいて直接的に測定され得る。適切な方法は、例に詳細に記載される方法を包含する。当業者は、所望により、それらの方法がいかに変性され得るかを容易に理解するであろう。本発明はさらに、本発明のhmGluRサブタイプを生成でき、そして前記サブタイプをコードする異種(外来性)DNAを包含できる宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、広範囲の種類の宿主細胞、たとえば適切な発現ベクターにより形質転換され又はトランスフェクトされる上記の細胞において発現され得る。本発明の受容体（又はその一部）はまた、融合タンパク質としても発現され得る。次に、組換え細胞は、本発明の DNAによりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養され得る。適切な真核生物は、真正細菌、たとえばグラム陰性又はグラム陽性生物、たとえばＥ．コリ、たとえばＥ．コリK-12株、DH5α及び HB101又はバチルス属を包含する。hmGluRをコードするベクターのために適切なさらなる宿主細胞は、真核微生物、たとえば糸状菌又は酵母、たとえばサッカロミセスセレビシアエ（Sa ccharomyces cerevisiae）を包含する。高等真核細胞は、昆虫、両性類及び脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞、たとえば神経芽細胞腫細胞系又は線維芽細胞由来の細胞系を包含する。好ましい哺乳類細胞系の例は、たとえばHEK293細胞、CHO細胞、CV１細胞、BHK細胞、Ｌ細胞、LLCPK-1細胞、CH３細胞、及び COS細胞である。最近、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は日常の方法になって来た。本出願において言及される宿主細胞は、インビトロ培養における細胞及び宿主動物内に存在する細胞を含んで成る。活性組換え hmGluR2の発現のための適切な宿主細胞は、好都合には、内因性又は組換えＧ−タンパク質を発現する。存在するなら、内因性向代謝性グルタミン酸受容体をほとんど生成しない細胞が好ましい。DNAは細胞中に安定して組込まれ、又は従来の方法に従って、一過性に発現され得る。安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞は、選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターにより細胞をトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクトされた細胞を、マーカー遺伝子を発現する細胞のために選択的である条件下で増殖することによって調製され得る。一過性トランスフェクタントを調製するためには、哺乳類細胞が、トランスフェクションの効能をモニターするために受容体遺伝子によりトランスフェクトされる。そのような安定して又は一過性にトランスフェクトされた細胞を生成するためには、細胞は、本発明のhmGluRを形成するために十分な量のhmGluR−コード核酸によりトランスフェクトされるべきである。本発明のhmGluRをコードする DNAの正確な量は、実験的に決定され得、そして特定の細胞及びアッセイのために最適化され得る。本発明の DNAはまた、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニック温血動物においても発現され得る。トランスジェニック動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、羊及びブタを生成するための方法は、当業界において知られており、そしてたとえばHammerなど．(Nature 315，680-683，1985)により開示されている。適切に配置された発現制御配列と共にhmGluRをコードする本発明の DNAを包含する発現単位は、受精された卵の前核中に注入される。注入は、たとえばマイクロインジェクションにより達成され得る。注入された DNAの組込みは、たとえば適切な組織サンプルからの DNAのブロット分析により検出される。注入された DNA は、それが動物の子孫に伝えられるように動物の胚系中に組込まれることが好ましい。さらに、ノックアウト動物は、mGluR配列に突然変異を導入し、それにより、機能的mGluR2遺伝子をもはや発現しない動物を生成することによって成長せしめられ得る。そのようなノックアウト動物は、たとえば代謝、特に正常な及び障害のある脳機能において向代謝性受容体の役割を研究するために有用である。より詳しくは、ノックアウト動物（すなわち、内因性mGluR2遺伝子をもはや発現しない動物）が成長せしめられ、ここで変異誘発された又は野生型 hmGluR2遺伝子を導入する。ノックアウトマウスを生成するための方法は当業界において知られている。ノックアウト動物は、公開された研究（たとえば、F.Conquetなど. ，Nature 372，237-243（1994）；A.Aibaなど.，Cell 79，365-375(1994)；M.Ma suなど.，Cell 80，757-765(1995)を参照のこと）により例示されるように、与えられた向代謝性受容体の役割を研究するためにのみならず、また、特に、相同ヒト受容体及び／又はいくつかのそのイソフォームをコードするトランス遺伝子を導入し、そして発現するための適切な遺伝子バックグラウンドを有する哺乳類動物モデルを供給するためにも有用である。相同遺伝子のノックアウトバックグラウンドに対するヒト相当受容体の発現は、受容体における種−特異的配列の差異により引き起こされる与えられた受容体（この場合、mGluR2）に対する薬物の効能における差異を排除するユニークな利点を有する。宿主細胞は、本発明の上記発現又はクローニングベクターによりトランスフェクトされ又は形質転換され、そしてプロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、又は所望する配列をコートする遺伝子を増幅するために適切なように変性された従来の栄養培地において培養される。異種 DNAは、当業界において知られているいづれかの方法、たとえばリン酸カルシウム同時沈殿技法、エレクトロポレーション又はリポフェクチン介在によっての異種 DNAをコードするベクターによるトランスフェクションにより宿主細胞中に導入され得る。多くのトランスフェクション方法は当業者に知られている。好結果をもたらすトランスフェクションは、一般的に、このベクターの操作のいづれかの指示が宿主細胞において生じる場合に認識される。形質転換は、使用される特定の宿主細胞に対して適切な標準の技法を用いて達成される。クローン化された DNAの適切な発現ベクター中への組込み、プラスミドベクター又はプラスミドベクターの組合せ（個々は１又は複数の明確な遺伝子をコードする）、又は線状 DNAによる真核細胞のトランスフェクション、及びトランスフェクトされた細胞の選択は当業界において良く知られている（たとえば、Sambro okなど．