HUT74247A - Human metabotropic glutamate receptor subtypes (hmr4, hmr6, hmr7) and related dna compounds - Google Patents

Description

A humán metabotróp glutamát receptor altípusok (HMR4, HMR6, HMR7) és rokon DNS vegyületeik

A jelen találmány humán metabotróp glutamát receptor (hmGluR) proteinekkel kapcsolatos, valamint az ezeket kódoló izolált nukleinsavakkal, a találmány proteinjeit termelő gazdasejtekkel, az ilyen proteinek, nukleinsavak és gazdasejtek előállítására szolgáló módszerekkel, valamint ezek alkalmazásával. Továbbá, a jelen találmány a találmány hmGluR proteinjei ellen irányított antitesteket is biztosít.

A metabotróp glutamát receptorok (hmGluR) a G-protein (guanin nukleotid kötő protein) párosított receptorok osztályába tartoznak, melyek egy glutamáterg liogandum kötődése esetében egy extracelluláris jelet egy intracelluláris második messenger rendszeren keresztül - mint amilyen a kalcium ionok, egy ciklikus nukleotid, diacilglicerol és inozitol 1,4,5trifoszfát - egy fiziológiai válasszá alakítanak. A hét feltételezett transzmembránt áthidaló szegmentet tartalmazó melyet egy nagy extracelluláris amino-terminális dómén előz meg • · · · > t • · · · · · · • ······ · • · ····· ·· · ···· ··· · · a a a és melyet egy nagy karboxi-terminális dómén követ - metabotróp glutamát receptorok azonos szerkezettel jellemezhetők. Aminosav szinten a szekvencia azonosság mértékére alapozva az mGluR osztály különböző egyedi receptor altípusokat magába foglaló alcsaládokba sorolható (Nakanishi, Science 258, 597-603 (1992)). Az egyes mGluR altípusokat egy egyedi gén kódolja. Egy mGluR altípus egy eltérő alcsaládba tartozó másik altípussal való homológiáját tekintve az aminosav szekvenciák 50 %-nál kisebb homológiát mutatnak. Egy alcsaládon belül a szekvencia azonosság foka általában 70 %-nál kisebb. így egy adott altípus, különösen ugyanazon emlős faj altípusa, jellemezhető egy másik mGluR altípussal való aminosav szekvencia homológiájával. Továbbá, egy adott altípus jellemezhető régió és szövet megoszlásával is, celluláris vagy szubcelluláris mintájával vagy különböző fiziológiai profiljával, például elektrofiziológiai és farmakológiai tulajdonságaival is.

Mivel az aminosav L-glutamát az egyik fő serkentő neurotranszmitter, feltételezik, hogy a glutamát rendszerek fontos szerepet játszanak számos neuronális folyamatban ideértve a gyors serkentési szinaptikus transzmissziót, a neurotranszmitter felszabadulási szabályozást, a hosszú-távú potenciálást, a tanulást és emlékezést, a fejlődési szinaptikus plaszticitást, a hipoxiás-ischemiás sérülést és az idegsejt puszrulást, az epilepszia-szerű rohamokat, valamint számos neurodegeneratív rendellenesség patogenezisét. Ezideig nem állt rendelkezésre adat a humán metabotróp glutamát receptor (hmGluR) altípusokról, például aminosav szekvenciájukról, vagy szövet megoszlásukról. Ezen ismeretek hiánya különösen az olyan humán terápiás anyagok kutatását akadályozta, melyek •· · · · a ···· • · · · · · · • «····· « • · ····· ·· · specifikusan képesek befolyásolni a glutamát rendszer defektjenek tulajdonítható bármilyen rendellenességet. A metabotróp glutamát receptorok potenciális fiziológiai és pathológiai jelentőségének fényében szükség van a humán receptor altípusokra, valamint az ilyen altípusokat olyan mennyiségben termelő sejtekre, mely ezen proteinek elektrofiziológiai és farmakológiai tulajdonságait helyes megvilágításba helyezi. Például a gyógyszer szkrínelési vizsgálatokhoz aktív formában levő, tisztított humán receptor proteinekre van szükség, ez eddig nem volt megvalósítható.

A jelen találmány célja ezen igény kielégítése, nevezetesen egyértelmű hmGluR altípusok, ezeket kódoló nukleinsavak és az ilyen altípusokat termelő sejtek biztosítása. Részletesebben, a jelen találmány a hmGluR4 jelölésű altípust tartalmazó hmGluR alcsaládot, valamint az említett alcsalád egyes proteinjeit írja le. A következőkben az említett alcsaládra hmGluRi alcsaládként utalunk. Más hmGluR altípusokkal szemben ezen alcsalád tagjai hatékonyan aktiválhatok L-2-amino-4-foszfo-butánsavval (AP4) és expresszió esetén például kínai hörcsög ovarium (CHO) sejtekben vagy fiatal hörcsög vese (baby hamster kidney = BHK) sejtekben negatívan kapcsolódik az adenilát ciklázhoz a G-proteinen keresztül. A jelen találmány rekombináns hmGluR altípusát tartalmazó rendszert használva a hmGluR-lel szemben aktív gyógyszerek szkrínelésében többek között sejtenként! nagy számú receptor elérését teszi lehetővé, nagyobb hozamot és a zaj arány magasabb jelét biztosítva a vizsgálatokban, valamint megnövekedett receptor altípus specifitást eredményezve • · · t

(feltehetően nagyobb biológiai és betegség specifitást biztosít) .

Még specifikusabban, a jelen találmány egy olyan hmGluR altípussal kapcsolatos, mely azzal jellemezhető, hogy aminosav szekvenciája 65 %-nál nagyobb azonosságot mutat a hmGluR4 altípus szekvenciájával, melynek aminosav szekvenciáját a 2. számú szekvenciában adjuk meg.

A találmány szerint a hmGluR altípus kifejezés egy olyan tisztított proteinre vonatkozik, mely a G-protein-kapcsolt receptorok osztályába tartozik és mely egy glutamát ligandum kötődése során egy intarcelluláris második messenger rendszeren keresztül egy extracelluláris jelet transzdukál. Ilyen esetben a találmány altípusa úgy jellemezhető, hogy egy ciklikus nukleotid (cAMP, cGMP) szintjét módosítja. Másik lehetőségként, jel transzdukció következhet be a találmány egy receptor altípusához kapcsolódó G-protein más membrán proteinnel, mint például az ioncsatornával vagy más receptorral való közvetlen interakciója következtében. A találmány egy receptor altípusáról úgy vélik hogy egy olyan egyértelmű gén kódolja, mely nem kódol más metabotróp glutamát receptor altípust. A találmány egy adott altípusa eltérő fiziológiai profiljával, előnyösen jel transzdukciós és farmakológiai tulajdonságaival jellemezhető. A farmakológiai tulajdonságok közé tartoznak például az agonistákra való szelektivitás és az agonista válaszok.

A találmány meghatározása szerint egy glutamát ligandum például L-glutamát vagy más hmGluR altípussal reagáló más vegyület és különösen az ehhez glutamát-szerű módon kötődő más vegyület lehet, mint például az ACPD (IS,3R-1-amino-ciklof t

pentán-1,3-dikarboxilessav) egy ACPD-szerú ligandum például QUIS (quisqualát), AP4 és más hasonló vegyületek. Más ligandumok, például az (R,S)-alfa-metil-karboxi-fenil-glicin (MCPG) vagy az alfa-metil-L-AP4 reakcióba léphet a találmány receptorával oly módon, hogy megakadályozza a glutamát ligandum kötődését.

A találmány szerinti használatban a korábbiakban és a későbbiekben is a tisztított vagy izolált kifejezések a találmány egy olyan molekulájára vonatkoznak, mely egy természetes forrásból vagy a génsebészet segítségével dúsított vagy tiszta formában nyerhető. A találmány tisztított proteinjei, DNS-ei és RNS-ei, míg a természetes módon előforduló proteinek, DNS-ek és RNS-ek nem, addig ezek egy a találmány hmGluR expresszióját vagy aktivitását szelektíven módosító vegyületek azonosításában is hasznosak lehetnek.

A találmány tisztított hmGluR-je a hmGluR4 alcsalád egy olyan tagját jelenti, melyet azonosítottunk és mely a természetes környezetének egy vagy több alkotórészétől mentes. A tisztított hmGluR a találmány tisztított hmGluR-jét is magába foglalja rekombináns sejttenyészetben. A találmány altípusának dúsított formája egy olyan készítményre utal, mely a természetesnél nagyobb koncentrációban tartalmazza az említett altípust, például egy celluláris frakció az említett altípust tartalmazza. Ha az említett altípus tiszta formában van alapjában véve mentes más makromolekuláktól, különösen a temészetesen előforduló proteines szennyeződésektől. Ha kívánatos a találmány altípusa oldható formában van. A találmány előnyben részesített tisztított hmGluR altípusa egy rekombináns protein. Előnyösen a találmány altípusa aktív « * • · · · · · • · · · · • · · · · · · •··· ··· · ·· · · > 6 állapotban van, ami azt jelenti, hogy ligandum kötő és jel transzdukciós aktivitással is rendelkezik. A receptor aktivitást a tudomány e területén ismert módszerekkel mérjük, például egy kötési vizsgálatot vagy egy funkcionális vizsgálatot, például az alábbiakban leírt vizsgálatot használva.

A hmGluR alcsalád előnyben részesített hmGluR altípusa a hmGluR4, a hmGluR7 és hmGluR6 altípusok. A különösen előnyben részesített a hmGluR4 altípus, egy a későbbiekben bemutatott 2. számú aminosav szekvenciával rendelkező protein. A hmGluR7típus protein tartalmazhat egy a 4, 6, 8 és 10 számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptideket tartalmazó csoportból szelektált polipeptidet. Az ilyen hmGluR7 altípus előnyben részesül. A különösen előnyben részesített hmGluR7 altípusok a sorrendben a 12. és a 14. számú szekvenciákban bemutatott aminosav szekvenciákkal rendelkeznek. Egy előnyben részesített hmGluR6-típusú protein a

16. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidet tartalmaz.

A találmány továbbá magába foglalja a találmány receptor altípusainak variánsait is. Például a találmány hmGluR altípus egy variánsa az említett altípussal funkcionálisan vagy immunológiailag azonos. Egy funkcionális ekvivalens egy olyan protein, különösen egy olyan humán protein, mely az említett adott altípus jellemzőivel alapjában véve azonos fiziológiai profillal rendelkezik. A fiziológiai prolfil in vitro és in vivő receptor effektor funkciókat, elektrofiziológiai és farmakológiai tulajdonságokat - például szelektív interakciót az agonistákkal és antagonistákkal szemben - jelent. A • · · ·

példaként szolgáló funkcionális ekvivalensek lehetnek a primer transzkript alternatív hasításával létrehozott mRNS által kódolt illesztési variánsok, aminosav mutánsok és glikozilációs variánsok. Egy adott hmGluR altípus immunológiai ekvivalense egy olyan protein vagy peptid, mely az említett altípussal szemben specifikus antitesteket képes létrehozni. A receptor extracelluláris doménjének részeit, például a legalább 6-8 aminosavat tartalmazó peptideket, különösen a 20 aminosavat tartalmazókat különösen hasznos immunológiai ekvivalenseknek tartjuk.

A találmányban szereplő további variánsok membránhoz kötött és oldódó fragmentek, valamint más kémiai egységek kovalens vagy teljes konjugátumai, ezek a variánsok egy vagy több receptor funkcióval rendelkeznek, mint például ligandum kötő vagy jel transzdukáló funkcióval. A találmány hmGluR altípusaira példaként szolgáló fragmentek sorrendben a 4., 6., 8., 10. és 16. számú szekvenciákban bemutatott aminosav szekvenciákkal rendelkező polipeptidek. A találmány fragmentjei előállíthatok természetes forrásokból, kémiai szintézissel vagy rekombináns technikákkal. A találmány hmGluR altípusa endogén ellenpárjával a ligandum kötő domént tartalmazó endogén ligandumokért, fragmentekért vagy ezek származékáért való versenyképességüknek köszönhetően ezeket terápiás anyagoknak tartj ák.

A kovalens származékok például alifás észtereket vagy egy receptor karboxil csoport amidjait, maradékokat tartalmazó hidroxil csoport 0-acil származékait és maradékokat tartalmazó aminocsoportok N-acil származékait foglalják magukba. Az ilyen származékok előállíthatok a funkcióscsoportok • · · · ·· ···· • · · · · · · • ······ · • · ····· · · · ···· ··· · _>β reakciócsoportokhoz való kötésével, melyek az oldalláncokban találhatók, valamint a receptor dómén N- és C-terminusánál. A találmány proteinje jelölhető egy detektálható csoporttal, például radioaktív jelöléssel, kovalensen a ritka földkelátokhoz köthető vagy fluoreszcens egységgel konj ugálható.

A további származékok a találmány proteinjeinek más proteinekkel vagy peptidekkel (fúziós proteinek) való kovalens konjugátumai. Példaként a különböző glutamát receptorok különböző részeit tartalmazó fúziós proteinek szolgálnak. Az ilyen fúziós proteinek hasznosak lehetnek a G-proteinekhez való kapcsolódás megváltoztatásában és/vagy egy funkcionális vizsgálat érzékenységének fejlesztésében. Például az ilyen fúziós proteinekben vagy kiméra receptorokban a találmány egy altípusának intracelluláris doménjei egy másik mGluR altípus megfelelő doméjeivel helyettesíthető, különösen egy másik hmGluR altípuséval, például egy másik alcsaládba tartozó hmGluR altípussal. Egy ilyen kiméra receptor megszerkesztéséhez különösen megfelelőek az olyan receptor intracelluláris doménjei, melyek a foszfolipáz C/Ca²⁺ jelző reakcióutat aktiválják, például az mGluR (Masu et al., Natúré 349, 760-765) vagy az mGluR5. Egy ilyen cserére alkalmas intracelluláris dómén, például egy második intracelluáris hurok, melyre i2-ként (Pin et al., EMBO J. 13, 342-348 (1994)) is utalnak. így lehetővé válik egy teszt vegyület a találmány receptorának egy ligandum kötő doménjével való kölcsönhatásának vizsgálatára a kalcium ionok vizsgálatát használva. A találmány szerint a kiméra receptor rekombináns technikákkal szintetizálható vagy a • « tudomány e területén ismert anyagokkal, melyek a keresztkötéses proteinekhez megfelelőek.

Az aggregációs származékok például a sejtmembránnal képzett adszorpciós komplexek.

Egy másik megvalósulásban a jelen találmány egy olyan anyag összetételre vonatkozik, mely a találmány egy hmGluR altípusát tartalmazza.

A találmány proteinjei hasznosak például immunogénekként a gyógyszer szkrínelési vizsgálatokban, reagensekként immunovizsgálatokban és tisztítási eljárásokban, mint például egy kötő ligandum affinitás tisztítási eljárásában.

A találmány egy proteinje kinyerhető természetes forrásokból, például az agyszövetből való izolálással, vagy kémiai szintézissel vagy rekombináns technikákkal.

A találmány a továbbiakban a találmány egy hmGluR altípusának előállítására szolgáló módszert is biztosít, ami azzal jellemezhető, hogy a találmány egy receptor altípusát termelő megfelelő gazdasejtet in vitro vagy in vivő szaporítjuk. Előnyösen, a gazdasejtet egy az említett altípust kódoló DNS szekvenciát és promótert tartalmazó expressziós kazettát tartalmazó hibrid vektorral transzformáljuk (transzfektáljuk). A DNS-t az említett promóter szabályozza. Ezt követően a találmány hmGluR altípusát kinyerjük. A kinyerés például a találmány altípusának a gazdasejtböl való izolálását jelenti, vagy az altípust tartalmazó gazdasejt például tenyésztápközegből való izolálását. Különösen előnyös egy a funkcionálisan aktív receptor előállítására szolgáló módszer.

A találmány egy hmGluR proteinjét kódoló DNS-ből előállíthatok a hmGluR mutánsok, mely DNS-t például egy vagy • · • ······ ·· 4 ···· ··· · ·· ·· több aminosav addicióját, cseréjét és/vagy delécióját eredményező in vitro mutagenezisnek vetettük alá. Például a találmány egy hmGluR altípusának helyettesítési, deléciós és inzertációs variánsai előállíthatok rekombináns módszerekkel és a hmGluR natív formáival való immuno-keresztreaktivitásra szkrínelhetők.

A találmány egy proteinje származtatható in vitro módon a tudomány e területén ismert hagyományos módszerekkel.

A megfelelő gazdasejtek közé tartoznak az eukarióta sejtek például az állati sejtek, a növényi sejtek és fonalasgombák, valamint a prokarióta sejtek, mint például a gram pozitív és gram-negatív baktériumok, mint például a E. coli. Az eukarióta gazdasejetek közül előnyben részesülnek a kétéltű és emlős eredetű sejtek.

A találmány szerinti használatban az in vitro ex vivo-t jelent, így például a sejt tenyészet és szövettenyészet körülményeit is magába foglalja.

A találmány a továbbiakban vonatkozik egy a találmány altípusát kódoló tisztított, előnyösen rekombináns nukleinsavat (DNS, RNS) tartalmazó nukleinsavra (DNS, RNS) vagy egy ilyen nukleinsav egy fragmentjéré. Azon túl, hogy a fenti rekombináns hmGluR proteinek termelésében hasznos, ezek a nukleinsavak hasznosak próbákként is, így könnyen lehetővé teszik a tudomány e területén képzett szakember számára a találmány egy hmGluR proteinjét kódoló nukleinsav azonosítását és/vagy izolálását. A nukleinsav lehet jelöletlen, vagy egy detektálható egységgel jelölt. Továbbá, a találmány szerinti nukleinsav hasznos például a jelen hmGluR meghatározására szolgáló módszerben is, az említett módszer magába foglalja a hmGluR-t kódoló (vagy

azzal komplementer) DNS (vagy RNS) teszt minta nukleinsavhoz való hibridizálását és a hmGluR jelenlétének meghatározását.

A jelen találmány tisztított hmGluR-t kódoló nukleinsav olyan nukleinsavat foglal magába, mely mentes legalább egy szennyező nukleinsavtól és mellyel a hmGluR nukleinsav természetes forrásában rendszerint kapcsolatban áll. A tisztított nukleinsavak így tehát a természetben talált formától vagy kerettől eltérő módon vannak jelen. Azonban a tisztított hmGluR nukleinsav magába foglalja az általában hmGluR expresszáló sejtekben levő hmGluR nukleinsavat, ahol a nukleinsav a természetes sejtektől eltérő kromoszómás lokációban található vagy mely máskülönben a természetben találttól eltérő DNS szekvenciákkal határolt.

Részletesebben, a találmány egy tisztított vagy izolált DNS molekulát biztosít, mely a találmány egy hmGluR altípusát kódolja, vagy egy ilyen DNS fragmentet. A meghatározás értelmében egy ilyen DNS egy kódoló'egyedüli DNS-t egy az említett kódoló DNS-t tartalmazó kettősszálú DNS-t, valamint egy az ezzel komplementer DNS-t tartalmaz, vagy magát a komplementer (egyszálú) DNS-t. Előnyben részesül, a fent leírt előnyben részesített hmGluR altípust kódoló DNS, vagy ennek egy fragmentje. Továbbá, a találmány vonatkozik egy ilyen DNS-t tartalmazó DNS-re is.

Még specifikusabban előnyben részesül egy olyan DNS, mely egy hmGluR4 altípust vagy annak egy részét kódolja, különösen egy a 2. számú szekvenciában leírt aminosav szekvenciával rendelkező hmGluR4 altípust kódoló DNS, például az 1. számú szekvenciában leírt nukleiotid szekvenciával rendelkező DNS. A •· · · ·· ···· • · · · · · · • ······ · • ··«··· · · · ···· ··· · · · · · hmGluR4 egy részét kódoló példaként szolgáló DNS a cDNS cmR20 hmGluR4-et kódoló része, ahogy azt a Példákban leírtuk.

Hasonlóképpen előnyben részesül a hmGluR7-et kódoló DNS is, különösen a sorrendben a 12. és 14. számú szekvenciákban bemutatott aminosav szekvenciákkal rendelkező hmGluR7 altípusok bármelyikét kódoló DNS, például a sorrendben a 11. és 13. számú szekvenciákban bemutatott nukleotid szekvenciákkal rendelkező DNS-ek. A találmány a továbbiakban biztosítja a hmGluR7 altípus egy részét, különösen a fent előnyben részesítettként azonosított hmGluR-et kódoló részeket kódoló DNS fragmentet. A példaként szolgáló hmGluR7 DNS fragmentek közé tartoznak a Példákban leírt cDNS cmR2, cmR3, cmR5 és cR7PCRl hmGluR7-et kódoló részei, vagy egy olyan DNS fragment, mely alapjában véve ugyanazt az aminosav szekvenciát kódolja, melyet a cmR2 plazmid hmGluR7-et kódoló része kódol. A plazmid 1993 szept. 13-án került deponálásra a DSM-nél DSM 8550 katalógusszámon. Ezek a DNS-ek a hmGluR7 itt leírt altípusának feltételezett hasítási variánsait kódolják.

Előnyben részesül egy a hmGluR6 altípust vagy ennek egy részét kódoló DNS is, különösen a hmGluRő altípus részét kódoló DNS, melynek aminosav szekvenciáját a 16. számú szekvenciban mutatunk be, vagy egy olyan DNS, mely alapjában véve ugyanazt az aminosav szekvenciát kódolja, mint amit az 1993 szept. 13-án DSM-nél deponált (DSM 8549 katalógusszám) cmRl plazmid hmGluR6-ot kódoló része kódol. A példaként szolgáló DNS szekvenciát a 15. számú szekvenciában mutatjuk be.

A találmányban biztosított nukleinsav szekvenciák felhasználhatók további hmGluR altípusokat kódoló DNS-ek azonosítására. Például a találmány nukleinsav szekvenciái

• · felhasználhatók a hmGluR4et tartalmazó alcsaládba tartozó további hmGluR altípusokat kódoló DNS-ek azonosítására. Az ilyen DNS azonosítására szolgáló módszer a humán DNS a fent leírt nukleinsav próbával reagáltatható, majd a próbához hibridizáló DNS(ek) azonosíthatók.

A találmány példaként szolgáló nukleinsavai alternatív lehetőségként úgy is jellemezhetők, mint olyan nukleinsavak, melyek a találmány hmGluR altípusát kódolják és egy az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. számú szekvenciákban bemutatott DNS szekvenciákhoz hibridizálódnak, vagy az említett DNS szekvencia szelektált részéhez (fragmentjéhez). Például, a hibridizálódáshoz használható szelektált fragmentek az említett DNS-ek protein kódoló részei. Előnyben részesülnek egy a találmány hmGluR-jét kódoló olyan DNS-ek, melyek erősen szigorú körülmények között az előbb említett DNS-ekhez hibridizálódnak.

A hibridizáció szigorúsága olyan körülményekre utal, melyek között a polinukleinsavak hibridjei stabilak. Az ilyen körülmények egyértelműek a tudomány e területén jártas szakemberek számára. A tudomány e területén képzett szakember számára ismert, hogy a hibridek stabilitását a hibrid olvadási hőmérséklete (Tm) tükrözi, mely megközelítően 1-1,5 C° hőmérséklet csökkenést jelent a szekvencia homológiában bekövetkező 1% csökkenéssel. Általában egy hibrid stabilitása a nátrium ion koncentráció és a hőmérséklet függvénye. Tipikusan a hibridizációs reakció erősen szigorú körülmények között megy végbe, melyet változó szigorúságű mosások követnek.

A találmány szerinti használatban az erősen szigorú körülmény olyan körülményt jelent, mely csupán azon nukleinsav szekvenciák hibridizációját teszi lehetővé, melyek 1 M Na⁺ • 4 · · • · «· 44 4 4 • 44 ·· • · 4 444· • ····· ·· » • · 4 4 44( » koncentrációban 65-68 C° hőmérsékleten képeznek stabil hibrideket. Az erősen szigorú körülmények például úgy biztosíthatók, hogy a hibridizáció 6 x SSC-t, 5x Denhardt-féle oldatot, 1% SDS-t (nátrium dódecil szulfát), 0,1 Na⁺ pirofoszfátot és 0,1 mg/ml denaturált lazac sperma DNS-t (nem specifikus kompétitorként) tartalmazó vizes oldatban megy végbe. A hibridizácoó után a szigorú körülmények között végzett mosások több lépésben is elvégezhetők, az utolsó mosás (körülbelül 30 perc) a hibridizációs hőmérsékleten és 0,2-0,1 x SSC, 0,1% SDS elegyében történik.

A mérsékelt szigorúság olyan körülményekre utal, mely a fent leírt oldatban végbemenő hibridizációval azonos, azonban a hőmérséklet körülbelül 60-62 C° hőmérsékletet jelent. Ebben az esetben a végső mosást a hibridizáció hőmérsékletén végezzük 1 x SSC és 0,1 % SDS elegyében.

A kevéssé szigorú körülmények olyan körülményeket jelentenek, ahol a hibridizáció a fent leírt oldatban játszódik le, de a hőmérséklet körülbelül 50-52 C° hőmérsékletet jelent. Ebben az esetben a végső mosást a hibridizáció hőmérsékletén hajtjuk végre 2 x SSC és 0,1% SDS elegyében.

Érthető, hogy ezek a körülmények adaptálhatók és különböző puffereket például formamid-alapú puffereket, és hőmérsékleteket használva megduplázhatok. A Denhardt-féle oldat és az SSC jól ismertek a tudomány e területén képzett szakemberek számára, akárcsak az egyéb hibridizációs pufferek (lásd például Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, vagy Ausubel, F.M. et al., (1993) Current protocols in

Molecular Biology, Greene and Wiley, USA). Az optimális hibridizációs körülményeket kísrleti úton kell meghatározni, mivel a próba hosszúsága és a GC tartalma szintén szerepet j átszanak.

A jelen találmány útmutatását megadva a találmány nukleinsavai a tudomány e területén jól ismert módszerek szerint szerezhetők meg. A jelen találmány a továbbiakban vonatkozik az ilyen nukleinsav előállítására szolgáló eljárásokra is.

Például, a találmány egy DNS-e előállítható kémiai szintézissel, rekombináns DNS technikával vagy polimeráz láncreakcióval (PCR). A rekombináns DNS technológiával való előállítás egy megfelelő cDNS vagy genom könyvtár szkrínelését is magába foglalja. Egy DNS vagy a találmány megvalósításához megfelelő módszer magába foglalja számos oligonukeotid szintézisét, ezek PCR módszerekkel való amplifikálását (kierősétését), valamint a kívánt DNS szekvencia előállításához ezek hasítását. A megfelelő könyvtárak, például a példákban szereplő könyvtárak, beszerezhetők a kereskedelemben, vagy előállíthatok neurális vagy neuronális szövet mintákból például a hippocampus és cerebellum szövetből, sejtvonalakból és más hasonlókból.

A találmány egyedi hmGluR altípusaihoz (és hasítási variánsaihoz) a neurális vagy neuronális szövet expressziós mintája eltérő lehet. így egy adott altípust (vagy hasítási variánst) kódoló cDNS izolálásához előnyös a különböző megfelelő szövetekből vagy sejtekből előállított könyvtárakat szkrínelni. Szkrínelési próbaként a jelen találmány hmGluR altípusának alapjában véve teljes kódoló régióját tartalmazó • · · · • · · · · · ···· ··· ·

DNS-t vagy RNS-t lehet alkalmazni vagy az említett DNS-re alapuló megfelelő oligonukleotidot. Egy megfelelő oligonukleotid próba (a szkríneléshez magába foglalja a hibridizációt) egy olyan egyszálú DNS vagy RNS mely olyan nukleotid szekvenciával rendelkezik, mely magába foglal legalább 14 szomszédos bázist, melyek megegyeznek, vagy komplementerek bármely az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. és 15.

számú szekvenciákban bemutatott 14 vagy több szomszédos bázisokkal. A próba jelölhető egy megfelelő, könnyen detektálható kémiai egységgel. A próbaként szelektált nukleinsav szekvenciák megfelelő hosszúságúak és megfelelően egyértelműek kell legyenek azért, hogy a hamis pozitív eredményeket a minimálisra csökkentsük.