(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Co ld Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと）。トランスフェクトされた又は形質転換された細胞が、当業界において知られている培地及び培養方法を用いて培養され、それにより DNAをコードするhmGluRが発現される。適切な培地の組成物は当業者に知られており、その結果、それらは容易に調製され得る。適切な培養培地もまた、市販されている。本明細書に提供される DNAはいづれか適切な宿主細胞、たとえば上記に言及される細胞において発現され得るが、真核発現システム、特に哺乳類発現システム、たとえば市販のシステム及び当業者に知られている他のシステムが、機能的hmGluRをコードする DNAの発現のために好ましい。本発明のヒトmGluR2 DNAは、ベクター中に連結され、そして適切な宿主細胞中に導入され、本発明の hmGluR2、又は hmGluR2を包含するhmGluRサブタイプの特定の組合せを発現する形質転換された細胞系が生成される。次に、得られる細胞系が、受容体−特異的アゴニスト、アンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの効果の再生可能な定質及び定量分析のために十分な量で生成され得る。さらに、mRNAは、本発明のサブタイプをコードする DNAのインビトロ転写により生成され得る。このmRNAがアフリカツメガエルの卵母細胞中に注入され、ここで mRNAが活性受容体サブタイプの合成を指図する。他方、サブタイプコードの DNA が卵母細胞中に直接的に注入され得る。次に、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は注入された卵母細胞が、この後に提供される薬物スクリーニングアッセイに使用され得る。そのような薬物は、本発明のhmGluRサブタイプの病因に関連する疾病に使用され得る。そのような疾病は、hmGluRにより選択的に介在されるグルタミン酸の過度の作用に起因する疾病、たとえば発作、癲癇、及び慢性神経発生性疾病を包含する。本発明のhmGluRを発現する安定してトランスフェクトされた細胞系は、特定のhmGluRサブタイプと化合物との特異的相互作用を評価するために特に有用である。本発明のhmGluRを発現する宿主細胞は、薬物スクリーニングのために有用であり、そして hmGluR2の活性を調節する化合物又はシグナルを同定するための方法を提供することが本発明のさらなる目的であり、前記方法は本発明のhmGluRをコードする異種 DNAを含む細胞（機能的 hmGluR2を生成する）を、前記hmGluRの活性を調節する能力が決定されるために要求される少なくとも１つの化合物又はシグナルに暴露し、そしてその後、前記調節により引き起こされる変化について前記細胞をモニターすることを含んで成る。そのようなアッセイは、本発明のhmGluRのアゴニスト、アンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターの同定を可能にする。さらなる観点において、本発明は hmGluR2の活性を調節する化合物を同定するためのアッセイに関し、ここで前記アッセイは、 −活性 hmGluR2を発現し、そして前記hmGluRサブタイプをコードする異種 DNA を含む細胞と、前記受容体の活性を調節するその能力について試験されるべき少なくとも１つの化合物とを接触せしめ；そして −第２メッセンジャーレベル又は受容体活性の差異について細胞を分析することを含んで成る。特に、本発明は、hmGluR2の活性を調節する化合物を同定するためのアッセイに関し、ここで前記アッセイは、 −活性 hmGluR2を発現し、そして前記hmGluRサブタイプをコードする異種 DNA を含む細胞と、前記受容体の活性を調節するその能力について試験されるべき少なくとも１つの化合物とを接触せしめ；そして −第２メッセンジャー活性における得られる変化について前記細胞をモニターすることを含んで成る。アッセイにおいて得られる結果は、負の対照として適切なアッセイに比較される。アッセイ方法は一般的に、種々の対照への比較を要する。受容体活性又は第２メッセンジャーレベルの変化は、そのような効果が試験化合物の不在下で生じない場合、試験化合物により誘発されると言われている。本発明の受容体サブタイプに対する試験化合物の効果は、この効果が受容体を発現しない細胞において観察されない場合、前記受容体により介在されると言われている。本明細書で使用される場合、本発明のhmGluRの活性を調節する化合物又はシグナルは、細胞内の hmGluR2により介在される応答経路を変える化合物又はシグナルを意味する（前記hmGluRの不在に比較される場合）。応答経路は細胞外刺激により活性化され、第２メッセンジャー濃度又は酵素活性の変化をもたらし、又は膜結合タンパク質、たとえば受容体又はイオンチャネルの活性の変化をもたらす。種々の応答経路、たとえばアデニル酸シクラーゼ応答経路、ホスホリパーゼＣ／細胞内カルシウムイオン応答経路、又はイオンチャネルへの受容体の結合を包含する応答経路が利用され得る。アデニル酸シクラーゼ活性を決定するためのアッセイは、当業界において良く知られており、そしてたとえば、Nakajimaなど. ，(J.Biol.Chem．267，2437-2442(1992))により開示されるアッセイを包含する。従って、hmGluR2を発現する細胞は、化合物、特にグルタミン酸アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することができる低分子量分子の同定のために使用され得る。1,000ドルトン以下の低分子量分子が好ましい。本発明の範囲内で、アゴニストは、hmGluR2と相互作用することができ、従って、Ｌ−グルタミン酸の作用を模倣する分子を言及するものとして理解される。特に、グルタミン酸アゴニストは、本発明のhmGluRと相互作用するし、そしてそれにより、細胞内の応答経路の刺激を高め又は低めるその能力により特徴づけられる。たとえば、アゴニストは、宿主細胞内の測定可能なパラメーター、たとえば第２メッセンジャーの濃度を、天然のリガンドが前記パラメーターを高めたり又は低めたりするように、高めたり又は低めたりする。たとえば、本発明のhmGluRがアデニル酸シクラーゼに消極的に結合される適切な試験システム、たとえば hmGluR2を発現する C HO細胞又は BHK細胞において、そのようなアゴニストは、cAMPの細胞内濃度が低められるように hmGluR2の機能を調節することができる。対照的に、hmGluR2の活性を和らげることが所望される情況においては、アゴニスト分子が有用である。本発明の範囲内で、アゴニストは、hmGluR2と相互作用できるが、しかし細胞内の応答経路を刺激しない分子に関することが理解される。特に、グルタミン酸アゴニストは一般的に、本発明の hmGluR2と相互作用するそれらの能力により同定され、そしてそれにより、たとえば本発明のhmGluRへのＬ−グルタミン酸の結合を妨害することにより、又はhmGluRの活性のために必要とされる他の細胞機能を阻害することにより、細胞内の応答経路を刺激する天然のリガンドの能力を減じる。たとえば、適切なアッセイ、たとえば hmGluR2を発現する CHO細胞又は BHK細胞を包含するアッセイにおいては、グルタミン酸アゴニストは、細胞内cAMP濃度を低める天然のリガンドの能力が弱められるように本発明のhmGluRの活性を調節することができる。アンタゴニスト効果を達成するためのさらにもう１つの選択は、アンチセンスhmGluR RNAの過剰発現に依存する。hmGluR2に対して選択的に作用するアゴニスト又はアンタゴニストが好ましい。いづれか他のサブタイプの活性に影響を及ぼさないで、hmGluR2の活性を特異的に調節するアゴニスト又はアンタゴニストが特に有用である。本発明のアロステリックモジュレーターは、Ｌ−グルタミン酸以外の部位で受容体タンパク質と相互作用し、従ってアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。従って、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、また、本発明の受容体のアロステリックモジュレーターを検出するためにも有用である。たとえば、アゴニストとして作用するアロステリックモジュレーターは、本発明のhmGluRとＬ−グルタミン酸との間での特定の相互作用を高めることができる。アロステリックモジュレーターがアンタゴニストとして作用する場合、それは、アゴニストの結合が機能的にほとんど効果的でないような手段で受容体タンパク質と相互作用できる。グルタミン酸アゴニスト又はアンタゴニストについてのインビトロアッセイは、本発明のhmGluRが組換え DNA法を用いて機能的形で十分な量で生成されることを必要とする。次に、hmGluR2タンパク質の機能的性質、たとえばグルタミン作用性リガンドとの相互作用を測定するアッセイが企画される。本発明のhmGluRの生成は、前記受容体の活性が測定可能な応答をもたらす場合、十分な量で生じるものとして見なされる。たとえば、哺乳類細胞、たとえばHEK293細胞、Ｌ細胞、CHO-K1細胞、LLCPK-1 細胞又はGH３細胞（たとえば、American Tissue Type Culture Collectionから入手できる）は、減じられたグルタミン酸、好ましくはグルタミン酸を含まない培地において増殖するよう適合される。hmGluR発現プラスミド、たとえば例に記載されるプラスミドは、たとえばリン酸カルシウム沈殿法(Ansubel，F.M.，など (1993)Current Protocols in Molecular Biology，Greene and Wiley，USA)により細胞中に過渡的にトランスフェクトされる。本発明のhmGluRを安定して発現する細胞系は、たとえば hmGluR2発現プラスミド及び選択マーカー遺伝子を含んで成るプラスミド、たとえばpSV2-Neo（Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet．1 ．327-341(1982)）、G-418耐性遺伝子をコードするプラスミドベクターによるリポフェクチン介在トランスフェクションにより生成され得る。選択を生存する細胞が単離され、そして選択培地において増殖される。耐性クローン細胞が、たとえばサブタイプ特異的抗体との免疫反応性について又はアゴニストの添加に続く、hmGluRの機能的応答についてのアッセイにより分析される。所望するhmGluRサブタイプを生成する細胞は、本発明のhmGluRに結合する化合物を検出するための方法又はグルタミン酸アゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法に使用される。さらなる態様においては、本発明は hmGluR2に結合する化合物を同定するための方法を提供し、前記方法は本発明のhmGluRサブタイプを競争結合アッセイに使用することを含んで成る。競争結合アッセイ下にある原理は一般的に当業界において知られている。手短に言及すれば、結合アッセイは、hmGluR2標的分子で結合部位のために既知の、安定してラベルされたグルタミン酸作用性リガンドと競争するその hmGluR2結合能力についての前記化合物の試験を可能にすることにより実施される。適切にラベルされたリガンドは、たとえば放射性ラベルされたリガンド、たとえば〔³Ｈ〕グルタミン酸、又はその光学性質、たとえば吸光度又は螢光性により検出され得るリガンドである。結合されていないリガンド及び試験化合物を除去した後、hmGluR2に結合されるラベルされたリガンドの量が測定される。ラベルされたリガンドの量が試験化合物の存在下で減じられる場合、この化合物は標的分子に結合されたと言われる。競争結合アッセイは、本発明のhm GluRを発現する形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞、又は本発明のhmGluRを含んで成る膜細胞画分により実施され得る。標的hmGluRに結合される化合物は、hmGluR2の機能的性質を調節することができ、又はそれにより、機能的アッセイにおいてグルタミン酸アゴニスト又はアンタゴニストとして同定され得る。機能的アッセイは、本発明の hmGluR2の機能的活性の変化を検出するために、すなわち、たとえば前記hmGluRと試験されるべき化合物との相互作用の結果として機能的応答を検出するために使用される。機能的応答は、たとえば、相当する第２メッセンジャーの濃度の変化（差異）、又は機能的 hmGluR2を発現する細胞内での本発明の受容体により影響される他の膜結合タンパク質の活性の変化である（負の対照と比較される場合）。当業者は活性 hmG luR2の発現を示す細胞内第２メッセンジャーのレベルの変化を検出するために適切なアッセイを容易に同定することができる（機能的アッセイ）。例は、cAMPアッセイ（たとえば、Nakajimaなど.，J.Biol.Chem．267，2437-2442（1992）を参照のこと）、cGMPアッセイ（たとえば、 Steinerなど.，J.Biol.Chem．247，110 6-1113（1972）を参照のこと）、ホスファチジルイノシトール（PI）ターンオーバーアッセイ（Nakajimaなど.，J.Biol.Chem．267，2437-2442（1992）を参照のこと）、カルシウムイオン流動アッセイ(Itoなど.，J.Neurochem．56，531-540( 1991)を参照のこと)、アラキドン酸開放アッセイ（たとえば、Felderなど.，J.B iol.Chem．264，20356-20362（1989）を参照のこと）及び同様のアッセイを包含する。