Az előnyben részesített régiók, melyekből a próbákat megszerkesztjük, magukba foglalják az 5' és/vagy 3' kódoló szekvenciákat, melyekről előre megmondható, hogy ligandum kötő helyeket és hasonlókat kódolnak. Például, bármely a találmányban leírt teljes hosszúságú cDNS kiónok vagy ezek fragmentjei is felhasználhatók próbaként. Előnyösen, a találmány nukleinsav próbáit megfelelő jelöléssel látjuk el, így a hibridizáció során könnyű a detektálásuk. Például egy megfelelő jelölés radioaktív jelölést jelenthet. Egy DNS fragment jelölésének egy előnyben részesített módszere a ³²Pjelölésű alfa-dATP a DNS polimeráz Klenow fragmentjével való beépítése egy random primelési reakció során, amint az jól ismert a tudomány e területén. Az oligonukleotidok általában 32p-j_eiölésü gamma-ATP és polinukleotid kináz végjelölést kapnak. Azonban, más módszerek is felhasználhatók a fragment • · · · ·· ···· • · · · · · · • ······ · • · ····· ·· · • · · · ··· · ·· ·· vagy az oligonukleotid jelölésére, ideértve az enzimes jelölést és a biotinilációt.

A könyvtár szkrínelése után, például alapjában véve az egész hmGluR-t kódoló szekvenciát magába foglaló DNS részlettel vagy egy az említett DNS részére alapuló oligonukleotiddal, a pozitív kiónok egy hibridizációs jel detektálása révén azonosíthatók; az azonosított kiónokat restrikciós térképezéssel és/vagy DNS szekvencia analízissel jellemezzük, majd vizsgáljuk, például a találmányban megadott szekvenciákkal való összehasonlítással, annak biztosítása céljából, hogy tartalmazzák-e a teljes hmGluR-t kódoló DNS-t (azaz vajon tartalmaznak-e tarnszlációs iniciációs és terminációs kódonokat). Ha a szelektált kiónok nem teljesek, ezek felhasználhatók ugyanezen vagy más könyvtárak újra szkrínelésére átfedő kiónok kinyerése céljából. Ha a könyvtár genom eredetű, akkor az átfedő kiónok exonokat és intronokat is magukba foglalhatnak. Ha a könyvtár cDNS könytár, akkor az átfedő kiónok egy nyílt leolvasási keretet is magába foglalnak. Mindkét esetben a teljes kiónok azonosíthatók, ha a találmányban biztosított DNS-ekkel és származtatott aminosav szekvenciákkal hasonlítjuk össze.

Továbbá, a találmány egy endogén hmGluR altípus bármilyen abnormalitásának detektálása céljából a genetikai szkrínelés elvégezhető a találmány nukleotid szekvenciáinak hibridizációs próbákként való felhasználásával. A találmányban biztosított nukleinsav szekvenciákra alapozva antisense típusú terápiás anyagok is megtervezhetők.

Előre látható, hogy a találmány nukleinsava könnyen módosítható nukleotid helyettesítéssel, nukleotid delécióval, • · · · · · ···· • · · · · · · • ······ · • · ····· · · · •··· ··· · ·· · · nukleotid inzertációval vagy egy nukleotid szakasz inverziójával, valamint ezek bármilyen kombinációjával. Az ilyen módosított szekvenciák egy mutáns hmGluR altípus előállítására használhatók, mely a természteben megtalálható receptor altípustól eltérő. A mutagenezis lehet előre megtervezett (hely-specifikus) vagy véletlenszerű. A nem néma mutációk nem helyezhetnek szekvenciákat a nyílt leolvasási kereten kívülre és előnyösen nem hoznak létre olyan komplementer régiókat, melyek úgy hibridizálódnak, hogy másodlagos mRNS szerkezeteket hoznak létre, például hurkokat vagy túkanyarokat.

A találmány natív vagy mutáns hmGluR-jét kódoló cDNS vagy genom DNS beépíthető vektorokba a további felhasználáshoz. Továbbá, a találmány vonatkozik egy olyan rekombináns DNS-re is, mely egy a fent említett DNS-ek közül legalább egyet tartalmazó hibrid vektor.

A találmány hibrid vektorjai egy replikációs origót vagy egy autonóm módon replikálódó szekvenciát tartalmaznak, egy vagy több domináns marker szekvenciát és tetszés szerint expressziós szabályozó szekvenciákat, jel szekvenciákat valamint további restrikciós helyeket.

Előnyösen a találmány hibrid vektora egy fent leírt nukleinsav inzertet tartalmaz egy expressziós szabályozó szekvenciához működőképesen kapcsolva, különösen azokhoz kapcsolva, melyek a későbbiekben kerülnek leírásra.

A vektorok tipikusan két funkciót mutatnak a kompatibilis gazdasejttel együttműködésben. Az egyik funkció a találmány hmGluR altípusát kódoló nukleinsav klónozásának elősegítése, azaz a nukleinsavból (klónozó vektorok) használható mennyiség

• · előállítása. A másik funkció egy megfelelő gazdában a gén szerkezet replikációjának és expressziójának biztosítása, akár egy extrakromoszómális elemként való fenntartásán keresztül, vagy a gazda kromoszómába való beépülésen keresztül (expressziós vektorok). Egy klónozó vektor a fent leírtak szerint tartalmazza a DNS-eket, egy replikációs origót, vagy egy autonóm módon replikálódó szekvenciát, szelektálható marker szekvenciákat és tetszés szerint jel szekvenciákat és további restrikciós helyeket. Egy expressziós vektor továbbá tartalmaz expresziós szabályozó szekvenciákat, melyek alapvető fontosságúak a találmány DNS-ének transzkripciójához és transzlációjához. így egy expressziós vektor vonatkozik egy rekombináns DNS szerkezetre is, mint például egy plazmádra, egy fágra, rekombináns vírusra vagy más vektorra, mely egy megfelelő gazdasejtbe való bejuttatás során a klónozott DNS expresszióját eredményezi. A megfelelő expressziós vektorok jól ismertek a tudomány e területén és magukba foglalják azokat, melyek eukarióta és/vagy prokarióta sejtekben replikálhatók.

A legtöbb expressziós vektor képes a szervezetek legalább egy osztályában replikálódni, azonban transzfektálhatók az expresszió céljából más organizmusba is. Például egy vektor klónozható az E. coli-ba, majd ugyanezen vektor transzfektálható egy élesztőgombába vagy emlős sejtekbe, még akkor is, ha nem képes a gazdasejt kromoszómájától függetlenül replikálódni. A DNS amplifikálható (kierősíthető) a gazda genomba való ijnzertáción keresztül is. Azonban a hmGluR-t kódoló genom DNS kinyerése sokkal komplexebb, mint az exogén módon replikálódó vektor kinyerése, mivel a restrikciós enzimes emésztés szükséges a hmGluR DNS kimetszéséhez. A DNS • · • · · · • · • · · · · • · · · · · • «· amplifikálható (kierősíthető) PCR-ral is és transzfektálható közvetlenül a gazdasejtbe bármilyen replikációs komponens nélkül is.

Előnyösen, az expressziós és klónozó vektor tartalmaz egy szelekciós gént, melyre szelektálható markerként is szoktak utalni. Ez a gén egy olyan proteint kódol, melyre egy szelektív tenyésztápközegben szaporított transzformált gazdasejtek túléléséhez vagy szaporodásához van szükség. A szelekciós gént tartalmazó vektorral nem transzformált gazdasejtek nem maradnak életben a tenyésztápközegben. A tipikus szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, melyek antibiotikumokkal és más toxinokkal például ampicillinnel, neomicinnel, methotrexáttal vagy tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosítanak, komplementer auxotrófiás hiányokkal szembeni rezisztenciát, vagy olyan kritikus tápanyagokat biztosítanak, melyek a komplex tápközegből nem nyerhetők ki.

Mivel a vektorok amplifikálását (kierősítését) rendszerint E. coli-ban végzik egy E. coli genetikai marker és egy E. coli replikációs origó előnyösen használható fel. Ezeket E. coli plazmidokból lehet kinyerni, mint például a pBR322-böl, a Bluescript vektorból, vagy egy pUC plazmidból.

Az emlős sejtekhez való megfelelő szelekciós markerek azok, melyek lehetővé teszik a hmGluR nukleinsav felvételében kompetens sejtek azonosítását, mint például a dihidrofolát reduktáz (DHFR, methotroxát rezisztencia), timidin kináz vagy a G418cal vagy higromicinnel szembeni rezisztenciát biztosító gének. Az emlős transzfektánsokat szelekciós nyomás alá helyezzük, melyekhez csupán azok az egyedüli transzfektánsok • · · · · · · • · · • · · · · · • · · · · ·· · • · · · · adaptálódnak a túléléshez, melyek felvették és expresszálják a markert.

Az expressziós és klónozó vektorok általában taralmaznak egy olyan promótert, melyet a gazda szervezet ismer fel és mely működőképesen kapcsolódik a hmGluR nukleinsavhoz. Az ilyen promóter indukálható vagy konstitúciós promóter. A promóterek működőképesen kapcsolódnak a hmGluR-t kódoló DNS-hez, úgy, hogy a promótert a forrás DNS-től restrikciós enzimes hasítással eltávolítják és az izolált promóter szekvenciát a vektorba inzertálják. Mind a natív hmGluR promóter szekvencia és számos heterológ promóter felhasználható a direkt amplifikációhoz és/vagy a hmGluR DNS expressziójához. Azonban, a heterológ promóterek részesülnek előnyben, mivel ezek általában nagyobb transzkripciót és magasabb hmGluR expressziós hozamot tesznek lehetővé a natív hmGluR promóterhez viszonyítva.

A prokarióta gazdákhoz való megfelelő promóterek közé tartoznak például a béta-laktamáz és laktóz promóter rendszerek, az alkalikus foszfatáz, a triptofán (trp) promóter rendszer és hibrid promóterek mint amilyen a tac promóter. Ezek nukleotid szekvenciáját már publikálták, így a tudomány e területén képzett szakember számára lehetővé vált, hogy ezeket a hmGluR-t kódoló DNS-hez működőképesen ligáláják, kötők vagy adaptorok felhasználásával, hogy bármilyen szükséges restrikciós helyet felhasználjanak. A bakteriális rendszerekben való alkalmazásra megfelelő promóterek általában tartalmaznak egy Shine-Delgarno szekvenciát, mely működőképesen kapcsolódik a hmGluR-t kódoló DNS-hez.

Az emlősökben vektorokból való hmGluR gén transzkripció olyan promóterekkel szabályozható, melyek a gazdasejt • ······ · • · ····· ·· · ···· ··· t ·· · · rendszerrel kompatibilisek, például vírusok genomjából származó promóterek. A találmány egy hmGluR altípusának eukarióta gazdasejtekben, különösen emlős sejtekben való expressziójához a megfelelő plazmidok például a citomegalovírus (CMV) promótert tartalmazó vektorok, RSV promótert tartalmazó vektorok és az SV40 promótert tartalmazó vektorok, valamint az MMTV LTR promótert tartalmazó vektorok. Ezek szabályozásának természetétől függően a promóter lehetnek konstitutív vagy a kísérlet körülményei által szabályozható promóterek.

Egy a találmány szerinti hmGluR altípust kódoló DNS magasabbrendü eukarióták általi transzkripciója fokozható, ha a vektorba egy erősítő szekvenciát inzertálunk.

A vektor DNS különböző DNS szegmentjei működőképesen kapcsolódnak, azaz szomszédosak és egymáshoz viszonyítva funkcionális kapcsolatban helyezkednek el.

A találmány szerinti vektorok megszerkesztésekor hagyományos ligálási technikákat alkalmazunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS fragmenteket hasítjuk, szabjuk és abban a formában ligáijuk újra, mely a kívánt plazmid létrehozásához szükséges. Ha kívánatos, a megszerkesztett plazmidokban levő helyes szekvenciák ellenőrzéséhez a tudomány e területén ismert módszerekkel analízist végzünk. Az expressziós vektorok megszerkesztéséhez való megfelelő módszerek, az in vitro transzkriptek előállítása, a DNS gazdasejtekbe való bejuttatása, valamint a hmGluR expresszió és funkció biztosításához az analízis elvégzése a tudomány e területén jártas szakember számára ismertek. A gén jelenléte, az amplifikáció (felerősítés) és/vagy az expresszió a mintában közvetlenül mérhető például a hagyományos Southern lenyomat • · • ······ · • · ····· ·· · technikával, northern lenyomat technikával az mRNS transzkripciójának mennyiségi vizsgálatához, pont lenyomat technikával (DNS vagy RNS analízis), in situ hibridizációval, egy megfelelően jelölt próbát használva a találmány során biztosított szekvenciára alapozva, kötési vizsálattal, immunodetektálással és funkcionálási vizsgálattal. A megfelelő módszerek közé tartoznak a részletesen a példákban leírt módszerek. A tudomány e területén képzett szakemberek számára egyértelmű, hogyan lehet ezeket a módszereket szükség esetén módosítani.

A találmány a továbbiakban biztosít a találmány egy hmGluR altípusának termelésére megfelelő gazdasejteket valamint az említett altípust kódoló heterológ (idegen) DNS-t.

A találmány nukleinsavai gazdasejtek széles körében expresszálhatók, például a fent említettekben, melyeket egy megfelelő expressziós vektorral transzformáltunk vagy transzfektáltunk. A találmány receptora (vagy ennek egy része) fúziós proteinként is expresszálható. Ezután a rekombináns sejtek olyan körülmények között tenyészthetők, ahol a találmány DNS-e által kódolt protein(ek) expresszálódik(nak).

A megfelelő prokarióták közé tartoznak az eubaktériumok, mint a Gram-negatív vagy Gram-pozitív szervezetek, például az E. coli, például az E. coli Κ-12-es törzs, a DH5alfa és a HB 101 törzs vagy a Bacillusok. További, a hmGluR-t kódoló vektorokhoz való megfelelő gazdasejtek közé tartoznak az eukarióta mikrobák, mint például a fonalasgombák vagy az élesztőgombák, mint például a Saccharomyces cerevisiae. A magasabbrendü eukarióta sejtek közé tartoznak a rovar, a kétéltűek, a gerincesek sejtjei és különösen az emlős sejtek, mint például a neuroblasztoma sejtvonalak vagy a fibroblaszt eredetű sejtvonalak. Az előnyben részesített sejtvonalakra példák például a HEK 293 sejtek a CHO sejtek, a CV1 sejtek, a BHK sejtek, az L sejtek, az LLCPK-1 sejtek, a GH3 sejtek, az L sejtek és a COS sejtek. Az utóbbi években a gerinces sejtek tenyészetekben (szövettenyészet) való szaporítása rutin eljárás lett. A jelen találmányban hivatkozott gazdasejtek in vitro tenyészetben levő sejteket valamint egy gazda állatban levő sejteket foglalnak magukba.

A találmány egy aktív rekombináns hmGluR-jének expressziójára szolgáló megfelelő gazdasejtek előnyösen endogén vagy rekombináns G-proteineket expresszálnak. Előnyben részesülnek az olyan sejtek, melyek kevés endogén metabotróp glutamát receptort termelnek, vagy egyáltalán nem termelnek. A DNS a sejtekbe lehet stabilan beépített, vagy lehet a megfelelő módszerek szerint tranziensen expresszálódó.

A stabilan transzfektált emlős sejtek előállíthatok a sejtek egy olyan expressziós vektorral való transzfektálásával, melyek egy szelektálható marker génnel rendelkeznek, és a transzfektált sejteket a marker gént expresszáló sejtekre szelektív körülmények között szaporítjuk. Az átmenetileg transzfektáns sejtek előállításához az emlős sejteket egy riporter génnel transzfektáljuk a transzfekció hatékonyságának nyomonkövetése céljából.

Az ilyen stabilan vagy átmenetileg transzfektált sejtek létrehozásához a sejteket megfelelő mennyiségű hmGluR-t kódoló nukleinsavval kell transzfektálni a találmány hmGluR-jének létrehozása céljából. A hmGluR-t kódoló DNS pontos mennyiségét • · · · · · · • ······ · • ♦·♦··· «« « ···· ··· · · · ·« kísérletileg lehet meghatározni és optimalizálni egy adott sejtre és vizsgálatra.

A találmány egy DNS-e expresszálható nem-humán transzgenikus állatokban is, különösen transzgenikus melegvérű állatokban. A transzgenikus állatok, ideértve az egereket, a patkányokat, nyulakat, birkákat és sertéseket, előállítására szolgáló módszerek jól ismertek a tudomány e területén és például Hammer et al (Natúré 315, 680-683, 1985) írják le. Egy expressziós egységet, mely magába foglalja a találmány egy hmGluR-t kódoló DNS-ét egy megfelelően pozícionált expressziós szabályozó szekvenciával együtt, megtermékenyített tojások pronukleuszaiba juttatjuk be. A bejuttatás elvégezhető például mikroinjektálással. Az injektált DNS integrációját például a megfelelő szövetmintákból származó DNS lenyomat analízisével detektáljuk. Előnyben részesül, ha a bejuttatott DNS az állat ivarvonalába épül be így átkerül az állat utódaiba. Előnyösen, egy transzgenikus állatot egy mutáció megcélzásával fejlesztünk ki egy hmGluR szekvencia megzavarása céljából. Egy ilyen állat hasznos lehet például egy metabotróp receptor metabolizmusban való szerepének tanulmányozásában.

Továbbá, egy hatástalanított (=knock-out = KO) állat fejleszthető ki úgy, hogy a hmGluR szekvenciába egy mutációt juttatunk be, így egy olyan állatot hozunk létre, mely a továbbiakban nem expresszálja a funkcionális hmGluR gént. Az ilyen KO állatok hasznosak a metabotróp receptorok metabolizmusban való szerepének tanulmányozásában. A KO egerek létrehozásának módszerei ismertek a tudomány e területén.

A gazdasejteket a találmány fent leírt expressziós vagy klónozási vektoraival transzfektáljuk vagy transzformáljuk , • · • · · ·«·· • · · • · · · 99 •9999 999 • 9999 majd olyan hagyományos tenyész tápkőzegben szaporítjuk, melyet úgy módosítottunk, hogy megfelelő legyen a promóterek indukálásához, a transzformánsok szelektálásához vagy a kívánt szekvenciákat kódoló gének amplifikálásához (kierösítéséhez). A heterológ DNS a tudomány e területén jól ismert módszerekkel juttatható be a gazdasejtbe, például egy heterológ DNS-t kódoló vektorral való transzfekcióval a kálcium foszfátos koprecipitációs technikát használva, elektroporációval vagy lipofektin által közvetítve. A tudomány e területén képzett szakember számára számos transzfekciós módszer ismert. Általában a sikeres transzfekció úgy ismerhető fel, hogy a vektor működésének bármilyen indikációja megmutatkozik a gazdasejten. A transzformáció olyan standard technikákkal végezhető el, melyek az adott felhasznált gazdasejt esetében megfelelőek.

Egy klónozott DNS egy megfelelő expressziós vektorba való beépítése, eukarióta sejtek plazmid vektorral, vagy plazmid vektorokkal kombinációjával - melyek mindegyike egy vagy több egyértelmű gént kódol- vagy egy lineáris DNS-sel való transzfektálása, és a transzfektált sejtek szelekciója jól ismert módszerek a tudomány e területén (lásd például Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

A transzfektált vagy transzformált sejteket a tudomány e területén jól ismert tápközeget és tenyésztési módszereket használva tenyésztjük, előnyösen olyan körülmények között, ahol a DNS által kódolt hmGluR expresszálódik. A megfelelő tápközeg összetétele a tudomány e területén képzett szakember számára • ·

ismert, így ezek könnyen előállíthatok. A megfelelő tenyésztési tápközegek a kereskedelemben is beszerezhetők.

Míg a találmányban biztosított DNS bármilyen megfelelő gazdasejtben expresszálható, például a fent hivatkozottakban, a funkcionális hmGluR-t kódoló DNS expressziójához az eukarióta expressziós rendszereket részesítjük előnyben, különösen az emlős expressziós rendszereket, ideértve a kereskedelemben beszerezhető expressziós rendszereket és más olyan rendszereket, melyek a tudomány e területén jól ismertek.

A találmány humán mGluR DNS-ét egy vektorba ligáljuk és megfelelő gazdasejtekbe juttajuk be olyan transzformált sejtvonalak létrehozása céljából, melyek a találmány egy adott hmGluR altípusát, vagy az altípusok egy specifikus kombinációját expresszálják. Ezután a kapott sejtvonal olyan mennyiségben hozható létre, mely megfelelő egy receptor agonista, antagonista vagy alloszterikus modulátor reprodukálható minőségi és mennyiségi analíziséhez. Továbbá, az mRNS létrehozható a találmány egy altípusát kódoló DNS in vitro transzkripciójával. Ez az mRNS a Xenopus oocytes-be injektálható, ahol az mRNS az aktív receptor altípus szintézisét irányítja. Másik lehetőségként az altípust kódoló DNS közvetlenül injektálható az oocitákba. Ezután a transzfektált emlős sejtek vagy az injektált oociták használhatók a továbbiakban leírt drog (gyógyszer) szkrínelési vizsgálatokban. Az ilyen gyógyszerek hasznosak a találmány hmGluR altípusainak patogenezisével kapcsolatos betegségek esetében. Az ilyen betegségek közé tartoznak a glutamát, előnyösen a hmGluR-ek által közvetített túlzott működés következtében fellépő betegségek, mint például az agyi • · • · · · katasztrófa, az epilepszia valamint a krónikus neurogeneratív betegségek. Különösen hasznosak a vegyületek specifikus hmGluR altípusokkal való specifikus kölcsönhatásának értékelésében a találmány egy hmGluR-jét expresszáló stabilan transzfektált sej tvonalak.

így a találmány hmGluR-jét expresszáló gazdasejtek hasznosak a gyógyszer szkrínelésben és a jelen találmány egy további célja egy a hmGluR aktivitást módosító vegyület vagy jel azonosítására szolgáló módszer biztosítása, az említett módszer a következőket foglalja magába: a találmány hmGluR-jét kódoló heterológ DNS-t tartalmazó sejteket - mely sejtek funkcionális hmGluR-t termelnek - kitesszük legalább egy olyan vegyület vagy jel hatásának, melyeknek az említett hmGluR aktivitását módosító képességét meg szándékozunk határozni, valamint ezután az említett módosítások által okozott változásokat az említett sejtek esetében nyomonkövetjük. Egy ilyen vizsgálat lehetővé teszi a találmány egy hmGluR-ja agonistáinak, antagonistáinak és alloszterikus modulátorainak azonosítását.

Egy további megvalósulásban a találmány egy olyan vizsgálattal kapcsolatos, melyben a találmány hmGluR altípusa aktivitását módosító vegyületeket azonosítjuk, az említett vizsgálat a következő lépésekből áll:

- a találmány egy aktív hmGluR altípusát expresszáló és az említett hmGluR altípust kódoló heterológ DNS-t tartalmazó sejteket legalább egy az említett receptor aktivitásának módosítására való képességére tesztelendő vegyülettel hozzuk érintkezésbe, és

- a sejteket a második messenger szintbeli vagy receptor aktivitásbeli eltérésre analizáljuk.

Különösen, a találmány magába foglal egy olyan vizsgálatot, melyben a találmány hmGluR altípusa aktivitását módosító vegyületeket azonosítunk, az említett vizsgálat a kővetkező lépésekből áll:

- a találmány egy aktív hmGluR altípusát expresszáló és az említett hmGluR altípust kódoló heterológ DNS-t tartalmazó sejteket legalább egy az említett receptor aktivitásának módosítására való képességére tesztelendő vegyülettel hozzuk érintkezésbe, és

- a sejteket a kapott második messenger aktivitásbeli változásokra nyomon követjük. A vizsgálatban kapott eredményeket egy negatív kontrollnak megfelelő vizsgálathoz hasonlítjuk.

A vizsgálati módszerek általában különböző kontrollokhoz való hasonlítást tesznek szükségessé. Úgy tűnik, hogy a receptor aktivitásban vagy a második messenger szintben bekövetkező változást a teszt vegyület indukálja, ha egy ilyen hatás nem kövbetkezik be a teszt vegyület hiányában. Egy teszt vegyület a találmány receptor altípusára kifejtett hatása úgy tűnik az említett receptor által közvetített hatás, ha ezt a hatást a receptort nem expresszáló sejtek esetében nem lehet megfigyelni.

A találmány szerinti használatban a találmány hmGluR altípusát módosító vegyület vagy jel egy olyan vegyületre vagy jelre utal, mely megváltoztatja az említett hmGluR altípus által közvetített válasz reakcióutat a sejten belül (az említett hmGluR hiányához viszonyítva). A válasz reakcióutat egy extracelluláris inger aktiválja, ami a második messenger koncentrációját vagy enzim aktivitását változtatja meg, vagy egy membránhoz kötött protein, mint például egy receptor vagy az ioncsatorna aktivitását változtatja meg. Számos különböző válasz reakcióiét alkalmazható, ideértve például az adenilát cikláz válasz reakcióutat, a foszfolipáz C/intracelluláris kalcium ion válasz reakcióutat vagy egy ioncsatornához való kapcsolódást. Az adenilát cikláz aktivitás meghatározására szolgáló módszerek jól ismertek a tudomány e területén és ezek közé tartoznak például a Nakajima et al. (J. Bioi. Chem. 267, 2437-2442, 1992) által leírt vizsgálat.

így a találmány hmGluR-ját expresszáló sejtek vegyületek, különösen a glutainát agonistaként vagy antagonistaként hatni képes alacsony molekulasúlyú molekulák azonosítására használhatók. Különösen az 1000 Daltonnál kisebb alacsony molekulasúlyú molekulák részesülnek előnyben. A jelen találmány szövegösszefüggésében egy agonista egy olyan molekulára utal, mely egy receptorral kölcsönhatásba képes lépni, így az Lglutamát hatását képes utánozni. Különösen, egy glutamát agonistát azon képességén keresztül jellemezzük, hogy a találmány hmGluR-jával kapcsolatba lép és így a sejten belül egy válasz reakcióút stimulálását fokozza vagy csökkenti. Például, egy agonista a gazdasejten belül egy mérhető paramétert növel vagy csökkent, ilyen paraméter lehet például a második messenger koncentrációja, ahogy a természetes ligandum csökkenti vagy növeli az említett paramétert. Például, egy megfelelő teszt rendszerben, ahol a találmány hmGluR-je negatívan kapcsolódik az adenilát ciklázhoz, például a találmány egy hmGluR-jét expresszáló CHO vagy BHK sejtek, mint • · • · · · · · · • ······ · • ······ ·· ' • ··· ··· · ·· ·· például egy agonista képes az említett hmGluR funkciójának olyan módosítására, hogy a cAMP intracelluláris koncentrációja csökken.