より特定には、本発明によれば、グルタミン酸アゴニストを検出するための方法は、（ａ）応答経路に結合される本発明のhmGluRサブタイプに化合物を、前記受容体と前記化合物との相互作用及び前記経路を通しての関連する応答を可能にする条件下で及び十分な時間、暴露し、そして（ｂ）試験される化合物の不在に関して、hmGluR2と前記化合物との相互作用に起因する応答経路の刺激の上昇又は低下を検出し、そしてそれから、グルタミン酸アゴニストの存在を決定する段階を含んで成る。グルタミン酸アンタゴニストを同定するための方法は、（ａ）応答経路に結合される hmGluR2に、既知のグルタミン酸アゴニストの存在下で化合物を、前記受容体と前記アゴニストとの相互作用及び前記経路を通しての関連する応答を可能にするのに十分な条件下で及び十分な時間、暴露し；そして（ｂ）グルタミン酸アゴニストのみによる応答経路の刺激に関して、前記化合物と hmGluR2との相互作用に起因する、前記アゴニストにより誘発される応答経路の刺激の阻害を検出し、そしてそれから、グルタミン酸アンタゴニストの存在を決定する段階を含んで成る。阻害は、試験化合物が hmGluR2 のためのグルタミン酸アゴニストと競争する場合、検出され得る。そのような方法を用いてスクリーンされ得る化合物は、hmGluR2に特異的に結合するブロッキング抗体を包含する。さらに、そのようなアッセイは、Ｌ−グルタミン酸と相互作用する化合物についてのスクリーニングのために有用である。この場合、アゴニスト効果は、たとえばアゴニストへの試験化合物の結合により中和され又は減じられ、従って、受容体とのアゴニストの相互作用に影響を及ぼす。例は、リガンド結合ドメインの一部又はすべてを含んで成る可溶性hmGluRフラグメントである。好ましくは、本発明の hmGluR2とアゴニスト又はアンタゴニストとの相互作用は、前記hmGluRへのアゴニスト又はアンタゴニストの結合を示す。本明細書で使用される場合、グルタミン酸アゴニスト又はアゴニスト候補体と受容体との相互作用のために十分な条件及び時間は、受容体源により変化するが、しかしながら、結合のために一般的に適切な条件は、約４℃〜約40℃、好ましくは、約４℃〜約37℃の温度、０〜２ＭのNaCl、好ましくは０〜0.9 ＭのNaClの緩衝液(0.1ＭのNaClが特に好ましい）、及び５〜９のpH、好ましくは 6.5〜８の pHである。結合及び応答のための十分な時間は一般的に、暴露の後、約１分〜約 24時間であろう。本発明の１つの態様においては、応答経路は膜結合のアデニル酸シクラーゼ経路であり、そしてアゴニストに関して、検出する段階は、相当する対照の構成におけるcAMP生成に関して、膜結合のアデニル酸シクラーゼ応答経路によりcAMP生成の低下又は上昇、好ましくは低下を測定することを含んで成る。本発明のためには、cAMP生成の低下又は上昇は、そのIC₅₀値に対応する濃度で適用されるＬ−グルタミン酸により誘発される低下又は上昇に等しいか又はそれよりも高いことが好ましい。アンタゴニストに関しては、検出の段階は、アンタゴニストの不在下でのcAMP生成に比較して、膜結合のアデニル酸シクラーゼ応答経路によるcAMP生成のＬ−グルタミン酸誘発された低下又は上昇をアンタゴニストの存在下で測定することを含んで成る。cAMPの測定は、細胞の破壊の後、又は細胞中に位置するcAMP感受性分子プローブ、たとえばcAMPの結合に基づいて、その性質、たとえばその螢光性質を変える螢光色素により実施され得る。環状 AMP生成は、当業界において良く知られている方法、たとえばNakajimaなど.,（前記）により記載される方法を用いて、又は市販のキット、たとえば放射性ラベルされたcAMP、たとえば〔¹²⁵I〕cAMP又は〔³H〕cAMPを含んで成るキットを用いて測定され得る。代表的なキットは、ヨウ素化されたcAMPとcAMP抗体との競争によりcAMPの生成を測定する、Amershamからの Scintillation Proximity A ssay Kit、又はAmershamからのCyclic AMP〔³H〕Assay Kit である。アデニル酸シクラーゼ経路に消極的に結合される hmGluR2を発現する細胞を用いる、すなわち刺激に基づいてcAMPの低下及び刺激の低下に基づいてcAMPの上昇を引き起こすアッセイシステムにおいては、アデニル酸シクラーゼを可逆的又は不可逆的に刺激する化合物、たとえばホルスコリン、又はホスホジエステラーゼインヒビターである化合物、たとえばイソブチルメチルキサンチン（IBMX）に細胞を、（潜在的な）受容体アゴニスト又はアンタゴニストの付加の前に暴露することが好ましい。本発明のもう１つの態様においては、応答経路は、PI加水分解／Ca²⁺移動経路である。本発明のhmGluRサブタイプと試験化合物との特異的な相互作用を決定するためのそのようなアッセイは、細胞内カルシウムイオン（Ca²⁺）濃度の変化に機能的に関連される。Ca²⁺の細胞内濃度の変化を決定するためのいくつかの方法、たとえば螢光感受性色素、たとえばfura-2(Grynkiewiszなど.，J.Biol.Chem． 260，3440-3450，1985)、fluo-3又はIodo-Iを包含する方法、たとえば Charest など．(J.Biol.Chem．259，8679-8773(1993))により記載されるカルシウム fluo r Quinz方法、又はNakajima-Shimada（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 88，6878-6882 (1991)）により記載されるアエクオリン発光タンパク質方法は当業界において知られている。本発明の１つの態様においては、細胞内カルシウムイオン濃度が、カルシウム感受性螢光色素fluo-3又はfura-2により負荷された組換え細胞においての微小螢光定量法により測定される。それらの測定は、単一の細胞レベルでのカルシウム濃度を測定するために逆顕微鏡及びビデオ−像化技法又は螢光光度計の使用を可能にするカバーグラスにおいて増殖された細胞を用いて行なわれ得る。両アプローチのためには、hmGluR2発現プラスミドにより形質転換された細胞が、カルシウム指示体により負荷されるべきである。最後に、増殖培地が細胞から除去され、そしてfura-2又はfluo-3を含む溶液により置換される。細胞は、続く８時間、カルシウム測定のために選択的に使用される。微小螢光定量法は次の標準工程の通りである。化合物と標的分子との機能的相互作用に起因するCa²⁺シグナルは、前記化合物が制限された時間、たとえば流灌システムを通して適用される場合、過渡的であり得る。過渡的な適用を用いれば、いくつかの測定が、内部対照及び高い数の化合物の試験を可能にする同じ細胞により行なわれ得る。 Ca²⁺シグナルへの本発明のhmGluRの機能的結合は、次の種々の方法により、たとえば CHO細胞において達成され得る：（ｉ）本発明の組換えhmGluR、及び組換えボルテージ−ゲートカチオンチャネル（この活性は、hmGluR2の活性に機能的に連結されている）の同時発現；（ii）PI／Ca²⁺経路を直接的に刺激するキメラhmGluR受容体の発現；（iii）組換えCa²⁺−透過性cAMP依存性カチオンチャネルと本発明の組換えhmG luRとの同時発現。他の発現システムにおいては、Ca²⁺シグナルへの hmGluR2の機能的結合は、それらの細胞が、（ｉ）ボルテージ−ゲートCaチャネル（この活性は、mGluRの活性に機能的に連結されている）、又は（ii）Ca²⁺−透過性cAMP依存性イオンチャネルを天然において発現する場合、本発明のhmGluRのトランスフェクションにより達成され得る。たとえば、ボルテージ−ゲートCaチャネルを天然において発現するCH３細胞は、hmGluRの同時トランスフェクションによる hmGluR2機能的活性についての試験へのCa²⁺アッセイの適用を直接的に可能にする。さらに、細胞に基づくスクリーニングアッセイは、たとえば受容体タンパク質、すなわち容易にアッセイできるタンパク質、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)又はルシフェラーゼの発現が本発明のhmGluRの機能に依存する細胞系を構成することによって企画され得る。たとえば、cAMP応答要素を含んで成る DNA構造体が、ルシフェラーゼをコードする DNAに操作可能的に連結される。酵素 DNAを含んで成るその得られる D NA構造体は、宿主細胞中に安定してトランスフェクトされる。次に、宿主細胞は、受容体の発現のために必要な追加の DNAセグメントに操作可能的に連結される、本発明のhmGluRをコードする第１の DNAセグメントを含む第２ DNA構造体によりトランスフェクトされる。たとえば、本発明のhmGluRへのアゴニストの結合が低められたcAMPレベルをもたらす場合、ルシフェラーゼの発現は、選択されるプロモーターに依存して、誘発され又は低められる。ルシフェラーゼはルシフェリンに暴露され、そしてルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化の間に発せられる光子が測定される。本発明において提供される薬物スクリーニングアッセイは、受容体サブタイプ −特異的化合物、特に hmGluR2に結合するリガントの同定及び企画を可能にし、結果的に、疾病特異的薬物の開発を導びく。唯一の特定のhmGluRサブタイプとのひじょうに特異的な相互作用（又はhmGluRサブタイプの予定された選択）のために企画される場合、そのような薬物は、（未知の）種々の受容体サブタイプを発現する細胞によりスクリーンすることにより同定される薬物よりも低い所望しない副作用を示す傾向がある。また、本発明の単一の受容体サブタイプ、又は異なった受容体サブタイプと種々の潜在的なアゴニスト又はアンタゴニストとの特定の組合せの試験は、個々の hmGluR2の機能及び活性に関して追加の情報を提供し、そして１又は複数の受容体サブタイプとのひじょうに特異的な相互作用を行なうことができる化合物の同定及び企画を導びく。もう１つの態様において、本発明は、hmGluR2に対して生成されるポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。そのような抗体は、たとえば免疫組織化学を包含するイムノアッセイ並びに診断及び治療用途のために有用である。たとえば、hmGluR2の細胞外ドメイン、又はその一部に対して特異的な抗体は、内因性hmGluRサブタイプをブロックするために適用され得る。本発明の抗体は、本発明のhmGluR、そのフラグメント又は前記サブタイプ又はフラグメントを発現する細胞を抗原として用いて、当業界において良く知られている方法に従って調製され得る。前記抗原は、本発明の受容体の活性又は不活性形を表わすことができる。抗体は、活性形又は不活性形の間を区別することができる。抗原（合成ペプチド又は融合タンパク質として）としてサブタイプフラグメントの選択において見なすための要因は、特定のサブタイプに対する抗原性、接近性（すなわち、細胞外及び細胞質ドメイン）及び独特性を包含する。 hmGluR2を選択的に認識し、そしてそれに結合する抗体が特に有用である。本発明の抗体は、標準方法を用いて、それを必要とする患者に適用され得る。当業者は、使用される投与の態様に依存して、投与形、処理法、等を容易に決定することができる。本発明は、本発明を例示するが、しかし限定しない例に記載されるような特定の態様に関する。略語：hmGluR＝ヒト向代謝性グルタミン酸受容体；nt＝ヌクレオチド。例１： hmGluR2をコードするcDNAのクローニング及び発現 1.1 ヒト脳からのcDNAクローニングラット mGluR2 cDNAのＮ−末端及びＣ−末端フラグメント（フラグメントnt 1 92−518 及びフラグメント nt 1983−2810、Tanabeなど.，Neuron ８，169-179( 1992)）を、ラット前脳の一本鎖 DNAからの PCRにより生成する。一本鎖cDNA合成を、１μｇのラット前脳ポリ(A)⁺RNA 、80Ｕの M-MLV逆転写酵素(BRL)、25mMのトリス−HCl、pH 8.3、37.5mMの KCl、1.5mMの MgCl₂、10mMのジチオトレイトール、それぞれ１mMのdATP，dCTP， dGTP，dTTP、50mg／mlのoligo-dT_12-18（Pharmacia）、及び２ＵのRNAsin(Prome ga)により37℃で60分間、行なう。PCRのために使用される５′及び３′プライマーは、Ｎ−末端フラグメント(ヌクレオチド 192−518)のために ATGGAATCACTGCT TGGGTT/TGAGGCAGGCACAAAGTCCA及びＣ−末端フラグメント（ヌクレオチド1983−2 810）のためにGTCAAGGCTTCCGGTCGGGA/TCAAAGCGACGACGTTGTTGAである。PCR反応を、次の条件下で、GeneAMP DNA増幅キット（Perkin Elmer Cetus）を用いて行なう：93℃で 0.5分、56℃で 1.5分、及び72℃で３分、40回のサイクル。増幅された DNAを、ゲル精製し、pBluescript SKの SmaＩ部位中にクローン化し、そして DNA配列決定(Sequenase T7 Polymerase Kit，United States Biochemicals)により特徴づける。oligo-(dT)及びランダムにプライムされたポリ(A)⁺RNA からLa mbda-ZAPII（Stratogene）において構成された、２×10⁶個のプラークのヒト胎児脳及びヒト成人海馬cDNAライブラリーを、Ｎ−及びＣ−末端ラットmGluR2プローブにより連続的にスクリーンする。向代謝性 GluR2プローブを、〔α-³²P］dC TPを用いてのゲル精製されたフラグメントのランダムプライミングにより生成する。ハイブリダイゼーションを、５×SSC ／５×Denhardt／50mMの Na₂HPO₄／10 mMのEDTA／１％の SDS／50μｇ／mlのニシン精巣 DNA／20μｇ／mlの酵母 DNAにおいて60℃で一晩、実施する。