Ezzel szemben, az olyan esetekben, amikor kívánatos a hmGluR aktivitásának csökkentése, antagonizáló molekulák lehetnek hasznosak. A jelen találmány szövegösszefüggésében egy antagonistán egy olyan molekulát értünk, mely képes egy receptorral vagy az L-glutamáttal kölcsönhatásba lépni, de ami nem stimulál egy válasz reakcióutat a sejten belül. Különösen, a glutamát antagonistákat azon képességük révén azonosítjuk, hogy a találmány egy hmGluR-jával képesek-e kölcsönhatásba lépni és így a temészetes ligandum sejten belüli válasz reakcióútjának stimulálási képességét csökkenteni, például beleavatkozik az L-glutamát a találmány egy hmGluR-jéhez való kötődésébe, vagy gátolja a hmGluR aktivitásához szükséges más celluláris funkciót. Például egy megfelelő vizsgálatban, például egy a találmány hmGluR altípusát expresszáló CHO vagy BHK sejteket magába foglaló vizsgálatban, egy glutamát antagonista a találmány egy hmGluR-je aktivitásának módosítására képes oly módon, hogy a természetes ligandum intracelluáris cAMP koncentrációjának csökkentési képességét gyöngíti. Egy az antagonista hatás elérésnek másik módja az antisense hmGluR RNS túlexpressziójára való hagyatkozás.

Előnyben az agonista vagy antagonista részesül, mely szelektíven hat a hmGluR4 alcsalád egy receptorára, például a hmGluR4-re, a hmGluR6-ra vagy a hmGluR7-re. Különösen egy olyan agonista vagy antagonista hasznos, mely specifikusan módosítja egy adott hmGluR altípus aktivitását, anélkül, hogy bármely más altípus aktivitására hatással lenne.

• * · · • · · · · • · ·♦ · · • ···«·· ·

A találmány egy hmGluR-jának alloszterikus modulátora az L-glutamáttói eltérő helyen levő receptor proteinnel lép kölcsönhatásba, így agonistaként vagy antagonistaként hat. Ezért az itt leírt szkrínelési eljárás megfelelő eljárás a találmány egy receptora alloszterikus modulátorának detektálására is. Például egy agonistaként ható alloszterikus modulátor fokozhatja a találmány egy hmGluR-je és az L-glutamát közötti specifikus kölcsönhatást is. Ha egy alloszterikus modulátor antagonistaként hat, akkor az, például a receptor proteinnel oly módon léphet kölcsönhatásba, hogy az agonista kötődése funkcionálisan kevésbé lesz hatékony.

Egy glutamát agonista vagy antagonista utáni in vitro vizsgálat szükségessé teheti, hogy a találmány egy hmGluR-je megfelelő mennyiségben termelődjön működőképes formában, rekombináns DNS módszereket használva. Egy olyan vizsgálatot tervezünk ezután, mellyel a hmGluR protein egy funkcionális tulajdonságát mérjük, például egy glutaterg ligandummal való kölcsönhatást. A találmány egy hmGluR-jenek termelésére úgy tekintjük, hogy akkor fordul elő megfelelő mennyiségben, ha az említett receptor aktivitása mérhető választ eredményez.

Például, az emlős sejteket, mint például a HEK293 sejtek, az L sejtek, a CH0-K1 sejtek, az LLCPK-1 sejtek vagy a GH3 sejtek (melyek az American Type Culture Collection-töl beszerezhetők) glutamát csökkentett, előnyösen glutamát-mentes tápközegben való szaporodáshoz adoptáljuk. Egy hmGluR expressziós plazmidot, például egy a példákban leírt plazmidot átmenetileg sejtekbe transzfektáljuk , például kálcium foszfátos precipitációval (Ausubel, F.M. et al. , 1993, Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, USA). A • · · · találmány egy hmGluR-jét stabilan expresszáló sejtvonalak hozhatók létre például lipofektin által közvetített transzfekcióval, hmGluR expressziós plazmidokkal és egy szelektálható marker gént, például a pSV2-Neo plazmidot (Southern and Berg, J. Mól. Appl. Génét. 1, 327-341, 1982) ami a G-418 rezisztencia gént kódoló plazmid vektor tartalmazó plazmiddal. A szelekciót túlélő sejtekek izoláljuk és szelekciós tápközegben szaporítjuk. A rezisztens klónozott sejtvonalat analizáljuk például az altípus-specifikus hmGluR antitestekkel szembeni immunoreaktivitásra vagy az agonista hozzáadását követő hmGluR funkcionális válaszok utáni vizsgálatokkal. A kívánt hmGluR altípust termelő sejteket a találmány hmGluR-jéhez kötődő vegyületek detektálására szolgáló módszerben, vagy egy glutamát agonista vagy antagonista azonosítására szolgáló módszerben használjuk.

Egy további megvalósulásban, a találmány egy hmGluR altípushoz kötődő vegyületek azonosítására szolgáló módszert biztosít, mely módszer a következőket foglalja magába: a találmány egy hmGluR altípusát alkalmazzuk egy kompetíciós kötődési vizsgálatban. A kompetíciós kötődési vizsgálat elvi alapjai általánosságban ismertek a tudomány e területén. Röviden, a találmány szerinti kötődési vizsgálatot úgy végezzük el, hogy a hmGluR kötési képességre teszteledő vegyületet egy ismert megfelelően jelölt glutamaterg ligandummal versenyeztetjük a hmGluR célmolekula kötési helyénél. Egy megfelelően jelölt ligandum például egy radioaktívan jelölt ligandum, mint például a [³H]glutamát vagy egy az optikai tulajdonságai miatt detektálható ligandum, mint például az abszorbancia vagy fluoreszcvencia miatt detektálható. A nem ·· ···· kötött ligandum és a teszt vegyület eltávolítása után a hmGluRhez kötődő jelölt ligandum mennyiségét mérjük. Ha a jelölt ligandum mennyisége csökken a teszt vegyület jelenlétében, akkor azt módjuk, hogy ez a vegyület a célmolekulához kötődik. Egy kompetíciós kötődéi vizsgálat elvégezhető például a találmány hmGluR-jét, vagy a találmány hmGluR-jét tartalmazó membránszerü celluláris frakcióját expresszáló transzformált vagy transzfektált gazdasejtekkel.

A cél hmGluR-hez kötődő vegyület módosíthatja a hmGluR funkcionális tulajdonságait és így glutamát agonistaként vagy antagonistaként azonosítható egy funkcionális vizsgálatban.

A funkcionális vizsgálatokat a találmány hmGluR funkcionális aktivitásában bekövetkező változások detektálására használjuk, azaz egy funkcionális válasz detektálására, ami például az említett hmGluR és a tesztelendő vegyület kölcsönhatásának eredménye. Egy funkcionális válasz, például egy idevonatkozó második messenger koncentrációjában bekövetkező (eltérés) változás, vagy egy másik membránhoz kötött protein aktivitásában bekövetkező változás, melyet a találmány receptora befolyásol azokon a sejteken belül, amelyek a találmány funkcionális hmGluR-jét expresszálják (egy negatív kontrolihoz viszonyítva). A tudomány e területén képzett szakember számára könnyen megállapítható egy az aktív hmGluR expresszióját jelző intracelluláris második messenger szintjében bekövetkező változás detektálására szolgáló megfelelő módszer. A példák közé tartoznak a cAMP vizsgálatok (lásd például Nakajima et al., J. Bioi. Chem. 267, 2437-2442, 1992), a cGMP vizsgálatok (lásd például Steiner et al., J. Bioi. Chem. 247, 1106-1113, 1972), a foszfatidil inozitol (Pl) • · • · · · · · · • ······ · • ······ · · · ·♦·· ··· · ·· ·· átfordulás! vizsgálatok (Nakajima et al., J. Bioi. Chem. 267, 2437-2442), a kalcium ion flux vizsgálatok (Ito et al., J. Neurochem. 56, 531-540, 1991), az arachidonsav felszabadulási vizsgálatok (lásd például Felder et al., J. Bioi. Chem. 264, 20356-20362, 1989) és más hasonló vizsgálatok.

Még specifikusabban, a találmány szerint egy glutamát agonista detektálására szolgáló módszer a következő lépésekből áll: (a) egy vegyületet egy válasz reakcióúthoz kapcsolódó, a találmány hmGluR altípusa hatásának teszünk ki, olyan körülmények között és annyi ideig, mely lehetővé teszi a vegyület receptorral való kölcsönhatását és egy kapcsolódó válasz kiváltását a reakcióúton keresztül, (b) a válasz reakcióút stimulálásában a vegyület és a hmGluR altípus kölcsönhatásának eredményeként bekövetkező növekedést vagy csökkenést - a tesztelt vegyület hiányához viszonyítva detektáljuk, és ebből meghatározzuk a glutamát agonista jelenlétét.

A találmány szerint egy glutamát agonista detektálására szolgáló módszer a következő lépésekből áll: (a) egy vegyületet egy válasz reakcióúthoz kapcsolódó, a találmány hmGluR altípusa hatásának teszünk ki egy ismert glutamát agonista jelenlétében, olyan körülmények között és annyi ideig, mely lehetővé teszi az agonista receptorral való kölcsönhatását és egy kapcsolódó válasz kiváltását a reakcióúton keresztül, (b) a válasz reakcióút stimulálásában a vegyület és a hmGluR altípus kölcsönhatásának eredményeként bekövetkező, az agonista által kiváltott gátlást - csak a glutamát agonista válasz reakcióútjának stimulálásához viszonyítva - detektáljuk, és ebből meghatározzuk a glutamát antagonista jelenlétét. A gátlás • · · · · · ···· • · · · · · · • ······ · • ······ · · · ···· ··· · ·· · _t detektálható például, ha a teszt vegyület a találmány hmGluRjéért versenyez a glutamát agonistával. Azok a vegyületek melyek az ilyen módszerek felhasználásával szkrínelhetők például a hmGluR3 altípushoz specifikusan kötődő blokkoló antitestek. Továbbá, egy ilyen vizsgálat hasznos az Lglutamáttal, például a ligandum kötő dómén egy részét vagy egészét tartalmazó oldható hmGluR fragmentekekkel kölcsönhatásba lépő vegyületek szkrínelésében.

Előnyösen, egy agonista vagy antagonista a találmány hmGluR-jával való kölcsönhatása az agonista vagy antagonista az említett hmGluR-hez való kötődését jelzi.

A találmány szerinti alkalmazásban egy glutamát agonista vagy antagonista jelölt receptorral való megfelelő körülmények közötti és ideig tartó kölcsönhatása a receptor forrásától függően változik, azonban, általában a kötődéshez megfelelő körülmények 4 - 40 C° hőmérséklet között találhatók, előnyösen 4-37 C° hőmérséklet között, 0 - 2 M NaCl érték közötti puffer oldatban, előnyösen 0 és 0,9 M NaCl értékek között, legelőnyösebben 0,1 M NaCl értéknél, és a pH tartomány 5 és 9 értékek közötti, előnyösen 6,5 és 8 érték közötti. A kötődéshez a megfelelő kitettségi időtartam általában körülbelül 1 perc és 24 óra között található.

A találmány egy megvalósulásában a válasz reakcióút egy membrán-kötött adenilát cikláz reakcióút, és egy agonista esetében a detektálási lépés a membránhoz kötött adenilát cikláz reakcióút általi cAMP termelésben bekövetkező csökkenés vagy növekedés, előnyösen csökkenés mérését jelenti, a megfelelő kontroll felállás cAMP termeléséhez viszonyítva. A jelen találmány céljaihoz előnyben részesül ha a cAMP • · · · · · · • ······ · • ··«··· ·· · termelésbeli csökkenés vagy növekedés azonos vagy nagyobb, mint az IC50 koncentrációnak megfelelő koncentrációban alkalmazott L-glutamát által indukált csökkenés vagy növekedés. Az antagonista esetében a detektálás a membránhoz kötött adenilát cikláz válasz reakcióút általi és egy kisebb L-glutamát által indukált cAMP termelésben bekövetkező csökkenés vagy növekedés mérését jelenti, az antagonista hiányában bekövetkező cAMP termeléshez viszonyítva. A cAMP mérése elvégezhető a sejt roncsolás után vagy egy a sejtekhez adott cAMP érzékeny molekuláris próbával, mint például egy fluoreszcensz festék hozzáadásával, mely megváltoztatja tulajdonságait, például a cAMP kötődésekor fluoreszcensz tulajdonságait.

A ciklikus AMP termelés a tudomány e területén jól ismert módszerek felhasználásával mérhető, ideértve például a Nakajima és munkatársai által supra leírt módszerekkel, vagy a kereskedelemben beszerezhető kitekkel, például radioaktív jelölésű cAMP-t tartalmazó kitekkel, például [¹25j]_CAMP-t vagy [^HjcAMP-t tartalmazó kitekkel. Ilyen kitekre példák a Scintillation Proximity Assay Kit (Amersham), ami a cAMP termelést a jódozott cAMP cAMP antitestekkel való versengésének mérésével határozza meg, vagy a Cyclic AMP pH] Assay Kit (Amersham).

Az adenilát cikláz reakcióúthoz negatívan kötődő receptor altípusokat - azaz stimulálás esetében a cAMP csökkenését okozza, és a stimulálás csökkentésekor a cAMP növekedését okozza - expresszáló sejteket felhasználó vizsgálati rendszerekben, előnyben részesül, ha a sejteket a (feltételezett) receptor agonista vagy antagoniusta hozzáadása előtt egy olyan vegyület hatásának tesszük ki, mely az adenilát • · · • · · · · • · · · ciklázt, például a forskolint reverzibilisen vagy irreverzibilisen stimulálja, vagy ami egy foszfodiészteráz inhibitor, mint például az izobutil-metil-xantin (IBMX).

A találmány egy másik megvalósulásában a válasz reakcióút a Pl hidrolízis/Ca²⁺ mobilizációs reakcióút. Egy ilyen a teszt vegyület a találmány egy hmGluR altípusával való specifikus kölcsönhatásának meghatározására szolgáló vizsgálat funkcionálisan kapcsolódhat az intracelluláris kalcium ion (Ca²⁺) koncentrációk változásaihoz. Számos módszer ismert a tudomány e területén a Ca²⁺ intracelluláris koncentrációjában bekövetkező változások meghatározására, például egy olyan módszer, mely magába foglalja egy kalcium ion érzékeny fluoreszcensz festék, mint a fura-2 (lásd Grynkiewisz et al., J. Bioi. Chem. 260, 3440-3450, 1985), a fluo-3 vagy az Indo-1, mint a Charest et al (J. Bioi. Chem. 259, 8679-8773, 1993) által leírt kalcium fluor QuinZ módszert, vagy a NakajimaShimada (proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88. 6878-6882 , 1991) által leírt aequorin fotoprotein módszet. A találmány egy megvalósulásában az intracelluáris kalcium ion koncentrációt mikrofluorometriával mérjük fluo-3 vagy fura-2 kalcium érzékeny fluoreszcensz festékekkel terhelt rekombináns sejtekben. Ezeket a méréseket fedőlemezen szaporított sejteket használva végezzük el, lehetővé téve egy inverz mikroszkóp és video-megjelenítéses technológiák vagy egy fluoreszcensz fotométer felhasználását az egyedüli sejt szinten való kalcium koncentrációk mérésére. Mindkét megközelítéshez a hmGluR-t expresszáló plazmiddal transzformált sejteket kalcium indukátorral kell terhelni. Ehhez, a tenyésztápközeget eltávolítjuk a sejtekről és fura-2-ot vagy fluo-3-at tartalmazó • · · oldattal helyettesítjük. A sejteket a kálciumos mérésekhez előnyösen a kővetkező 8 óra során felhasználjuk. A mikrofluorometria során standard eljárásokat használunk.

A vegyület célmolekulával való funkcionális kölcsönhatásából adódó Ca^{2 +} jelek átmenetiek lehetnek, ha a vegyületet egy korlátozott ideig alkalmazzuk, például egy prefúziós rendszeren keresztül. Tranziens alkalmazást használva ugyanazokkal a sejtekkel számos mérés végezhető el, ez belső szabályozást és nagyobb számú tesztelt vegyületet jelent.

A találmány egy hmGluR-jének Ca^{2 +} jelzéshez való funkcionális kapcsolása különböző módszerekkel érhető el, például CHO sejtekben:

(i) a találmány egy rekombináns hmGluR-jének és egy rekombináns feszültség-kivezetésü kation csatornával való koexpressziója, melynek aktivitása funkcionálisan kapcsolódik a hmGluR aktivitásához;

(ii) egy kiméra hmGluR receptor expressziója, mely közvetlenül stimulálja a PI/Ca²⁺ reakcióutat;

(iii) a találmány egy rekombináns hmGluR-jének egy rekombináns Ca²⁺-permeábilis cAMP függő kation csatornával való koexpressziój a.

Más expressziós rendszerekben egy hmGluR Ca²⁺ jelzéshez való funkcionális kapcsolása elérhető a találmány egy hmGluRjének transzfekciójával, ha ezek a sejtek természtes körülmények között (i) expresszálják a feszültség kivezetésű Ca csatornákat, melyek aktivitása funkcionálisan kapcsolódik az mGluR-ek aktivitásához vagy ha (ii) Ca²⁺-permeábilis cAMP függő ioncsatornákat expresszálnak. Például, a természetes körülmények között feszültség-kivezetésü Ca csatornákat ·* · · ·· ···· • · · · · · · • ······ · • · ····· · · · ···· ··· · ·· · a expresszáló CH3 sejtek közvetlenül lehetővé teszik a Ca2 + vizsgálatok alkalmazását a hmGluR funkcionális aktivitás hmGluR-ek kotranszfektálásával történő tesztelésére.

További sejt alapú szkrínelési vizsgálatok tervezhetők például olyan sejtvonalak megszerkesztésével, melyekben egy riporter protein azaz egy könnyen vizsgálható protein, mint amilyen a beta-galaktozidáz, kloramfenikol acetiltranszferáz (CAT) vagy a luciferáz expressziója a találmány egy hmGluRjének funkciójától függ. Például egy cAMP válasz elemet tartalmazó DNS szerkezet működőképesen kapcsolódik a luciferázt kódoló DNS-hez. Az enzim DNS-t tartalmazó kapott DNS szerkezet stabilan transzfektálható a gazdasejtbe. Ezután a gazdasejtet egy a találmány hmGluR-jét kódoló első DNS szegmentet tartalmazó második DNS szerkezettel transzfektáljuk, mely működőképesen kapcsolódik további a receptor expressziójához szükséges DNS szegmentekhez. Például, ha egy teszt vegyület a találmány hmGluR-jéhez való kötődése emelkedett cAMP szinteket eredményez a luciferáz expressziója indukálódik vagy csökken a választott promótertől függően. A luciferázt luciferin hatásának tesszük ki, és a luciferin luciferáz általi oxidációja során kibocsátott fotonokat mérjük.

A találmányban biztosított gyógyszer szkrínelési vizsgálatok lehetővé teszik a receptor altípus-specifikus vegyületek azonosítását és megtervezését, különösen a receptor proteinhez kapcsolódó ligandumokét, ez végül egy betegségspecifikus gyógyszer kifejlesztéséhez vezet. Ha csak egy adott hmGluR altípussal való nagyon specifikus kölcsönhatáshoz tervezzük (vagy egy hmGluR altípus előre meghatározott szelekciójához) az ilyen gyógyszer legnagyobb valószínűséggel ·· · · ·· ···· • · · · · · • ······ · • · ····· «· · ··· ··· · «· kevesebb nem kívánatos mellékhatást fog mutatni, mint egy olyan gyógyszer, melyet olyan sejtek szkrínelésével azonosítottunk, melyek (ismeretlen) receptor altípusokat expresszálnak. A találmány egy egyedüli receptor altípusának tesztelése, vagy különböző receptor altípusok specifikus kombinációinak számos potenciális agonistával vagy antagonistával való tesztelése további információkat szolgáltat az egyes altípusok funkcióját illetve aktivitását illetően és ez olyan vegyületek azonosításához és tervezéséhez kell vezessen, melyek egy vagy több altípussal való nagyon specifikus kölcsönhatásra képesek.

A találmány egy másik megvalósulásában a találmány egy hmGluR altípusával szembeni poliklonális és monoklonális antitesteket biztosítunk. Az ilyen antitestek hasznosak lehetnek például az immunohisztokémiát, valamint a diagnosztikai és terápiás alkalmazásokat is magába foglaló immunovizsgálatok során. Például, egy adott hmGluR altípus extracelluláris dóménjével, vagy annak részeivel szemben specifikus antitestek felhasználhatók az endogén hmGluR altípusok blokkolására.

A találmány antitestjei a tudomány e területén jól ismert módszerekkel előállíthatok antigénként a találmány egy hmGluR3 altípusát vagy ennek egy fragmentjét használva, vagy egy az adott altípus vagy fragment által expresszált sejtet használva. Az antigén a találmány receptorának aktív vagy inaktív formáját képviselheti. Az antitestek képesek lehetnek az aktív és az inaktív forma közötti különbségtételre. Az antigénként szolgáló altípus fragmentek (akár szintetikus peptid, vagy fúziós protein) szelektálásakor figyelembe veendő tényezők közé taroznak az antigenitás, az elérhetőség, (azaz extracelluláris és citoplazmás domének) és az a tény, hogy az adott altípussal szemben egyedülállóak-e.

Különösen hasznosak azok az antitestek, melyek szelektíven ismerik fel és kötik a fent leírt alcsalád receptor altípusait, anélkül, hogy egy másik alcsalád altípusához kötődnének, valamint olyan antitestek, melyek szelektíven ismerik fel és kötődnek egy adott altípushoz, anélkül, hogy bármely másikhoz kötődnének.

A találmány antitestjei standard módszerekkel egy erre rászoruló alanynak adhatók. A tudomány e területén képzett szakember könnyen meghatározhatja a dózis formákat, a kezelési előírást, stb. az alkalmazott kezelés módjától függően.

A találmány különösen a példákban leírt specifikus megvalósulásokra vonatkozik, mely példák a jelen találmány illusztrálását szolgálják és nem tekinthetők a találmány korlátozásának.

Rövidítések: hmGluR = humán metabotróp glutamát receptor, nt = nukleotid

1. példa: hmGluR4-et kódoló cDNS

A humán mGluR4 cDNS kiónokat humán magzati agy és humán cerebellum cDNS könyvtárakból izoláljuk alacsony szigorúságú hibridizációs körülmények között patkány agy cDNS-ből PCR-ral létrehozott radioaktív jelölésű patkány mGluR4 próbát használva.

1.1 Poli(A)⁺ RNS előállítása patkány eloagyból

Felnőtt hím Sprague-Dawley patkányokat fullasztással elpusztítunk, előagyukat eltávolítjuk és azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. A teljes RNS-t guanidin tiocianátos eljárással (Chomczynski and Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159) izoláljuk. A poli(A)⁺ RNS dúsítását oligo(dT)cellulózon standard eljárásoknak megfelelően végzett (Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Habroe Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) affinitás kromatografiával érjük el.

1.2 A cDNS első szálának szintézise PCR-hoz

A poli(A)⁺ RNS-t (mRNS) reverz transzkripcióval DNS-sé alakítjuk Moloney Murine Leukémia Vírus Reverse Transcriptasezal (M-MLV RT, BRL). Az 50 μΐ mennysiégben zajló reakciók a következők: 10 μΐ steril vízben levő 10 μg patkány előagy poli(A)⁺ RNS-t 70 C° hőmérsékletre hevítünk 10 percig majd gyorsan lehűtjük jégen. Ezután 10 μΐ 5x 250 mM Tris-HCl-t (pH 8,3), 375 mM KCl-t, 15 mM MgC12őt tartalmazó reakció puffért, 5 μΐ 0,1 M ditiotreitolt, 5 μΐ kevert dNTP-t (10 mM a dATP-ből, a dCTP-ből a dGTP-ből, a dTTP-ből, Pharmacia), 1,25 μΐ 2 mg/ml koncentrációjú oligo-dT]_2 _ ig (Pharmacia), 2,5 μΐ 40 U/μΙ koncentrációjú RNazint, 12,25 μΐ steril vizet és 4 μΐ 200 U/μΙ koncentrációjú M-MLV RT-t adunk a reakcióelegyhez. A reakció 37 C° hőmérsékleten játszódik le 60 perc alatt.

• ·

1.3 PCR körülmények a patkány mGluR4 fragment létrehozásához

A PCR-hoz használt oligonukleotid primereket a foszforamidit módszerrel szintetizáljuk. A szekvenciákat az 1. táblázatban soroljuk fel.

1. táblázat

Pl: 5'-GTCAAGGCCTCGGGCCGGGA-3' ez megfelel a patkány mGluR4 cDNS 1921-1940 bázispárjainak (Tanabe et al., (1992), Neuron 8, 169-179)

P2: 5'-CTAGATGGCATGGTTGGTGTA-3' ez megfelel a patkány mGluR4 cDNS 2788-2808 bázispárjainak (Tanabe et al., (1992), Neuron 8, 169-179)

100 μΐ reakcióelegyhez a standard PCR körülmények a következők: 30 ng patkány előagy cDNS, 50 pmol a Pl és P2 primerekből, 200 μιηοΐ a négy dezoxinukleotid trifoszfátok bármelyikéből (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10% PCR pufferben (10 mM Tris-HCl, pH8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KC1, 10 mM betamerkaptoetanol, 0,05% Tween (súly/térfogat) 0,05% NP-40 (s/t) és 0,5 U AmpliTaq Polimeráz (Perkin Elmer Cetus)levő DMSO. Az amplifikálást a következő körülményeket használva hajtjuk végre: 30 másodperc 93 C° hőmérsékleten való denaturálás, 1,5 perc 56 C° hőmérsékleten való anneálás (primer beégetés) és 3 perc 72 C° hőmérsékleten való extenzió (lánchosszabbítás) összesen 40 cikluson keresztül. A kezdeti denaturálást 4 percig 94 C° hőmérsékleten végezzük.

1.4 A patkány mGluR4 PCR fragment szubklónozása

A restrikciós endonukleázos emésztést, a módosító enzimeket, a vektor előállítást (defoszforiláció, géltisztítás), a ligálást, az E. coli transzformálását és a plazmád DNS előállítást standard eljárásoknak (Sambrook et al., 1989, supra) megfelelően végezzük el.

Az 1.3 pontban leírt módszer szerint nyert 888 bázispár hosszúságú PCR fragmentet a Bluescript SK⁺ plazmid (Stratagene, La Jolla, USA) Smal helyére ligáljuk. A Bluescript vektorba inzertált fragmentet mindkét végén szekvenáljuk T7 és T3 (Stratagene, La Jolla, USA) primereket használva.

1.5 Egy radioaktív jelölésű próba előállítása

20-50 ng PCR-ral létrehozott patkány mGluR4 fragmentet géltisztítunk majd ²²P-jelöljük egy DNS Jelölő Kitet (Boehringer Mannheim) használó random primeléssel.

1.6. cDNS könyvtár szkrínelés

Humán magzati agy könyvtárból (lambdaZAPII, Stratagen, La

Jolla, USA), humán hippocampus könyvtárból (lambdaZAP,

Stratagene, La Jolla, USA) és humán cerebellum cDNS könyvtárból (lambdaZAP, STrategene) származó körülbelül 1 x 10⁶ fágot szkrínelünk a patkány mGluR4 fragmenthez való hibridizációhoz.

A hibridizáció 5 x SSC (s/t), Ficoll (400-as Típus), 0,02% (s/t) polivinilpirrolidon, 0,1% (s/t) SDS, 50 ^g/ml hering testis DNS elegyében hajtjuk végre. Az előhibridizációt 30 perc • · ···· és 3 óra közötti időtartamig végezzük 58 C° hőmérsékleten. A hibridizáció alacsony szigorúsági körülmények mellett megy végbe 58 C° hőmérsékleten egy éjszakán keresztül 1-3 x 10⁵ cpm/ml koncentrációban levő ³²P-jelölésű fragmentet tartalmazó ugyanilyen oldatban. A mosásokat háromszor végezzük egyenként 20 percig 58 C° hőmérsékleten 2 x SSC/0,1% SDS elegyében.

A patkány mGluR4 próbához hibridizálódó fágokat egy második és harmadik szkrínelési menettel tisztítjuk a fent leírt körülmények között. A tisztított fágokban található cDNS inzerteket in vivő kimetszéssel nyerjük ki ExAssist/SOLR rendszert (Stratagene, La Jolla, USA) használva.