洗浄を、５×SSC ／ 0.2％の SDS、２×SSC ／ 0 .2％の SDS、及び１×SSC ／ 0.2％の SDSにおいて、それぞれ25℃で30分間、行なう。Ｎ−及びＣ−末端のラットmGluR2フラグメントにハイブリダイズする５つのプラークを第２及び第３回目のスクリーニングにより精製し、そして５つのcD NA挿入体をインビボ切除により Bluescript SKファージミド中に供給する。cDNA 挿入体を、制限酵素地図及び D NA配列決定により特徴づける。cDNAクローンは、５′及び３′末端でのみ異なる制限地図を示す。最大のcDNAクローン、すなわち hmGIuR2.1は、4.1kbの KpnＩ／ NotＩフラグメントを含む。完全なコード配列を両鎖に基づいて配列決定する。hmGluR2タンパク質をコートする DNA配列及び推定されるアミノ酸配列を、それそれ配列番号１及び２に示す。 1.2 hmGluR2発現構造体の構成及び哺乳類細胞における発現 cDNA hmGluR2.1の 4.1kb挿入体を、哺乳類発現ベクターpSMC（Asselbergs and Grand，1993）におけるマウス CMVプロモーターの下流のブラント末端化された NotＩ／ KpnＩ部位中にクローン化し、発現構造体 pSMChmGluR2をもたらす。チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO-K1）を、リポフェクチン介在の遺伝子トランスファー(Gibco-BRL)を用いて、pSMChmGluR2及びpSV2-Neo（Southern and B erg，Journal of Molecular and Applied Genetics 1，327-341 (1982)）により同時トランスフェクトする。32の G-418耐性クローン細胞系を単離し、そしてcA MPラジオイムノアッセイ（前記を参照のこと）を通して抗− hmGluR2抗体との免疫反応性（免疫検出、前記を参照のこと）及びアゴニストの添加に続く機能的応答によるmGluR2タンパク質発現について分析する。例２：サブタイプ特異的hmGluR抗体による hmGluR2タンパク質発現の免疫検出 HmGluR2発現を、サブタイプ特異的hmGluR抗体による免疫細胞化学により分析する（例５を参照のこと）。トランスフェクション後１〜３日で細胞をリン酸緩衝溶液(PBS)により２度、洗浄し、PBS／４％パラホルムアルデヒドにより10分間、固定し、そして PBSにより洗浄する。細胞を PBS／ 0.4％ Triton X-100 により透過性にし、続いて、PBS／10mMのグリシン及び PBSにより洗浄する。細胞をPBSTB(１×PBS ／ 0.1％ Triton X-100 ／１％ BSA）により１時間ブロックし、そして続いて、免疫精製されたhmGluR抗血清(PBSTBにおいて 0.5〜2.0 μｇ／ ml)と共に１時間インキュベートする。 PBSによる３回の洗浄の後、細胞を、アルカリペルオキシダーゼ接合の抗−ウサギIgG（PBSTBにおいて１：200 ；Jackso n Immuno Research)と共に１時間インキュベートする。細胞を PBSにより３度、洗浄し、そして免疫反応性を 0.4mg／mlのナフトールホスフェート（Biorad）／１mg／mlのFast Red（Biorad）／10mMのLevamisole(Sigma)／ 100mMのトリス／H Cl 、pH 8.8／ 100mMのNaCl／50mMの MgCl₂により検出する。染色反応を、続く PBSによる洗浄により15分後に停止する。それぞれ hmGluR2を均質的に発現する４つの細胞系を、免疫染色により同定する。例３：受容体活性のモジュレーターのスクリーニングへの hmGluR2を発現する安定した細胞系の使用 hmGluR2を発現する安定した細胞系を用いて、アゴニスト、アンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターについてスクリーンする。そのような化合物を、〔³Ｈ〕グルタミン酸を用いての結合研究、及び細胞内第２メッセンジャーレベル（〔cAMP〕、〔Ca²⁺〕）の変化の測定により同定する。 3.1 cAMPラジオイムノアッセイリガンド結合、及びホルスコリン刺激されたcAMP蓄積のアゴニスト誘発された低下（細胞内cAMP濃度の変化）を、cAMPラジオイムノアッセイ（Amersham）により分析する。細胞を、ウェル当たり 0.5〜 2.0×10⁵個の細胞の密度で12−ウェルプレートに接種し、そして細胞の集密的層が得られるまで、２〜４日間、増殖する。細胞を PBSにより２度洗浄し、そして１mMの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（IBMX）を含む PBSにおいて20分間インキュベートをする。細胞を、10μＭのホルスコリン、１mMのIBMX及び既知のhmGluRアゴニストを含む新鮮な PBSと共に20分間インキュベートする。アゴニスト効果を停止し、そして細胞により生成されるcAMPを、薬物含有の培地をアスピレートした後、１ml のエタノール−水−HCl 混合物(100mlのエタノール、50mlの水、１ＭのHCl １ml )を添加することによって開放する。cAMPレベルを、〔³H〕cAMP（Amersham）を包含するcAMPラジオイムノアッセイにより決定する。 HmGluR2は、CHO細胞において発現される場合、アデニル酸シクラーゼに消極的に結合される。アゴニスト結合は、ホルスコリン誘発されたcAMP蓄積の阻害を導びく。アゴニスト能力の順位は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−α−（カルボキシシクロプロピル）−グリシン＞（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３ −ジカルボン酸＝Ｌ−グルタミン酸＞キスカル酸である。 3.2 細胞内〔Ca²⁺〕の測定 hmGluR2発現プラスミド、たとえば上記発現プラスミドにより形質転換された細胞を、カルシウム感受性螢光色素、たとえばfura-2又は fluro-3により負荷する。これを達成するために、細胞を単一のウェル、カバーグラスを含むウェル、又は96−ウェルプレートにプレートし、そして細胞の50〜100 ％集密的層が得られるまで、１〜５日間、増殖する。ウェルを平衡塩類溶液(BBS)により３度洗浄し、そして BBSにおいて１時間インキュベートし、続いて BBSによりさらに３回洗浄する。次に、細胞を、50μｇのfura-2-AM(又はfluro-3-AM)(Molecular Prob es，Inc.)、4.99mlの BBS、75μｌのDMSO及び6.25μｇのPluronic(Molecular Pr obes，Inc)を含む溶液において20〜60分間インキュベートする。細胞を、２mg／ mlのウシアルブミンを含む BBSにより３度洗浄し、続いて、BBSにより３度洗浄する。少なくとも10分間、細胞の回収を可能にした後、それらを〔Ca²⁺〕の微小螢光定量測定のために使用する。細胞を、螢光定量のための装置、たとえば逆顕微鏡、螢光読取りのスペクトロメーターに移す。カルシウム指示体（たとえばfura-2又はfluo-3）の螢光を、色素(fura-2、340／380nm 、fluo-3、480nm)の励起スペクトルにより包含される波長の光による照射により誘発する。細胞内フリーカルシウムイオンの上昇を、それぞれ、３40nm及び 480nmで励起されるfura-2又は fluro-3螢光の上昇として、又は 380nmで励起するfura-2螢光の低下としてモニターする。陽性の対照として、Ｌ−グルタミン酸を細胞に対してそのEC₅₀値に対応する濃度で適用し、それにより、細胞内カルシウムイオン濃度の測定できる上昇を誘発する。試験化合物は、それがグルタミン酸により誘発されるCa²⁺シグナルに比較できるCa²⁺シグナルを誘発する場合、アゴニストであると言われる。試験化合物は、グルタミン酸誘発されたカルシウムイオンが試験化合物の不在下でよりも試験化合物の存在下で少ない場合、アンタゴニストであると言われる。例４：キメラ性 hmGluR2 mGluR1の細胞内ドメイン、特に第２細胞内ループ（ｉ２）及びＣ−末端領域は、受容体の薬理学的プロフィールを変えないで、ホスホリパーゼＣ／Ca²⁺シグナル経路を活性化するＧ−タンパク質の結合のために臨界であることが示されている(Pinなど.，EMBO J．13, 342-348(1994))。従来の PCR変異誘発技法が、hmGlu R1の対応するドメインによりhmGluRs2の細胞内ドメインを変換するために使用される。安定した CHO細胞系を、Ca²⁺−依存性アッセイを用いて、受容体活性(hmG luR2)のモジュレーターの影響の分析を可能にする hmGluR2／１キメラ発現構造体により生成する。（ｉ）cDNAクローン hmGluR2.1をキメラの構成のために使用する。(ii)hmGluR1のトランスメンブラン領域を、Masuなど.，1991 、前記、に由来するプライマーを用いて PCRによりクローン化する。次の配列：５′−TATCTTGA GTGGAGTGACATAG−３′を有するオリゴヌクレオチド（Masu配列の nt 1753〜1774 に対応する）を、センスプライマーとして使用する。アンチセンスプライマーは、Masu配列の nt 2524〜2544に対応する次の配列：５′−ACTGCGGACGTTCCTCTCAG G −３′を有する。スプライス変異体１ａ，１ｂ及び１ｃのＣ−末端を、それぞれMasuなど.，1991，Tanabe など.，1992 、及び Pinなど.，(Proc.Natl.Acad.S ci．USA，89，10331-10335(1992))に由来するプライマーを用いて PCRにより切断する。次の配列：５′−AAACCTGAGAGGAACGTCCGCAG −３′を有するオリゴヌクレオチド（Masu配列の nt 2521〜2543に対応する）を、センスプライマーとして使用する。Masu配列の nt 3577〜3600に対応する配列：５′−CTACAGGGTGGAAGAG CTTTGCTT−３′、Tanabe配列の nt 2698〜2721に対応する配列：５′−TCAAAGCT GCGCATGTGCCGACGG−３′、及び Pin配列の nt 2671〜2694により対応する配列：５′−TCAATAGACAGTGTTTTGGCGGTC−３′を有するオリゴヌクレオチドを、それぞれ、hmGluRla，1b及び1cのためのアンチセンスプライマーとして使用する。PCR フラグメントを、pBluescriptII中にクローン化し、そして完全に配列決定する。(iii)hmGluR2のｉ２−ループ（配列番号１の nt 1966〜2037）が hmGluR1のその対応する配列により置換されているキメラcDNAフラグメントを PCRにより生成する(Pinなど.，1994 、前記に記載されているようにして)。そのフラグメントを Bsu36Ｉ及び DraIIIにより消化し、ｉ２−ループを端に有するユニーク制限部位を切断する。キメラ性 Bsu36Ｉ／ DraIIIラグメントと、クローン hmGluR2. 1の Bsu36Ｉ／ DraIIIフラグメントとを交換する。（iv）上記 hmGluR1スプライス変異体のその対応する配列による hmGlu R2のＣ−末端ドメインの追加の交換を、hmGluR2のＣ−末端を端に有するユニーク制限部位 DraIII及び KpnＩを用いることによって達成する。（ｖ）その得られるキメラ性 hmGluR2／hmGluR1 cDNAを配列決定し、そして KpnＩ及び NotＩにより消化し、それにより、pBluescriptから完全なcDNAを開放する。CHO細胞における安定した発現のために、そのキメラ性cDNAをブラント末端化し、そして CHO 細胞におけるキメラ性 hmGluR2／１受容体の安定した発現のために哺乳類の発現ベクター pCMV-T7-2のブラント末端化された NotＩ部位中にクローン化する。例５：抗− hmGluR2抗体の生成及び適用 hmGluR2の推定されるＣ−末端アミノ酸配列に対応するペプチドを合成し、そしてオボアルブミン又はTentagelに結合する。ポリクローナル抗血清をウサギに発生せしめる。ヒトmGluR2特異的抗体を、ペプチドカラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより抗血清から精製する。hmGluR2特異的抗体を、E LISA、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／hmGluR融合タンパク質（Ｅ．コリにおいて生成される）又はヒト脳抽出物によるイムノブロティングにより特徴づける。hmGluR2に対して特異的な抗体を用いて、トランスフェクトされた細胞における hmGluR2受容体を検出し、そしてヒト脳材料の組織断片における h mGluR2タンパク質の細胞又はサブ細胞発現パターンを分析する。抗体を、20個のアミノ酸から成る異なった hmGluR2−特異的ペプチド及びＥ．コリにおいて発現される融合タンパク質に対して生ぜしめる。グルタルアルデヒドによりキーホールリンペット（カサガイ）のヘモシアニン(KLH)に結合されたペプチドを、固相合成法により合成する。hmGluR2の完全な推定上の細胞内Ｃ− 末端フラグメントを含む PCRフラグメントを、BamHＩ／EcoRＩフラグメントとして、Ｅ．コリ発現プラスミドpGEX-2T（Guan and Dixon，Analytical Biochemist ry 192，262-267(1991)）中にクローン化し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)／hmGluR融合遺伝子を生成する。GST／hmGluR融合遺伝子と共に発現プラスミドを担持するＥ．コリDH5a細胞(Gibco-BRL)を、LB培地／ 100mg／mlのアンピシリンにおいて37℃で一晩、増殖せしめる。培養物をLBにより１：30に希釈し、そして30℃で２時間、増殖する。融合タンパク質の発現を、0.1mMのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより30℃で３時間、処理することにより誘発する。細胞を 5,000×ｇでの遠心分離により収穫する。融合タンパク質を、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ピュットナー，イレーヌスイス国，ツェーハー−4053 バーゼル, メルティンゲルシュトラーセ 19 (72)発明者クネーフェル，トーマススイス国，ツェーハー−4310 レインフェルデン，マルクガッセ 10 ベー