1.7 Az izolált cDNS kiónok jellemezése

Restrikciós enzimes térképezéssel és DNS szekvencia analízissel számos cDNS inzertet jellemzünk. Ezek kiónok egyike a cDNS cmR20 (melyet humán cerebellum könyvtárból izoláltunk) megközelítően 3,3 kb hosszúságú inzertet tartalmaz. A cmR20 szekvencia analízise azt mutatja, hogy a humán mGluR4 szinte egész kódoló régióját tartalmazza, beleértve a transzlációs terminációs kódont is (nt 158-2739, vesd ősze az 1. számú szekvenciával), valamint megközelítően a 3' nem transziáit régió 750 nukleotidját. A transzlációs start kódont is tartalmazó 5'-vég hiányzik.

1.8 A humán mGluR4 5'-végének izolálása

A humán mGluR4 kódoló régiójának teljessé tételéhez a POR reakciókat templátként humán genom DNS-t vagy a humán agy RNS • · első szál cDNS-ét használva hajtjuk végre. A sense primer P3 megfelel a patkány mGluR4 cDNS 5'-végének, az antisense P4 primer a patkány mGluR4 cDNS 440-459 nukleotidjainak.

2. táblázat

P3: 5¹ -GCGGTGCAGGCGGCCGCAGGGCCTGCTAGGGCTAGGAGCGGGGC- 3' megfelel a patkány mGluR4 cDNS 11-37 nukleotidjának (Tanabe et al., (1992), Neuron, 8, 169-179)

P4: 5'-GCGGAATTCCCTCCGTGCCGTCCTTCTCG-3' megfelel a patkány mGluR4 cDNS 440-459 nukleotidjának (Tanabe et al., (1992), Neuron, 8, 169-179)

A. hozzáadott szekvenciákat aláhúzással, a restrikciós enzimekhez való helyeket vastag betűvel jelöljük

100 μΐ reakció elegyhez a PCR reakció a következőket tartalmazza: PCR pufferben (10 mM Tris-HCl, pH8,3, 1,5 mM

MgC12, 50 mM KC1 és 2 U AmpliTaq Polimeráz) levő 400 ng humán genom DNS, 1 μΜ az egyes printerekből, 2 mM az egyes dezoxinukleotid trifoszfátokból (dATP, dCTP, dGTP és dTTP). Az amplifikálást (kierösítést) a következő körülményeket használva hajtjuk végre: 1 perces 95 C° hőmérsékleten való denaturálás, 1 perces 56 C° hőmérsékleten végzett anneálás (primer beégetés), és 1 perces 72 C° hőmérsékleten végzett extenzió (lánchosszabbítás) 32 cikluson keresztül. A kezdeti denaturáció 3 percig tart 94 C° hőmérsékleten.

A különböző egymástól független PCR-ok termékeit a PstI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, géltisztítjuk és a pBluescript SK (Stratagene) Pstl/EcoRI helyeire ligáljuk. A • · · · • · · · * • · · · · · · • ····· ·· · ··· ♦ ·· ·· különböző egymástól független PCR-ok szubklónozott fragmentjeit DNS szekvencia analízissel (cR4PCRl-4) analizáljuk. A szekvencia analízis felfedi, hogy a CR4PCR2 klón a hmGluR4 transzlációs iniciációs kódont (1-380 nt, vesd össze az 1. számú szekvenciával) is magába foglaló kódoló régiójának 380 nukleotidját kódolja. A cR4PCR2 átfedésben van a 3' végen 223 nt-dal a cmR20-szal.

A hmGluR4 protein teljes származtatott aminosav szekvenciáját a 2. számú szekvencia mutatja.

2. példa: A hmGluR7-et kódoló cDNS kiónok

A humán magzati agy és humán cerebellum cDNS könyvtárakat alacsony szigorúságú körülmények között végzett hibridizációval szkríneljük, melynek során radioaktív jelölésű patkány mGluR4 fragmentet használunk (ahogy azt az 1.5 és 1.6 pontokban leírtuk) ez lehetővé teszi olyan cDNS kiónok izolálását, melyek az mGluR7 altípusú humán metabotróp glutamát receptorokat azonosítják. A cDNS kiónok DNS szekvencia analízissel végzett jellemzése felfedi, hogy az izolált cDNS-ek a humán mGluR7 mRNS legalább két egyértelmű hasítási variánsát képviselik.

A humán magzati agy cDNS könyvtárból izolált cDNS cmR2 3804 nt méretű. A cmR2 klón a hmGluR7 transzlációs terminációs kódont is magába foglaló kódoló szekvencia 2604 nt-ját tartalmazza, melyet a 3' nem transziáit szekvencia 1200 nt-ja követ.

A humán hippocampus cDNS könyvtárból izolált cDNS cmR3 1399 nt méretű (5. számú szekvencia). A cmR3 klón a hmGluR7 transzlációs terminációs stop kódont (a származtatott aminosav • · szekvencia a 6. számú szekvenciában kerül bemutatásra) is magába foglaló 3' vég kódoló régió 270 nt-ját tartalmazza, melyet a 3' nem transziáit szekvencia 1129 nt-ja követ. A cmR3 szekvenciája teljes mértékben megtalálható a cmR2-ben, azonban a cmR2-től 92 nukleotidban különbözik, melyek a 3. számú szekvencia 2534 nt pozíciójától a 2625 nt pozícióig találhatók. A hmGluR7 ezen egyértelmű hasítási variánsa a származtatott hmGluR7 aminosav szekvencia eltérő 3' végét hozza létre.

A humán magzati agy cDNS könyvtárból izolált cDNS cmR5 1588 nt méretű (7. számú szekvencia). A cDNS cmR5 1424 nt-dal átfedésben van a cDNS cmR2-vel. Ez a 3' végnél pontosan a cmR2/cmR3 92 nt inzertációs/deléciós pozíciónál különbözik. A cmR5 további 164 nukleotidja vagy intron szekvenciákat kódol, ahogy azt egy konzervált hasítási donor szekvencia jelenléte jelzi, mely közvetlenül a cmR5 és cmR3 szekvencia eltérések helyeit követi, vagy egy harmadik hasítási variánst képvisel.

A cDNS cmR2, cmR3 és cmR5 kiónokból hiányzó hmGluR7 5' kódoló régiót a genom könyvtár szkrínelés és PCR technika kombinálásával izoláljuk. Egy Lambda-Fix genom könyvtárat (Stratagene) egy EcoRI/Smal restrikciós fragmenttel szkríneljük, mely a cDNS cmR2 1-1304 nt-jait tartalmazza, erősen szigorú hibridizációs körülmények között Sambrook leírásának megfelelően (1989, supra). A cDNS cmR2 klón 5' végéhez hibridizálódó lambda kiónokat tisztítjuk és restrikciós analízissel analizáljuk, majd DNS szekvenálásnak vetjük alá. Az ATG transzlációs iniciációs kódont is magába foglaló humán mGluR7 kódoló régiójának teljes 5' végét PCR-ral amplifikáljuk (kierösítjük) a humán agy cDNS-böl a klónozott genom fragmentekből származó primer szekvenciák felhasználásával. A • · · ·

PCR fragmentek mérete 557 nt. Ezt cR7PCRlként jelöljük és a 9. számú szekvenciában mutatjuk be. A származtatott aminosav szekvenciát a 10. számú szekvenciában mutatjuk be. A CR7PCR1 a 3' végen 392 nt-dal átfedést mutat a cmR2-vel.

A teljes hmGluR7a és b proteineket kódoló DNS szekvenciákat sorrendben a 11. és 13. számú szekvenciákban mutatjuk be. A származtatott aminosav szekvenciákat sorrendben a 12. és 14. számú szekvenciákban mutatjuk be. A származtatott aminosav szekvenciák összehasonlítása felfedi, hogy az 1. példában szereplő hmGluR4 altípussal megközelítően 70%-os szekvencia azonosságot mutat.

3. példa: A részleges hmGluR6-ot kódoló cDNS

Egy 1,0 kb hosszúságú inzertet tartalmazó egyedüli cDNS kiónt, a cmRl-et, alacsony szigorúságú hibridizációs körülmények mellett az 1.5 és 1.6 pontokban leírtak szerint a hmGluR fragmentet használva egy humán hippocampus könyvtárból izoláljuk. Megközelítően 630 nukleotid homológ a humán mGluR4gyel. A cmRl 5' és 3' végeinél található további szekvenciák egyértelműen intron szekvenciákat kódolnak, ahogy azt a feltételezett hasítási donor és hasítási akceptor hely szekvenciák jelenléte jelzi. A cDNS cmRl a humán metabotróp glutamát receptor hmGluR6 altípusának (15. számú szekvencia) egy részével azonos.

A hmGluR6 teljes kódoló régiója a cDNS és genom könyvtárak szkrínelésével izolálható erősen szigoró körülmények köztt próbaként cDNS cmRl-et használva. A származtatott aminosav • · · · • · · · · · « · • · · · • « · · • · · · szekvenciák összehasonlítása felfedi, hogy az 1. példa hmGluR4ével megközelítően 70% a szekvencia azonosság.

4. példa: A hmGluR cDNS-ek emlős sejtekben való expressziőja

4.1.Receptor expresszáló plazmidok

A fenti teljes hosszúságú hmGluR4-et, hmGluR6-ot és hmGluR7-et kódoló cDNS-eket cDNS fragmentekből hozzuk létre, majd konstitúciós promóterekre (CMV, SV40, RSV) vagy indukálható promóterekre alapuló emlős expressziós vektorokba ligáljuk ezeket. A pBK-CMV (Stratagene), a pBK-RSV (Stratagene), a pCMV-T7 (Sibia, Inc.) és a pICP4 (Novagen, USA) plazmidok ezekre a plazmidokra példák.

A hmGluR4 altípust kódoló teljes hosszúságú cDNSt az emlős pBK-CMV expressziós vektorba úgy juttatjuk be, hogy a hmGluR4 5' vég fragmentet (cR4PCR2 klón) a cDNS cm20-szal a hmGluR4 cDNS 346-351 nukleotidjainál elhelyezkedő egyedüli Xhol helyre ligáljuk. Specifikusan, a pBK-CMV-hmGluR4 plazmidot a CR4PCR2 Notl/Xhol fragmentének, a cDNS cmR20 XhoI/NotI fragmentjének, valamint a NőtI-gyei emészett pBK-CMV vektor három utas ligálásával hozzuk létre. A pCMV-T7-hmGluR4 plazmidot a CR4PCR4 Pstl/Xhol fragmentjének, a cmR20 Xhol/EcoRI fragmentjének és a Pstl/EcoRI-gyei meésztett pCMV-T7-2 vektor három utas ligálásával hozzuk létre. Mindkét expressziós szerkezet a hmGluR4 teljes kódoló régióját tartalmazza, valamint a 3' nemtranszlált szekvenciák megközelítően 750 nukleotidját.

A két hmGluR7 hasítási variánst - a hmGluR7a (12. számú szekvencia) és a hmGluR7b (14. számú szekvencia) jelölésű • · · variánsokat képviselő teljes hosszúságú cDNS-eket a pCMV-T7-2 plazmidba (SIBIA, Inc.) építjük be az átfedést mutató cmR2, cmR3 és hcR7PCRl cDNS kiónok felhasználásával. A pCMV-T7hmGluR7b-nek jelölt teljes hosszúságú hmGluR7b expressziós szerkezetet hcR7PCRl Pstl/Bsal fragmentjének, a cmR2 Bsal/EagI fragmentjének és a pCMV-T7-2 plazmid Pstl/NotI fragmentjének három utas ligálásával állítjuk elő. A pCMV-T7-hmGluR7b plazmid a hmGluR7b teljes kódoló régióját tartalmazza, valamint a 3' nemtranszlált szekvenciák 191 nukleotidját. Egy teljes hosszúságú hmGluR7a expressziós szerkezet létrehozásához pCMV-T7-hmGluR7a - a cmR2 egy 370 bázispár hosszúságú Hindlll/Eagl fragmentjét a cmR3 megfelelő fragmentjére cseréljük. A kapott klón Bsal/EagI fragmentjét a fentiek szerint leírt három utas ligáláshoz használjuk.

A pBK-CMV-hmGluR6 plazmidot analóg módon hozzuk létre hagyományos technikákat használva (Sambrook et al., supra).

4.2 Az emlős sejtek transzfektálása

Emlős sejteket (például CHO-K1, GH3; American Tissue Type Culture Collection) adoptálunk glutamát mentes tápközegben (Lglutamát mentes Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg, mely csökkent koncentrációjú 2mM L-glutamint tartalmaz, valamint 0,046 mg/ml prolinnal, és 10 % dializált magzati szarvasmarha szérummal (Gibco-BRL) van kiegészítve) való szaporodáshoz. A hmGluR expressziós plazmidokat tranziens módon kálcium-foszfátos kicsapatással a sejtekbe transzfektáljukk (Ausubel, F.M. et al., (1993) Current protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, USA).

• · · · • · • · · · • · · · ·· ··

A hmGluR-eket stabilan expresszáló sejtvonalakat a CH0-K1 sejtek lipofektin-által közvetített (Gibco-BRL) hmGluR expressziós plazmidokkal és a pSV2-Neo (Southern and Berg, 1982) plazmid - egy a G-418 rezisztencia gént kódoló plazmid vektor - való transzfekciójával hozzuk létre. A sejteket 48 óráig szaporítjuk 1 mg/ml G-418 szulfát (Genetin, Gibco) hozzáadása előtt. A tápközeget minden második vagy harmadik napon cseréljük. A G-418-as szelekciót túlélő sejteket izoláljuk és szelekciós tápközegben szaporítjuk. 32 G-418 rezisztens klónos sejtvonalat vizsgálunk a kezdeti transzfekciót követő 6-8 hét eltelte után a hmGluR protein expresszióra az anti-hmGluR7 antitesttel szembeni immunoreaktivitással (immunodetektálás, vesd össze a 4.3. infra), valamint az agonista hozzáadása után funkcionális válaszokon keresztül cAMP radioimmunovizsgálaton keresztül (vesd össze az 5.1. infra).

Hasonlóképpen, a pBK-CMV-hmGluR4, pCMV-T7-hmGluR4, pCMVT7-hmGluR7b és pCMV-T7-hmGluR7a hmGluR expressziós szerkezeteket is tranziens módon és stabilan expresszáljuk az emlős sejtekben (CV1, CHO, HEK293, COS) standard eljárásoknak megfelelően (Ausubel, F.M. et al., (1993) Current protocols in

Molecular Biology, Greene and Wiley, USA). A transzfektált sejteket hmGluR expresszióra különböző vizsgálatokkal analizáljuk:[³H]-glutamát kötési vizsgálatokkal, hmGluR altípus specifikus antitesteket használó immunocitokémiával, valamint a cAMP ([cAMPa]) intracelluláris koncentrációjában bekövetkező változás mérésével.

• · • « · · · · * • ······ · • · ···«« ·· · ·«·· ··· · ·· ♦·

4.3. A hmGluR protein expresszió altípus-specifikus hmGluR antitestekkel való immunodetektálása

A hmGluR protein expressziót altípus-specifikus hmGluR antitesteket használva immunocitokémiával analizáljuk (lásd a 7. példát). A transzfekció után 1-3 nappal a sejteket kétszer mossuk foszfát puffereit sóoldattal (PBS), PBS/4% paraformaldehiddel 10 percig rögzítjük, majd PBS-sel mossuk. A sejteket PBS/0.4% Triton Χ-100-zal permeabilizáljuk, ezt PBS/10 mM glicerinnel és PBS-sel való mosás követi. A sejteket 1 órán keresztül PBSTB-vel (1 x PBS/0,1% Triton X-100/1% BSA elegye) blokkoljuk, majd ezt követően az immunotisztított hmGluR antiszérummal (0,5-2,0 ^g/ml PBSTB-ben) 1 órán keresztül inkubáljuk. PBS-sel történő háromszori mosás után a sejteket 1 órán keresztül alkalikus peroxidázzal konjugált kecske antinyúl IgG-vel ( 1:200 PBS-ben; Jackson Immuno Research) inkubáljuk. A sejteket háromszor mossuk PBS-sel és az immunoreaktivitást 0,4 mg/ml naftolfoszfát (Biorad)/1 mg/ml Fást Red (Biorad)/10 mM Levamisol (Sigma)/100 mM Tris/HCl pH 8,8/100 mM NaCl/50 mM MgC12 elegyével mérjük. A festési reakciót 15 perc után leállítjuk PBS-sel való további mosással. 2-4 sejtvonalat - melyek mindegyike homogén módon expresszálja a hmGluR4-et, a hmGluR6-ot vagy a hmGluR7-et - azonosítunk az immunofestéssel.

·

5. példa: A hmGluR-eket expresszáló stabil sejtvonalak felhasználása a receptor aktivitás modulátorainak szkrínelésében

A hmGluR4-et, a hmGluR6-ot és a hmGluR7-et expresszió stabil sejtvonalakat használunk agonisták, antagonisták és alloszterikus modulátorok utáni szkríneléshez. Az ilyen vegyületek [^H]glutamátot felhasználó kötési vizsgálatokkal és/vagy az intracelluláris második messenger szintekben ([cAMP], [Ca²⁺]) bekövetkező változások mérésével határozható meg.

5.1. cAMP radioimmunovizsgálat

A forskolin által stimulált cAMP agonista-indukálta depressziót és ligandum kötést a cAMP radioimmunovizsgálatával (Amersham) analizáljuk. A sejteket 12 üregű lemezekre oltjuk 0,5-2,0 x 10⁵ sejt/üreg sűrűségben és 2-4 napig szaporítjuk konfluenciáig. Ekkor a sejteket kétszer mossuk PBS-ben és 20 recig 1 mM 3-izobutil-l-metil-xantint (IBMX) tartalmazó PBS-ben inkubáljuk. A sejteket friss, 10 μΐ forskolint, 1 mM IBMX-et és egy ismert hmGluR agonistát tartalmazó PBS-ben inkubáljuk 20 percig. Az agonista hatást leállítjuk és a sejtek által termelt cAMP-t 1 ml etanol-víz-HCl elegyének (100 ml etanol, 50 ml víz, 1 ml 1 M HC1) hozzáadásával szabadítjuk fel a drogot tartalmazó tápközeg elpárologtatása után. A cAMP szinteket cAMP radioimmunovizsgálattal határozzuk meg, melynek során [^h]cAMPt (Amershma) használunk.

• ·

A 4-es, 6-os és 7-es hmGluR altípusok negatívan kapcsolódnak az adenilát ciklázhoz, a CHO sejtekben való expresszáláskor. Az agonista kötés a forskolin által indukált cAMP akkumuláció gátlásához vezet. Az összes altípus AP-4 érzékeny, ami azt jelenti, hogy az AP-4 agonista hatású 1 mMnál kisebb koncentrációban.

5.2. Az intracelluláris [Ca²⁺] mérése

Az egyik fent említett expressziós plazmiddal transzformált sejteket kalcium érzékeny fluoreszcens festékkel, mint például fura-2-vel vagy fluro-3-mal terheljük. Ennek eléréséhez a sejteket egyedüli üregekbe helyezzük, az egyedüli üregek fedőlemezzel ellátottak, vagy 96-üregü lemezekbe helyezzük és 1-5 napig szaporítjuk az 50-100 %-os konfluencia eléréséig. Az üregeket háromszor mossuk az egyensúlyi sóoldattal (BBS) és a BBS-ben 1 órán keresztül inkubáljuk, majd BBS-sel további három alkalommal mossuk. A sejteket 50 μg fura2-AM-at (vagy fluro3-AM)(Molecular probes, Inc.), 4,99 ml BBSt, 75 μΐ DMSO-t és 6,25 μΆ Pluronic-ot (Molecular Probes, Inc) tartalmazó oldatban inkubáljuk 20-60 percig. A sejteket 2 mg/ml szarvasmarha albumint tartalmazó BBS-ben mossuk háromszor, melyet BBS-ben történő háromszori mosás követ. A sejtek legalább 10 percig tartó regenerációja után ezeket [Ca^{2 +} ] mikrofluorometriás méréséhez használjuk.

A sejteket a fluorometriához való készülékbe helyezzük, mint például egy inverz mikroszkópba, egy fluoroszcens olvasó spektrofluorométerébe. A kalcium indikátor (például fura-2 vagy fluo-3) fluoreszcenciáját a festék serkentés! spektrumát fedő hullámhoszúsággal (fura-2:340-380 nm, fluo-3 3 480 nm) való besugárzással indukáljuk. Az intracelluláris szabad kalcium ion koncentráció növekedését sorrendben a 340 nm-en és 480 nm-en való serkentés hatására bekövetkezett fura-2 vagy fluo-3 fluoreszcenciában bekövetkezett növekedésként követjük nyomon vagy a 380 nm hullámhosszon serkentett fura-2 fluoreszcenciában bekövetkezett csökkenés ként.

Pozitív kontrollként az L-glutamátot használjuk a sejtekre kifejtett EC50 értéknek megfelelő koncentrációban, így az intracelluláris kalcium ion koncentrációban bekövetkező mérhető növekedést indukálunk. A teszt vegyület agonistának mondható, ha a glutamát által indukált Ca^{2 +} jelhez hasonlítható indukciót eredményez. A teszt vegyület antagonistának tartható, ha a glutamát által indukált kalcium jel kisebb a teszt vegyület jelenlétében mint annak hiányában.

6. példa: Kiméra hmGluR4,6 és 7 receptorok

Az mGluRl intracelluláris doménjeit, különösen a második intracelluláris hurkot (i2) és a C-terminális régiót, kritikus fontosságúnak vélik a G-proteinek kötéséhez, mely a foszfolipáz C/Ca²⁺ jelölő reakcióutat aktiválja, anélkül, hogy a receptor farmakológiai profilját megváltoztatná (Pin et al., EMBO J. 13, 342-348 (1994)). Hagyományos PCR mutagenezises technikákat használunk a hmGluR4,6 és 7 intracelluáris domének a hmGluRl megfelelő doménjeivel való kicseréléséhez. A stabil CHO sejtvonalakat hmGluR4/l, 6/1 és 7/1 kiméra expressziós szerkezetekkel hozzuk létre, lehetővé téve a receptor aktivitás (hmGluR4,6,7) modulátorok hatásának Ca²⁺-fűggö vizsgálatot felhasználó analizálását. A következőkben leírjuk egy kiméra hmGluR7/l receptor létrehozását. A kiméra hmGluR4/l és hmGluR6/l-et tartalmazó expressziós szerkezeteket analóg klónozási és PCR technikákat felhasználva hozzuk létre.

(i) A pCMV-hmGluR7b expressziós szerkezetet Eagl-gyel emésztjük, így felszabadítjuk a teljes cDNS inzertet. A cDNS-t a pBluescript-Nőt - mely a pBluescript II egy olyan származéka, ahol az egyedüli KpnI és NotI helyek között a polikötő szekvenciákat delécióval eltávolítottuk - NotI helyére klónozzuk. Ezt a kapott kiónt nevezzük pBluescript-Nőt-hmGluR7 plazmidnak.

(ii) A hmGluRl transzmembrán régióját PCR-ral klónozzuk, a Masu et al (1991, supra) származó primereket használva. Az

5'-TATCTTGAGTGGAGTGACATAG-3' szekvenciával rendelkező oligonukleotidot (mely a Masu szekvencia 1753-1774 nukleotidjának felel meg) használjuk sense primerként. Az antisense primer az

5'-ACTGCGGACGTTCCTCTCAGG-3' szekvenciával rendelkezik, ami megfelel a Masu szekvencia 2524-2544 nukletidjának. Az la, lb és le hasítási variánsok Cterminális végét PCR-ral hasítjuk sorrendben a Masu és munkatársaitól (1991), Tanabe és munkatársaitól (1992 supra) valamint Pin és munkatársaitól (1992, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 89, 10331-10335 (1992) származó primereket használva. Az

5'-AAACCTGAGAGGAACGTCCGCAG-3 ' szekvenciával rendelkező oligonukleotidot (a Masu szekvencia 2521-2543 nukleotidjainak felel meg) használjuk sense primerként. A sorrendben a hmGluRla, lb és lc-hez antisense primerekként az

5'-CTACAGGGTGGAAGAGCTTTGCTT-3 ' szekvenciával rendelkező oligonukleotidot (mely a Masu szekvencia 3577-3600 nt-jainak felel meg), az

5'-TCAAAGCTGCGCATGTGCCGACGG-3' szekvenciával rendelkező oligonukleotidot (mely a Tanabe szekvencia 2698-2721 nt-jainak felel meg), valamint az

5'-TCAATAGACAGTGTTTTGGCGGTC-3' szekvenciával rendelkező oligonukleotidot (mely a Pin szekvencia 2671-2694 nt-jának felel meg) használjuk. A PCR fragmentet a pBluescript II plazmidba klónozzuk és teljesen szekvenáljuk.

(iii) Egy kiméra cDNS fragmentet, ahol a hmGluR7a, vagy a hmGluR7b (sorrendben a 11. és 13. számú szekvenciák 2035-2106 nukleotidjai) i2-hurkát a hmGluRl megfelelő szekvenciáival helyettesítjük PCR-ral hozunk létre (Pin et al., 1994, supra leírásának megfelelően). A fragmentet Smal-gyel és BglII-vel emésztjük, melyek az i2-hurkot szegélyező egyedüli restrikciós helyeket hasítják. A kiméra Smal/BglII fragmentet a pBluescript-Nőt-mGluR7 Smal/BglII fragmentjeire cseréljük.

(iv) A hmGluR7b vagy hmGluR7a C-terminális doménjének a fent említett hmGluRl megfelelő szekvenciáival való további helyettesítésével hasítási variánsok hozhatók létre a hmGluR7 C-terminális végét szegélyező egyedüli BglII és SacII restrikciós helyeket használva.

(v) A kapott kiméra hmGluR7/hmGluRl cDNS-t szekvenáljuk és Eagl-gyel emésztjük, így a pBluescript-Not plazmidból a teljes cDNS-eket. felszabadítjuk. A CHO sejtekben való stabil expresszióhoz a kiméra cDNS-eket pCMV-T7-2 emlős expressziós vektor egyedüli NotI helyére klónozzuk.

7. példa: Az anti-hmGluR antitestek létrehozása és alkalmazása

A hmGluR4 és hmGluR7 származtatott C-terminális aminosav szekvenciáinak megfelelő peptideket szintetizáljuk és ovalbuminhoz vagy Tentagel-hez kapcsoljuk A poliklonális antiszérumot nyulakban termeltetjük. A humán mGluR specifikus antitesteket az antiszérumból immunoaffinitási kromatográfiával peptid oszlopokon tisztítjuk. A hmGluR specifikus antitesteket ELISA módszerrel és glutation-S-transzferáz/hmGluR fúziós preoteinekkel végzett immunolenyomat technikával jellemezzük. Sorrendben a hmGluR4-re és a hmGluR7-re specifikus antitesteket a transzfektált sejtekben levő hmGluR receptorok detektálására használjuk, valamint a humán agy szövet szekcióiban levő hmGluR receptor proteinek celluláris és szubcelluláris mintázatának analizálására használjuk. A különböző, E. coli-ban expresszált 20 aminosavat és fúziós proteineket expresszáló hmGluRspecifikus peptidekkel szemben antitesteket hozunk létre. A peptideket szilárd fázisú szintézissel szintetizáljuk, kacsakagyló (keyhole limpet) hemocianinhoz (KLH) kapcsoljuk vagy ovalbuminhoz glutáraldehiddel. A hmGluR-ek teljes feltételezett intracelluláris C-terminusát tartalmazó PCR fragmenteket BamHl/EcoRI fragmentekként a pGEX-2T E. coli expressziós plazmidba (Guan and Dixon, Analytical Biochemistry, 192, 262-267 (1991)) klónozzuk, glutation-S-transzferáz (GST)/hmGluR fúziós géneket hozva létre. Expressziós plazmidokat hordozó E. coli DH5a sejteket (Gibco-BRL) 37 C° hőmérsékleten LB tápközegben/100 mg/ml ampicillinnel GST/hmGluR fúziós génekkel egy éjszakán át szaporítunk. A tenyészeteket

LB-ben 1:30 arányban hígítjuk és 2 órán keresztül 30 C° hőmérsékleten szaporítjuk. A fúziós proteinek expresszióját 0,1 mM izopropil-b-D-tio-galakto-piranoziddal való kezeléssel indukáljuk 3 órán keresztül 30 C° hőmérsékleten. A sejteket 5000 x g való centrifugálással gyűjtjük össze. A fúziós proteint glutation affinitás kromatográfiát használva izoláljuk.