Claims

【特許請求の範囲】１．精製されたヒト向代謝性グルタミン酸受容体（hmGluR）２。２．配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項記載の受容体。３．請求の範囲第１又は２項記載の受容体の変異体。４．請求の範囲第１項記載の受容体を含んで成る物質の組成物。５．インビトロ又はインビボでの適切な宿主細胞の増殖を含んで成る、請求の範囲第１項記載の受容体の調製方法。６．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の受容体の活性を調節する化合物についてのスクリーンのための前記受容体の使用。７．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の受容体を含んで成る融合タンパク質。８．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の受容体をコードする核酸、又は前記核酸のフラグメントを含んで成る核酸。９．DNAである請求の範囲第８項記載の核酸。 10．配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第９項記載の DNA。 11．請求の範囲第９又は10項記載の DNAの少なくとも14個の隣接した塩基、又はその補体を含んで成る核酸プローブ。 12．請求の範囲第11項記載の核酸の調製方法。 13．ハイブリッドベクターである請求の範囲第９項記載の DNA。 14．請求の範囲第９項記載の DNAを含んで成る宿主細胞。 15．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードする DNAを発現する請求の範囲第14項記載の真核宿主細胞。 16．請求の範囲第９項記載の DNAによりトランスフェクトされた宿主細胞。 17．哺乳類細胞である請求の範囲第16項記載の宿主細胞。 18．請求の範囲第１項記載の受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングのためへの請求の範囲第16項記載の宿主細胞の使用。 19．請求の範囲第14項記載の宿主細胞の調製方法。 20．請求の範囲第９項記載の DNAに対して相補的な精製されたmRNA。 21．請求の範囲第１項記載のhmGluRサブタイプをコードする DNAを同定するための方法であって、請求の範囲第11項記載のプローブとヒト DNAとを接触せしめ、そして前記プローブに実質的にハイブリダイズする DNAを同定することを含んで成る方法。 22．競争結合アッセイへの請求の範囲第１項記載の受容体タンパク質の使用を含んで成る、hmGluR2に結合する化合物を同定するための方法。 23．請求の範囲第１項記載のhmGluRの活性を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、 −請求の範囲第15項記載の細胞と、前記受容体の活性を調節する能力が決定される少なくとも１つの化合物又はシグナルとを接触せしめ、そして続いて、 −前記受容体により介在される機能的応答の差異について細胞を分析することを含んで成るアッセイ。 24．−請求の範囲第15項記載の細胞と、hmGluR2の活性を調節する能力が決定される少なくとも１つの化合物又はシグナルとを接触せしめ、そして続いて、 −特定の第２メッセンジャーのレベルの変化について前記細胞をモニターすることを含んで成る請求の範囲第23項記載のアッセイ。 25．請求の範囲第１項記載のhmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性を調節するための方法であって、前記サブタイプと、請求の範囲第23項記載のアッセイにおいて同定された少なくとも１つの化合物の有効量とを接触せしめることを含んで成る方法。 26．請求の範囲第23項記載のアッセイにより同定される、アゴニスト、アンタゴニスト、又はアロステリックモジュレーター。 27．アゴニスト活性を有する、hmGluR2のグルタミン酸アゴニスト又はアロステリックモジュレーターを検出するための方法であって、（ａ）応答経路に結合される請求の範囲第１項記載のhmGluRに化合物を、前記受容体と前記化合物との相互作用及び前記経路を通しての関連する応答を可能にする条件下で及び十分な時間、暴露し、そして（ｂ）試験される化合物の不在に関して、hmGluR2と前記化合物との相互作用に起因する応答経路の刺激の上昇又は低下を検出し、そしてそれから、アゴニスト又はアロステリックモジュレーターの存在を決定する段階を含んで成る方法。 28．アンタゴニスト活性を有する hmGluR2のグルタミン酸アンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを同定するための方法であって、（ａ）応答経路に結合される請求の範囲第１項記載のhmGluRに、既知のグルタミン酸アゴニストの存在下で化合物を、前記受容体と前記アゴニストとの相互作用及び前記経路を通しての関連する応答を可能にするのに十分な条件下で及び十分な時間、暴露し、そして（ｂ）グルタミン酸アゴニストのみにより誘発される応答経路の刺激に関して、試験される化合物と hmGluR2との相互作用に起因するアゴニストによる前記応答経路の刺激の阻害を検出し、そしてそれから、アンタゴニスト様活性を有するアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの存在を決定する段階を含んで成る方法。 29．請求の範囲第１項記載のタンパク質に対して向けられた抗体。 30．ポリクローナル抗体である請求の範囲第29項記載の抗体。 31．モノクローナル抗体である請求の範囲第29項記載の抗体。 32．請求の範囲第１項記載のhmGluRサブタイプのシグナル形質導入活性を調節するための方法であって、前記受容体と請求の範囲第29項記載の抗体とを接触せしめることを含んで成る方法。 33．組換え DNA技法により得られる請求の範囲第１項記載の受容体。 34．内因性mGluR2遺伝子を発現しないが、しかし請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の受容体をコードする核酸を発現するトランスジェニック非ヒト動物。