Deponálási adatok

A következő plazmidokat deponáljuk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (DMS) gyűjteménynél (Mascheroder Weg lb, D-38124, Braunkschweig) 1993 szeptember 13-án:

cmRl plazmid: DSM 8549 katalógusszám cmR2 plazmid: DSM 8550 katalógusszám

SZEKVENCIA LISTA

ÁLTALÁNOS	INFORMÁCIÓ:
(i) FELTALÁLÓ:
(A)	NÉV: CIBA-GEIGY AG
(B)	UTCA: klybeckstr. 141
(C)	VÁROS: Basel
(E)	ORSZÁG: Svájc
(F)	IRÁNYÍTÓSZÁM: 4002
(G)	TELEFON: +41 61 69	11 11
(H)	TELEFAX: +41 61 696	79 76
(I)	TELEX: 962 991

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Humán receptor proteinek (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 16 (iv) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, #1.25 verzió (EPO) (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A)	HOSSZÚSÁG:	2739 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLTÍPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS ···· • · · ··

1. SZÁMÚ SZEKVENCIA

ATG

CCT

GGG

AAG

AGA

GGC

TTG

GGC

TGG

TGG

TGG

GCC

CGG

CTG

CCC

CTT

48

Met

Pro

Gly

Lys

Arg

Gly

Leu

Gly

Trp

Trp

Trp

Alá

Arg

Leu

Pro

Leu

1

5

10

15

TGC

CTG

CTC

CTC

AGC

CTT

TAC

GGC

CCC

TGG

ATG

CCT

TCC

TCC

CTG

GGA

96

Cys

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Tyr

Gly

Pro

trp

Met

Pro

Ser

Ser

Leu

Gly

20

25

30

AAG

CCC

AAA

GGC

CAC

CCT

CAC

ATG

AAT

TCC

ATC

CGC

ATA

GAT

GGG

GAC

144

Lys

Pro

Lys

Gly

His

Pro

His

Met

Asn

Ser

Ile

Arg

Ile

Asp

Gly

Asp

35

40

45

ATC

ACA

CTG

GGA

GGC

CTG

TTC

CCG

GTG

CAT

GGC

CGG

GGC

TCA

GAG

GGC

192

Ile

The

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Gly

Arg

Gly

Ser

Glu

Gly

50

55

60

AAG

CCC

TGT

GGA

GAA

CTT

AAG

AAG

GAA

AAG

GGC

ATC

CAC

CGG

CTG

GAG

240

Lys

Pro

Cys

Gly

Glu

Leu

Lys

Lys

Glu

Lys

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

GCC

ATG

CTG

TTC

GCC

CTG

GAT

CGC

ATC

AAC

AAC

GAC

CCG

GAC

CTG

CTG

288

Alá

Met

Leu

Phe

Alá

Leu

Asp

Arg

Ile

Asn

Asn

Asp

Pro

Asp

Leu

Leu

CCT AAC

ATC Ile

ACG Thr 100

CTG Leu

GGC Gly

GCC Alá

CGC Arg

ATT Ile 105

CTG Leu

GAC Asp

ACC Thr

TGC Cys

TCC Ser 110

AGG Arg

GAC Asp

336

Pro

Asn

ACC

CAT

GCC

CTC

GAG

CAG

TCG

CTG

ACC

TTT

GTG

CAG

GCG

CTC

ATC

GAG

384

Thr

His

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Glu

115

120

125

AAG

GAT

GGC

ACA

GAG

GTC

CGC

TGT

GGC

AGT

GGC

GGC

CCA

CCC

ATC

ATC

432

Lys

Asp

Gly

Thr

Glu

Val

Arg

Cys

Gly

Ser

Gly

Gly

Pro

Pro

Ile

Ile

130

135

140

ACC

AAG

CCT

GAA

CGT

GTG

GTG

GGT

GTC

ATC

GGT

GCT

TCA

GGG

AGC

TCG

480

Thr

Lys

Pro

Glu

Arg

Val

Val

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

145

150

155

160

GTC

TCC

ATC

ATG

GTG

GCC

AAC

ATC

CTT

CGC

CTC

TTC

AAG

ATA

CCC

CAG

528

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Lys

Ile

Pro

Gin

165

170

175

ATC

AGC

TAC

GCC

TCC

ACA

GCG

CCA

GAC

CTG

AGT

GAC

AAC

AGC

CGC

TAC

576

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Asn

Ser

Arg

Tyr

180

185

190

GAC

TTC

TTC

TCC

CGC

GTG

GTG

CCC

TCG

GAC

ACG

TAC

CAG

GCC

CAG

GCC

624

Asp

Phe

Phe

Ser

Arg

Val

Val

Pro

Ser

Asp

Thr

Tyr

Gin

Alá

Gin

Alá

195

200

205

ATG

GTG

GAC

ATC

GTC

CGT

GCC

CTC

AAG

TGG

AAC

TAT

GTG

TCC

ACA

GTG

672

Met

Val

Asp

Ile

Val

Arg

Alá

Leu

Lys

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Val

210

215

220

GCC

TCG

GAG

GGC

AGC

TAT

GGT

GAG

AGC

GGT

GTG

GAG

GCC

TTC

ATC

CAG

720

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

Glu

Ser

Gly

Val

Glu

Alá

Phe

Ile

Gin

225 230

235

240 ····

AAG Lys

TCC Ser

CGT A.rg

GAG Glu

GAC Asp 245

GGG Gly

GGC Gly

GTG Val

TGC Cys

ATC Ile 250

GCC Alá

CAG Gin

TCG Ser

GTG Val

AAG Lys 255

ATA Ile

768

CCA

CGG

GAG

CCC

AAG

GCA

GGC

GAG

TTC

GAC

AAG

ATC

ATC

CGC

CGC

CTC

816

Pro

Arg

Glu

Pro

Lys

Alá

Gly

Glu

Phe

Asp

Lys

Ile

Ile

Arg

Arg

Leu

260

265

270

CTG

GAG

ACT

TCG

AAC

GCC

AGG

GCA

GTC

ATC

ATC

TTT

GCC

AAC

GAG

GAT

864

Leu

Glu

Thr

Ser

Asn

Alá

Arg

Alá

Val

Ile

Ile

Phe

Alá

Asn

Glu

Asp

275

280

285

GAC

ATC

AGG

CGT

GTG

CTG

GAG

GCA

GCA

CGA

AGG

GCC

AAC

CAG

ACA

GGC

912

Asp

Ile

A.rg

Arg

Val

Leu

Glu

Alá

Alá

Arg

Arg

Alá

Asn

Gin

Thr

Gly

290

295

300

CAT

TTC

TTC

TGG

ATG

GGC

GAC

AGC

TGG

GGC

TCC

AAG

ATT

GCA

CCT

960

His

Phe

Phe

Trp

Met

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

Alá

Pro

305

310

315

320

GTG

CTG

CAC

CTG

GAG

GAG

GTG

GCT

GAG

GGT

GCT

GTC

ACG

ATC

CTC

CCC

1008

Val

Leu

His

Leu

Glu

Glu

Val

Alá

Glu

Gly

Alá

Val

Thr

Ile

Leu

Pro

325

330

335

AAG

AGG

ATG

TCC

GTA

CGA

GGC

TTC

GAC

CGC

TAC

TTC

TCC

AGC

CGC

ACG

1056

Lys

Arg

Met

Ser

Val

Arg

Gly

Phe

Asp

Arg

Tyr

Phe

Ser

Ser

Arg

Thr

340

345

350

CTG

GAC

AAC

AAC

CGG

CGC

AAC

ATC

TGG

TTT

GCC

GAG

TTC

TGG

GAG

GAC

1104

Leu

Asp

A.sn

Asn

A.rg

Arg

Asn

Ile

Trp

Phe

Alá

Glu

Phe

Trp

Glu

Asp

3 55

360

365

AAC

TTC

CAC

TGC

AAG

CTG

AGC

CGC

CAC

GCC

CTC

AAG

AAG

GGC .

AGC

CAC

1152

Asn

Phe

His

Cys

Lys

Leu

Ser

Arg

His

Alá

Leu

Lys

Lys

Gly

Ser

His

370

375

380

GTC Val 385

AAG Lys

AAG Lys

TGC Cys

ACC Thr

AAC Asn 390

CGT Arg

GAG Glu

CGA Arg

ATT Ile

GGG Gly 395

CAG Gin

GAT Asp

TCA Ser

GCT Alá

TAT Tyr 400

1200

GAG

CAG

GAG

GGG

AAG

GTG

CAG

TTT

GTG

ATC

GAT

GCC

GTG

TAC

GCC

ATG

1248

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

Alá

Met

405

410

415

GGC

CAC

GCG

CTG

CAC

GCC

ATG

CAC

CGT

GAC

CTG

TGT

CCC

GGC

CGC

GTG

1296

Gly

His

Alá

Leu

His

Alá

Met

His

Arg

Asp

Leu

Cys

Pro

Gly

Arg

Val

420

425

430

GGQ

CTC

TGC

CCG

CGC

ATG

GAC

CCT

GTA

GAT

GGC

ACC

CAG

CTG

CTT

AAG

1344

Gly

Leu

Cys

Pro

Arg

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Gly

Thr

Gin

Leu

Leu

Lys

435

440

445

TAC

ATC

CGA

AAC

GTC

AAC

TTC

TCA

GGC

ATC

GCA

GGG

AAC

CCT

GTG

ACC

1392

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Ser

Gly

He

Alá

Gly

Asn

Pro

Val

Thr

450

455

460

TTC

AAT

GAG

AAT

GGA

GAT

GCG

CCT

GGG

CGC

TAT

GAC

ATC

TAC

CAA

TAC

1440

Phe

Asn

Glu

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Gin

Tyr

465

470

475

480

CAG

CTG

CGC

AAC

GAT

TCT

GCC

GAG

TAC

AAG

GTC

ATT

GGC

TCC

TGG

ACT

1488

Gin

Leu

Arg

Asn

Asp

Ser

Alá

Glu

Tyr

Lys

Val

ile

Gly

Ser

Trp

Thr

485

490

495

GAC

CAC

CTG

CAC

CTT

AGA

ATA

GAG

CGG

ATG

CAC

TGG

CCG

GGG

AGC

GGG

1536

Asp

His

Leu

His

Leu

Arg

Ile

Glu

Arg

Met

His

Trp

Pro

Gly

Ser

Gly

500

505

510

CAG

CAG

CTG

CCC

CGC

TCC

ATC

TGC

AGC

CTG

CCC

TGC

CAA

CCG

GGT

GAG

1584

Gin

Gin

Leu

Pro

Arg

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Pro

Cys

Gin

Pro

Gly

Glu

515 520 525 «· « · ·· ···· * · ·· · , * , · « · ··· · • · · · · · · · · * »··· ··· · ·· ··

CGG Arg

AAG Lys 530

AAG Lys

ACA Thr

GTG Val

AAG Lys

GGC Gly 535

ATG Met

CCT Pro

TGC Cys

TGC Cys

TGG Trp 540

CAC HÍS

TGC Cys

GAG Glu

CCT Pro

1632

TGC

ACA

GGG

TAC

CAG

TAC

CAG

GTG

GAC

CGC

TAC

ACC

TGT

AAG

ACG

TGT

1680

Cys

Thr

Gly

Tyr

Gin

Tyr

Gin

Val

Asp

Arg

Tyr

Thr

Cys

Lys

Thr

Cys

545

550

555

560

CCC

TAT

GAC

ATG

CGG

CCC

ACA

GAG

AAC

CGC

ACG

GGC

TGC

CGG

CCC

ATC

1728

Pro

Tyr

Asp

Met

Arg

Pro

Thr

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

Arg

Pro

Ile

565

570

575

CCC

ATC

ATC

AAG

CTT

GAG

TGG

GGC

TCG

CCC

TGG

GCC

GTG

CTG

CCC

CTC

1776

Pro

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

Trp

Gly

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Leu

Pro

Leu

580

585

590

TTC

CTG

GCC

GTG

GTG

GGC

ATC

GCT

GCC

ACG

TTG

TTC

GTG

GTG

ATC

ACC

1824

Phe

Leu

Alá

Val

Val

Gly

Ile

Alá

Alá

Thr

Leu

Phe

Val

Val

Ile

Thr

595

600

605

TTT

GTG

CGC

TAC

AAC

GAC

ACG

CCC

ATC

GTC

AAG

GCC

TCG

GGC

CGT

GAA

1872

Phe

Val

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Lys

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

610

615

620

CTG

AGC

TAC

GTG

CTG

CTG

GCA

GGC

ATC

TTC

CTG

TGC

TAT

GCC

ACC

ACC

1920

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

Alá

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

Alá

Thr

Thr

625

630

635

640

TTC

CTC

ATG

ATC

GCT

GAG

CCC

GAC

CTT

GGC

ACC

TGC

TCG

CTG

CGC

CGA

1968

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Glu

Pro

Asp

Leu

Gly

Thr

Cys

Ser

Leu

Arg

Arg

645

650

655

ATC

TTC

CTG

GGA

CTA

GGG

ATG

AGC

ATC

AGC

TAT

GCA

GCC

CTG

CTC

ACC

2016

Ile

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Ser

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

660 665 670

AAG Lys

ACC Thr

AAC Asn 675

CGC Arg

ATC Ile

TAC Tyr

CGC ATC

TTC GAG

CAG Gin

GGC Gly

AAG Lys 685

CGC Arg

TCG Ser

GTC Val

2064

Arg

Ile 680

Phe

Glu

AGT

GCC

CCA

CGC

TTC

ATC

AGC

CCC

GCC

TCA

CAG

CTG

GCC

ATC

ACC

TTC

2112

Ser

Alá

Pro

Arg

Phe

Ile

Ser

Pro

Alá

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile

Thr

Phe

690

695

700

AGC

CTC

ATC

TCG

CTG

CAG

CTG

CTG

GGC

ATC

TGT

GTG

TGG

TTT

GTG

GTG

2160

Ser

Leu

Ile

Ser

Leu

Gin

Leu

Leu

Gly

Ile

Cys

Val

Trp

Phe

Val

Val

705

710

715

720

GAC

CCC

TCC

CAC

TCG

GTG

GTG

GAC

TTC

CAG

GAC

CAG

CGG

ACA

CTC

GAC

2208

Asp

Pro

Ser

His

Ser

Val

Val

Asp

Phe

Gin

Asp

Gin

Arg

Thr

Leu

Asp

725

730

735

CCC

CGC

TTC

GCC

AGG

GGT

GTG

CTC

AAG

TGT

GAC

ATC

TCG

GAC

CTG

TCG

2256

Pro

Arg

Phe

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Ser

Asp

Leu

Ser

740

745

750

CTC

ATC

TGC

CTG

CTG

GGC

TAC

AGC

ATG

CTG

CTC

ATG

GTC

ACG

TGC

ACC

2304

Leu

Ile

Cys

Leu

Leu

Gly

Tyr

Ser

Met

Leu

Leu

Met

Val

Thr

Cys

Thr

755

760

765

GTG

TAT

GCC

ATC

AAG

ACA

CGC

GGC

GTG

CCC

GAG

ACC

TTC

AAT

GAG

GCC

2352

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

G1U

Thr

Phe

Asn

Glu

Alá

770

775

780

AAG

CCC

ATT

GGC

TTC

ACC

ATG

TAC

ACC

ACT

TGC

ATC

GTC

TGG

CTG

GCC

2400

Lys

Pro

He

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

785

790

795

800

TTC

ATC

CCC

ATC

TTC

TTT

GGC

ACC

TCG

CAG

TCG

GCC

GAC

AAG

CTG

TAC

2448

Phe

He

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Ser

Gin

Ser

Alá

Asp

Lys

Leu

Tyr

805 810

815 ····

ATC

CAG

ACG

ACG

ACG

CTG

AGC

GTC

TCG

GTG

AGT

CTG

AGC

GCC

TCG

GTC

2496

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Val

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

820

825

830

TCC

CTG

GGA

ATG

CTC

TAC

ATG

CCC

AAA

GTC

TAC

ATC

ATC

CTC

TTC

CAC

2544

Ser

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Leu

Phe

His

835

840

845

CCG

GAG

CAG

AAC

GTG

CCC

AAG

CGC

AAG

CGC

AGC

CTC

AAA

GCC

GTC

GTT

2592

Pro

Glu

Gin

Asn

Val

Pro

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Leu

Lys

Alá

Val

Val

850

855

860

ACG

GCG

GCC

ACC

ATG

TCC

AAC

AAG

TTC

ACG

CAG

AAG

GGC

AAC

TTC

CGG

2640

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Asn

Lys

Phe

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Phe

Arg

865

870

875

880

CCC

AAC

GGA

GAG

GCC

AAG

TCT

GAG

CTC

TGC

GAG

AAC

CTT

GAG

GCC

CAA

2688

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Ser

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Leu

Glu

Alá

Pro

885

890

985

GCG

CTG

GCC

ACC

AAA

CAG

ACT

TAC

GTC

ACT

TAC

ACC

AAC

CAT

GCA

ATC

2736

Alá

Leu

Alá

Thr

Lys

Gin

Thr

Tyr

Val

Thr

Tyr

Thr

Asn

His

Alá

Ile

900 905 910

ΤΑ

2739 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

	(A)	HOSSZÚSÁG: 912 aminosav
	(B)	TÍPUS: aminosav
	(C)	TOPOLÓGIA: lineáris
(ii)	A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi)	A 2	. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

Met Pro Gly Lys Arg Gly Leu Gly Trp Trp Trp Alá Arg Leu Pro Leu

1	5
Cys	Leu	Leu	Leu	Ser	Leu	Tyr	Gly
			20
Lys	Pro	Lys	Gly	His	Pro	His	Met
		35					40
Ile	Thr	Leu	Gly	Gly	Leu	Phe	Pro
	50					55
Lys	Pro	Cys	Gly	Glu	Leu	Lys	Lys
65					70
Alá	Met	Leu	Phe	Alá	Leu	Asp	Arg
				85
Pro	Asn	Ile	Thr	Leu	Gly	Alá	Arg
			100
Thr	His	Alá	Leu	Glu	Gin	Ser	Leu
		115					120
Lys	Asp	Gly	Thr	Glu	Val	Arg	Cys
	130					135
Thr	Lys	Pro	Glu	Arg	Val	Val	Gly
145					150
Val	Ser	Ile	Met	Val	Alá	Asn	Ile

165

	10	15
Pro	Trp	Met	Pro	Ser	Ser	Leu	Gly
25					30
Asn	Ser	Ile	Arg	Ile	Asp	Gly	Asp
				45
Val	His	Gly	Arg	Gly	Ser	Glu	Gly
			60
Glu	Lys	Gly	Ile	His	Arg	Leu	Glu
		75					80
Ile	Asn	Asn	Asp	Pro	Asp	Leu	Leu
	90					95
Ile	Leu	Asp	Thr	Cys	Ser	Arg	Asp
105					110
Thr	Phe	Val	Gin	Alá	Leu	Ile	Glu
				125
Gly	Ser	Gly	Gly	Pro	Pro	Ile	Ile
			140
Val	Ile	Gly	Alá	Ser	Gly	Ser	Ser
		155					160
Leu	Arg	Leu	Phe	Lys	Ile	Pro	Gin

170

175

He

Ser

Tyr Alá 180

Ser

Thr

Alá

Pro

Asp 185

Leu

Ser

Asp

Asn

Ser 190

Arg

Tyr

Asp

Phe

Phe

Ser

Arg

Val

Val

Pro

Ser

Asp

Thr

Tyr

Gin

Alá

Gin

Alá

195

200

205

Met

Val

Asp

Ile

Val

Arg

Alá

Leu

Lys

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Val

210

215

220

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

Glu

Ser

Gly

Val

Glu

Alá

Phe

Ile

Gin

225

230

235

240

Lys

Ser

Arg

Glu

Asp

Gly

Gly

Val

Cys

Ile

Alá

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

245

250

255

Pro

Arg

Glu

Pro

Lys

Alá

Gly

Glu

Phe

Asp

Lys

Ile

Ile

Arg

Arg

Leu

260

265

270

Leu

Glu

Thr

Ser

Asn

Alá

Arg

Alá

Val

Ile

Ile

Phe

Alá

Asn

Glu

Asp

275

280

285

Asp

Ile

Arg

Arg

Val

Leu

Glu

Alá

Alá

Arg

Arg

Alá

Asn

Gin

Thr

Gly

290

295

300

His

Phe

Phe

Trp

Met

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

Alá

Pro

305

310

315

320

Val

Leu

His

Leu

Glu

Glu

Val

Alá

Glu

Gly

Alá

Val

Thr

Ile

Leu

Pro

325

330

335

Lys

Arg

Met

Ser

Val

Arg

Gly

Phe

Asp

Arg

Tyr

Phe

Ser

Ser

Arg

Thr

340

345

350

Leu

Asp

Asn

Asn

Arg

Arg

Asn

Ile

Trp

Phe

Alá

Glu

Phe

Trp

Glu

Asp

355

360

365

Asn

Phe 370

His

Cys

Lys

Leu

Ser 375

Arg

His

Alá

Leu

Lys 380

Lys

Gly

Ser

His

Val

Lys

Lys

Cys

Thr

Asn

Arg

Glu

Arg

Ile

Gly

Gin

Asp

Ser

Alá

Tyr

385

390

395

400

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

Alá

Met

405

410

415

Gly

His

Alá

Leu

His

Alá

Met

His

Arg

Asp

Leu

Cys

Pro

Gly

Arg

Val

420

425

430

Gly

Leu

Cys

Pro

Arg

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Gly

Thr

Gin

Leu

Leu

Lys

435

440

445

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Ser

Gly

Ile

Alá

Gly

Asn

Pro

Val

Thr

450

455

460

Phe

Asn

Glu

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Gin

Tyr

465

470

475

480

Gin

Leu

Arg

Asn

Asp

Ser

Alá

Glu

Tyr

Lys

Val

Ile

Gly

Ser

Trp

Thr

485

490

495

Asp

His

Leu

His

Leu

Arg

Ile

Glu

Arg

Met

His

Trp

Pro

Gly

Ser

Gly

500

505

510

Gin

Gin

Leu

Pro

Arg

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Pro

Cys

Gin

Pro

Gly

Glu

515

520

525

Arg

Lys

Lys

Thr

Val

Lys

Gly

Met

Pro

Cys

Cys

Trp

His

Cys

Glu

Pro

530

535

540

Cys

Thr

Gly

Tyr

Gin

Tyr

Gin

Val

Asp

Arg

Tyr

Thr

Cys

Lys

Thr

Cys

545

550

555

560

• · · · • · · · · · · • ······ · • · ····· ·· · • · · · ··· · ·· ··

Pro Tyr

Asp

Met

Arg 565

Pro

Thr

Glu

Asn

Arg 570

Thr

Gly

Cys

Arg

Pro 575

Ile

Pro Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

Trp

Gly

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Leu

Pro

Leu

580

585

590

Phe Leu

Alá

Val

Val

Gly

Ile

Alá

Alá

Thr

Leu

Phe

Val

Val

Ile

Thr

595

600

605

Phe Val

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Lys

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

610

615

620

Leu Ser

Tyr

Val·

Leu

Leu

Alá

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

Alá

Thr

Thr

625

630

635

640

Phe Leu

Met

Ile

Alá

Glu

Pro

Asp

Leu

Gly

Thr

Cys

Ser

Leu

Arg

Arg

645

650

655

Ile Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Ser

Tle

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

660

665

670

Lys Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

Arg

Ser

Val

675

680

685

Ser Alá

Pro

Arg

Phe

Ile

Ser

Pro

Alá

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile

Thr

Phe

690

695

700

Ser Leu

Ile

Ser

Leu

Gin

Leu

Leu

Gly

He

Cys

Val

Trp

Phe

Val

Val

705

710

715

720

Asp Pro

Ser

His

Ser

Val

Val

Asp

Phe

Gin

Asp

Gin

Arg

Thr

Leu

Asp

725

730

735

Pro Arg

Phe

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Ser

Asp

Leu

Ser

740

745

750

• · · • ······ · * ······ «· · • · · · ··· · ·· ··

Leu

Ile

Cys 755

Leu

Leu

Gly

Tyr

Ser 760

Met

Leu

Leu

Met

Val 765

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Thr

Phe

Asn

Glu

Alá

770

775

780

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

785

790

795

800

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Ser

Gin

Ser

Alá

Asp

Lys

Leu

Tyr

805

810

815

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Val

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

820

825

830

Ser

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Leu

Phe

His

835

840

845

Pro

Glu

Gin

Asn

Val

Pro

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Leu

Lys

Alá

Val

Val

850

855

860

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Asn

Lys

Phe

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Phe

Arg

865

870

875

880

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Ser

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Leu

Glu

Alá

Pro

885

890

895

Alá

Leu

Alá

Thr

Lys

Gin

Thr

Tyr

Val

Thr

Tyr

Thr

Asn

His

Alá

Ile

900

905

910

• ·

(2) A 3.	SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i)	A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:
	(A)	HOSSZÚSÁG: 3804 bázispár
	(B)	TÍPUS: nukleinsav
	(C)	SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú
	(D)	TOPOLÓGIA: lineáris
(ii)	A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genom)
(ix)	JELLEMZŐK:
	(A)	NÉV/KULCS: CDS
	(B)	LOKÁCIÓ: 1..2604
	(D)	EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = a cmR2 hmGluR7-őt
		kódoló régiója
(xi)	A 3	. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCC

GTA

CAC

GCC

AAG

GGT

CCC

AGC

GGA

GTG

CCC

TGC

GGC

GAC

ATC

AAG

48

Pro

Val

Hí s

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

1

5

10

15

AGG

GAA

AAC

GGG

ATC

CAC

AGG

CTG

GAA

GCG

ATG

CTC

TAC

GCC

CTG

GAC

96

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

20

25

30

CAG

ATC

AAC

AGT

GAT

CCC

AAC

CTA

CTG

CCC

AAC

GTG

ACG

CTG

GGC

GCG

144

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

• · · ·

CGG Arg

ATC Ile 50

CTG Leu

GAC ACT

TGT Cys

TCC Ser 55

AGG Arg

GAC Asp

ACT Thr

TAC Tyr

GCG Alá 60

CTC Leu

GAA Glu

CAG Gin

TCG Ser

192

Asp

Thr

CTT

ACT

TTC

GTC

CAG

GCG

CTC

ATC

CAG

AAG

GAC

ACC

TCC

GAC

GTG

CGC

240

Leu

Thr

Phe

val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

65

70

75

80

TGC

ACC

AAC

GGC

GAA

CCG

CCG

GTT

TTC

GTC

AAG

CCG

GAG

AAA

GTA

GTT

288

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

85

90

95

GGA

GTG

ATT

GGG

GCT

TCG

GGG

AGT

TCG

GTC

TCC

ATC

ATG

GTA

GCC

AAC

336

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

100

105

110

ATC

CTG

AGG

CTC

TTC

CAG

ATC

CCC

CAG

ATT

AGT

TAT

GCA

TCA

ACG

GCA

384

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

115

120

125

CCC

GAG

CTA

AGT

GAT

GAC

CGG

CGC

TAT

GAC

TTC

TTC

TCT

CGC

GTG

GTG

432

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

Asp

Arg

Arg

Tyr

Asp

Phe

Phe

Ser

Arg

Val

Val

130

135

140

CCA

CCC

GAT

TCC

TTC

CAA

GCC

CAG

GCC

ATG

GTA

GAC

ATT

GTA

AAG

GCC

480

Pro

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Alá

Gin

Alá

Met

Val

Asp

He

Val

Lys

Alá

145

150

155

160

CTA

GGC

TGG

AAT

TAT

GTG

TCT

ACC

CTC

GCA

TCG

GAA

GGA

AGT

TAT

GGA

528

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

165

170

175

GAG

AAA

GGT

GTG

GAG

TCC

TTC

ACG

CAG

ATT

TCC

AAA

GAG

GCA

GGT

GGA

576

Glu

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Phe

Thr

Gin

Ile

Ser

Lys

Glu

Alá

Gly

Gly

180

185

190

CTC Leu

TGC Cys

ATT Ile 195

GCC Alá

CAG Gin

TCC Ser

GTG Val

AGA Arg 200

ATC Ile

CCC Pro

CAG Gin

GAA Glu

CGC Arg 205

AAA Lys

GAC Asp

AGG Arg

624

ACC

ATT

GAC

TTT

GAT

AGA

ATT

ATC

AAA

CAG

CTC

CTG

GAC

ACC

CCC

AAC

672

Thr

Ile

Asp

Phe

Asp

Arg

Ile

Ile

Lys

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

210

215

220

TCC

AGG

GCC

GTC

GTG

ATT

TTT

GCC

AAC

GAT

GAG

GAT

ATA

AAG

CAG

ATC

720

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

Asp

Glu

Asp

Ile

Lys

Gin

Ile

225

230

235

240

CTT

GCA

GCA

GCC

AAA

AGA

GCT

GAC

CAA

GTT

GGC

CAT

TTT

CTT

TGG

GTG

768

Leu

Alá

Alá

Alá

Lvs

Arg

Alá

Asp

Gin

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

245

250

255

GGA

TCA

GAC

AGC

TGG

GGA

TCC

AAA

ATA

AAC

CCA

CTG

CAC

CAG

CAT

GAA

816

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

260

265

270

GAT

ATC

GCA

GAA

GGG

GCC

ATC

ACC

ATT

CAG

CCC

AAG

CGA

GCC

ACG

GTG

864

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

275

280

285

GAA

GGG

TTT

GAT

GCC

TAC

TTT

ACG

TCC

CGT

ACA

CTT

GAA

AAC

AAC

AGA

912

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg

290

295

300

AGA

AAT

GTA

TGG

TTT

GCC

GAA

TAC

TGG

GAG

GAA

AAC

TTC

AAC

TGC

AAG

960

Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

305

310

315

320

TTG

ACG

ATT

AGT

GGG

TCA

AAA

AAA

GAA

GAC

ACA

GAT

CGC

AAA

TGC

ACA

1008

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Lys

Lys

Glu

Asp

Thr

Asp

Arg

Lys

Cys

Thr

325 330 335 • · · · · ·· ·· · • · · ·

GGA Gly

CAG Gin

GAG AGA ATT

GGA AAA

GAT Asp

TCC Ser 345

AAC Asn

TAT Tyr

GAG Glu

CAG Gin

GAG Glu 350

GGT Gly

AAA Lys

1056

Glu

Arg 340

Ile

Gly

Lys

GTC

CAG

TTC

GTG

ATT

GAC

GCA

GTC

TAT

GCT

ATG

GCT

CAC

GCC

CTT

CAC

1104

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

355

360

365

CAC

ATG

AAC

AAG

GAT

CTC

TGT

GCT

GAC

TAC

CGG

GGT

GTC

TGC

CCA

GAG

1152

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

Tyr

Arg

Gly

Val

Cys

Pro

Glu

370

375

380

ATG

GAG

CAA

GCT

GGA

GGC

AAG

AAG

TTG

CTG

AAG

TAT

ATA

CGC

AAT

GTT

1200

Met

Glu

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

385

390

395

400

AAT

TTC

AAT

GGT

AGT

GCT

GGC

ACT

CCA

GTG

ATG

TTT

AAC

AAG

AAC

GGG

1248

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

405

410

415

GAT

GCA

CCT

GGG

CGT

TAT

GAC

ATC

TTT

CAG

TAC

CAG

ACC

ACA

AAC

ACC

1296

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

420

425

430

AGC

AAC

CCG

GGT

TAC

CGT

CTG

ATC

GGG

CAG

TGG

ACA

GAC

GAA

CTT

CAG

1344

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

435

440

445

CTC

AAT

ATA

GAA

GAC

ATG

CAG

TGG

GGT

AAA

GGA

GTC

CGA

GAG

ATA

CCC

1392

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

450

455

460

GCC

TCA

GTG

TGC

ACA

CTA

CCA

TGT

AAG

CCA

GGA

CAG

AGA

AAG

AAG

ACA

1440

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

465

470

475

480

CAG Gin

AAA Lys

GGA ACT

CCT Pro 485

TGC Cys

TGT TGG

ACC Thr

TGT Cys 490

GAG Glu

CCT TGC

GAT Asp

GGT Gly 495

TAC Tyr

1488

Gly

Thr

Cys

Trp

Pro

Cys

CAG

TAC

CAG

TTT

GAT

GAG

ATG

ACA

TGC

CAG

CAT

TGC

CCC

TAT

GAC

CAG

1536

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

500

505

510

AGG

CCC

AAT

GAA

AAT

CGA

ACC

GGA

TGC

CAG

GAT

ATT

CCC

ATC

ATC

AAA

1584

Arg

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

Gin

Asp

Ile

Pro

Ile

Ile

Lys

515

520

525

CTG

GAG

TGG

CAC

TCC

CCC

TGG

GCT

GTG

ATT

CCT

GTC

TTC

CTG

GCA

ATG

1632

Leu

Glu

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

530

535

540

TTG

GGG

ATC

ATT

GCC

ACC

ATC

TTT

GTC

ATG

GCC

ACT

TTC

ATC

CGC

TAC

1680

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

545

550

555

560

AAT

GAC

ACG

CCC

ATT

GTC

CGG

GCA

TCT

GGG

CGG

GAA

CTC

AGC

TAT

GTT

1728

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

565

570

575

CTT

TTG

ACG

GGC

ATC

TTT

CTT

TGC

TAC

ATC

ATC

ACT

TTC

CTG

ATG

ATT

1776

Leu

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

580

585

590

GCC

AAA

CCA

GAT

GTG

GCA

GTG

TGT

TCT

TTC

CGG

CGA

GTT

TTC

TTG

GGC

1824

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

595

600

605

TTG

GGT

ATG

TGC

ATC

AGT

TAT

GCA

GCC

CTC

TTG

ACG

AAA

ACA

AAT

CGG

1872

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

610 615

620

ΑΤΤ Ile 625

TAT Tyr

CGC ATA

TTT Phe

GAG Glu 630

CAG Gin

GGC Gly

AAG AAA

TCA Ser 635

GTA Val

ACA Thr

GCT Alá

CCC Pro

AGA Arg 640

1920

Arg

Ile

Lys

Lys

CTC

ATA

AGC

CCA

ACA

TCA

CAA

CTG

GCA

ATC

ACT

TCC

AGT

TTA

ATA

TCA

1968

Leu

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

645

650

655

GTT

CAG

CTT

CTA

GGG

GTG

TTC

ATT

TGG

TTT

GGT

GTT

GAT

CCA

CCC

AAC

2016

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

660

665

670

ATC

ATC

ATA

GAC

TAC

GAT

GAA

CAC

AAG

ACA

ATG

AAC

CCT

GAG

CAA

GCC

2064

Ile

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

675

680

685

AGA

GGG

GTT

CTC

AAG

TGT

GAC

ATT

ACA

GAT

CTC

CAA

ATC

ATT

TGC

TCC

2112

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

690

695

700

TTG

GGA

TAT

AGC

ATT

CTT

CTC

ATG

GTC

ACA

TGT

ACT

GTG

TAT

GCC

ATC

2160

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

Leu

Leu

Met

Val

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

705

710

715

720

AAG

ACT

CGG

GGT

GTA

ccc

GAG

AAT

TTT

AAC

GAA

GCC

AAG

CCC

ATT

GGA

2208

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

725

730

735

TTC

ACT

ATG

TAC

ACG

ACA

TGT

ATA

GTA

TGG

CTT

GCC

TTC

ATT

CCA

ATT

2256

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

740

745

750

TTT

TTT

GGC

ACC

GCT

CAA

TCA

GCG

GAA

AAG

CTC

TAC

ATA

CAA

ACT

ACC

2304

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

755 760 765

ACG Thr

CTT Leu 770

ACA ATC

TCC Ser

ATG Met

AAC Asn 775

CTA AGT

GCA Alá

TCA GTG

GCG Alá

CTG Leu

GGG Gly

ATG Met

2352

Thr

Ile

Leu

Ser

Ser

Val 780

CTA

TAC

ATG

CCG

AAA

GTG

TAC

ATC

ATC

ATT

TTC

CAC

CCT

GAA

CTC

AAT

2400

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

785

790

795

800

GTC

CAG

AAA

CGG

AAG

CGA

AGC

TTC

AAG

GCG

GTA

GTC

ACA

GCA

GCC

ACC

2448

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

805

810

815

ATG

TCA

TCG

AGG

CTG

TCA

CAC

AAA

CCC

AGT

GAC

AGA

CCC

AAC

GGT

GAG

2496

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

820

825

830

GCA

AAG

ACC

GAG

CTC

TGT

GAA

AAC

GTA

GAC

CCA

AAC

AAC

TGT

ATA

CCA

2544

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

Asp

Pro

Asn

Asn

Cys

Ile

Pro

835

840

845

CCA

GTA

AGA

AAG

AGT

GTA

CAA

AAG

TCT

GTT

ACT

TGG

TAC

ACT

ATC

CCA

2592

Pro

Val

Arg

Lys

Ser

Val

Gin

Lys

Ser

Val

Thr

Trp

Tyr

Thr

Ile

Pro

850

855

860

CCA ACA GTA TAGCTTTTGA CTGCTTTCCC AAAGGCCCTG CTGCAAAAAA

Pro Thr Val

865

2641

GAAGTATGTC	AGTTATAATA	ACCTGGTTAT	CTAACCTGTT	CCATTCCATG	GAACCATGGA	2701
GGAGGAAGAC	CCTCAGTTAT	TTTGTCACCC	AACCTGGCAT	AGGACTCTTT	GGTCCTACCC	2761
GCTTCCCATC	ACCGGAGGAG	CTTCCCCGGC	CGGGAGACCA	GTGTTAGAGG	ATCCAAGCGA	2821

CCTAAACAGC TGCTTTATGA AATATCCTTA CTTTATCTGG GCTTAATAAG TCACTGACAT 2881

CAGCACTGCC	AACTTGGCTG	CAATTGTGGA	CCTTCCCTAC	CAAAGGGAGT	GTTGAAACTC	2941
AAGTCCCGCC	CCGGCTCTTT	AGAATGGACC	ACTGAGAGCC	ACAGGACCGT	TTTGGGGCTG	3001
ACCTGTCTTA	TTACGTATGT	ACTTCTAGGT	TGCAAGGTTT	TGAAATTTTC	TGTACAGTTT	3061
GTGAGGACCT	TTGCACTTTG	CCATCTGATG	TCGTACCTCG	GTTCACTGTT	TGTTTTCGAA	3121
TGCCTTGTTT	TCATAGAGCC	CTATTCTCTC	AGACGGTGGA	ATATTTGGAA	aaattttaaa	3181
ACAATTAAAA	TTTTAAAGCA	ATCTTGGCAG	ACTAAAACAA	GTACATCTGT	ACATGACTGT	3241
ATAATTACGT	TATAGTACCA	CTGCACATCA	TGTTTTTTTT	TTTAAGACAA	AAAAGATGTT	3301
TAAAGACCAA	AAACTGTGCT	GAGNAAGTAT	GCCCCACCTA	TCTTTNGNAT	ATGATAGGTT	3361
ACATAAAAGG	AAGGTATTGG	CTGAACTGNA	TAGAGGTCTT	GATCTTTGGA	ATGCATGCCA	3421
GTAATGTATT	TACAGTACAT	GTTTATTATG	TTCAATATTT	GTATTTGTGT	TCTCTTTTGT	3481
TATTTTTAAT	TAGNGTATAT	GAATATTTTG	CAATAATTTT	AATAATTATT	AAGCTGTTTG	3541
AAGGAAAGAA	TATGGATTTT	TCATGTCTTG	AGGTTTTGTT	CATGCCCCCT	TTGACTGATC	3601
AGTGTGATAA	GGACTTTAGG	AAAAAAAGCA	TGTATGTTTT	TTACTGTTTG	TAATAAGTAC	3661
TTTCGTTAAT	CTTGCTGCTT	ATGTGCCAAT	TTAGTGGAAA	AGAACAACCC	TTGCTGAAAA	3721
ATTCCCTCTT	TCCATTCTCT	TTCAATTCTG	TGATATTGTC	CAAGAATGTA	TCAATAAAAT	3781

ACTTTGGTTA ACTTTAAAAA AAA

3804 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 867 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

1

5

10

15

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

20

25

30

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

35

40

45

Arg

Ile

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser

Arg

ASp

Thr

Tyr

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

50

55

60

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

65

70

75

80

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

pro

Val

Phe

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

85

90

95

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

100

105

110

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

115

120

125 ' · «

« · ·

Pro

Glu 130

Leu

Ser

Asp

Asp

Arg 135

Arg

Tyr

Asp

Phe

Phe 140

Ser

Arg

Val

Val

Pro

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Alá

Gin

Alá

Met

Val

Asp

Ile

Val

Lys

Alá

145

150

155

160

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

165

170

175

Glu

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Phe

Thr

Gin

Ile

Ser

Lys

Glu

Alá

Gly

Gly

180

185

190

Leu

Cys

Ile

Alá

Gin

Ser

Val

Arg

Ile

Pro

Gin

Glu

Arg

Lys

Asp

Arg

195

200

205

Thr

Ile

Asp

Phe

Asp

Arg

Ile

Ile

Lys

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

210

215

220

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

Asp

Glu

Asp

Ile

Lys

Gin

Ile

225

230

235

240

Leu

Alá

Alá

Alá

Lys

Arg

Alá

Asp

Gin

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

245

250

255

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

260

265

270

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

275

280

285

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg

290

295

300

Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

305

310

315

320

• · • · · · ·· · ·

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly 325

Ser

Lys

Lys

Glu Asp 330

Thr

Asp

Arg

Lys

Cys 335

Thr

Gly

Gin

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Asp

Ser

Asn

Tyr

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

340

345

350

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

355

360

365

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

Tyr

Arg

Gly

Val

Cys

Pro

Glu

370

375

380

Met

Glu

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

385

390

395

400

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

405

410

415

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

420

425

430

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

435

440

445

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

450

455

460

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

465

470

475

480

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

485

490

495

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

500

505

510

·· ··

V • ·· • · · ·

Arg

Pro

Asn 515

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly 520

Cys

Gin

Asp

Ile

Pro 525

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

530

535

540

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

545

550

555

560

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

565

570

575

Leu

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

580

585

590

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

Phe

Arg

Arg

val

Phe

Leu

Gly

595

600

605

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

610

615

620

Ile

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

625

630

635

640

Leu

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

645

650

655

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

660

665

670

Ile

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

675

680

685

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

690

695

700

• · · · • · ··· · ··· · • · · · ·· ·4

Leu 705

Gly

Tyr

Ser

Ile

Leu 710

Leu

Met

Val

Thr

Cys 715

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile 720

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

725

730

735

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

740

745

750

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

755

760

765

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

770

775

780

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

785

790

795

800

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

805

810

815

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

820

825

830

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

Asp

Pro

Asn

Asn

Cys

Ile

Pro

835

840

845

Pro

Val

Arg

Lys

Ser

Val

Gin

Lys

Ser

Val

Thr

Trp

Tyr

Thr

Ile

Pro

850

855

860

Pro Thr Val

865 • · · · • · · · * » · • ·····» · • · ····· ·· · ···· ··· · ·· ·· (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1399 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..270 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = a cmR3 hmGluR7-et kódoló régiója (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATC

TCC

ATG

AAC

CTA

AGT

GCA

TCA

GTG

GCG

CTG

GGG

ATG

CTA

TAC

ATG

48

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

1

5

10

15

CCG

AAA

GTG

TAC

ATC

ATC

ATT

TTC

CAC

CCT

GAA

CTC

AAT

GTC

CAG

AAA

96

pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

20

25

30

CGG

AAG

CGA

AGC

TTC

AAG

GCG

GTA

GTC

ACA

GCA

GCC

ACC

ATG

TCA

TCG

144

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Ser

35

40

45

AGG

CTG

TCA

CAC

AAA

CCC

AGT

GAC

AGA

CCC

AAC

GGT

GAG

GCA

AAG

ACC

192

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Thr

·· ···· • · ··» · • · · · *· ·· ··· ♦ ·« ··

GAG Glu 65

CTC Leu

TGT Cys

GAA Glu

AAC Asn

GTA Val 70

GAC Asp

CCA Pro

AAC Asn

AGC Ser

CCT GCT GCA AAA

AAG Lys

AAG Lys 80

240

Pro 75

Alá Alá

Lys

TAT

GTC

AGT

TAT

AAT

AAC

CTG

GTT

ATC

TAACCTGTTC ι

CATTCCATGG

287

Tyr

Val

Ser

Tyr

Asn

Asn

Leu

Val

Ile

90

AACCATGGAG	GAGGAAGACC	CTCAGTTATT	TTGTCACCCA	ACCTGGCATA	GGACTCTTTG	347
GTCCTACCCG	CTTCCCATCA	CCGGAGGAGC	TTCCCCGGCC	GGGAGACCAG	TGTTAGAGGA	407
TCCAAGCGAC	CTAAACAGCT	GCTTTATGAA	ATATCCTTAC	TTTATCTGGG	CTTAATAAGT	467
CACTGACATC	AGCACTGCCA	ACTTGGCTGC	AATTGTGGAC	CTTCCCTACC	AAAGGGAGTG	527
TTGAAACTCA	AGTCCCGCCC	CGGCTCTTTA	GAATGGACCA	CTGAGAGCCA	CAGGACCGTT	587
TTGGGGCTGA	CCTGTCTTAT	TACGTATGTA	CTTCTAGGTT	GCAAGGTTTT	GAAATTTTCT	647
GTACAGTTTG	TGAGGACCTT	TGCACTTTGC	CATCTGATGT	CGTACCTCGG	TTCACTGTTT	707
GTTTTCGAAT	GCCTTGTTTT	CATAGAGCCC	TATTCTCTCA	GACGGTGGAA	TATTTGGAAA	767
AATTTTAAAA	CAATTAAAAT	TTTAAAGCAA	TCTTGGCAGA	CTAAAACAAG	TACATCTGTA	827
CATGACTGTA	TAATTACGTT	ATAGTACCAC	TGCACATCAT	GTTTTTTTTT	TTAAGACAAA	887
AAAGATGTTT	AAAGACCAAA	AACTGTGCTG	AGNAAGTATG	CCCCACCTAT	CTTTNGNATA	947
TGATAGGTTA	CATAAAAGGA	AGGTATTGGC	TGAACTGNAT	AGAGGTCTTG	ATCTTTGGAA	1007
TGCATGCCAG	TAATGTATTT	ACAGTACATG	TTTATTATGT	TCAATATTTG	TATTTGTGTT	1067

CTCTTTTGTT ATTTTTAATT AGNGTATATG AATATTTTGC AATAATTTTA ATAATTATTA 1127 ·· ···· • · ···«

AGCTGTTTGA AGGAAAGAAT ATGGATTTTT CATGTCTTGA GGTTTTGTTC ATGCCCCCTT

1187

TGACTGATCA GTGTGATAAG GACTTTAGGA AAAAAAGCAT GTATGTTTTT TACTGTTTGT

1247

AATAAGTACT TTCGTTAATC TTGCTGCTTA TGTGCCAATT TAGTGGAAAA GAACAACCCT

1307

TGCTGAAAAA TTCCCTCTTT CCATTCTCTT TCAATTCTGT GATATTGTCC AAGAATGTAT

1367

ΟΆΑΤΆΆΆΆΤΆ CTTTGGTTAA CTTTAAAAAA AA

1399 (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 89 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ile	Ser	Met	Asn	Leu	Ser	Alá	Ser
1				5
Pro	Lys	Val	Tyr	Ile	Ile	Ile	Phe
			20
Arg	Lys	Arg	Ser	Phe	Lys	Alá	Val
		35					40
Arg	Leu	Ser	His	Lys	Pro	Ser	Asp
	50					55
Glu	Leu	Cys	Glu	Asn	Val	Asp	Pro
65					70

Val	Alá 10	Leu	Gly	Met	Leu	Tyr 15	Met
His	Pro	Glu	Leu	Asn	Val	Gin	Lys
25					30
Val	Thr	Alá	Alá	Thr	Met	Ser	Ser
				45
Arg	Pro	Asn	Gly	Glu	Alá	Lys	Thr
			60
Asn	Ser	Pro	Alá	Alá	Lys	Lys	Lys
		75					80

Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Leu Val Ile (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1588 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..1447 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = a cmR5 hmGluR7-et kódoló régiója

	(xi	) A	7 .	SZÁMÚ	SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
G AAC	AAG	GAT	CTC	TGT GCT	GAC TAC CGG	GGT GTC TGC	CCA	GAG	ATG	46
Asn	Lys	Asp	Leu	Cys Alá	Asp Tyr Arg	Gly Val Cys	Pro	Glu	Met
1				5		10			15

GAG

CAA

GCT

GGA

GGC

AAG

AAG

TTG

CTG

AAG

TAT

ΑΤΆ

CGC

AAT

GTT

AAT

94

Glu

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

20

25

30

TTC

ΑΆΤ

GGT

AGT

GCT

GGC

ACT

CCA

GTG

ATG

TTT

AAC

AAG

AAC

GGG

GAT

142

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

• ·

GCA CCT

GGG Gly 50

CGT TAT Arg Tyr

GAC Asp

ATC Ile

TTT Phe 55

CAG Gin

TAC Tyr

CAG ACC

ACA Thr 60

AAC Asn

ACC Thr

AGC Ser

190

Alá

Pro

Gin

Thr

AAC

CCG

GGT

TAC

CGT

CTG

ATC

GGG

CAG

TGG

ACA

GAC

GAA

CTT

CAG

CTC

238

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

65

70

75

AAT

ATA

GAA

GAC

ATG

CAG

TGG

GGT

AAA

GGA

GTC

CGA

GAG

ATA

CCC

GCC

286

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá

80

85

90

95

TCA

GTG

TGC

ACA

CTA

CCA

TGT

AAG

CCA

GGA

CAG

AGA

AAG

AAG

ACA

CAG

334

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

100

105

110

AAA

GGA

ACT

CCT

TGC

TGT

TGG

ACC

TGT

GAG

CCT

TGC

GAT

GGT

TAC

CAG

382

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

Gin

115

120

125

TAC

CAG

TTT

GAT

GAG

ATG

ACA

TGC

CAG

CAT

TGC

CCC

TAT

GAC

CAG

AGG

430

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

130

135

140

CCC

AAT

GAA

JVAT

CGA

ACC

GGA

TGC

CAG

GAT

ATT

CCC

ATC

ATC

AAA

CTG

478

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

Gin

Asp

Ile

Pro

Ile

Ile

Lys

Leu

145

150

155

GAG

TGG

CAC

TCC

CCC

TGG

GCT

GTG

ATT

CCT

GTC

TTC

CTG

GCA

ATG

TTG

526

Glu

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

160

165

170

175

GGG

ATC

ATT

GCC

ACC

ATC

TTT

GTC

ATG

GCC

ACT

TTC

ATC

CGC

TAC

AAT

574

Gly

He

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

180 . 185 190 • · • · · ·

GAC ACG CCC

ATT GTC

CGG Arg

GCA Alá

TCT GGG CGG

GAA Glu

CTC Leu

AGC TAT

GTT Val

CTT Leu

622

Asp

Thr

Pro

Ile 195

Val

Ser

Gly 200

Arg

Ser

Tyr 205

TTG

ACG

GGC

ATC

TTT

CTT

TGC

TAC

ATC

ATC

ACT

TTC

CTG

ATG

ATT

GCC

670

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

He

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

210

215

220

AAA

CCA

GAT

GTG

GCA

GTG

TGT

TCT

TTC

CGG

CGA

GTT

TTC

TTG

GGC

TTG

718

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

225

230

235

GGT

ATG

TGC

ATC

AGT

TAT

GCA

GCC

CTC

TTG

ACG

AAA

ACA

AAT

CGG

ATT

766

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

240

245

250

255

TAT

CGC

ATA

TTT

GAG

CAG

GGC

AAG

AAA

TCA

GTA

ACA

GCT

CCC

AGA

CTC

814

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

Leu

260

265

270

ATA

AGC

CCA

ACA

TCA

CAA

CTG

GCA

ATC

ACT

TCC

AGT

TTA

ATA

TCA

GTT

862

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

Val

275

280

285

CAG

CTT

CTA

GGG

GTG

TTC

ATT

TGG

TTT

GGT

GTT

GAT

CCA

CCC

AAC

ATC

910

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

Ile

290

295

300

ATC

ATA

GAC

TAC

GAT

GAA

CAC

AAG

ACA

ATG

AAC

CCT

GAG

CAA

GCC

AGA

958

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

305

310

315

GGG

GTT

CTC

AAG

TGT

GAC

ATT

ACA

GAT

CTC

CAA

ATC

ATT

TGC

TCC

TTG

1006

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

320 325 330 335

GGA Gly

TAT Tyr

AGC Ser

ATT CTT

CTC ATG Leu Met

GTC Val

ACA Thr

TGT Cys 345

ACT Thr

GTG Val

TAT Tyr

GCC Alá

ATC Ile 350

AAG Lys

1054

Ile

Leu 340

ACT

CGG

GGT

GTA

CCC

GAG

AAT

TTT

AAC

GAA

GCC

AAG

CCC

ATT

GGA

TTC

1102

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

355

360

365

ACT

ATG

TAC

ACG

ACA

TGT

ATA

GTA

TGG

CTT

GCC

TTC

ATT

CCA

ATT

TTT

1150

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

370

375

380

TTT

GGC

ACC

GCT

CAA

TCA

GCG

GAA

AAG

CTC

TAC

ATA

CAA

ACT

ACC

ACG

1198

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

385

390

395

CTT

ACA

ATC

TCC

ATG

AAC

CTA

AGT

GCA

TCA

GTG

GCG

CTG

GGG

ATG

CTA

1246

Leu

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

400

405

410

415

TAC

ATG

CCG

AAA

GTG

TAC

ATC

ATC

ATT

TTC

CAC

CCT

GAA

CTC

AAT

GTC

1294

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

420

425

430

CAG

AAA

CGG

AAG

CGA

AGC

TTC

AAG

GCG

GTA

GTC

ACA

GCA

GCC

ACC

ATG

1342

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

435

440

445

TCA

TCG

AGG

CTG

TCA

CAC

AAA

CCC

AGT

GAC

AGA

CCC

AAC

GGT

GAG

GCA

1390

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

450

455

460

AAG

ACC

GAG

CTC

TGT

GAA

AAC

GTA

GAC

CCA

AAC

AGT

GAG

AAG

TGC

AAC

1438

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

Asp

Pro

Asn

Ser

Glu

Lys

Cys

Asn

465 470 475

TGC TAC TGACCATCTG CACTGGCATC TAGTCAAGCG ATTGTCTGAG GAAAGGATTT

Cys Tyr

480

TGGAGATTCC CATCTGATAT TCTTCTATTT GGTCTCTTGT ACCCATTGTC ATCCTGTACC

1554

ACACATAATA AAGTTTAAGA ATGTCAAGCA AAAG (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 481 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

1494

1588

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

Tyr

Arg

Gly

Val

Cys

Pro

Glu

Met

Glu

1

5

10

15

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

20

25

30

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

35

40

45

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

Ser

Asn

50

55

60

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Asn

• · · ·

Ile Glu

Asp

Met

Gin 85

Trp

Gly

Lys

Gly

Val 90

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá 95

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

Lys

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

Gin

Tyr

115

120

125

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

Pro

130

135

140

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

.Gly

Cys

Gin

Asp

Ile

Pro

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

145

150

155

160

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

Gly

165

170

175

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

Asp

180

185

190

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

195

200

205

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Lys

210

215

220

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

225

230

235

240

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

245

250

255

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

Leu

Ile

260

265

270

Ser

Pro

Thr 275

Ser

Gin

Leu

Alá

Ile 280

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile 285

Ser

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

Ile

Ile

290

295

300

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

Gly

305

310

315

320

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

Gly

325

330

335

Tyr

Ser

Ile

Leu

Leu

Met

Val

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

340

345

350

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

355

360

365

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

370

375

380

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

385

390

395

400

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

405

410

415

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

420

425

430

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

435

440

445

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

450 455 460

Thr Glu Leu Cys Glu Asn Val Asp Pro Asn Ser Glu Lys Cys Asn Cys

465 470 475 480

Tyr (2)

A 9.

SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i)

A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A)

HOSSZÚSÁG: 558 bázispár (B)

TÍPUS: nukleinsav (C)

SZALAZOTTSAG: egyszálú (D)

TOPOLÓGIA: lineáris (ii)

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix)

JELLEMZŐK:

(A)

NÉV/KULCS: CDS (B)

LOKACIO: 1..558 (D)

EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = a

CR7PCR1 hmGluR7-et kódoló része

A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:

ATG

GTC

CAG

CTG

AGG

AAG

CTG

CTC

CGC

GTC

CTG

ACT

TTG

ATG

AAG

TTC

48

Met

Val

Gin

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Leu

Met

Lys

Phe

1

5

10

15

CCC

TGC

TGC

GTG

CTG

GAG

GTG

CTC

CTG

TGC

GCG

CTG

GCG

GCG

GCG

GCG

96

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

• · • <* · · · • · · · · • · · • ·

CGC Arg

GGC Gly

CAG Gin 35

GAG Glu

ATG Met

TAC Tyr

GCC Alá

CCG Pro 40

CAC His

TCA ATC

CGG Arg

ATC Ile 45

GAG Glu

GGG Gly

GAC Asp

144

Ser

Ile

GTC

ACC

CTC

GGG

GGG

CTG

TTC

CCC

GTA

CAC

GCC

AAG

GGT

CCC

AGC

GGÁ

192

Val

Thr

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

50

55

60

GTG

CCC

TGC

GGC

GAC

ATC

AAG

AGG

GAA

AAC

GGG

ATC

CAC

AGG

CTG

GAA

240

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

GCG

ATG

CTC

TAC

GCC

CTG

GAC

CAG

ATC

AAC

AGT

GAT

CCC

AAC

CTA

CTG

288

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

85

90

95

CCC

AAC

GTG

ACG

CTG

GGC

GCG

CGG

ATC

CTG

GAC

ACT

TGT

TCC

AGG

GAC

336

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

Arg

Ile

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser

Arg

Asp

100

105

110

ACT

TAC

GCG

CTC

GAA

CAG

TCG

CTT

ACT

TTC

GTC

CAG

GCG

CTC

ATC

CAG

384

Thr

Tyr

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

115

120

125

AAG

GAC

ACC

TCC

GAC

GTG

CGC

TGC

ACC

AAC

GGC

GAA

CCG

CCG

GTT

TTC

432

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

130

135

140

GTC

AAG

CCG

GAG

AAA

GTA

GTT

GGA

GTG

ATT

GGG

GCT

TCG

GGG

AGT

TCG

480

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

145

150

155

160

GTC

TCC

ATC

ATG

GTA

GCC

AAC

ATC

CTG

AGG

CTC

TTC

CAG

ATC

CCC

CAG

528

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

165 170

175

100

ATT AGT TAT GCA TCA ACG GCA CCC GAG CTA	558
Ile	Ser Tyr	Alá Ser 180	Thr Alá Pro	Glu Leu 185
(2)	A 10 .	SZÁMÚ	SZEKVENCIA	ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 186 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Val

Gin

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Leu

Met

Lys

Phe

1

5

10

15

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

20

25

30

Arg

Gly

Gin

Glu

Met

Tyr

Alá

Pro

His

Ser

Ile

Arg

Ile

Glu

Gly

Asp

35

40

45

Val

Thr

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

50

55

60

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

101

Pro

Asn

Val

Thr 100

Leu

Gly

Alá

Arg

Ile 105

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser Arg 110

Asp

Thr

Tyr

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

115

120

125

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

130

135

140

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

145

150

155

160

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

165

170

175

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

Pro

Glu

Leu

180

185

(2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 2748 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS : CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..2748 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = hmGluR7a (xi) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG GTC CAG CTG AGG AAG CTG CTC CGC GTC CTG ACT TTG ATG AAG TTC

102

Met 1

Val

Gin

Leu

Arg 5

Lys

Leu

Leu

Arg

Val 10

Leu

Thr

Leu

Met

Lys 15

Phe

CCC

TGC

TGC

GTG

CTG

GAG

GTG

CTC

CTG

TGC

GCG

CTG

GCG

GCG

GCG

GCG

96

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

20

25

30

CGC

GGC

CAG

GAG

ATG

TAC

GCC

CCG

CAC

TCA

ATC

CGG

ATC

GAG

GGG

GAC

144

Arg

Gly

Gin

Glu

Met

Tyr

Alá

Pro

His

Ser

Ile

Arg

Ile

Glu

Gly

Asp

35

40

45

GTC

ACC

CTC

GGG

GGG

CTG

TTC

CCC

GTA

CAC

GCC

AAG

GGT

CCC

AGC

GGA

192

Val

Thr

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

50

55

60

GTG

CCC

TGC

GGC

GAC

ATC

AAG

AGG

GAA

AAC

GGG

ATC

CAC

AGG

CTG

GAA

240

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

GCG

ATG

CTC

TAC

GCC

CTG

GAC

CAG

ATC

AAC

AGT

GAT

CCC

AAC

CTA

CTG

288

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

85

90

95

CCC

AAC

GTG

ACG

CTG

GGC

GCG

CGG

ATC

CTG

GAC

ACT

TGT

TCC

AGG

GAC

336

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

Arg

Ile

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser

Arg

Asp

100

105

110

ACT

TAC

GCG

CTC

GAA

CAG

TCG

CTT

ACT

TTC

GTC

CAG

GCG

CTC

ATC

CAG

384

Thr

Tyr

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

115

120

125

AAG

GAC

ACC

TCC

GAC

GTG

CGC

TGC

ACC

AAC

GGC

GAA

CCG

CCG

GTT

TTC

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

130

135

140

103

GTC Val 145

AAG Lys

CCG Pro

GAG Glu

AAA Lys

GTA GTT

GGA Gly

GTG Val

ATT GGG GCT

TCG Ser

GGG Gly

AGT Ser

TCG Ser 160

480

Val 150

Val

Ile

Gly 155

Alá

GTC

TCC

ATC

ATG

GTA

GCC

AAC

ATC

CTG

AGG

CTC

TTC

CAG

ATC

CCC

CAG

528

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

165

170

175

ATT

AGT

TAT

GCA

TCA

ACG

GCA

CCC

GAG

CTA

AGT

GAT

GAC

CGG

CGC

TAT

576

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

Asp

Arg

Arg

Tyr

180

185

190

GAC

TTC

TTC

TCT

CGC

GTG

GTG

CCA

CCC

GAT

TCC

TTC

CAA

GCC

CAG

GCC

624

Asp

Phe

Phe

Ser

Arg

Val

Val

Pro

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Alá

Gin

Alá

195

200

205

ATG

GTA

GAC

ATT

GTA

AAG

GCC

CTA

GGC

TGG

AAT

TAT

GTG

TCT

ACC

CTC

672

Met

Val

Asp

Ile

Val

Lys

Alá

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

210

215

220

GCA

TCG

GAA

GGA

AGT

TAT

GGA

GAG

AAA

GGT

GTG

GAG

TCC

TTC

ACG

CAG

720

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

Glu

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Phe

Thr

Gin

225

230

235

240

ATT

TCC

AAA

GAG

GCA

GGT

GGA

CTC

TGC

ATT

GCC

CAG

TCC

GTG

AGA

ATC

768

Ile

Ser

Lys

Glu

Alá

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Alá

Gin

Ser

Val

Arg

Ile

245

250

255

CCC

CAG

GAA

CGC

AAA

GAC

AGG

ACC

ATT

GAC

TTT

GAT

AGA

ATT

ATC

AAA

816

Pro

Gin

Glu

Arg

Lys

Asp

Arg

Thr

Ile

Asp

Phe

Asp

Arg

Ile

Ile

Lys

260

265

270

CAG

CTC

CTG

GAC

ACC

CCC

AAC

TCC

AGG

GCC

GTC

GTG

ATT

TTT

GCC

AAC

864

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

275 280 285

104

GAT GAG

GAT ATA

AAG Lys

CAG Gin

ATC Ile 295

CTT GCA Leu Alá

GCA Alá

GCC AAA

AGA GCT

GAC Asp

CAA Gin

912

Asp

Glu 290

Asp

Ile

Alá

Lys 300

Arg

Alá

GTT

GGC

CAT

TTT

CTT

TGG

GTG

GGA

TCA

GAC

AGC

TGG

GGA

TCC

AAA

ATA

960

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

305

310

315

320

AAC

CCA

CTG

CAC

CAG

CAT

GAA

GAT

ATC

GCA

GAA

GGG

GCC

ATC

ACC

ATT

1008

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

325

330

335

CAG

CCC

AAG

CGA

GCC

ACG

GTG

GAA

GGG

TTT

GAT

GCC

TAC

TTT

ACG

TCC

1056

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

340

345

350

CGT

ACA

CTT

GAA

AAC

AAC

AGA

AGA

AAT

GTA

TGG

TTT

GCC

GAA

TAC

TGG

1104

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg

Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

355

360

365

GAG

GAA

AAC

TTC

AAC

TGC

AAG

TTG

ACG

ATT

AGT

GGG

TCA

AAA

AAA

GAA

1152

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Lys

Lys

Glu

370

375

380

GAC

ACA

GAT

CGC

AAA

TGC

ACA

GGA

CAG

GAG

AGA

ATT

GGA

AAA

GAT

TCC

1200

Asp

Thr

Asp

Arg

Lys

Cys

Thr

Gly

Gin

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Asp

Ser

385

390

395

400

AAC

TAT

GAG

CAG

GAG

GGT

AAA

GTC

CAG

TTC

GTG

ATT

GAC

GCA

GTC

TAT

1248

Asn

Tyr

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

405

410

415

GCT

ATG

GCT

CAC

GCC

CTT

CAC

CAC

ATG

AAC

AAG

GAT

CTC

TGT

GCT

GAC

1296

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

420

425

430

·* · ·

105

TAC Tyr

CGG Arg

GGT Gly 435

GTC Val

TGC Cys

CCA Pro

GAG Glu

ATG Met 440

GAG CAA

GCT Alá

GGA Gly

GGC Gly 445

AAG Lys

AAG Lys

TTG Leu

1344

Glu

Gin

CTG

AAG

TAT

ATA

CGC

AAT

GTT

AAT

TTC

AAT

GGT

AGT

GCT

GGC

ACT

CCA

1392

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

450

455

460

GTG

ATG

TTT

AAC

AAG

AAC

GGG

GAT

GCA

CCT

GGG

CGT

TAT

GAC

ATC

TTT

1440

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

465

470

475

480

CAG

TAC

CAG

ACC

ACA

AAC

ACC

AGC

AAC

CCG

GGT

TAC

CGT

CTG

ATC

GGG

1488

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

485

490

495

CAG

TGG

ACA

GAC

GAA

CTT

CAG

CTC

AAT

ATA

GAA

GAC

ATG

CAG

TGG

GGT

1536

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

500

505

510

AAA

GGA

GTC

CGA

GAG

ATA

CCC

GCC

TCA

GTG

TGC

ACA

CTA

CCA

TGT

AAG

1584

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

515

520

525

CCA

GGA

CAG

AGA

AAG

AAG

ACA

CAG

AAA

GGA

ACT

CCT

TGC

TGT

TGG

ACC

1632

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

530

535

540

TGT

GAG

CCT

TGC

GAT

GGT

TAC

CAG

TAC

CAG

TTT

GAT

GAG

ATG

ACA

TGC

1680

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

545

550

555

560

CAG

CAT

TGC

CCC

TAT

GAC

CAG

AGG

CCC

AAT

GAA

AAT

CGA

ACC

GGA

TGC

1728

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

565

570

575

• · • · • · • · · ·

106

CAG Gin

GAT Asp

ATT CCC

ATC Ile

ATC He

AAA Lys

CTG GAG TGG

CAC His

TCC Ser

CCC Pro

TGG Trp 590

GCT Alá

GTG Val

1776

Ile

Pro 580

Leu

Glu 585

Trp

ATT

CCT

GTC

TTC

CTG

GCA

ATG

TTG

GGG

ATC

ATT

GCC

ACC

ATC

TTT

GTC

1824

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

595

600

605

ATG

GCC

ACT

TTC

ATC

CGC

TAC

AAT

GAC

ACG

CCC

ATT

GTC

CGG

GCA

TCT

1872

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

610

615

620

GGG

CGG

GAA

CTC

AGC

TAT

GTT

CTT

TTG

ACG

GGC

ATC

TTT

CTT

TGC

TAC

1920

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

625

630

635

640

ATC

ATC

ACT

TTC

CTG

ATG

ATT

GCC

AAA

CCA

GAT

GTG

GCA

GTG

TGT

TCT

1968

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

645

650

655

TTC

CGG

CGA

GTT

TTC

TTG

GGC

TTG

GGT

ATG

TGC

ATC

AGT

TAT

GCA

GCC

2016

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

660

665

670

CTC

TTG

ACG

AAA

ACA

AAT

CGG

ATT

TAT

CGC

ATA

TTT

GAG

CAG

GGC

AAG

2064

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

He

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

675

680

685

AAA

TCA

GTA

ACA

GCT

CCC

AGA

CTC

ATA

AGC

CCA

ACA

TCA

CAA

CTG

GCA

2112

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

Leu

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

690

695

700

ATC

ACT

TCC

AGT

TTA

ATA

TCA

GTT

CAG

CTT

CTA

GGG

GTG

TTC

ATT

TGG

2160

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

He

Ser

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

705 710 715 720

107

TTT GGT

GTT Val

GAT Asp

CCA Pro 725

CCC Pro

AAC Asn

ATC Ile

ATC Ile

ATA GAC

TAC Tyr

GAT Asp

GAA Glu

CAC His 735

AAG Lys

2208

Phe

Gly

Ile 730

Asp

ACA

ATG

AAC

CCT

GAG

CAA

GCC

AGA

GGG

GTT

CTC

AAG

TGT

GAC

ATT

ACA

2256

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

740

745

750

GAT

CTC

CAA

ATC

ATT

TGC

TCC

TTG

GGA

TAT

AGC

ATT

CTT

CTC

ATG

GTC

2304

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

Leu

Leu

Met

Val

755

760

765

ACA

TGT

ACT

GTG

TAT

GCC

ATC

AAG

ACT

CGG

GGT

GTA

CCC

GAG

AAT

TTT

2352

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

770

775

780

AAC

GAA

GCC

AAG

CCC

ATT

GGA

TTC

ACT

ATG

TAC

ACG

ACA

TGT

ATA

GTA

2400

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

785

790

795

800

TGG

CTT

GCC

TTC

ATT

CCA

ATT

TTT

TTT

GGC

ACC

GCT

CAA

TCA

GCG

GAA

2448

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

805

810

815

AAG

CTC

TAC

ATA

CAA

ACT

ACC

ACG

CTT

ACA

ATC

TCC

ATG

AAC

CTA

AGT

2496

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

820

825

830

GCA

TCA

GTG

GCG

CTG

GGG

ATG

CTA

TAC

ATG

CCG

AAA

GTG

TAC

ATC

ATC

2544

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

835

840

845

ATT

TTC

CAC

CCT

GAA

CTC

AAT

GTC

CAG

AAA

CGG

AAG

CGA

AGC

TTC

AAG

2592

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

850

855

860

108

GCG

GTA

GTC

ACA

GCA

GCC

ACC

ATG

TCA

TCG

AGG

CTG

TCA

CAC

AAA

CCC

2640

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

865

870

875

880

AGT

GAC

AGA

CCC

AAC

GGT

GAG

GCA

AAG

ACC

GAG

CTC

TGT

GAA

AAC

GTA

2688

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

885

890

895

GAC

CCA

AAC

AGC

CCT

GCT

GCA

ΑΆΑ

AAG

AAG

TAT

GTC

AGT

TAT

AAT

AAC

2736

Asp

Pro

Asn

Ser

Pro

Alá

ALa

Lys

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Tyr

Asn

Asn

900 905 910

CTG GTT ATC TA	2748
Leu	Val Ile
	915
(2)	A 12 .	SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 915 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Val

Gin

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Leu

Met

Lys

Phe

1

5

10

15

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

Arg Gly Gin Glu Met Tyr Alá Pro His

Ser He Arg

Ile Glu Gly Asp ·· · ·

109 ···· ·· • · · • ·

Val	Thr 50	Leu	Gly	Gly	Leu	Phe 55	Pro
Val	Pro	Cys	Gly	Asp	Ile	Lys	Arg
65					70
Alá	Met	Leu	Tyr	Alá	Leu	Asp	Gin
				85
Pro	Asn	Val	Thr	Leu	Gly	Alá	Arg
			100
Thr	Tyr	Alá	Leu	Glu	Gin	Ser	Leu
		115					120
Lys	Asp	Thr	Ser	Asp	Val	Arg	Cys
	130					135
Val	Lys	Pro	Glu	Lys	Val	Val	Gly
145					150
Val	Ser	Ile	Met	Val	Alá	Asn	Ile
				165
Ile	Ser	Tyr	Alá	Ser	Thr	Alá	Pro
			180
Asp	Phe	Phe	Ser	Arg	Val	Val	Pro
		195					200
Met	Val	Asp	Ile	Val	Lys	Alá	Leu
	210					215
Alá	Ser	Glu	Gly	Ser	Tyr	Gly	Glu
225					230

Val His Alá Lys Gly Pro Ser Gly

Glu Asn Gly Ile His Arg Leu Glu

7580

Ile Asn Ser Asp Pro Asn Leu Leu

9095

Ile Leu Asp Thr Cys Ser Arg Asp

105110

Thr Phe Val Gin Alá Leu Ile Gin

125

Thr Asn Gly Glu Pro Pro Val Phe

140

Val Ile Gly Alá Ser Gly Ser Ser

155160

Leu Arg Leu Phe Gin Ile Pro Gin

170175

Glu Leu Ser Asp Asp Arg Arg Tyr

185190

Pro Asp Ser Phe Gin Alá Gin Alá

205

Gly Trp Asn Tyr Val Ser Thr Leu

220

Lys Gly Val Glu Ser Phe Thr Gin

235

240

Ile

Ser Lys

Glu

Alá Gly 245

Gly

Leu

Cys

Ile Alá Gin Ser 250

Val

Arg 255

Ile

Pro

Gin

Glu

Arg

Lys

Asp

Arg

Thr

Ile

Asp

Phe

Asp

Arg

Ile

Ile

Lys

260

265

270

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

275

280

285

Asp

Glu

Asp

Ile

Lys

Gin

Ile

Leu

Alá

Alá

Alá

Lys

Arg

Alá

Asp

Gin

290

295

300

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

305

310

315

320

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

325

330

335

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

340

345

350

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg

Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

355

360

365

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Lys

Lys

Glu

370

375

380

Asp

Thr

Asp

Arg

Lys

Cys

Thr

Gly

Gin

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Asp

Ser

385

390

395

400

Asn

Tyr

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

405

410

415

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

420

425

430

111

Tyr Arg

Gly 435

Val

Cys

Pro

Glu

Met 440

Glu

Gin Alá

Gly Gly 445

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

450

455

460

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

465

470

475

480

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

485

490

495

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

500

505

510

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

515

520

525

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

530

535

540

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

545

550

555

560

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

565

570

575

Gin

Asp

Ile

Pro

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

580

585

590

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

595

600

605

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

610

615

620

·· ····

Gly 625

Arg Glu

Leu

Ser

Tyr 630

Val

Leu

Leu Thr

Gly 635

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr 640

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

645

650

655

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

660

665

670

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

675

680

685

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

Leu

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

690

695

700

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

705

710

715

720

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

Ile

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

725

730

735

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

740

745

750

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

Leu

Leu

Met

Val

755

760

765

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

770

775

780

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

785

790

795

800

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

805

810

815

«· ···· • · • · ···· « ···· ♦ ·· ··

113

Lys

Leu

Tyr

Ile 820

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu 825

Thr

Ile

Ser

Met

Asn 830

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

835

840

845

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

850

855

860

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

865

870

875

880

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

885

890

895

Asp

Pro

Asn

Ser

Pro

Alá

Alá

Lys

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Tyr

Asn

Asn

900 905 910

Leu Val Ile

915 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 2769 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: CDNS (ix) JELLEMZŐK:

• ·· ···· • · · • · ··· · ·«·· · · · · • ·· ··

114 (A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..2769 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = hmGluR7b (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG

GTC

CAG

CTG

AGG

AAG

CTG

CTC

CGC

GTC

CTG

ACT

TTG ATG

AAG

TTC

48

Met

Val

Gin

Leu

Arg

Lys

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Leu

Met

Lys

Phe

1

5

10

15

CCC

TGC

TGC

GTG

CTG

GAG

GTG

CTC

CTG

TGC

GCG

CTG

GCG

GCG

GCG

GCG

96

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

20

25

30

CGC

GGC

CAG

GAG

ATG

TAC

GCC

CCG

CAC

TCA

ATC

CGG

ATC

GAG

GGG

GAC

144

Arg

Gly

Gin

Glu

Met

Tyr

Alá

Pro

His

Ser

Ile

Arg

Ile

Glu

Gly

Asp

35

40

45

GTC

ACC

CTC

GGG

GGG

CTG

TTC

CCC

GTA

CAC

GCC

AAG

GGT

CCC

AGC

GGA

192

Val

Thr

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

50

55

60

GTG

CCC

TGC

GGC

GAC

ATC

AAG

AGG

GAA

AAC

GGG

ATC

CAC

AGG

CTG

GAA

240

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

GCG

ATG

CTC

TAC

GCC

CTG

GAC

CAG

ATC

AAC

AGT

GAT

CCC

AAC

CTA

CTG

288

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

85

90

95

CCC

AAC

GTG

ACG

CTG

GGC

GCG

CGG

ATC

CTG

GAC

ACT

TGT

TCC

AGG

GAC

336

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

Arg

Ile

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser

Arg

Asp

100

105

110 ···· ·· • · ··· · ···· · · · ·

115

ACT Thr

TAC Tyr

GCG Alá 115

CTC Leu

GAA Glu

CAG Gin

TCG Ser

CTT Leu 120

ACT TTC

GTC Val

CAG Gin

GCG Alá 125

CTC Leu

ATC Ile

CAG Gin

384

Thr

Phe

AAG

GAC

ACC

TCC

GAC

GTG

CGC

TGC

ACC

AAC

GGC

GAA

CCG

CCG

GTT

TTC

432

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

130

135

140

GTC

AAG

CCG

GAG

AAA

GTA

GTT

GGA

GTG

ATT

GGG

GCT

TCG

GGG

AGT

TCG

480

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

145

150

155

160

GTC

TCC

ATC

ATG

GTA

GCC

AAC

ATC

CTG

AGG

CTC

TTC

CAG

ATC

CCC

CAG

528

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

165

170

175

ATT

AGT

TAT

GCA

TCA

ACG

GCA

CCC

GAG

CTA

AGT

GAT

GAC

CGG

CGC

TAT

576

He

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

Asp

Arg

Arg

Tyr

180

185

190

GAC

TTC

TTC

TCT

CGC

GTG

GTG

CCA

CCC

GAT

TCC

TTC

CAA

GCC

CAG

GCC

624

Asp

Phe

Phe

Ser

Arg

Val

Val

Pro

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Alá

Gin

Alá

195

200

205

ATG

GTA

GAC

ATT

GTA

AAG

GCC

CTA

GGC

TGG

AAT

TAT

GTG

TCT

ACC

CTC

672

Met

Val

Asp

Ile

Val

Lys

Alá

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

210

215

220

GCA

TCG

GAA

GGA

AGT

TAT

GGA

GAG

AAA

GGT

GTG

GAG

TCC

TTC

ACG

CAG

720

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

Glu

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Phe

Thr

Gin

225

230

235

240

ATT

TCC

AAA

GAG

GCA

GGT

GGA

CTC

TGC

ATT

GCC

CAG

TCC

GTG

AGA

ATC

768

Ile

Ser

Lys

Glu

Alá

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Alá

Gin

Ser

Val

Arg

Ile

245

250

255

• · · · • · *

• · · • · · ·

116

CCC Pro

CAG GAA Gin Glu

CGC Arg 260

AAA Lys

GAC Asp

AGG ACC

ATT GAC

TTT Phe

GAT AGA

ATT Ile 270

ATC Ile

AAA Lys

816

Arg

Thr

Ile 265

Asp

Asp

Arg

CAG

CTC

CTG

GAC

ACC

CCC

AAC

TCC

AGG

GCC

GTC

GTG

ATT

TTT

GCC

AAC

864

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

275

280

285

GAT

GAG

GAT

ATA

AAG

CAG

ATC

CTT

GCA

GCA

GCC

AAA

AGA

GCT

GAC

CAA

912

Asp

Glu

Asp

Ile

Lys

Gin

Ile

Leu

Alá

Alá

Alá

Lys

Arg

Alá

Asp

Gin

290

295

300

GTT

GGC

CAT

TTT

CTT

TGG

GTG

GGA

TCA

GAC

AGC

TGG

GGA

TCC

AAA

ATA

960

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

305

310

315

320

AAC

CCA

CTG

CAC

CAG

CAT

GAA

GAT

ATC

GCA

GAA

GGG

GCC

ATC

ACC

ATT

1008

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

325

330

335

CAG

CCC

AAG

CGA

GCC

ACG

GTG

GAA

GGG

TTT

GAT

GCC

TAC

TTT

ACG

TCC

1056

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

340

345

350

CGT

ACA

CTT

GAA

AAC

AAC

AGA

AGA

AAT

GTA

TGG

TTT

GCC

GAA

TAC

TGG

1104

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg

Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

355

360

365

GAG

GAA

AAC

TTC

AAC

TGC

AAG

TTG

ACG

ATT

AGT

GGG

TCA

AAA

AAA

GAA

1152

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Lys

Lys

Glu

370

375

380

GAC

ACA

GAT

CGC

AAA

TGC

ACA

GGA

CAG

GAG

AGA

ATT

GGA

AAA

GAT

TCC

1200

Asp

Thr

Asp

Arg

Lys

Cys

Thr

Gly

Gin

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Asp

Ser

385 390 395

400 « · · · · · · • · · • · · · · · «···· ·· · • · · ··

117

AAC Asn

TAT Tyr

GAG Glu

CAG GAG

GGT AAA

GTC Val

CAG Gin

TTC Phe 410

GTG Val

ATT Ile

GAC Asp

GCA Alá

GTC Val 415

TAT Tyr

1248

Gin

Glu 405

Gly

Lys

GCT

ATG

GCT

CAC

GCC

CTT

CAC

CAC

ATG

AAC

AAG

GAT

CTC

TGT

GCT

GAC

1296

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

420

425

430

TAC

CGG

GGT

GTC

TGC

CCA

GAG

ATG

GAG

CAA

GCT

GGA

GGC

AAG

AAG

TTG

1344

Tyr

Arg

Gly

Val

Cys

Pro

Glu

Met

Glu

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

435

440

445

CTG

AAG

TAT

ATA

CGC

AAT

GTT

AAT

TTC

AAT

GGT

AGT

GCT

GGC

ACT

CCA

1392

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

450

455

460

GTG

ATG

TTT

AAC

AAG

AAC

GGG

GAT

GCA

CCT

GGG

CGT

TAT

GAC

ATC

TTT

1440

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

465

470

475

480

CAG

TAC

CAG

ACC

ACA

AAC

ACC

AGC

AAC

CCG

GGT

TAC

CGT

CTG

ATC

GGG

1488

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

485

490

495

CAG

TGG

ACA

GAC

GAA

CTT

CAG

CTC

AAT

ATA

GAA

GAC

ATG

CAG

TGG

GGT

1536

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

500

505

510

AAA

GGA

GTC

CGA

GAG

ATA

CCC

GCC

TCA

GTG

TGC

ACA

CTA

CCA

TGT

AAG

1584

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

515

520

525

CCA

GGA

CAG

AGA

AAG

AAG

ACA

CAG

AAA

GGA

ACT

CCT

TGC

TGT

TGG

ACC

1632

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

530

535

540

118

TGT Cys 545

GAG Glu

CCT TGC Pro Cys

GAT Asp

GGT TAC

CAG Gin

TAC CAG TTT

GAT Asp

GAG ATG Glu Met

ACA Thr

TGC Cys 560

1680

Gly 550

Tyr

Tyr

Gin

Phe 555

CAG

CAT

TGC

CCC

TAT

GAC

CAG

AGG

CCC

AAT

GAA

AAT

CGA

ACC

GGA

TGC

1728

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

565

570

575

CAG

GAT

ATT

CCC

ATC

ATC

AAA

CTG

GAG

TGG

CAC

TCC

CCC

TGG

GCT

GTG

1776

Gin

Asp

Ile

Pro

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu

Trp

His

Ser

Pro

Trp

Alá

Val

580

585

590

ATT

CCT

GTC

TTC

CTG

GCA

ATG

TTG

GGG

ATC

ATT

GCC

ACC

ATC

TTT

GTC

1824

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

595

600

605

ATG

GCC

ACT

TTC

ATC

CGC

TAC

AAT

GAC

ACG

CCC

ATT

GTC

CGG

GCA

TCT

1872

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

610

615

620

GGG

CGG

GAA

CTC

AGC

TAT

GTT

CTT

TTG

ACG

GGC

ATC

TTT

CTT

TGC

TAC

1920

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

625

630

635

640

ATC

ATC

ACT

TTC

CTG

ATG

ATT

GCC

AAA

CCA

GAT

GTG

GCA

GTG

TGT

TCT

1968

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

645

650

655

TTC

CGG

CGA

GTT

TTC

TTG

GGC

TTG

GGT

ATG

TGC

ATC

AGT

TAT

GCA

GCC

2016

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

660

665

670

CTC

TTG

ACG

AAA

ACA

AAT

CGG

ATT

TAT

CGC

ATA

TTT

GAG

CAG

GGC

AAG

2064

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

675

680

685

119

ΑΛΑ Lys

TCA Ser 690

GTA Val

ACA Thr

GCT CCC

AGA Arg 695

CTC Leu

ATA AGC

CCA Pro

ACA Thr 700

TCA Ser

CAA Gin

CTG Leu

GCA Alá

2112

Alá

Pro

Ile

Ser

ATC

ACT

TCC

AGT

TTA

ATA

TCA

GTT

CAG

CTT

CTA

GGG

GTG

TTC

ATT

TGG

2160

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

705

710

715

720

TTT

GGT

GTT

GAT

CCA

CCC

AAC

ATC

ATC

ATA

GAC

TAC

GAT

GAA

CAC

AAG

2208

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

Ile

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

725

730

735

ACA

ATG

AAC

CCT

GAG

CAA

GCC

AGA

GGG

GTT

CTC

AAG

TGT

GAC

ATT

ACA

2256

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

740

745

750

GAT

CTC

CAA

ATC

ATT

TGC

TCC

TTG

GGA

TAT

AGC

ATT

CTT

CTC

ATG

GTC

2304

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

Gly

Tyr

Ser

He

Leu

Leu

Met

Val

755

760

765

..

ACA

TGT

ACT

GTG

TAT

GCC

ATC

AAG

ACT

CGG

GGT

GTA

CCC

GAG

AAT

TTT

2352

Thr

Cys

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile

Lys

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Asn

Phe

770

775

780

AAC

GAA

GCC

AAG

CCC

ATT

GGA

TTC

ACT

ATG

TAC

ACG

ACA

TGT

ATA

GTA

2400

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

785

790

795

800

TGG

CTT

GCC

TTC

ATT

CCA

ATT

TTT

TTT

GGC

ACC

GCT

CAA

TCA

GCG

GAA

2448

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

805

810

815

AAG

CTC

TAC

ATA

CAA

ACT

ACC

ACG

CTT

ACA

ATC

TCC

ATG

AAC

CTA

AGT

2496

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

820 825 830 • · · · • · ·

120

GCA

TCA

GTG

GCG

CTG

GGG

ATG

CTA

TAC

ATG

CCG

AAA

GTG

TAC

ATC

ATC

2544

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

835

840

845

ATT

TTC

CAC

CCT

GAA

CTC

AAT

GTC

CAG

AAA

CGG

AAG

CGA

AGC

TTC

AAG

2592

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

850

855

860

GCG

GTA

GTC

ACA

GCA

GCC

ACC

ATG

TCA

TCG

AGG

CTG

TCA

CAC

AAA

CCC

2640

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

865

870

875

880

AGT

GAC

AGA

CCC

AAC

GGT

GAG

GCA

AAG

ACC

GAG

CTC

TGT

GAA

AAC

GTA

2688

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

885

890

895

GAC

CCA

AAC

AAC

TGT

ATA

CCA

CCA

GTA

AGA

AAG

AGT

GTA

CAA

AAG

TCT

2736

Asp

Pro

Asn

Asn

Cys

Ile

Pro

Pro

Val

Arg

Lys

Ser

Val

Gin

Lys

Ser

900

905

910

GTT

ACT

TGG

TAC

ACT

ATC

CCA

CCA

ACA

GTA

TA

2769

Val

Thr

Trp

Tyr

Thr

Ile

Pro

Pro

Thr

Val

915 920 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 922 aminosav (B) TÍPUS: aminosav • · • « ♦ · • · · ·

121 (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Val

Gin

Leu

Arg 5

Lys

Leu

Leu

Arg Val 10

Leu

Thr

Leu

Met

Lys 15

Phe

Pro

Cys

Cys

Val

Leu

Glu

Val

Leu

Leu

Cys

Alá

Leu

Alá

Alá

Alá

Alá

20

25

30

Arg

Gly

Gin

Glu

Met

Tyr

Alá

Pro

His

Ser

Ile

Arg

Ile

Glu

Gly

Asp

35

40

45

Val

Thr

Leu

Gly

Gly

Leu

Phe

Pro

Val

His

Alá

Lys

Gly

Pro

Ser

Gly

50

55

60

Val

Pro

Cys

Gly

Asp

Ile

Lys

Arg

Glu

Asn

Gly

Ile

His

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Alá

Met

Leu

Tyr

Alá

Leu

Asp

Gin

Ile

Asn

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Leu

85

90

95

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Alá

Arg

Ile

Leu

Asp

Thr

Cys

Ser

Arg

Asp

100

105

110

Thr

Tyr

Alá

Leu

Glu

Gin

Ser

Leu

Thr

Phe

Val

Gin

Alá

Leu

Ile

Gin

115

120

125

Lys

Asp

Thr

Ser

Asp

Val

Arg

Cys

Thr

Asn

Gly

Glu

Pro

Pro

Val

Phe

130

135

140

Val

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Val

Gly

Val

Ile

Gly

Alá

Ser

Gly

Ser

Ser

145

150

155

160

Val

Ser

Ile

Met

Val

Alá

Asn

Ile

Leu

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Pro

Gin

165

170

175

Ile

Ser

Tyr

Alá

Ser

Thr

Alá

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

Asp

Arg

Arg

Tyr

180

185

190

122

Asp

Phe

Phe 195

Ser

Arg Val Val

Pro 200

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin Alá 205

Gin

Alá

Met

Val

Asp

Ile

Val

Lys

Alá

Leu

Gly

Trp

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

210

215

220

Alá

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Gly

Glu

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Phe

Thr

Gin

225

230

235

240

Ile

Ser

Lys

Glu

Alá

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Alá

Gin

Ser

Val

Arg

Ile

245

250

255

Pro

Gin

Glu

Arg

Lys

Asp

Arg

Thr

Ile

Asp

Phe

Asp

Arg

Ile

Ile

Lys

260

265

270

Gin

Leu

Leu

Asp

Thr

Pro

Asn

Ser

Arg

Alá

Val

Val

Ile

Phe

Alá

Asn

275

280

285

Asp

Glu

Asp

Ile

Lys

Gin

Ile

Leu

Alá

Alá

Alá

Lys

Arg

Alá

Asp

Gin

290

295

300

Val

Gly

His

Phe

Leu

Trp

Val

Gly

Ser

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Lys

Ile

305

310

315

320

Asn

Pro

Leu

His

Gin

His

Glu

Asp

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Ile

Thr

Ile

325

330

335

Gin

Pro

Lys

Arg

Alá

Thr

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Tyr

Phe

Thr

Ser

340

345

350

Arg

Thr

Leu

Glu

Asn

Asn

Arg. Arg

Asn

Val

Trp

Phe

Alá

Glu

Tyr

Trp

355

360

365

Glu

Glu

Asn

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

Lys

Lys

Glu

370

375

380

• ·

123

Asp 385

Thr Asp

Arg Lys

Cys 390

Thr Gly Gin Glu Arg 395

Ile

Gly

Lys

Asp

Ser 400

Asn

Tyr

Glu

Gin

Glu

Gly

Lys

Val

Gin

Phe

Val

Ile

Asp

Alá

Val

Tyr

405

410

415

Alá

Met

Alá

His

Alá

Leu

His

His

Met

Asn

Lys

Asp

Leu

Cys

Alá

Asp

420

425

430

Tyr

Arg

Gly

Val

Cys

Pro

Glu

Met

Glu

Gin

Alá

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

435

440

445

Leu

Lys

Tyr

Ile

Arg

Asn

Val

Asn

Phe

Asn

Gly

Ser

Alá

Gly

Thr

Pro

450

455

460

Val

Met

Phe

Asn

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Phe

465

470

475

480

Gin

Tyr

Gin

Thr

Thr

Asn

Thr

Ser

Asn

Pro

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Gly

485

490

495

Gin

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile

Glu

Asp

Met

Gin

Trp

Gly

500

505

510

Lys

Gly

Val

Arg

Glu

Ile

Pro

Alá

Ser

Val

Cys

Thr

Leu

Pro

Cys

Lys

515

520

525

Pro

Gly

Gin

Arg

Lys

Lys

Thr

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Cys

Cys

Trp

Thr

530

535

540

Cys

Glu

Pro

Cys

Asp

Gly

Tyr

Gin

Tyr

Gin

Phe

Asp

Glu

Met

Thr

Cys

545

550

555

560

Gin

His

Cys

Pro

Tyr

Asp

Gin

Arg

Pro

Asn

Glu

Asn

Arg

Thr

Gly

Cys

565

570

575

• ·

124

Gin

Asp

Ile

Pro 580

Ile

Ile

Lys

Leu

Glu 585

Trp

His

Ser

Pro

Trp 590

Alá

Val

Ile

Pro

Val

Phe

Leu

Alá

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Alá

Thr

Ile

Phe

Val

595

600

605

Met

Alá

Thr

Phe

Ile

Arg

Tyr

Asn

Asp

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

610

615

620

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Cys

Tyr

625

630

635

640

Ile

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Ile

Alá

Lys

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Cys

Ser

645

650

655

Phe

Arg

Arg

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

Met

Cys

Ile

Ser

Tyr

Alá

Alá

660

665

670

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

675

680

685

Lys

Ser

Val

Thr

Alá

Pro

Arg

Leu

Ile

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Alá

690

695

700

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Ile

Ser

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

Ile

Trp

705

710

715

720

Phe

Gly

Val

Asp

Pro

Pro

Asn

Ile

Ile

Ile

Asp

Tyr

Asp

Glu

His

Lys

725

730

735

Thr

Met

Asn

Pro

Glu

Gin

Alá

Arg

Gly

Val

Leu

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

740

745

750

Asp

Leu

Gin

Ile

Ile

Cys

Ser

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

Leu

Leu

Met

Val

755 760 765

125

Thr

Cys 770

Thr

Val

Tyr

Alá

Ile 775

Lys

Thr Arg Gly

Val 780

Pro

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Alá

Lys

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Met

Tyr

Thr

Thr

Cys

Ile

Val

785

790

795

800

Trp

Leu

Alá

Phe

Ile

Pro

Ile

Phe

Phe

Gly

Thr

Alá

Gin

Ser

Alá

Glu

805

810

815

Lys

Leu

Tyr

Ile

Gin

Thr

Thr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

820

825

830

Alá

Ser

Val

Alá

Leu

Gly

Met

Leu

Tyr

Met

Pro

Lys

Val

Tyr

Ile

Ile

835

840

845

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Phe

Lys

850

855

860

Alá

Val

Val

Thr

Alá

Alá

Thr

Met

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser

His

Lys

Pro

865

870

875

880

Ser

Asp

Arg

Pro

Asn

Gly

Glu

Alá

Lys

Thr

Glu

Leu

Cys

Glu

Asn

Val

885

890

895

Asp

Pro

Asn

Asn

Cys

Ile

Pro

Pro

Val

Arg

Lys

Ser

Val

Gin

Lys

Ser

900

905

910

Val

Thr

Trp

Tyr

Thr

Ile

Pro

Pro

Thr

Val

915 920 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

126 (i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 630 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..630 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: /termék = részleges hmGluR6 (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTG

GAG

GCC

CTG

CAG

TGG

TCT

GGC

GAC

CCC

CAC

GAG

GTG

CCC

TCG

TCT

48

Val

Glu

Alá

Leu

Gin

Trp

Ser

Gly

Asp

Pro

His

Glu

Val

Pro

Ser

Ser

1

5

10

15

CTG

TGC

AGC

CTG

CCC

TGC

GGG

CCG

GGG

GAG

CGG

AAG

AAG

ATG

GTG

AAG

96

Leu

Cys

Ser

Leu

Pro

Cys

Gly

Pro

Gly

Glu

Arg

Lys

Lys

Met

Val

Lys

20

25

30

GGC

GTC

CCC

TGC

TGT

TGG

CAC

TGC

GAG

GCC

TGT

GAC

GGG

TAC

CGC

TTC

144

Gly

Val

Pro

Cys

Cys

Trp

His

Cys

Glu

Alá

Cys

Asp

Gly

Tyr

Arg

Phe

35

40

45

CAG

GTG

GAC

GAG

TTC

ACA

TGC

GAG

GCC

TGT

CCT

GGG

TAC

ATG

AGG

CCC

192

Gin

Val

Asp

Glu

Phe

Thr

Cys

Glu

Alá

Cys

Pro

Gly

Tyr

Met

Arg

Pro

50

55

60

ACN

CCC

AAC

CAC

ATC

NNA

CTT

NNG

CCC

ACA

CCT

GTG

GTG

CGC

CTG

AGC

240

Xaa

Pro

Asn

His

Ile

Xaa

Leu

Xaa

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Arg

Leu

Ser

TGG TCC

TCC Ser

CCC Pro

TGG Trp 85

GCA Alá

GCC Alá

CCG Pro

CCG Pro

CTC Leu 90

CTC Leu

CTG Leu

GCC Alá

GTG Val

CTG Leu 95

GGC Gly

288

Trp

Ser

ATC

GTG

GCC

ACT

ACC

ACG

GTG

GTG

GCC

ACC

TTC

GTG

CGG

TAC

AAC

AAC

336

Ile

Val

Alá

Thr

Thr

Thr

Val

Val

Alá

Thr

Phe

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

100

105

110

ACG

CCC

ATC

GTC

CGG

GCC

TCG

GGC

CGA

GAG

CTC

AGC

TAC

GTC

CTC

CTC

384

Thr

Pro

Ile

Val

Arg

Alá

Ser

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Tyr

Val

Leu

Leu

115

120

125

ACC

GGC

ATC

TTC

CTC

ATC

TAC

GCC

ATC

ACC

TTC

CTC

ATG

GTG

GCT

GAG

432

Thr

Gly

Ile

Phe

Leu

Ile

Tyr

Alá

Ile

Thr

Phe

Leu

Met

Val

Alá

Glu

130

135

140

CCT

GGG

GCA

GCG

GTC

TGT

GCC

GCC

CGC

AGG

CTC

TTC

CTG

GGC

CTG

GGC

480

Pro

Gly

Alá

Alá

Val

Cys

Alá

Alá

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Gly

145

150

155

160

ACG

ACC

CTC

AGC

TAC

TCT

GCC

CTG

CTC

ACC

AAG

ACC

AAC

CGT

ATC

TAC

528

Thr

Thr

Leu

Ser

Tyr

Ser

Alá

Leu

Leu

Thr

Lys

Thr

Asn

Arg

Ile

Tyr

165

170

175

CGC

ATC

TTT

GAG

CAG

GGC

AAG

CGC

TCG

GTC

ACA

CCC

CCT

CCC

TTC

ATC

576

Arg

Ile

Phe

Glu

Gin

Gly

Lys

Arg

Ser

Val

Thr

Pro

Pro

Pro

Phe

Ile

180

185

190

AGC

CCC

ACC

TCA

CAG

CTG

GTC

ATC

ACC

TTC

AGC

CTC

ACC

TCC

CTG

CAG

624

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Leu

Val

Ile

Thr

Phe

Ser

Leu

Thr

Ser

Leu

Gin

195 200 205

GTG GGG

Val Gly

210

630

128 (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 210 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val	Glu	Alá	Leu	Gin	Trp	Ser	Gly
1				5
Leu	Cys	Ser	Leu	Pro	Cys	Gly	Pro
			20
Gly	Val	Pro	Cys	Cys	Trp	His	Cys
		35					40
Gin	Val	Asp	Glu	Phe	Thr	Cys	Glu
	50					55
Xaa	Pro	Asn	His	Ile	Xaa	Leu	Xaa
65					70
Trp	Ser	Ser	Pro	Trp	Alá	Alá	Pro
				85
Ile	Val	Alá	Thr	Thr	Thr	Val	Val
			100
Thr	Pro	Ile	Val	Arg	Alá	Ser	Gly

115

120

Asp	Pro 10	His	Glu	Val	Pro	Ser 15	Ser
Gly	Glu	Arg	Lys	Lys	Met	Val	Lys
25					30
Glu	Alá	Cys	Asp	Gly	Tyr	Arg	Phe
				45
Alá	Cys	Pro	Gly	Tyr	Met	Arg	Pro
			60
Pro	Thr	Pro	Val	Val	Arg	Leu	Ser
		75					80
Pro	Leu	Leu	Leu	Alá	Val	Leu	Gly
	90					95
Alá	Thr	Phe	Val	Arg	Tyr	Asn	Asn
105					110
Arg	Glu	Leu	Ser	Tyr	Val	Leu	Leu

125 • · · · · · · • · · • · ··· · ····· ♦ · ·

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Tisztított humán metabotróp glutamát receptor (hmGluR), azzal jellemezve, hogy a hmGluR4, a hmGluR6 és a hmGluR7 altípusokat tartalmazó csoportból cselektált hmGluR4 alcsalád tagja, ahol a hmGluR4a 2. számú szekvenciában leírt aminosav szekvenciával rendelkezik; a hmGluR7-et a 12. számú szekvenciában leírt aminosav szekvenciával rendelkező hmGluR7at, a 14. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező hmGluR7b-t, valamint a sorrendben a 6., 8., vagy a

   10. számú aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidet tartalmazó hmGluR7et tartalmazó csoportból szelektáljuk; és a hmGluRő egy a 16. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidet tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy a hmGluR4 altípus a 2. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkezik.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy a hmGluR7 altípust a 12. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező hmGluR7a-t és a 14. számú

   131 • ······ · • ·«···· ·· · ···· ··· · · · ·· szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező hmGluR7b-t tartalmazó csoportból szelktáljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy a hmGluR7 altípus sorrendben egy a 6., 8. és 10. számú szekvenciákban bemutatott aminosav szekvenciákkal rendelkező polipeptideket tartalmazó csoportból szelektált polipeptidet tartalmaz.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy a hmGluR6 altípus egy a 16. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidet tartalmaz.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti receptor variánsa azzal jellemezve, hogy hasítási variánsokat, aminosav mutánsokat, glikozilációs variánsokat, membránhoz kötött és oldható fragmenteket valamint kovalens vagy aggregációs egységeket valamint más kémiai egységeket tartalmazó csoportból szelektáljuk.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti receptor előállítására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy az ilyen receptort kódoló DNS-t és promótert (a DNS-t az említett promóter szabályozza) tartalmazó expressziós kazettát magába foglaló hibrid vektorral transzformált megfelelő gazdasejtet in vitro vagy in vivő szaporítjuk.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy az említett receptor aktivitását módosító vegyület szkrínelésére használjuk.

   • · · ·« ·« · · · • · • · · ·

   132
9. 9. Nukleinsav azzal jellemezve, hogy az izolált nukleinsav az

   1. igénypont szerinti receptort vagy az említett nukleinsav egy fragmentjét kódoló nukleinsavat tartalmaz.
10. 10. A 9. igénypont szerinti nukleinsav azzal jellemezve, hogy a nukleinsavat egy DNS molekula képviseli.
11. 11. A 10. igénypont szerinti DNS azzal jellemezve, hogy alapjában véve sorrendben az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. és

    15. számú szekvenciákban bemutatott nukleotid szekvenciákkal rendelkező DNS-eket tartalmazó csoportból szelektáljuk.
12. 12. Nukleinsav próba azzal jellemezve, hogy a 10. vagy a 11. igénypontok szerinti DNS legalább 14 szomszédos bázisát vagy ezek komplementjeit tartalmazza.
13. 13. A 10. igénypont szerinti nukleinsav előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az eljárás kémiai szintézist, rekombináns DNS technológiát vagy polimeráz láncreakciót (PCR) j elent.
14. 14. A 10. igénypont szerinti DNS azzal jellemezve, hogy egy hibrid vektort jelent.
15. 15. Egy gazdasejt azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti DNS-t tartalmazza.

    ····

    133
16. 16. Egy eukarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti DNS-t expresszálja.
17. 17. A 15. és 16. igénypontok szerinti gazdasejt azzal jellemezve, hogy egy emlős sejtet jelent.
18. 18. A 15. igénypont szerinti gazdasejt használata azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti receptor aktivitását módosító vegyület szkrínelésére használjuk.
19. 19. A 15. igénypont szerinti gazdasejt előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a 14. igénypont szerinti hibrid vektorral transzfektáljuk vagy transzformáljuk.
20. 20. Tisztított mRNS azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti DNS-sel komplementer mRNS-t jelent.
21. 21. Egy az 1. igénypont szerinti hmGluR altípust kódoló DNS azonosítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy egy humán DNS-t a 12. igénypont szerinti próbával hozunk kapcsolatba, majd az említett próbához alapjában véve hibridizáló DNS(eke)t azonosítjuk.
22. 22. Egy a hmGluR altípushoz kapcsolódó vegyületek azonosítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti receptort egy kompetíciós kötődési vizsgálatban alkalmazzuk.

    ·· ·« fi134
23. 23. Egy az 1. igénypont szerinti hmGluR altípus aktivitását módosító vegyületek azonosítására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy

    - a 16. igénypont szerinti sejteket legalább egy olyan vegyúlettel vagy jellel hozzuk kapcsolatba, melynek az említett receptor altípus aktivitásának módosítására való képességét meg szándékozunk határozni, majd ezt követően

    - a sejteket a funkcionális válaszukban bekövetkezett eltérésekre, mely eltérések az említett receptornak köszönhetőek analizáljuk.
24. 24. A 23. igénypont szerinti vizsgálat azzal jellemezve, hogy

    -a 16. igénypont szerinti sejteket legalább egy olyan vegyülettel vagy jellel hozzuk kapcsolatba, melynek a találmány receptor altípus második messenger aktivitásának módosítására való képességét meg szándékozunk határozni, majd ezt követően

    - az említett sejteket az adott második messenger szintjének változása céljából nyomon követjük.
25. 25. Egy az 1. igénypont szerinti hmGluR altípus jel transzdukciós aktivitásának módosítására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy az említett altípust legalább egy a 24. igénypont szerinti vizsgálatban azonosított vegyület hatékony mennyiségével kapcsolatba hozzuk.
26. 26. Egy az 1. igénypont szerinti agonista aktivitással rendelkező hmGluR altípus glutamát agonistájának vagy alloszterikus modulátorának detektálására szolgáló módszer ···« ····

    135 azzal jellemezve, hogy a módszer a következő két lépésből áll:

    (a) egy vegyületet kiteszünk egy az 1. igénypont szerinti hmGluR altípus válasz hatásának olyan körülmények között és annyi ideig, mely elegendő ahhoz, hogy a vegyület a receptorral kölcsönhatásba lépjen és egy kölcsönös választ adjon a reakció révén, és (b) a válasz stimulálásának növekedését vagy csökkenését detektáljuk, mely válasz a vegyület hmGluR altípussal való kölcsönhatásának eredménye, és ezt viszonyítjuk ahhoz az esethez, amikor a tesztelt vegyület nincs jelen, és ezen adatokból az agonista-szerű aktivitással rendelkező agonista vagy alloszterikus modulátor jelenlétét meghatározzuk.
27. 27. Egy az 1. igénypont szerinti antagonista aktivitással rendelkező hmGluR altípus glutamát antagonistájának vagy alloszterikus modulátorának azonosítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a módszer a következő két lépésből áll: (a) egy vegyületet kiteszünk egy az 1. igénypont szerinti hmGluR altípus egy ismert glutamát agonistaja hatásának olyan körülmények között és annyi ideig, mely elegendő ahhoz, hogy az agonista a receptorral kölcsönhatásba lépjen és egy kölcsönös választ adjon a reakció révén, és (b) az agonista által adott válasz stimulálásának gátlását detektáljuk, mely válasz a vegyület hmGluR altípussal való kölcsönhatásának eredménye, és ezt viszonyítjuk ahhoz a válasz stimuláláshoz, melyet csupán a glutamát agonista indukál, és ezen adatokból az antagonistaszerű aktivitással rendelkező glutamát antagonista vagy alloszterikus modulátor jelenlétét meghatározzuk.

    ·· ···· • · ♦· · · · • · · · ··· · • ········· ···· ··· · ·· ··

    136
28. 28. Egy antitest azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti protein ellen irányítjuk.
29. 29. A 28 igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy poliklonális antitestet jelent.
30. 30. A 28 igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy monoklonális antitestet jelent.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti hmGluR altípus jel transzdukciós aktivitásának módosítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az említett receptort a 28. igénypont szerinti antitesttel hozzuk érintkezésbe.
32. 32. Az 1. igénypont szerinti receptor azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS technológiával nyerjük.
33. 33. Egy fúziós protein azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti receptort tartalmazza.